Summary
Her præsenterer vi en protokol for at udføre polysome profilering på isolerede perfunderet mus hjerte. Vi beskriver metoder til hjertet perfusion, polysome profilering og analyse af polysome fraktioner mRNAs, miRNAs og polysome proteomet.
Abstract
Undersøgelser i dynamiske ændringer i protein oversættelse kræver specialiserede metoder. Her undersøgte vi ændringer i nyligt syntetiseret proteiner i svar til iskæmi og reperfusion ved hjælp af isolerede perfunderet mus hjertet kombineret med polysome profilering. For yderligere at forstå de dynamiske ændringer i protein oversættelse, vi kendetegnet den mRNAs, der var lastet med cytosole ribosomer (polyribosomes eller polysomes) og også tilbagebetalte mitokondrie polysomes og sammenlignet mRNA og protein fordeling i de højeffektiv fraktioner (mange ribosomer knyttet til mRNA), lav-effektivitet (færre ribosomer vedlagt), der også omfattede mitokondrie polysomes, og de ikke-oversætte fraktioner. miRNAs kan også knytte mRNAs, der er ved at blive oversat, hvorved effektiviteten af oversættelse, vi undersøgte distribution af miRNAs på tværs af fraktioner. Fordelingen af mRNAs, miRNAs og proteiner blev undersøgt på basal perfunderet betingelser, i slutningen af 30 min globale no-flow iskæmi, og efter 30 min af reperfusion. Her præsenterer vi de metoder, der anvendes til at udføre denne analyse — navnlig tilgang til optimering af protein udvinding fra saccharose gradient, da dette er ikke blevet beskrevet før — og give nogle repræsentative resultater.
Introduction
Hjertet reagerer på skade af iskæmi (I) og reperfusion (R) på en dynamisk måde. Der er dog lidt indsigt i akutte ændringer i proteinsyntesen i svaret. For at løse dette, tog vi fordel af den veletablerede metode af polysome profilering1 for at identificere ændringer i protein overflod, der afspejler omfordeling af ribosomer og translationel regulerende faktorer fra cytosol til polysomes, og den forøgelse af nyligt syntetiserede proteiner (NSP). I fastsættelsen af jeg / R, stigning i nye proteinsyntesen opstår i en tidsramme, der er i strid med transskription af nye mRNAs2; Derudover har uoverensstemmelse mellem mRNA udtryk niveauer og protein overflod været rapporteret3. Af disse årsager valgte vi at analysere ændringer i det dynamiske proteomet som reflekteres af protein oversættelse. For at gøre dette, vi kvantificere mRNA i polysome fraktioner, og analysere protein sammensætning i polysome fraktioner. Endelig fordi MicroRNA (miRs) regulere tilgængeligheden af mRNAs for oversættelse og kan forstyrre effektivitet af protein oversættelse4,5, vi undersøgte distribution af miRs i polysome brøker, med fokus på den svar på jeg / R.
Vi valgte at bruge isoleret mus Langendorff perfusion model og høstede væv under basale forhold af kontinuerlig perfusion, efter 30 min globale no-flow iskæmi, og efter 30 min for iskæmi efterfulgt af 30 min. af reperfusion. Vi derefter solubilized hjertet væv og adskilt polysomes over en saccharose gradient, efterfulgt af proteom analyse og selektiv påvisning af mRNAs og miRNAs af PCR og microarray, henholdsvis. Denne kombination af metoder repræsenterer en kraftfuld tilgang til forståelsen af dynamiske proteomet, så samtidige påvisning af mRNA, miRNA, og NSP, omfordeling af regulerede proteiner, miRNA og mRNA mellem nontranslating fraktioner, ringe virkningsgrad polysomes, og højeffektiv polysomes (Se figur 1). Indsigt i den dynamiske regulering af denne proces vil blive udvidet med yderligere analyse af fosforylering af centrale lovgivningsmæssige faktorer såsom eIF2α eller mTOR. Disse individuelle skridt er nu beskrevet i detaljer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført efter institutionelle retningslinjer og godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget af Cedars-Sinai Medical Center.
1. Langendorff Perfusion af musen hjerte
-
Langendorff perfusion af musen hjerte med iskæmi og reperfusion
- Administrere intraperitoneal pentobarbital natrium 70 mg/kg til den voksne mus (8-uge-forhenværende, mand, C57BL6/j). Bekræft dyb anæstesi ved manglende tilbagetrækning til tå knivspids.
- Anticoagulate med intraperitoneal heparin 500 U/kg.
- Åbn brystet via brystbenet indsnit. Åbn mellemgulvet og skær langs de kystnære kant til den forreste aksillær akse. Derefter skæres den forreste aksillær akse op til forelimb åbne helt thorax bur. Efter, visualisere hjertet, klemme den opstigende aorta med pincet og hurtigt punktafgifter hjertet. Døden er på grund af exsanguination. Sted midt i kolde Krebs (NaCl 6,9 g/L, KCl 0,35 g/L, NaHCO3 2,1 g/L, KH2PO4 0.16 g/L, MgSO4 0.141 g/L, glucose 2 g/L og CaCl2 0.373 g/L).
- Kanyleres aorta med en stump-tip nål og perfuse hjerte retrogradely med Krebs løsning i konstant pres tilstand.
- Efter en stabiliseringsperiode af 15 min, er underlagt hjertet en global no-flow iskæmi i 30 min. efterfulgt af reperfusion i 30 min.
- Høste hjerter, efter 15 min oprindelige perfusion, efter 30 min. iskæmi eller efter 30 min reperfusion. Trim off hjertets forkamre, og snap-freeze vævet i flydende kvælstof.
- Opbevares ved-80 ° C indtil brug
2. Vævscentre homogenisering, oploesning og saccharose tæthed Gradient Sedimentation
-
Gradient forberedelse
- Forberede 2 løsninger (15% og 50%) af 100 mL saccharose, blande 4 mL NaCl 2,5 M;
0,8 mL MgCl2 1,25 M; 1 mL Tris-HCl 1 M, pH 7,5; 15 g eller 50 g saccharose (for 15% og 50%, henholdsvis); ultrarent vand til 100 mL; og xylen cyanol (0,02 mg/mL) til at farve 15% opløsning - Filtrere hver løsning (0,22 µm filtre)
- Den dag gradient er at blive brugt, forberede 40 mL af hver rørsukkeropløsning og tilføje cycloheximide til hver løsning til at opnå en endelig koncentration på 100 µg/mL
- Bruge en gradient maker til at forberede en blanding mellem 15% og 50% saccharose løsninger
- Fylde den venstre rum med 5 mL af 15% saccharose gradient
- Fylde den rigtige rum med 50% saccharose gradient
- Åbne hanen og tænde pumpen til de to små rum der omrøres med magnetomrører
- Brug et rør forbundet med anden hanen til at give den blandede rørsukkeropløsning til at flyde i en ultra-centrifugering tube med tynde vægge. Endelige volumen vil være omkring 10 mL.
