Summary
Aquí presentamos un protocolo para realizar polysome perfilado en el corazón de ratón perfundido aislado. Se describen métodos para la perfusión del corazón, polysome perfiles y análisis de las fracciones polysome mRNAs, miRNAs y el proteoma polysome.
Abstract
Estudios en cambios dinámicos en la traducción de la proteína requieren métodos especializados. Aquí examinamos cambios en las proteínas recién sintetizadas en respuesta a la isquemia y reperfusión con el corazón de ratón perfundido aislado juntado con perfiles polysome. Para entender más los cambios dinámicos en la traducción de la proteína, caracteriza los mRNAs que fueron cargados con los ribosomas citosólicas (Polirribosomas o polisomas) mitocondriales polisomas se recuperó y en comparación con la distribución de mRNA y proteína en la fracciones de alta eficiencia (numerosos ribosomas ARNm), baja eficiencia (menos ribosomas) mitocondriales polisomas, y las fracciones no traducir. también puede asociar miRNAs mRNAs que se están traduciendo, reduciendo así la eficiencia de la traducción, examinamos la distribución de los miRNAs a través de las fracciones. La distribución de proteínas, mRNAs y miRNAs fue examinada bajo condiciones perfusión basals, al final de 30 minutos de isquemia global sin flujo y después de 30 minutos de la reperfusión. Aquí presentamos los métodos utilizados para llevar a cabo este análisis, en particular, el enfoque de optimización de la extracción de la proteína de la gradiente de sacarosa, ya que esto no se ha descrito antes y algunos resultados representativos.
Introduction
El corazón responde a la lesión de isquemia (I) y (R) la reperfusión de manera dinámica. Sin embargo, hay poca penetración en cambios agudos en la síntesis de proteínas durante la respuesta. Para abordar esto, aprovechamos el método bien establecido de polysome perfiles1 para identificar los cambios en la abundancia de proteínas que reflejan la redistribución de los ribosomas y factores reguladores traslacionales de cytosol a polisomas, y la aumento de las proteínas recién sintetizadas (NSPs). En el marco de I / R, el aumento en la síntesis de proteínas nuevas se produce en un marco de tiempo que es inconsistente con la transcripción de mRNAs nuevo2; Además, la discordancia entre los niveles de expresión de mRNA y proteína abundancia ha sido reportado3. Por estas razones, hemos optado por analizar los cambios en el proteoma dinámico como se refleja por la traducción de proteínas. Para ello, cuantificar el mRNA en las fracciones polysome y analizar la composición de la proteína en las fracciones polysome. Por último, porque microRNAs (miRs) regulan la disponibilidad de los mRNAs para la traducción y puede interferir con la eficacia de la proteína traducción4,5, examinamos la distribución de miRs en las fracciones polysome, centrándose en la respuesta a me / r.
Optamos por utilizar el modelo de perfusión en ratones aislados Langendorff y tejido cosechada bajo condiciones basales de perfusión continua, después de isquemia caudal global de 30 minutos y después de 30 min de isquemia seguida de 30 minutos de la reperfusión. A continuación solubilizado el tejido del corazón y separa polisomas sobre un gradiente de sacarosa, seguido del análisis proteómico y detección selectiva de mRNAs y miRNAs mediante PCR y microarrays, respectivamente. Esta combinación de métodos representa un enfoque poderoso para entender el proteoma dinámico, que permite la detección simultánea de MARN, miRNA y NSPs, así como la redistribución de las proteínas reguladoras, miRNA y mRNA entre fracciones de nontranslating, baja eficiencia polisomas y polisomas de alta eficiencia (ver figura 1). Penetraciones en la regulación dinámica de este proceso se extenderá por más análisis de la fosforilación de factores reguladores claves eIF2α como mTOR. Continuación se describen estos pasos individuales en detalle.
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Protocol
Todos los estudios en animales fueron realizados de acuerdo con las directrices y aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité uso de Cedars-Sinai Medical Center.
1. Langendorff perfusión del corazón de ratón
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Langendorff perfusión del corazón de ratón con isquemia y reperfusión
- Administración intraperitoneal pentobarbital de sodio 70 mg/kg para el ratón adulto (8 semanas de edad, varón, C57BL6/j). Confirmar la anestesia profunda por falta de retiro a los pies, pizca.
- Anticoagulate con heparina intraperitoneal 500 U/kg.
- Abre el cofre por medio de incisión esternal. Abrir el diafragma y corte a lo largo del borde costero al eje axilar anterior. Cortan el eje axilar anterior hasta la extremidad delantera para abrir completamente la caja torácica. Después, visualizando el corazón, abrazadera de la aorta ascendente con pinzas y suprimir rápidamente el corazón. La muerte es por exsanguinación. Coloque el corazón en frío Krebs (NaCl 6,9 g/L, KCl 0,35 g/L, NaHCO3 2,1 g/L, KH2PO4 0.16 g/L, MgSO4 0,141 g/L, glucosa 2 g/L y CaCl2 0,373 g/L).
- Canule la aorta con una aguja de punta Roma y perfusión del corazón retrogradely con solución de Krebs en el modo de presión constante.
- Después de un período de estabilización de 15 minutos, someter el corazón a una isquemia global del caudal durante 30 min seguido de reperfusión durante 30 minutos.
- Cosecha de corazones después de 15 min de la perfusión basal, después de 30 min de isquemia o después de 30 min de reperfusión. Recorte de las aurículas y rápido-congele el tejido en nitrógeno líquido.