- Holde gradienter ved 4 ° C (natten over hvis det er nødvendigt, men ikke længere)
- Forberede 2 løsninger (15% og 50%) af 100 mL saccharose, blande 4 mL NaCl 2,5 M;
-
Homogenisering af hjerte væv
- Homogeniseres friske eller frosne hjerte med en polytron i filtreret lysisbuffer (modificeret til saccharose gradient fraktionering) indeholdende 100 mM KCl, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM MgCl2, 0,4% NP-40. Omfatte cycloheximide 100 µg/mL for at opretholde polysome struktur, 0,1 U RNase inhibitor og protease hæmmer cocktail (1 tablet til 50 mL).
- Inkuber den lysate på is 15 min.
- Der centrifugeres ved 18.000 x g i 15 min. ved 4 ° C for at fjerne uopløselige materiale og indsamle supernatanten.
- Reserve 50 µL for protein beslutsomhed, RNA isolering og RNA integritet analyse (Se figur 2).
- Lag supernatanten (500-100 µL) på toppen af gradienter og balance rør med lysisbuffer.
-
Bundfældning og samling af brøker
- Udføre ultracentrifugering for 120 min på 37.000 rpm ved 4 ° C i en swingende spand rotor. Ifølge producenten svarer dette til 228.000 x g på maksimal radius.
- Indsamle hver gradient som 17 fraktioner (omkring 600 µL hver fraktion) i microcentrifuge rør med kontinuerlig overvågning af absorbans ved 254 nm (OD254).
- Programmere brøkdel Samleren som følger:
- Kassere de første 3 min samling (svarende til væske i rørene før gradient)
- Fra 4 til 19 min, indsamle brøker ved en hastighed på 1 mL/min. i 17 fraktioner.
- Placere fraktioner på is, som hver er indsamlet. Fryse prøver på-80 ° C, hvis de ikke behandles omgående. En typisk UV densitometric sporing på gradueringen, er som det er indsamlet, vist i figur 1.
3. isolering og analyse af mRNAs fra Polysome og Nontranslating fraktioner
-
Udvinding af mRNA
- Tø fraktioner på is, hvis de var flash-frosset efter indsamling
- Overføre 200 µL af hver fraktion til en frisk tube
Bemærk: På dette trin to eller flere på hinanden følgende fraktioner kan samles sammen. Det skal gøres omhyggeligt efter at have analyseret OD254 graf, så at polysome og ikke-polysome fraktioner ikke får blandet. - Tilføje 10 ng af luciferase RNA som intern kontrol til hver prøve til normalisering formål.
Bemærk: Luciferase primere bør anvendes som en intern kontrol til at normalisere resultaterne. - Tilføje 700 µL af RNA udvinding reagens (monofasiske løsning af phenol og guanidin isothiocyanat; Se Tabel af materialer) til hver tube. Bland godt og Inkuber rør for 5 min på RT (stuetemperatur).
- Tilføje 140 µL chloroform og vortex for 15 s. Incubate for 2-3 min på RT.
- Centrifugeres prøver for 15 min på 12.000 x g ved 4 ° C.
- Omhyggeligt overføre den øverste vandige fase til en ny tube.
- Da RNA indholdet af fraktioner ikke er høj, tilføje 10 µg af glykogen som bærestof til hver tube.
- Tilføje 350 µL isopropanol til hver tube. Bland godt og Inkuber ved-20 ° C i 1 time til at øge udbyttet.
- Der centrifugeres i 15 min. ved 12.000 x g ved 4 ° C.
- Supernatanten og tilføje 700 µL ethanol 75% for at vaske RNA pellet.
- Der centrifugeres i 5 min på 7.500 x g ved 4 ° C.
- Fjern ethanol og lad pellet air tørre i 10-15 min.
Bemærk: Over tørring RNA pellet vil forhindre dens komplet oploesning i vand. - Resuspenderes RNA i 50 μL af RNase-fri ultrarent H2O.
- Inkuber prøver i 10 min. ved 55 ° C.
- Bruge 2 μl af hver prøve at måle kvaliteten og kvantiteten af den udpakkede RNA og gemme resten ved-80 ° C.
-
Reverse transkription og qPCR
- Brug 4 μL af reverse transkription cDNA syntese kit (Se Tabel af materialer) for en 20 μL reaktion. Forberede supermix afhængig af antallet af prøver. Overfør den nødvendige volumen til hver tube og tilsættes 5 μl af input RNA hver tube. Denne diskenhed kan korrigeres for at være relevante for rækken af Taq-polymerase arbejdsvilkår.
- Inkuber rør i en termisk cycler med følgende program anbefalet af fabrikanten: 5 min ved 25 ° C, 20 min reverse transkription i 20 min. på 46 ° C, og reverse transkriptase inaktivering i 1 min. ved 95 ° C.
- Køre qPCR med optimeret program for hvert par af primere.
Bemærk: For at påvise tilstedeværelsen af visse mRNAs i fraktioner, svarende mængde fra hver fraktion (af den isolerede RNA) bør anvendes til reverse transkription.
-
Analyse af resultaterne
- Bruge værdien Ct af interesserede genet og luciferase til at beregne delta Ct værdier
- Express hver fraktion delta Ct værdi som en procentdel af den samlede mRNA værdi i alle fraktioner til at visualisere fordelingen af mRNA på tværs af de forskellige fraktioner (tabel 1)
4. isolering og analyse af miRNAs fra Polysome brøker og Nontranslating fraktioner
-
Udvinding af mRNA og miRNA
Bemærk: Denne protokol følger producentens anvisninger, med nogle få ændringer.- Optø glykogen og spike-objektet. Holde på is.
- Tilføje 700 µL miRNA udvinding reagens til 200 µL af poolet prøve.
- Tilføj 1 µg/µL af glykogen og homogeniseres den ved hjælp af en pipette. Inkuber det i 5 min ved stuetemperatur.
- Tilføje 3,5 µL af 1,6 x 108 spike-i kontrol og bland det.
- Tilføje 200 µL chloroform og vortex det for mindst 15 sek.
- Inkuber i 3 min ved stuetemperatur.
- Der centrifugeres ved 12.000 x g i 15 min. ved 4 ° C.
- Ved hjælp af en pipette, overføre supernatanten til en ny 1,5 mL tube. Kassér de midterste og nederste faser.