- Almacenar a-80 ° C hasta su uso
2. tejido homogeneización, solubilidad y densidad de sacarosa gradiente sedimentación
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Preparación de gradiente
- Preparar 2 soluciones (15% y 50%) de sacarosa 100 mL, mezclar 4 mL de NaCl 2.5 M;
0,8 mL MgCl2 1,25 M; 1 mL de Tris-HCl 1 M, pH 7,5; 15 g o 50 g de sacarosa (15% y el 50%, respectivamente); agua ultrapura para llegar a 100 mL; y xileno cyanol (0,02 mg/mL) a la solución de 15% de color - Filtrar cada solución (filtros de 0,22 μm)
- El día que el gradiente debe ser utilizado, preparar 40 mL de cada solución de sacarosa y añadir cicloheximida al alcanzar la concentración final de 100 μg/mL de cada solución
- Utilizar un gradiente maker para preparar una mezcla entre las soluciones de sacarosa de 15% y 50%
- Llene el compartimiento izquierdo con 5 mL de la gradiente de sacarosa al 15%
- Llene el compartimiento derecho con el gradiente de sacarosa al 50%
- Abrir el grifo y encienda la bomba para remover los dos pequeños compartimientos con agitador magnético
- Uso un tubo relacionado con la segunda llave para permitir que la solución de sacarosa mezclada de flujo en un tubo de ultra centrifugación con paredes delgadas. Volumen final será aproximadamente de 10 mL.
- Mantener los gradientes a 4 ° C (durante la noche si es necesario, pero no más de largo)
- Preparar 2 soluciones (15% y 50%) de sacarosa 100 mL, mezclar 4 mL de NaCl 2.5 M;
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Homogeneización del tejido cardíaco
- Homogeneizar el corazón fresco o congelado con un polytron en tampón de lisis filtrada (modificado para el fraccionamiento de gradiente de sacarosa) contiene 100 mM KCl, 20 mM Tris, pH 7,5, 5 mM de MgCl2, 0,4% NP-40. Incluyen la cicloheximida 100 μg/mL para mantener la estructura polysome, inhibidor de Rnasa de U 0,1 y coctel inhibidor de la proteasa (1 tableta de 50 mL).
- Incubar el lisado de hielo por 15 minutos.
- Centrifugue a 18.000 x g durante 15 min a 4 ° C para eliminar el material insoluble y recoger el sobrenadante.
- Reserva 50 μL para la determinación de proteínas, aislamiento de RNA y RNA integridad análisis (ver figura 2).
- El sobrenadante (500 – 100 μL) de la capa en la parte superior los gradientes y balancear los tubos con tampón de lisis.
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Sedimentación y colección de fracciones
- Realizar ultracentrifugación durante 120 min a 37.000 rpm a 4 ° C en un rotor que hace pivotar del cubo. Según el fabricante, esto corresponde a 228.000 x g en radio máxima.
- Recoger cada gradiente como 17 fracciones (fracción de alrededor de 600 μL) en tubos de microcentrífuga con monitorización continua de la absorbancia a 254 nm (OD254).
- Programa el colector de fracciones como sigue:
- Deseche los primeros 3 minutos de colección (correspondiente al líquido contenido en los tubos antes de la pendiente)
- De 4 a 19 min, se recogerán las fracciones a la velocidad de 1 mL/min en 17 fracciones.
- Coloca las fracciones en el hielo tan pronto como cada uno se recoge. Congelar las muestras a-80 ° C, si ellos no se procesan inmediatamente. Un típico seguimiento densitométrico UV del gradiente que se recoge se muestra en la figura 1.
3. aislamiento y análisis de los mRNAs de Polysome y fracciones Nontranslating
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Extracción de ARNm
- Descongelar las fracciones en el hielo, si fueran flash-congeladas después de la recolección
- Transfiera 200 μL de cada fracción a un tubo nuevo
Nota: En este paso, dos o más fracciones consecutivas pueden ser agrupados juntos. Se debe hacer cuidadosamente después de analizar el gráfico de254 de OD por lo que no se mezclan fracciones polysome y no polysome. - Añadir 10 ng de luciferase RNA como control interno para cada muestra de propósito de la normalización.
Nota: Cartillas de Luciferase deben utilizarse como un control interno para normalizar los resultados. - Agregar 700 μl del reactivo de extracción de RNA (solución monofásica de fenol con isotiocianato de guanidina; véase Tabla de materiales) a cada tubo. Mezclar bien e incubar los tubos por 5 min a TA (temperatura ambiente).
- Añadir 140 μl cloroformo y vortex por 15 s. Incubar durante 2-3 min a TA.
- Centrifugar las muestras durante 15 min a 12.000 x g a 4 ° C.
- Cuidadosamente transferir la fase acuosa superior a un tubo nuevo.
- Puesto que el contenido de RNA de las fracciones no es alto, añadir 10 μg de glucógeno como portador a cada tubo.
- Añadir 350 μl isopropanol a cada tubo. Mezclar bien e incubar a-20 ° C durante 1 hora aumentar el rendimiento.
- Centrifugar 15 min a 12.000 x g a 4 ° C.
- Deseche el sobrenadante y añadir etanol μl 700 75% para lavar el pellet de RNA.
- Centrifugar durante 5 min a 7.500 x g a 4 ° C.
- Eliminar el etanol y Airee el pellet seco durante 10-15 minutos.
Nota: Sobre-secar el pellet de RNA evitará su solubilidad completa en agua. - Resuspender el precipitado de RNA en 50 μL de ARNasa-libre ultrapuro H2O.
- Incubar las muestras durante 10 min a 55 ° C.
- Utilice 2 μL de cada muestra para medir la calidad y cantidad del ARN extraído y guarde el resto a-80 ° C.
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QPCR y reversa de la transcripción
- Utilizar 4 μL de cDNA síntesis de transcripción reversa kit (véase Tabla de materiales) para una reacción de 20 μL. Preparar el supermix según el número de muestras. Transferir el volumen requerido a cada tubo y añadir 5 μL de la entrada de RNA a cada tubo. Este volumen puede ser corregido para ser relevantes para la gama de las condiciones de trabajo de Taq polimerasa.