- Tilføje 1,5 x volumen af 100% ethanol til supernatanten og bland det.
- Overføre 700 µL af denne blanding til miRNA udvinding kolonnen og centrifugeres det ved fuld hastighed for 15 s på RT og kassér flow-gennem; Gentag dette trin med enhver resterende prøve.
- Tilføje 700 µL af buffer 1 til kolonnen og centrifugeres ved fuld hastighed for 15 s på RT; Kassér gennemstrømnings.
- Tilsættes 500 µL af buffer 2 til kolonnen og centrifugeres det ved fuld hastighed for 15 s på RT; Kassér gennemstrømnings.
- Tilsættes 500 µL 80% ethanol til kolonnen og centrifugeres ved fuld hastighed i 2 min på RT; Kassér gennemstrømnings.
- Overfør kolonnen til et nyt 2 mL reducerede rør, åbne låget og centrifugeres det på RT for 5 min på fuld hastighed; Kassér gennemstrømnings.
- Tilføje 16 µL af RNAse-fri vand til kolonnen og centrifugeres det ved fuld hastighed i 1 minut på RT. holde eluatet på is eller opbevares ved-80 ° C for fremtidige analyser.
Bemærk: To microliters af hver prøve kan bruges til OD analyse.
-
Reverse transkription
- Forbered dig på isen. For hver 20 µL RT-PCR reaktion, tilføje 4 µL af miRNA RT buffer, 2 µL af nukleinsyrer, 9 µL af total RNA, 2 µL af enzymet og 3 µL af RNAse-fri vand; Bland det og spinde det ned kort.
- Angiv den termiske Cycler som følger:
37 ° C i 60 min.
95 ° C i 5 min;
4 ° C hold. - Fjerne rør fra den termiske cycler og tilføje 200 µL af RNAse-fri vand. Opbevares ved-20 ° C eller gå videre til real-time PCR.
-
Real-time PCR
Bemærk: Denne protokol følger 96 godt plade format. Forberede mastermix på is.- Forberede PCR-mastermix og tilføje cDNA (fra miRNAs ovenfor) Ifølge rækken accepteret af protokollen. Flere reaktioner kan tilberedes i batch.
- Tilføje ialt 25 µL PCR mix + cDNA i hver brønd.
- Forsegle pladen ved hjælp af en optisk plade segl.
- Der centrifugeres plade for 1 min på 1.000 x g ved stuetemperatur.
- Program for real-time cycler som følger:
Første aktivering trin ved 95 ° C i 15 min;
3-trins cykling: denaturering på 94 ° C i 15 s; udglødning ved 55 ° C i 30 s; udvidelse på 70 ° C i 30 s (udfører fluorescens dataindsamling); tilføje 40 cykler;
Smeltning-kurve ifølge cycler standard.
-
Sammenlignende analyse
- Eksempel på normalisering (Se tabel 2):
- Find minimumværdien SCM.
- Normalisér alle SCM værdier til dette minimum.
- Trække denne værdi fra Ct-værdier af miRNAs af interesse (MOI) og reference gen (REF).
- Analysere data ved hjælp af formlen 2-ΔCt .
- Eksempel på normalisering (Se tabel 2):
5. proteom analyse
-
Udvinding af proteiner fra polysome fraktioner
- Kombinere indsamlede saccharose fraktioner i tre endelige fraktioner. Marker fraktioner som tunge (høj effektivitet polysomes i poolede fraktioner 4, 5, 6 og 7 med den højeste koncentration af saccharose, bunden af gradient rør), lys (lav effektivitet polysomes i poolede brøkdel 8, 9, 10 og 11, midten af den gradient rør) og ikke-omsætning (poolede fraktioner 12, 13, 14 og 15 med den laveste koncentration af saccharose, toppen af gradient rør). Udføre protein assay på poolet fraktioner.
- Forberede 100% stock trichloreddikesyre (TCA) og gemme det ved 4 ° C i mørke. 0,5 mL af prøven blandes med 60 µL af 100% TCA og inkuberes ved-20 ° C natten over i mørke.
Bemærk: Brug 1,5 mL lav protein fastholdelse rør (Se Tabel af materialer). - Efter natten inkubation, tø prøve på ice og centrifugeres ved 15.000 x g, 4 ° C i 30 min. Fjern supernatanten.
Bemærk: 100 µg af total protein i prøven giver synlige protein pellet nederst tube. - Pre chill acetone i-20 ° C fryser. Tilsæt 0,5 mL koldt acetone til protein pellet og centrifugeres ved 15.000 x g, 4 ° C i 15 min. Fjern supernatanten. Gentag dette trin to gange.
- Luft tørre pellet. Resuspenderes i 360 µL af 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8).
Bemærk: Hvis det er nødvendigt, bruge en puls sonikator til resuspenderes. - Tilføje 40 µL af 0,1 M dithiothreitol (slutkoncentration 10 mM) og inkuberes ved 55 ° C på shaker til 45 min. tilsættes 50 µL af 0,15 M iodoacetamide (slutkoncentration 17 mM), og der inkuberes ved stuetemperatur på shaker i 30 min. i mørke.
- Forberede trypsin løsning: resuspend 20 µg af trypsin i 100 µL af 50 mM ammoniumbicarbonat. Tilføje tilsvarende volumen af trypsin løsning til prøven på 1:50 (w/w) trypsin: protein forholdet, sikre, at pH er 8 og Ruger på shaker ved 37 ° C natten over.
Bemærk: Tilføje 1 M ammoniumbicarbonat for at bringe pH 8. - Efter trypsin fordøjelse, cool prøven, centrifuge kort i bænk centrifuge, tilføje 10% myresyre til pH 2 – 3 til dæmpning af trypsin aktivitet, og fortsætte med at prøve afsaltning.
Bemærk: Brug µ-eluering plade for prøven afsaltning. - Tilstand af sorptionsmiddel i brøndene 96 godt plade med 200 µL af methanol ved hjælp af vakuum tre gange efterfulgt af konditionering af 200 µL af 0,1% myresyre tre gange. Indlæse prøve og udføre en prøve vask ved hjælp af 200 µL af 0,1% myresyre tre gange. Elueres prøve med 100 µL af 50% acetonitrile/0.1% myresyre to gange i lav protein fastholdelse 0,5 mL tube.
Bemærk: Elueres prøven langsomt i første omgang ved hjælp af gravitation efterfulgt af lav vakuum. - Fordampe prøve eluatet til tørhed bruge koncentrator og enten foretage direkte massespektrometri analyse eller butikken på-80 ° C indtil brug.
-
Massespektrometri analyse
- Rekonstruere hver pellet (bestående af de tryptic peptider) i 50-100 µL og injiceres 1 µL til massespektrometer.