- Incubar los tubos en un termociclador con el siguiente programa recomendado por el fabricante: 5 min a 25 ° C, transcripción reversa de 20 min por 20 min a 46 ° C y la inactivación de la transcriptasa reversa durante 1 min a 95 ° C.
- Ejecute qPCR con el programa optimizado para cada par de primers.
Nota: Para detectar la presencia de ciertos mRNAs en fracciones, igual volumen de cada fracción (del ARN aislado) puede usarse para reversa de la transcripción.
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Análisis de los resultados
- Utilizar el valor de Ct de gene del interesado y la luciferasa para calcular los valores de Ct de delta
- Expresar cada delta fracción valor Ct como el porcentaje del valor total de mRNA dentro de todas las fracciones para visualizar la distribución del mRNA a través de las diferentes fracciones (tabla 1)
4. aislamiento y análisis de los miRNAs de Polysome fracciones y fracciones Nontranslating
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Extracción de ARNm y miRNA
Nota: Este protocolo sigue las instrucciones del fabricante, con algunos cambios.- Descongelar el glucógeno y el punto de control. Mantener en hielo.
- Agregar 700 μl del reactivo de extracción de miRNA a 200 μL de la muestra combinada.
- Añadir 1 μg/μl de glucógeno y homogeneizarla con la pipeta. Incubar por 5 min a temperatura ambiente.
- Añadir 3,5 μl de 1.6 x 108 spike en el control y se mezcla.
- Añadir 200 μL de cloroformo y agitar durante al menos 15 segundos.
- Incubar 3 min a temperatura ambiente.
- Centrifugar a 12.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
- Usando una pipeta, transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 mL. Deseche las fases media y final.
- Añadir 1,5 volumen x de etanol 100% al sobrenadante y se mezcla.
- Transferencia de 700 μl de esta mezcla a la columna de extracción de miRNA y centrifugar a máxima velocidad por 15 s en RT y descartar el paso; Repita este paso con cualquier muestra restante.
- Agregar 700 μl de tampón 1 a la columna y centrifugar a máxima velocidad por 15 s en RT; Deseche el flujo a través.
- Añadir 500 μl de tampón 2 a la columna y centrifugar a máxima velocidad por 15 s en RT; Deseche el flujo a través.
- Añadir 500 μl de etanol al 80% a la columna y centrifugar a máxima velocidad durante 2 min a temperatura ambiente; Deseche el flujo a través.
- Transferencia de la columna para un nuevo 2 mL destapado del tubo, abra la tapa y centrifugar a temperatura ambiente durante 5 minutos a toda velocidad; Deseche el flujo a través.
- Añadir 16 μl de agua libre de ARNasa a la columna y centrifugar a máxima velocidad durante 1 min a RT. Mantenga el efluente en el hielo o almacenar a-80 ° C para futuros análisis.
Nota: Dos microlitros de cada muestra pueden utilizarse para el análisis de OD.
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Transcripción reversa
- Preparar en el hielo. Para cada reacción de RT-PCR de 20 μl, añadir 4 μL del buffer de RT de miRNA, 2 μl de ácidos nucleicos, 9 μl de RNA total, 2 μl de enzima y 3 μl de agua libre de ARNasa; mézclelo y desactivación brevemente.
- Establecidas en el termociclador:
37 ° C por 60 minutos;
95 ° C por 5 min;
4 ° C se mantenga. - Saque los tubos en el termociclador y añadir 200 μL de agua libre de ARNasa. Almacenar a-20 ° C o proceder a la PCR en tiempo real.
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PCR en tiempo real
Nota: Este protocolo sigue 96 placa bien. Preparar la mezcla de reacción sobre hielo.- Preparar la mezcla de reacción de PCR y añadir cDNA (de miRNAs arriba) según el rango aceptado por el protocolo. Reacciones múltiples se pueden preparar en lote.
- Agregar un total de 25 μl de la mezcla PCR + cDNA en cada pozo.
- Selle la placa con un sello de placa óptica.
- Centrifugar la placa durante 1 min a 1.000 x g a temperatura ambiente.
- Programa de la cycler en tiempo real como sigue:
Paso de la activación inicial a 95 ° C durante 15 min;
Paso 3 ciclo: desnaturalización a 94 ° C por 15 s; recocido a 55 ° C por 30 s; extensión a 70 ° C para 30 s (realizar la recopilación de datos de fluorescencia); Añadir 40 ciclos;
Curva de fusión según defecto cycler.
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Análisis comparativo
- Ejemplo de normalización (ver tabla 2):
- Encontrar el valor mínimo de SCM.
- Normalizar todos los valores de la SCM a este mínimo.
- Restar este valor de los valores de Ct de miRNAs de interés (MOI) y el gene de la referencia (REF).
- Analizar los datos utilizando la fórmula 2-ΔCt .
- Ejemplo de normalización (ver tabla 2):
5. análisis proteómico de
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Extracción de proteínas de fracciones polysome
- Combinar fracciones sacarosa recogidos en tres fracciones finales. Marcar las fracciones como pesado (polisomas de alta eficiencia en los fracciones 4, 5, 6 y 7 con la mayor concentración de sacarosa, parte inferior del tubo del gradiente), luz (polisomas de baja eficiencia en la fracción combinada 8, 9, 10 y 11; media de la tubo de gradiente) y no traducir (fracciones combinados 12, 13, 14 y 15 con la menor concentración de sacarosa, parte superior del tubo del gradiente). Realizar análisis de proteína en fracciones agrupadas.
- Preparar 100% stock de ácido tricloroacético (TCA) y almacenar a 4 ° C en oscuridad. Mezclar 0,5 mL de la muestra con 60 μL de 100% TCA e incubar a-20 ° C durante la noche en la oscuridad.
Nota: Use tubos de retención de proteína baja 1,5 mL (véase Tabla de materiales). - Después de la incubación durante la noche, descongelar la muestra en hielo y centrifugue a 15.000 x g, 4 ° C por 30 min descartar sobrenadante.
Nota: 100 μg de proteínas totales en muestra da pellet proteína visible en la parte inferior del tubo. - Pre-enfriar acetona en congelador de-20 ° C. Añadir 0.5 mL de acetona fría a la pelotilla de la proteína y centrifugar a 15.000 x g, 4 ° C por 15 minutos descartar sobrenadante. Repita este paso dos veces.
- Secar el pellet. Resuspender el precipitado en 360 μl de tampón de Tris-HCl 50 mM (pH 8).
Nota: Si es necesario, utilice un sonicador de pulso para Resuspender el precipitado. - Agregar 40 μl de 0,1 M dithiothreitol (concentración final 10 mM) e incubar a 55 º C en agitador para 45 min añadir 50 μl de solución 0,15 M Yodoacetamida (concentración final 17 mM) e incubar a temperatura ambiente en un agitador durante 30 minutos en oscuridad.
- Preparar la solución de tripsina: 20 μg de la tripsina de resuspender en 100 μl 50 mM de bicarbonato de amonio. Añadir volumen correspondiente de solución de tripsina a la muestra a 1:50 (w/w) tripsina: relación, asegúrese de que el pH es 8 e incubar en agitador a 37 ° C durante la noche.
Nota: Agregar bicarbonato de amonio de 1 M para llevar el pH a 8. - Después de la digestión de la tripsina, enfriar la muestra, centrifugar brevemente en centrífuga de banco, Añadir ácido fórmico al 10% a pH 2-3 para apagar la actividad de la tripsina y proceder con la muestra de la desalación.
Nota: Use placa μ-elución para muestra de la desalación. - Condición del sorbente en los pozos de 96 placa bien con 200 μL de metanol mediante vacío tres veces seguido por acondicionado 200 μL de ácido fórmico de 0.1% tres veces. Muestra la carga y realizar un lavado de la muestra con 200 μL de ácido fórmico de 0.1% tres veces. Eluir la muestra con 100 μl de ácido fórmico de 50% acetonitrile/0.1% dos veces en el tubo de 0,5 mL de retención baja en proteínas.
Nota: Eluir la muestra lentamente en un principio usando gravitación seguidas de bajo vacío. - Evaporar muestra eluyente hasta la sequedad utilizando concentrador y o directamente llevar a cabo análisis de espectrometría de masas o tienda a-80 ° C hasta su uso.
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Análisis de espectrometría de masas
- Reconstituir cada pellet (consistiendo en los péptidos trípticos) en 50 – 100 μl e inyectar 1 μl de espectrómetro de masas.
Nota: Optimizar la reconstitución y la inyección de volúmenes para obtener intensidad máxima LC/MS/MS de la señal. En nuestro caso, la señal máxima (total actual del ion; TIC) en el corazón de la exploración estaba en gama de 1E8 a 2E9. - Utilizar una trampa columna C18 (300 μm i.d. x 5 mm, 5 μm, 100Å) seguido por la separación de péptidos mediante columna C18 (75 μm i.d. x 250 mm, 2 μm, 100Å) con un ajuste de la tasa de flujo en conjunto la temperatura capilar nano-fuente de 300 nL/min a 275 ° C y la tensión de aerosol a 2 kV.
- Aplicar un degradado lineal de 5 – 35% B por 90 min, B 35 – 95% por 3 min, en 95% B por 7 min y equilibrar a 5% B durante 25 minutos (r: 0,1% ácido fórmico/agua y B: 0,1% ácido fórmico en acetonitrilo). Adquirir espectros MS2 para los 15 iones de intensidad más alto de cada exploración de MS1 usando modo de CID. Espectrometría de masas en uso 3 réplicas por cada muestra analizada.
Nota: Optimizar y utilizar las condiciones experimentales y los parámetros que son adecuados para sus muestras en el instrumento particular espectrometría de masas. Los condiciones/parámetros mencionados en la sección 5.2. fueron utilizados y optimizados en nuestro laboratorio.
- Reconstituir cada pellet (consistiendo en los péptidos trípticos) en 50 – 100 μl e inyectar 1 μl de espectrómetro de masas.
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Identificación/cuantificación de proteína
- Tras el análisis de espectrometría de masas, convertir el crudo espectros mzXML compatible utilizando el software de MSConvert (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html).
- Enviar los archivos convertidos en motor de búsqueda SEQUEST con los criterios de búsqueda, por ejemplo, UniProtKB/Swiss-Prot ratón base de datos (más actualizada canónico revisado); digerir la enzima utilizando tripsina (después de KR /-); con 2 divisiones perdidas; gama total de precursor: 400 a 4.500 amu; modificación estática: carbamidomethyl (C) 57,021465 amu; tolerancia de masa de péptidos: 50 ppm; fragmento de masa tipo: monoisotopic.
Nota: Pueden utilizar otra proteína base de datos búsqueda motores y datos de tuberías. Si utiliza la base de datos para por ejemplo, la rata, que es menos completa que las bases de datos para el ratón y humanos, puede que necesite buscar contra el ratón (o humanos) bases de datos para aumentar la cobertura del proteoma. En este caso, redundancia en los nombres de proteína tendrá que eliminarse. - Realizar un análisis de la búsqueda. Establezca los filtros para ver los datos. Por ejemplo, establecer una probabilidad de proteína mínimo (umbral de proteína) como el 95% o 99%, es decir, se mostrará sólo las proteínas para que un análisis estadístico implica 95% o 99% de probabilidad de estar presente en la muestra. Establecer el filtro umbral del péptido (por ejemplo, 95%), es decir, una probabilidad mínima que se utilizará en la determinación de si un espectro identifica un péptido. Seleccionar el número mínimo de péptidos que van a determinar si una proteína está presente (se recomienda 2 péptidos como mínimo para identificación de proteínas).