Bemærk: Optimere rekonstitution og injektion mængder for at opnå maksimal intensitet LC/MS/MS signal. I vores tilfælde, den maksimale signal (samlede ion aktuelle; TIC) i hjertet af scanningen var inden for rækkevidde af 1E8 til 2E9. - Bruge en fælde kolonne C18 (300 µm i.d. x 5 mm, 5 µm, 100Å) efterfulgt af peptid adskillelse ved hjælp af C18 kolonne (75 µm i.d. x 250 mm, 2 µm, 100Å) med en flow sats indstilling på 300 nL/min. sæt nano-kilde kapillær temperatur til 275 ° C og spray spændingen til 2 kV.
- Anvende en lineær gradient 5-35% B for 90 min, 35-95% B for 3 min, holde på 95% B for 7 min og ækvilibrering på 5% B for 25 min (A: 0,1% myresyre/vand og B: 0,1% myresyre i acetonitril). Erhverve MS2 spektra for de 15 højeste intensitet ioner fra hver MS1 scanning ved hjælp af CID tilstand. Bruge 3 massespektrometri flergangsbestemmelser for hver prøve analyseres.
Bemærk: Optimere og bruge de eksperimentelle betingelser og parametre, der er egnet til din prøver på særlige massespektrometri instrument. Betingelser/parametrene nævnt i afsnit 5.2. blev brugt og optimeres i vores laboratorium.
- Rekonstruere hver pellet (bestående af de tryptic peptider) i 50-100 µL og injiceres 1 µL til massespektrometer.
-
Protein identifikation/kvantitering
- Efter massespektrometri analyse, skal du konvertere raw spectra filer til kompatible mzXML filer ved hjælp af MSConvert software (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html).
- Indsende de konverterede filer i SEQUEST søgemaskine med søgekriterier, fx UniProtKB/Swiss-Prot mus database (mest up to date kanoniske gennemgik); semi-enzym digest ved hjælp af trypsin (efter KR /-); med op til 2 savnede splittelser; forløber masseinterval: 400 til 4.500 amu; statisk ændring: carbamidomethyl (C) 57.021465 amu; peptid masse tolerance: 50 ppm; fragment masse type: monoisotopic.
Bemærk: Andre protein database søgning motorer og data rørledninger kan bruges. Hvis bruger database til fx rotte, der er mindre fuldstændig end databaser for mus og mennesker, du muligvis til at søge mod mus (og human) databaser at øge proteomet dækning. I dette tilfælde vil redundans i protein navne skal fjernes. - Udføre en post søgning analyse. Angive filtre til visning af data. For eksempel, sæt en minimum protein sandsynlighed (protein tærskel) som 95% eller 99%, dvs., vises kun de proteiner, som en statistisk analyse indebærer 95% eller 99% sandsynlighed for at være til stede i prøven. Angiv filteret for peptid tærskel (f.eks. 95%), dvs en minimum sandsynlighed, der skal bruges til at bestemme, om et spektrum identificerer et peptid. Vælg det minimum antal peptider, der bestemmer, om der findes en protein (2 peptider som et minimum for protein identifikation anbefales).
- Evaluere identificerede proteiner for kvalitet/mængde. Sikre at proteotypic peptider anvendes til kvantificering. Hvis isoform er identificeret sikre det er baser på observation af et tryptic peptid består af en unik for den specifikke isoform aminosyresekvens. Enhver "ligner" eller hypotetiske proteiner bør gennemgå sammenligning at se, om den observerede peptider svarer til et kendt protein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
mRNA analyse
mRNA resultater kan udtrykkes som en fordeling af en bestemt mRNA i hver fraktion (figur 3A); til kvantificering, kombinere polyribosomal oversætte fraktioner og sammenligne med den ikke-oversætte brøkdel (figur 3B), præsenterer en ratio af mRNA overflod i oversætte til nontranslating brøker. Yderligere oplysninger er opnået ved at undersøge de højeffektive polysome fraktioner adskilt fra lav-effektivitet polysome fraktioner (og adskilt fra nontranslating brøker). Dette er især vigtigt, når du analyserer miRNAs, der er beriget med ringe virkningsgrad fraktioner (hvor de griber med protein oversættelse af deres mål mRNAs).
Repræsentative resultater af en bestemt mRNA, der ændringer sin distribution i hele de oversætte og nontranslating brøker efter mus hjerter blev udsat for iskæmi og iskæmi/reperfusion i forhold til humbug er vist i figur 4.
miRNA array analyse
Repræsentative resultater fra en miRNA array analyse er vist i figur 5. Her, en delmængde af miRNAs (specialdesignede array plade) blev analyseret i de poolede tunge fraktioner med angivelse af at 22 miRNAs var forbundet med polysomes under iskæmi, 9 miRNas under iskæmi og reperfusion, med 7, som var fælles for begge betingelser. Dette viser, at sammenslutningen af miRNAs dynamisk som reaktion på belastninger af iskæmi og reperfusion.
Proteom-analyse
Analyse af tunge, lys og ikke oversætte fraktioner af fingeret (kontrol) prøve:
881 af samlede proteiner blev identificeret ved massespektrometri; 3, 46 og 208 proteiner af alt var unikke for tunge, lys og ikke-trans fraktioner, henholdsvis (figur 6A). Størstedelen (88%) af mitokondrie ribosomale proteiner (28S og 39S) blev identificeret i let fraktion (36 ud af 41) og et flertal (88%) af cytosole ribosomale proteiner (40S og 60) blev ikke fundet almindeligt i både tunge og lette fraktioner (53 ud af 60) bekræfter effektiv adskillelse og proteom evne til identificerede tungere cytosole vs lysere mitokondrie ribosomale proteiner. Delmængde af identificerede mitokondrie og cytosole ribosomale proteiner er vist i fig. 6B.
Figur 1: typiske UV-absorbans profil af polysome fraktioner på saccharose gradient. De første tre fraktioner repræsenterer dødvolumen i slangen. Høje effektivitet (høj molekylvægt, HMW) fraktioner indsamles i brøkdele 4-7, lave effektivitet (lav molekylvægt, LMW) fraktioner i 8-11, og den ikke-omsætning (og resterende cytosole materiale) er indsamlet i fraktioner 12-15 ( nontranslating, NTR). Den røde linje angiver ledningsevne, og det blå spor angiver UV absorbans ved 254 nm. Til højre er en tegneserie af et reagensglas med saccharose gradient, viser fordelingen af polysomes efter bundfældning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: RNA integritet kontrolanalyse på Bioanalyzer. RNA integritet antallet (RIN) af total RNA isoleret fra hjertet hele lysate. RIN beregnes ifølge 18S og 28S toppe. RIN interval: 1-10, og RIN = 10 repræsenterer en meget god integritet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentant profil af mRNA distribution i saccharose gradient. Hjerter blev udsat for basal Langendorff perfusion eller iskæmi og reperfusion (jeg / R). (A) hjerte lysates blev løst på saccharose gradient og mRNA indhold til GAPDH (venstre) og COX4 (til højre) blev bestemt i hver fraktion. Plot viser relative mRNA overflod i hver fraktion (brøkdel nummer på x-aksen) for basal perfusion (sham, rød linje og diamanter) og iskæmi/reperfusion (jeg / R, blå linje og firkanter). Overlejret på plottet er UV absorbans angiver samlede mRNA indhold (lys grå kurve) og ledningsevne (lige grå skrå linje). Boksene angiver, hvordan fraktioner var samlet. (B) søjlegrafen plot viser forholdet mellem mRNA overflod i oversættelse (polysomes) vs nontranslating (NT) brøker for GAPDH (venstre) og COX4 (til højre) mRNAs. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentative mRNA resultater. Kvantitering af ét mRNA i de poolede fraktioner (HMW, LMW, NTR) viser ændringer ifølge den eksperimentelle gruppe. Polysome fraktionering af musen hjerter blev udført efter Langendorff perfusion. Resultaterne er afbildet som % af samlede mRNA (øverste panel) og forholdet mellem polysomes (HMW + LMW) til nontranslating fraktion (NTR). Fejllinjer udgør resultater fra 5 hjerter pr. gruppe (sham, iskæmi, eller jeg / R). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: repræsentant miRNA resultater. Venn-Diagram af en pathway fokuseret miRNA analyse viser oppe og downregulated miRNAs i tunge brøkdel puljer af mus prøver efter hjertet iskæmi eller iskæmi og reperfusion. Cut-off værdi: 1.5 fold. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: proteiner identificeret ved massespektrometri. (A) Venn-diagram af proteiner fælles og entydige for tunge, lys og ikke-trans fraktioner. (B) undersæt af mitokondrie og cytosole ribosomale proteiner identificeret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: skematisk arbejdsgange for protein udvindingsmetoder afprøves. Protein udvindingsmetoder blev testet ved hjælp af fingeret (kontrol) prøve og tunge (højeffektiv polysomes) brøkdel med højeste saccharoseindhold. Tal med rødt angiver antallet af proteiner, der blev identificeret ved massespektrometri; såfremt to tal er vist, er fra to separate eksperimenter. Den detaljerede beskrivelse er givet i teksten. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| BRØKER | GEN Ct | LUCIFERASE Ct | ΔCt | 2ΔCt | SUMMEN AF ALLE FRAKTIONER | % AF HVER FRAKTION | Polysome/NTR forholdet |
| Høj effektivitet (HMW) | 28.75 | 22.79 | 5,96 | 0.016 | 0.046 | 34.64 | 2,77 |
| Lav effektivitet (LMW) | 28.43 | 22,63 | 5,80 | 0.018 | 38.81 | ||
| Ikke oversætte (NTR) | 29.12 | 22.77 | 6.35 | 0,012 | 26.55 | ||
| Polysome/NTR Ratio = (HMW + LMW) / NTR |
Tabel 1: Prøve analyse af mRNA. Metode til analyse af ét mRNA er vist for de forskellige poolede fraktioner (HMW, LMW, NTR) efter kvantitativ PCR. ΔCt = gen Ct - luciferase Ct, og 2ΔCt er 2ΔCt.
| Find minimumværdien SCM: 22.77 | |||
| Prøve 1 | Prøve 2 | Prøve 3 | |
| CT MOI | 22.92 | 22.36 | 22,58 |
| CT SCM | 22.81 | 22.77 | 22,9 |
| CT REF | 23.27 | 23.55 | 23.19 |
| Normalisér alle SCM værdier til dette minimum | |||
| Prøve 1 | Prøve 2 | Prøve 3 | |
| CT SCM | 0,05 | 0 | 0,13 |
| Subtrahere værdierne fra Ct-værdier af MOI og REF | |||
| Prøve 1 | Prøve 2 | Prøve 3 | |
| CT MOI | 22.87 | 22.36 | 22.45 |
| CT REF | 23.22 | 23.55 | 23.06 |
Tabel 2: prøve real-time PCR beregning for miRNA udtryk sammenligning i polysome og nontranslating fraktioner. miRNAs af interesse (MOI) og reference gen (REF) blev analyseret i de poolede tunge fraktioner af mus efter iskæmi eller iskæmi/reperfusion. Ct værdier blev først normaliseret til spike-objektet (SCM) Ct værdi, så formlen 2-ΔCt blev brugt til at sammenligne miRNA udtryk.
| Metode | Sample volumen [mL] | # af proteiner identificeret | Kommentarer |
| FASP | 1 | 227 | hovedparten af saccharose udfældet på filter |
| acetone nedbør | 0,6 | 372 | tyktflydende slam af saccharose i rør bunden; 4:1 (reagens: prøve) mængder; ingen synlige protein pellet |
| chloroform/methanol nedbør | 0,32 | 389 | tyktflydende slam af saccharose i rør bunden; 8:1 (reagens: prøve) mængder; ingen synlige protein pellet |
| TCA nedbør (ved 4 ° C) | 0,5 | 405, 415 | ingen saccharose nedbør; 0.12:1 (reagens: prøve) mængder; synlige pellet nederst tube |
| re nedbør | 85, 60 | yderligere TCA udfældning af supernatanten efter første pellet blev indsamlet | |
| TCA nedbør (ved-20 ° C) | 0,5 | 440, 430 | ingen saccharose nedbør; 0.12:1 (reagens: prøve) mængder; synlige pellet nederst tube |
| re nedbør | 81, 55 | yderligere TCA udfældning af supernatanten efter første pellet blev indsamlet |
Tabel 3: Sammenligning af protein udvindingsmetoder. FASP, acetone nedbør, chloroform/methanol nedbør og TCA nedbør ved 4 ° C og -20 ° C blev evalueret. Målet var at maksimere antallet af proteiner identificeret. TCA nedbør blev evalueret på et andet parti af materiale til at bekræfte reproducerbarhed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Polysome profil analyse giver mulighed for undersøgelse af protein oversættelse ved at analysere et bestemt mRNA eller hele transkriptom6,7translationel tilstand. Det er også af stor hjælp når lokale oversættelse skal studeres som synaptosomes8. Traditionelt, indebærer denne metode adskillelse af mono - og polyribosomes og den tilknyttede mRNAs på et saccharose forløb, som kan kobles til genomisk eller proteom teknikker til at opnå de tilsigtede resultater6,9. For eksempel, har en nylig undersøgelse udført af vores gruppe afsløret en post-transcriptional reguleringsmekanisme henrettet i hjertet af patienter, der gennemgår CPB, som efterligner iskæmi/reperfusion skade. Drage fordel af polysome profil analyse, har vi vist en stigning i oversættelse af nuklear-kodet mitokondrielle proteiner i hjertet efter CPB procedure2.