- Evaluar las proteínas identificadas por calidad/cantidad. Garantizar que los péptidos proteotypic se utilizan para la cuantificación. Si se identifica isoforma asegurar es base en la observación de un péptido tríptico conformado por una secuencia de aminoácidos única para la isoforma específica. Cualquier proteínas "similares" o hipotéticas deben someterse a la comparación para ver si los péptidos que corresponden a una proteína conocida.
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Representative Results
Análisis del mRNA
resultados de mRNA se pueden expresar como una distribución de un determinado mRNA en cada fracción (Figura 3A); para la cuantificación, combinar fracciones traducción polyribosomal y comparar a la fracción no traducir (figura 3B), presentando un cociente de abundancia del mRNA en la traducción de fracciones nontranslating. Información adicional es obtenida mediante el examen de las fracciones de alta eficiencia polysome por separado de las fracciones de baja eficiencia polysome (e independiente de fracciones nontranslating). Esto es particularmente importante cuando se analizan los miRNAs, que son enriquecidas en las fracciones de baja eficiencia (donde interfieren con la traducción de la proteína de sus mRNAs de destino).
Representante de resultados para un determinado mRNA que cambios en su distribución a través de las fracciones de traducir y nontranslating después de que los corazones de ratón fueron sometidos a isquemia y reperfusión/isquemia en comparación con el tratamiento simulado se muestran en la figura 4.
Análisis de matriz de miRNA
Resultados representativos de un análisis de la matriz de miRNA se muestran en la figura 5. Aquí, un subconjunto de miRNAs (placa de matriz de diseño personalizado) se analizaron las fracciones pesadas agrupadas indicando que 22 miRNAs se asociaron con polisomas durante isquemia, 9 miRNas durante isquemia y reperfusión, con 7 que eran comunes a ambas condiciones. Esto demuestra que la Asociación de miRNAs es dinámica en respuesta a las tensiones de la isquemia y reperfusión.
Análisis proteómico
Análisis de las fracciones pesadas, ligeras y no traducir de muestra simulada (control):
881 de las proteínas totales fueron identificados por espectrometría de masas; 3, proteínas de 46 y 208 del total eran únicas a fracciones pesadas, la luz y no trans, respectivamente (figura 6A). La mayoría (88%) de proteínas ribosomales mitocondriales (28S y 39S) fueron identificada en la fracción ligera (36 de 41) y la mayoría (88%) de proteínas ribosomales citosólicas (40S y 60S) fueron identificados comúnmente en fracciones ligeras y pesadas (53 de 60) confirmando la proteómica y la separación eficiente capacidad identificadas vs citosólicas más pesados más ligero proteínas ribosomales mitocondriales. El subconjunto de proteínas ribosomales mitocondriales y citosólicas identificados se muestra en la Figura 6B.
Figura 1: Perfil de absorción UV típico de fracciones polysome en gradiente de sacarosa. Las tres primeras fracciones representan volumen vacío en la tubería. La alta eficiencia (alto peso molecular HMW) fracciones se recogen fracciones 4-7, la baja eficiencia (bajo peso molecular, LMW) fracciones en 8-11 y la traducción (y restante material citosólica) se recoge en (fracciones 12-15 nontranslating, NTR). La línea roja indica la conductividad, y el rastro azul indica la absorbancia UV a 254 nm. A la derecha es una historieta de un tubo de ensayo con sacarosa gradiente, muestra distribución de polisomas después de sedimentación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis de control de integridad de ARN en el equipo Bioanalyzer. Número de integridad de RNA (RIN) de ARN total aislado de todo lisado de corazón. RIN se calcula según picos de 18S y 28S. Rango RIN: 1-10 y RIN = 10 representa una integridad muy buena. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: perfil representativo de la distribución de mRNA en gradiente de sacarosa de. Corazones fueron sometidos a perfusión basal de Langendorff o isquemia y reperfusión (me / R). (A) corazón lisados se resolvieron en gradiente de sacarosa y el contenido de ARNm de GAPDH (izquierda) y COX4 (derecha) se determinaron en cada fracción. Abundancia relativa de ARNm en cada fracción (número de fracción en eje x) muestra la perfusión basal (sham, línea roja y diamantes) y la isquemia/reperfusión (me / R, línea azul y plazas). Superpuesta a la trama son absorbancia UV indicando contenido total mRNA (curva gris clara) y conductancia (recto gris línea inclinada). Cajas de indican cómo se combinaron los fracciones. (B) diagrama de gráfico de barras muestra el cociente de abundancia del mRNA en la traducción de fracciones (polisomas) vs de nontranslating (NT) de GAPDH (izquierda) y COX4 mRNAs (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: resultados de mRNA representante. Cuantificación de un mRNA en las fracciones agrupados (APM, LMW, NTR) que cambia según el grupo experimental. Fraccionamiento polysome de corazones de ratón fue realizada después de la perfusión de Langendorff. Resultados se trazan como % del total mRNA (panel superior) y como relación de polisomas (APM + BPM) a fracción nontranslating (NTR). Barras de error representan resultados de 5 corazones por grupo (sham, isquemia o / R). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: resultados de miRNA representante. Diagrama de Venn de una vía enfocado análisis de miRNA mostrando y dando miRNAs en piscinas de la fracción pesada de muestras de ratones después de corazón isquemia o isquemia y reperfusión. Valor de corte: 1,5 veces. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: proteínas identificadas por espectrometría de masas. (A) diagrama de Venn de las proteínas comunes y únicas para fracciones pesadas, luz y no-trans. (B) subconjunto de proteínas ribosomales mitocondriales y citosólicas identificadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: esquema flujos de trabajo para los métodos de extracción de la proteína prueban. Los métodos de extracción de proteína fueron probados mediante muestra de sham (control) y pesados (polisomas de alta eficiencia) fracción con mayor contenido de sacarosa. Números en rojo indican el número de proteínas que fueron identificados por espectrometría de masas; donde se muestran dos números, son de dos experimentos independientes. La descripción detallada se indica en el texto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| FRACCIONES | Ct del gen | LUCIFERASE Ct | ΔCt | 2ΔCt | SUMA DE TODAS FRACCIONES | % DE CADA FRACCIÓN | Relación polysome/NTR |
| Alta eficiencia (APM) | 28.75 | 22.79 | 5,96 | 0.016 | 0.046 | 34.64 | 2.77 |
| Baja eficiencia (LMW) | 28.43 | 22.63 | 5.80 | 0.018 | 38.81 | ||
| No traducir (NTR) | 29.12 | 22.77 | 6.35 | 0.012 | 26.55 | ||
| Relación polysome/NTR = (APM + BPM) / NTR |
Tabla 1: Muestra el análisis del mRNA. Método de análisis de un mRNA se muestra las diferentes fracciones agrupadas (APM, LMW, NTR) después de la PCR cuantitativa. ΔCt = gen Ct - luciferase Ct, y el 2ΔCt 2ΔCt.