Den dynamiske proteomet polyribosomal profilering tilgang præsenteres her kan afsløre ændringer i befolkningens mRNAs forbundet med polyribosomes og de proteiner, der er ved at blive aktivt oversat. Som oversættelse af mRNAs er delvis underlagt miRNAs, kan analyse af miRNAs i disse fraktioner afsløre yderligere indsigt. Flere undersøgelser har faktisk ændret denne metode og viste det sig at være en passende og pålidelig strategi til at undersøge tilstanden miRNA forordning10,11.
Mange undersøgelser har været udført i det sidste årti, dykke ind i rollen som miRNAs, i betragtning af deres betydning i forskellige biologiske funktioner12,13. Da miRNAs handle gennem base-parring med modstykke mRNAs for at markere dem for nedbrydning, er polysome profil analyse blevet udført og vist at miRNAs findes faktisk i polysome brøker, målretning oversætte mRNAs14, 15 , 16. miR-21 er et godt eksempel, hvor det er forbundet med en lav undertrykkelse og svag polysomes bindende i normale celler, mens i kræftceller, foreningen med polysomes er steget og det undertrykkende effekt er meget stærkere17.
I denne undersøgelse, Real-time PCR analyse blev udført ved hjælp af Ct værdierne af miRNAs af interesse (MOI), Ct-værdier af spike-i styre miRNA (SCM) at reducere tekniske variationer og Ct værdien af en reference gen eller miRNA (REF) som er stabil blandt prøver. Det første skridt var at normalisere Ct værdierne af MOI og REF til Ct-værdier af SCM. Derefter var der en anden skridt normalisering af MOI til REF og den resulterende værdi blev brugt til at beregne 2-ΔCt formlen. Disse værdier eller fold-ændring værdier kan bruges til at vise forskelle mellem grupperne.
Da udvindingen af proteiner er vanskeligt fra polysome fraktioner, har de fleste af de undersøgelser, der er udført indtil nu, anvendes fraktioner direkte til western blot analyse. De simpelthen sediment proteinindholdet i hver fraktion og bland det med SDS-loading bufferen til brug for SDS-PAGE analyse8,18. Her, har vi udviklet en metode, som tillader os at ikke kun uddrag mRNAs og miRNAs efter fraktionering, men også at opnå peptider og proteiner med en høj kvalitet til at gå videre med massespektrometri analyse.
Denne fremgangsmåde kan udvides yderligere ved aktivt måling af nyligt syntetiserede proteiner ved hjælp af metaboliske mærkning som biorthogonal aminosyre homolog, såsom azidohomoalanine (AHA) til methionin19,20. AHA tillader indarbejdelse efterfulgt af klik kemi til indbygning af et biotin tag efterfulgt af streptavidin rensning af alle proteiner, der indarbejdet AHA. Dette giver mulighed for endelige identifikation af nyligt syntetiserede proteiner — anden del af det dynamiske proteomet. Påvisning af miRNAs at omfordele blandt de oversætte og nontranslating fraktioner som svar på en stimulus (her med jeg / R) giver mulighed for afhøring af dynamisk regulering af protein oversættelse. De faktorer, der rekrutterer miRNAs til omegnen af ribosomet-bundet mRNA er dog stadig for at være identificeret og systematisk undersøgt.
I vores undersøgelse, ud over TCA nedbør, vi testede tre andre metoder til protein udtræk fra polysome brøker: i) FASP (filter-støttede prøveforberedelse)21, ii) acetone nedbør og iii) chloroform/methanol nedbør. Egnetheden af metoderne blev evalueret baseret på både evnen til at behandle fraktioner med høj koncentration af saccharose (op til 50%) og antallet af proteiner identificeret ved massespektrometri (figur 7 og tabel 3).
For FASP metode fulgte vi protokol til forberedelse af prøven som en FASP Protein fordøjelse Kit der ansat en ultrafiltrering enhed med en relativ molekylære masse afskæring af 30 kDa. Dette filterenhed fungerede som et værktøj til vaskemiddel fjernelse, buffer exchange, protein fordøjelse og peptid eluering med evnen til at bevare høj molekylvægt stoffer (proteiner og DNA), der ellers ville forstyrre efterfølgende peptid adskillelse 21. kort, prøven blev blandet med urea-holdige buffer og indlæst på enheden spin filteret med spinning trin som iodoacetamide løsning, trypsin løsning og natriumchlorid løsning (eluering) blev senere tilføjet. Endelige filtratet, der indeholdt fordøjet peptider var syrnet af TFA, afsaltes og gemt for massespektrometri analyse. Du bruger denne metode, men hovedparten af udfældet saccharose støt akkumuleret på toppen af filteret, gengivelse centrifugeringen og vaske trin vanskeligt.
Acetone nedbør og chloroform/methanol nedbør, flere bind af opløsningsmidler var nødvendige for at udfælde proteiner fra en enkelt volumen af prøven. Denne begrænsede størrelse af sample volumen anvendes når nedbøren blev udført i 1,5 mL rør (protein lav-opbevaring rør). Samt, den tyktflydende slam af saccharose akkumuleret i bunden af rør efter nedbør for begge metoder og der var ingen synlige pellets nederst tube og på den flydende interface efter acetone nedbør og chloroform/methanol nedbør, henholdsvis.
Tabel 3 og figur 7 viser sammenligningen af fire protein udvindingsmetoder vi bruges til at optimere vores eksperimentelle arbejdsproces. De røde tal på hver metode (figur 7) repræsenterer antallet af proteiner, der blev identificeret ved massespektrometri (Se afsnit 5.2 og 5.3). Selv om prøven mængder anvendes for hver metode var forskellige, resulterede chloroform/methanol og TCA nedbør i højeste antal proteiner identificeret. Men på grund af ulemperne nævnt ovenfor (sample volumen begrænsning og saccharose nedbør), vi har valgt for TCA nedbør for efterfølgende forsøg.
For at finde de optimale betingelser for prøven forarbejdning, blev TCA nedbør gennemført ved forskellige temperaturer og TCA koncentrationer22,23,24. Dermed, vi udførte en udfældning med 10,7% TCA ved 4 ° C og -20 ° C og yderligere udfældede supernatanter med yderligere 60 µL af TCA (endelige 19,4% TCA) efter pellets blev indsamlet. Dette resulterede i fire pellets, der blev analyseret adskilt af massespektrometri. Desuden gentog vi den hele protokol to gange for at sikre, at resultaterne var reproducerbare. Arbejdsprocessen og antallet af proteiner identificeret i træpiller på både 4 ° C og ved-20 ° C med to gentagne forsøg er vist i figur 7 (tal med rødt). Selv om analysen af pellets fremstillet af gav supernatanter et ekstra antal proteiner (85 og 60 på 4 ° C, 81 og 55 ved-20 ° C); et flertal af proteinerne var allerede identificeret i første pellets og derfor valgte vi for at bruge 10,7% TCA for alle efterfølgende forsøg. Selvom chloroform/methanol nedbør resulterede i et tilsvarende antal proteiner, der er identificeret i forhold til TCA nedbør, vi foretrak TCA nedbør flere fordele: Jeg) lille mængde opløsningsmiddel, der er nødvendige for at udfælde proteiner (60 µL af TCA vs 1,28 mL chloroform/methanol/vand) brug af større stikprøve diskenheder aktiveres, hvis nødvendige mens bekvemt ved hjælp af 1,5 mL rør for nedbør, ii) synlighed pellet tube nederst, og iii) ingen akkumulering af saccharose i løbet nedbør trin.
Trods tilbyde dybdegående funktionelle oplysninger om det translationel land, er en stor ulempe ved denne metode behovet for frisk og stor råvare. Mange undersøgelser har forsøgt at optimere betingelserne ved hjælp af små mængder af celler eller væv, eller Tilføj trin for at øge effektiviteten af uddrager RNA og proteiner25. Stadig, væv fra forskellige dyr under de samme forsøgsbetingelser kunne trækkes sammen, hvis nødvendigt.
Til sidst, denne protokol giver mulighed for simultan analyse af mRNA, miRNA og protein fra fraktioner fra polysome profilering for at studere de regulerende mekanismer involveret i iskæmi/reperfusion. Imidlertid yderligere er studier påkrævet for at se om de oversætte mRNAs er induceret efter iskæmi eller reperfusion og hvis de vil være slukket ved fjernelse af stress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
NIH P01 HL112730 (RAG, JVE), NIH R01 HL132075 (RAG, JVE), Barbra Streisand kvinders Heart Center (RAG, JVE), Dorothy og E. Phillip Lyon stol i molekylær kardiologi (RAG), Erika Glazer begavet stol i kvindens hjertesundhed (JVE) og tjekkiske videnskabsakademi Institutionel støtte RVO: 68081715 (MS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital | Vortech Phamaceuticals | 9373 | for euthansia |
| Heparin | Sagent | 103424 | used in langendorff preparation |
| forceps | Fine Science Tools | 91110-10 | used to hang the heart |
| Langendorff system | Radnoti + home made | n/a | A 'four heart' system consisting of custom blown glass, tubing and water baths |
| NaCl | Sigma | S7653-5KG | Krebs buffer and Sucrose gradient |
| KCl | Sigma | P5405 | Krebs buffer and Lysis buffer |
| KH2PO42 | Sigma | P-5504 | Krebs buffer |
| MgSO4 | Sigma | M7774-500G | Krebs buffer |
| Glucose | Sigma | G5767 | Krebs buffer |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | Krebs buffer |
| Sucrose powder | Sigma | S0389-1KG | Sucrose gradient |
| MgCl2 | Sigma | 208337 | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503-1KG | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| Xylene Cyanole | Sigma | X-4126 | Sucrose gradient |
| Cycloheximide | Sigma-aldrich | 239763 | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| RNaseOUT | Life Technologies | C00019 | RNAse inhibitor for Lysis buffer |
| Igepal CA-360 (NP40) | Sigma | I3021 | Lysis buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail tablets, EDTA free | Roche | 5056489001 | |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | LE-80K | Ultracentrifugation of the gradients |
| Rotor | Beckman | SW41 | Ultracentrifugation of the gradients |
| Biologic LP (pump) | Biorad | 731-8300 | Fractionation of the gradients |
| BioFrac | Biorad | 741-0002 | Fractionation of the gradients |
| Eppendorf RNA/DNA LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL tube | Sigma | Z666513-100EA | Gradient fraction and RNA extraction |
| TRIzol Reagent | Life technologies | AM9738 | RNA extraction |
| Luciferase Control RNA | Promega | L4561 | RNA extraction |
| Chloroform | Fisher Scientific | C606-4 | RNA extraction |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher Scientific | R0551 | RNA extraction |
| Isopropanol | Sigma | I9516 | RNA extraction |
| Ethanol | Sigma | E7023-1L | RNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 170-8891 | Reverse transcription |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 175-5122 | Quantative PCR |
| miRNeasy Micro Kit (50) | Qiagen | 217084 | Kit for total RNA isolation |
| miScript II RT Kit (50) | Qiagen | 218161 | Kit for miRNA reverse transcription |
| miScript Sybr Green PCR Kit (200) | Qiagen | 218073 | Kit for real-time PCR expression analysis of miRNAs |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | For centrifugation of 1.5 mL or 2.0 mL tubes at different temperatures. Max speed - 21130 x g | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | For real-time PCR plate centrifugation at different temperatures. Max speed - 2039 x g | |
| My Cycler Thermal Cycler | Bio-Rad | For reverse transcription | |
| CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | For real-time PCR analysis | |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | For quality control of RNA isolation |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear | Bio-Rad | HSP9641 | For real-time PCR analysis |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-Rad | MSB1001 | For real-time PCR plate sealing |
| Research plus Single-Channel Pipette, Gray; 0.5-10 µL | Eppendorf | UX-24505-02 | For pipetting |
| PIPETMAN Classic Pipets, P20 | Gilson | F123600G | For pipetting |
| PIPETMAN Classic Pipets, P200 | Gilson | F144565 | For pipetting |
| Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 µL | Gilson | 17011782 | For pipetting |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher Scientific | R0551 | Improves total RNA isolation efficiency |
| Posi-Click 1.7 mL Tubes, natural color | Denville | C2170 | RNA isolation and storage; reagent mix |
| Thermal Cycling Tubes -0.2 mL Individual Caps, Standard 0.2 mL tubes with optically | Denville | C18098-4 (1000910) | Reverse transcription reaction |
| Sharp 10 Precision barrier Tips | Denville | P1096-FR | For pipetting |
| Sharp 20 Precision barrier Tips | Denville | P1121 | For pipetting |
| Sharp 200 Precision barrier Tips | Denville | P1122 | For pipetting |
| Tips LTS 1 mL Filter | Rainin | RT-L1000F | For pipetting |
| miScript Primer Assay (200) | Qiagen | (it changes according to the miRNA) | For real-time PCR analysis |
| Gradient Master ver 5.3 Model 108 | BioComp Instruments | For preparation of sucrose gradients | |
| trichloroacetic acid | Sigma Aldrich | T6399 | |
| acetone | Sigma Aldrich | 650501 | |
| Tris hydrochloride | Amresco | M108 | |
| dithiothreitol | Fisher Scientific | BP172 | |
| iodoacetamide | Gbiosciences | RC-150 | |
| sequencing grade modified trypsine, porcine | Promega | V5111 | |
| ammonium bicarbonate | BDH | BDH9206 | |
| formic acid, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A117 | |
| methanol, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A454 | |
| acetonitrile, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A996 | |
| Protein LoBind tubes 0.5 mL | Eppendorf AG | 22431064 | |
| Protein LoBind tubes 1.5 mL | Eppendorf AG | 22431081 | |
| HLB µElution plate 30 µm | Oasis | 186001828BA | |
| SpeedVac concentrator | Thermo Scientific | Savant SPD2010 | |
| sonicator | Qsonica | Oasis180 | |
| centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend micro 21R | |
| LC trap column PepMap 100 C18 | Thermo Scientific | 160454 | |
| LC separation column PepMap RSLC C18 | Thermo Scientific | 164536 | |
| mass spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Elite ion trap mass spectrometer | |
| MSConvert software | ProteoWizard Toolkit | ||
| Sorcerer-SEQUEST software | Sage-N Research, Inc. |
References
- Pourpirali, S., Valacca, C., Merlo, P., Rizza, S., D’Amico, S., Cecconi, F. Prolonged pseudohypoxia targets ambra1 mrna to p-bodies for translational repression. PLoS ONE. 10, e0129750 (2015).