| Encontrar el valor mínimo de SCM: 22.77 | |||
| Muestra 1 | Muestra 2 | Muestra 3 | |
| CT MOI | 22.92 | 22.36 | 22.58 |
| TAC SCM | 22.81 | 22.77 | 22.9 |
| CT REF | 23.27 | 23.55 | 23.19 |
| Normalizar todos los valores de la SCM a este mínimo | |||
| Muestra 1 | Muestra 2 | Muestra 3 | |
| TAC SCM | 0.05 | 0 | 0.13 |
| Restar los valores de los valores de Ct de MOI y REF | |||
| Muestra 1 | Muestra 2 | Muestra 3 | |
| CT MOI | 22.87 | 22.36 | 22.45 |
| CT REF | 23.22 | 23.55 | 23.06 |
Tabla 2: muestra el cálculo en tiempo real de PCR para la comparación de expresión de miRNA en polysome y fracciones nontranslating. miRNAs de interés (MOI) y el gene de la referencia (REF) se analizaron las fracciones pesadas agrupadas de ratones después de isquemia o isquemia/reperfusión. El Ct valores primero se normalizaron al espiga en el control valor de Ct (SCM), entonces la fórmula del 2-ΔCt fue utilizado para comparar la expresión de miRNA.
| Método | Volumen de muestra [mL] | número de proteínas identificadas | Comentarios |
| FASP | 1 | 227 | a granel de sacarosa precipitado en el filtro |
| precipitación de acetona | 0.6 | 372 | lodos viscosos de sacarosa en la parte inferior del tubo; volúmenes de reactivo: 4:1 (muestra); ningún pellet accesibles de proteína |
| precipitación de Cloroformo/metanol | 0.32 | 389 | lodos viscosos de sacarosa en la parte inferior del tubo; volúmenes de reactivo: 8:1 (muestra); ningún pellet accesibles de proteína |
| Precipitación de la TCA (a 4 ° C) | 0.5 | 405, 415 | ninguna precipitación de sacarosa; 0.12:1 (reactivos: muestra) volúmenes; pelotilla visible en la parte inferior del tubo |
| la precipitación | 85, 60 | precipitación de TCA adicional del sobrenadante después de pellets de primera se colectó | |
| Precipitación de la TCA (a-20 ° C) | 0.5 | 440, 430 | ninguna precipitación de sacarosa; 0.12:1 (reactivos: muestra) volúmenes; pelotilla visible en la parte inferior del tubo |
| la precipitación | 81, 55 | precipitación de TCA adicional del sobrenadante después de pellets de primera se colectó |
Tabla 3: Comparación de métodos de extracción de proteína. FASP, precipitación de acetona, Cloroformo/metanol precipitaciones y precipitación de TCA a 4 ° C y -20 ° C fueron evaluados. El objetivo era maximizar el número de proteínas identificadas. Las precipitaciones de los TCA fueron evaluadas en un segundo lote de material para confirmar la reproducibilidad.
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Discussion
Polysome perfil análisis permite el estudio de la traducción de proteínas mediante el análisis del estado traslacional de un mARN específico o el transcriptoma conjunto6,7. También es de gran ayuda cuando traducción local debe estudiarse como sinaptosomas8. Tradicionalmente, este método implica la separación de mono - y Polirribosomas y los mRNAs asociados a un gradiente de sacarosa que podría acoplarse con genómica o proteómica técnicas para obtener los resultados esperados6,9. Por ejemplo, un estudio reciente realizado por nuestro grupo ha revelado un mecanismo de regulación postranscripcional en el corazón de pacientes sometidos a CEC, que mímico isquemia/reperfusión. Del análisis del perfil de polysome aprovechando, hemos demostrado un aumento en la traducción de nuclear codificado proteínas mitocondriales de corazón después de CPB procedimiento2.
Proteoma dinámico polyribosomal perfilado lo presentado aquí puede revelar cambios en la población de mRNAs asociados con Polirribosomas y las proteínas que están siendo activamente. Como traducción de los mRNAs se rige en parte por miRNAs, análisis de miRNAs en estas fracciones pueden revelar perspectivas adicionales. De hecho, varios estudios han modificado este método y demostró ser un método conveniente y confiable para investigar el modo de miRNA de regulación10,11.
Muchos estudios se han realizado en la última década adentrarse en el papel de los miRNAs, considerando su importancia en diversas funciones biológicas12,13. Puesto miRNAs actúan a través de la base-que se aparea con contraparte mRNAs para marcarlos para su degradación, análisis del perfil de polysome ha sido realizado y demostrado que los miRNAs de hecho se encuentran en las fracciones polysome, dirigido a la traducción de mRNAs14, 15 , 16. miR-21 es un buen ejemplo donde se asocia una represión bajo y débiles polisomas vinculantes en las células normales, mientras que en las células de cáncer, la asociación con polisomas se incrementa y el efecto represivo es mucho más fuerte17.
En este estudio, se realizó análisis de PCR en tiempo real utilizando los valores de Ct de los miRNAs de interés (MOI), los valores de Ct de la espiga en miRNA (SCM) para reducir las variaciones de la técnicas y el valor de Ct de un gen de referencia o miRNA (REF) que es estable entre las muestras de control. El primer paso fue normalizar los valores de Ct de la MOI y la referencia a los valores de Ct del SCM. Luego hubo una segunda normalización paso del MOI para el REF y el valor resultante se utilizó para calcular la fórmula del 2-ΔCt . Estos valores o cambio doble puede utilizarse para demostrar diferencias entre los grupos.
Desde la extracción de las proteínas es difícil de fracciones polysome, la mayoría de los estudios realizados hasta ahora, han usado las fracciones directamente por análisis de western blot. Ellos simplemente sedimento el contenido de proteínas de cada fracción y mezcla con SDS carga para análisis de SDS-PAGE8,18. Aquí, hemos desarrollado un método que nos permite no solo Extracto de mRNAs y miRNAs después de fraccionamiento, pero también para la obtención de péptidos y proteínas de alta calidad para continuar con el análisis de espectrometría de masas.
Este enfoque se podría extender más por medir activamente las proteínas recién sintetizadas mediante etiquetado metabólico como homólogo del aminoácido del biorthogonal, como azidohomoalanine (AHA) por metionina19,20. AHA incorporación seguida de química del tecleo permite incorporación de una etiqueta de biotina seguida de estreptavidina purificación de todas las proteínas que incorporan AHA. Esto permite la identificación definitiva de las proteínas recién sintetizadas, la otra parte de la dinámica proteoma. Detección de miRNAs que redistribuir entre las fracciones nontranslating y traducir en respuesta a un estímulo (aquí con me / R) permite el interrogatorio de la regulación dinámica de la traducción de proteínas. Sin embargo, los factores que reclutan miRNAs en la vecindad de ARNm ribosoma-limite permanecen para ser identificado e investigado sistemáticamente.
En nuestro estudio, además de precipitación de TCA, probamos otros tres métodos para la extracción de la proteína de fracciones polysome:21i) FASP (preparación de la muestra con ayuda de filtro), ii) acetona precipitación y precipitación iii) Cloroformo/metanol. Se evaluó la idoneidad de los métodos basados en la capacidad de procesar fracciones con alta concentración de sacarosa (hasta un 50%) y el número de proteínas identificadas por espectrometría de masas (figura 7 y tabla 3).
Método del FASP, siguió el protocolo de preparación de la muestra de un Kit de digestión de proteína FASP que emplean una unidad de ultrafiltración con un atajo de masa molecular relativa de 30 kDa. Esta unidad de filtro sirve como herramienta para la eliminación del detergente, cambio de tampón, digestión de proteínas y elución de péptido con la capacidad para retener sustancias de alto peso molecular (proteínas y ADN) que de lo contrario interferiría con separación posterior del péptido 21. brevemente, la muestra fue mezclada con urea que contiene tampón y cargado en la unidad de filtro de centrifugado con spinning pasos como Yodoacetamida solución, solución de tripsina y cloruro de sodio solución (elución) fueron añadidas posteriormente. Filtrado final que contenía péptidos digeridos se acidifica por TFA, desalada y almacenado para análisis de espectrometría de masas. Usando este método, sin embargo, la mayor parte del precipitado sacarosa constantemente acumulado en la parte superior del filtro, haciendo el centrifugado y lavado pasos difíciles.
Para precipitación de acetona y Cloroformo/metanol precipitación, varios volúmenes de disolventes eran necesarias para precipitar las proteínas de un solo volumen de la muestra. Esto limita el tamaño del volumen de muestra aplicado cuando la precipitación se realiza en tubos de 1,5 mL (tubos de baja retención de proteína). Así, el lodo viscoso de sacarosa acumulada en la parte inferior de los tubos después de la precipitación para ambos métodos y no había gránulos visibles en la parte inferior del tubo y en la interfase líquida después de la precipitación de acetona y Cloroformo/metanol precipitación, respectivamente.
Tabla 3 y figura 7 muestran la comparación de cuatro métodos de extracción de la proteína que sirve para optimizar nuestro flujo de trabajo experimental. Los números rojos en cada método (figura 7) representan el número de proteínas que fueron identificados por espectrometría de masas (ver sección 5.2 y 5.3). Aunque fueron diferentes volúmenes de muestra utilizados para cada método, Cloroformo/metanol y TCA precipitaciones dio lugar a mayor número de proteínas identificadas. Sin embargo, debido a los inconvenientes mencionados anteriormente (limitación de volumen de muestra y precipitación de sacarosa), optamos por precipitación de TCA para experimentos posteriores.
Para encontrar las condiciones óptimas para el procesamiento de la muestra, precipitación de TCA se realizó a diferentes temperaturas y concentraciones de TCA22,23,24. Así, realizamos una precipitación con 10,7% TCA a 4 ° C y -20 ° C y precipitó aún más los sobrenadantes con adicional 60 μL de TCA (final 19,4% TCA) después de pellets fueron recogidos. Esto dio lugar a cuatro pelotillas que se analizaron separados por espectrometría de masas. Además, repetimos el protocolo entero dos veces para asegurar que los resultados obtenidos fueron reproducibles. El flujo de trabajo y el número de proteínas identificadas en las pelotillas en condiciones de 4 ° C y -20 ° C con dos experimentos repetidos se muestran en la figura 7 (números en rojo). Aunque el análisis de los pellets se deriva de los sobrenadantes rindieron un número adicional de las proteínas (85 y 60 a 4 ° C; 81 y 55 a-20 ° C); la mayoría de las proteínas ya se identificaron en pellets primera y por lo tanto, optó por utilizar 10,7% TCA para todos los experimentos posteriores. Precipitación de Cloroformo/metanol resultó en un número similar de proteínas identificadas frente a la precipitación de TCA, hemos preferido precipitación de TCA debido a varias ventajas: i) pequeño volumen de disolvente necesario para precipitar las proteínas (60 μL de TCA vs 1,28 mL de Cloroformo/metanol/agua) que permite el uso de mayores volúmenes de muestra si es necesario mientras que convenientemente usando tubos de 1,5 mL de precipitación, ii) visibilidad de la pelotilla en la parte inferior del tubo y iii) no hay acumulación de sacarosa en pasos de precipitación.