- Andres, A. M., Tucker, K. C., Thomas, A., Taylor, D. J., Sengstock, D., Jahania, S. M., Dabir, R., Pourpirali, S., Brown, J. A., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W., Mentzer, R. M. Jr, Gottlieb, R. A. Mitophagy and mitochondrial biogenesis in atrial tissue of patients undergoing heart surgery with cardiopulmonary bypass. JCI Insight. 2, e89303 (2017).
- Kislinger, T., Cox, B., Kannan, A., Chung, C., Hu, P., Ignatchenko, A., Scott, M. S., Gramolini, A. O., Morris, Q., Hallett, M. T., Rossant, J., Hughes, T. R., Frey, B., Emili, A. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: Combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
- Kren, B. T., Wong, P. Y., Shiota, A., Zhang, X., Zeng, Y., Steer, C. J. Polysome trafficking of transcripts and micrornas in regenerating liver after partial hepatectomy. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, G1181-G1192 (2009).
- Gottlieb, R. A., Pourpirali, S. Lost in translation: Mirnas and mrnas in ischemic preconditioning and ischemia/reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 95, 70-77 (2016).
- Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Lorsch, J. Methods in enzymology. Laboratory methods in enzymology: Rna. Preface. Methods in Enzymology. 530, xxi (2013).
- Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mrnas. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
- He, S. L., Green, R. Polysome analysis of mammalian cells. Methods in Enzymology. 530, 183-192 (2013).
- Molotski, N., Soen, Y. Differential association of micrornas with polysomes reflects distinct strengths of interactions with their mrna targets. RNA. 18, 1612-1623 (2012).
- Maroney, P. A., Yu, Y., Fisher, J., Nilsen, T. W. Evidence that micrornas are associated with translating messenger rnas in human cells. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1102-1107 (2006).
- Paul, P., Chakraborty, A., Sarkar, D., Langthasa, M., Rahman, M., Bari, M., Singha, R. S., Malakar, A. K., Chakraborty, S. Interplay between mirnas and human diseases. Journal of Cellular Physiology. 233, 2007-2018 (2018).
- Rupaimoole, R., Slack, F. J. Microrna therapeutics: Towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 203-222 (2017).
- Nelson, P. T., Hatzigeorgiou, A. G., Mourelatos, Z. Mirnp:Mrna association in polyribosomes in a human neuronal cell line. RNA. 10, 387-394 (2004).
- Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a mirna blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1108-1114 (2006).
- Kim, J., Krichevsky, A., Grad, Y., Hayes, G. D., Kosik, K. S., Church, G. M., Ruvkun, G. Identification of many micrornas that copurify with polyribosomes in mammalian neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 360-365 (2004).
- Androsavich, J. R., Chau, B. N., Bhat, B., Linsley, P. S., Walter, N. G. Disease-linked microrna-21 exhibits drastically reduced mrna binding and silencing activity in healthy mouse liver. RNA. 18, 1510-1526 (2012).
- Kraushar, M. L., Thompson, K., Wijeratne, H. R., Viljetic, B., Sakers, K., Marson, J. W., Kontoyiannis, D. L., Buyske, S., Hart, R. P., Rasin, M. R. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the rna-binding protein hu antigen r. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , E3815-E3824 (2014).
- McClatchy, D. B., Ma, Y., Liu, C., Stein, B. D., Martinez-Bartolome, S., Vasquez, D., Hellberg, K., Shaw, R. J., Yates, J. R. 3rd Pulsed azidohomoalanine labeling in mammals (palm) detects changes in liver-specific lkb1 knockout mice. Journal of Proteome Research. 14, 4815-4822 (2015).
- Schiapparelli, L. M., McClatchy, D. B., Liu, H. H., Sharma, P., Yates, J. R. 3rd, Cline, H. T. Direct detection of biotinylated proteins by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13, 3966-3978 (2014).
- Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6, 359-362 (2009).
- Rajalingam, D., Loftis, C., Xu, J. J., Kumar, T. K. Trichloroacetic acid-induced protein precipitation involves the reversible association of a stable partially structured intermediate. Protein Science. 18, 980-993 (2009).
- Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31, 3573-3579 (2010).
- Sashital, D. G., Greeman, C. A., Lyumkis, D., Potter, C. S., Carragher, B., Williamson, J. R. A combined quantitative mass spectrometry and electron microscopy analysis of ribosomal 30s subunit assembly in e. Coli. Elife. 3, (2014).
- Liang, S., Bellato, H. M., Lorent, J., Lupinacci, F. C. S., Oertlin, C., van Hoef, V., Andrade, V. P., Roffé, M., Masvidal, L., Hajj, G. N. M., Larsson, O. Polysome-profiling in small tissue samples. Nucleic Acids Research. 46, e3 (2018).