A pesar de ofrecer profundidad información funcional sobre el estado traslacional, un gran inconveniente de este método es la necesidad de materia prima fresca y grande. Muchos estudios han tratado de optimizar las condiciones de con volumen pequeño de células o tejidos o agregar pasos para aumentar la eficiencia de extracción de RNA y proteínas25. Aún así, tejidos procedentes de animales diferentes en las mismas condiciones experimentales podrían ser reunidos, si es necesario.
En conclusión, este protocolo permite el análisis simultáneo de MARN, miRNA y proteína de las fracciones obtenidas de polysome perfiles para estudiar los mecanismos de regulación involucrados en la isquemia/reperfusión. Sin embargo, más se requieren estudios para ver si los traducción de mRNAs son inducidos después de la isquemia o reperfusión y si ellos se desactivará en la eliminación del estrés.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
HL112730 NIH P01 (trapo, JVE), NIH R01 HL132075 (trapo, JVE), centro del corazón de la mujer de Barbra Streisand (trapo, JVE), Dorothy y Phillip Lyon E. Sillón en Cardiología Molecular (GAR), Erika Glazer dotado Cátedra salud del corazón de la mujer (JVE) y la Academia Checa de Ciencias Apoyo institucional RVO: 68081715 (MS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital | Vortech Phamaceuticals | 9373 | for euthansia |
| Heparin | Sagent | 103424 | used in langendorff preparation |
| forceps | Fine Science Tools | 91110-10 | used to hang the heart |
| Langendorff system | Radnoti + home made | n/a | A 'four heart' system consisting of custom blown glass, tubing and water baths |
| NaCl | Sigma | S7653-5KG | Krebs buffer and Sucrose gradient |
| KCl | Sigma | P5405 | Krebs buffer and Lysis buffer |
| KH2PO42 | Sigma | P-5504 | Krebs buffer |
| MgSO4 | Sigma | M7774-500G | Krebs buffer |
| Glucose | Sigma | G5767 | Krebs buffer |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | Krebs buffer |
| Sucrose powder | Sigma | S0389-1KG | Sucrose gradient |
| MgCl2 | Sigma | 208337 | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503-1KG | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| Xylene Cyanole | Sigma | X-4126 | Sucrose gradient |
| Cycloheximide | Sigma-aldrich | 239763 | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| RNaseOUT | Life Technologies | C00019 | RNAse inhibitor for Lysis buffer |
| Igepal CA-360 (NP40) | Sigma | I3021 | Lysis buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail tablets, EDTA free | Roche | 5056489001 | |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | LE-80K | Ultracentrifugation of the gradients |
| Rotor | Beckman | SW41 | Ultracentrifugation of the gradients |
| Biologic LP (pump) | Biorad | 731-8300 | Fractionation of the gradients |
| BioFrac | Biorad | 741-0002 | Fractionation of the gradients |
| Eppendorf RNA/DNA LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL tube | Sigma | Z666513-100EA | Gradient fraction and RNA extraction |
| TRIzol Reagent | Life technologies | AM9738 | RNA extraction |
| Luciferase Control RNA | Promega | L4561 | RNA extraction |
| Chloroform | Fisher Scientific | C606-4 | RNA extraction |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher Scientific | R0551 | RNA extraction |
| Isopropanol | Sigma | I9516 | RNA extraction |
| Ethanol | Sigma | E7023-1L | RNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 170-8891 | Reverse transcription |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 175-5122 | Quantative PCR |
| miRNeasy Micro Kit (50) | Qiagen | 217084 | Kit for total RNA isolation |
| miScript II RT Kit (50) | Qiagen | 218161 | Kit for miRNA reverse transcription |
| miScript Sybr Green PCR Kit (200) | Qiagen | 218073 | Kit for real-time PCR expression analysis of miRNAs |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | For centrifugation of 1.5 mL or 2.0 mL tubes at different temperatures. Max speed - 21130 x g | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | For real-time PCR plate centrifugation at different temperatures. Max speed - 2039 x g | |
| My Cycler Thermal Cycler | Bio-Rad | For reverse transcription | |
| CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | For real-time PCR analysis | |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | For quality control of RNA isolation |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear | Bio-Rad | HSP9641 | For real-time PCR analysis |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-Rad | MSB1001 | For real-time PCR plate sealing |
| Research plus Single-Channel Pipette, Gray; 0.5-10 µL | Eppendorf | UX-24505-02 | For pipetting |
| PIPETMAN Classic Pipets, P20 | Gilson | F123600G | For pipetting |
| PIPETMAN Classic Pipets, P200 | Gilson | F144565 | For pipetting |
| Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 µL | Gilson | 17011782 | For pipetting |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher Scientific | R0551 | Improves total RNA isolation efficiency |
| Posi-Click 1.7 mL Tubes, natural color | Denville | C2170 | RNA isolation and storage; reagent mix |
| Thermal Cycling Tubes -0.2 mL Individual Caps, Standard 0.2 mL tubes with optically | Denville | C18098-4 (1000910) | Reverse transcription reaction |
| Sharp 10 Precision barrier Tips | Denville | P1096-FR | For pipetting |
| Sharp 20 Precision barrier Tips | Denville | P1121 | For pipetting |
| Sharp 200 Precision barrier Tips | Denville | P1122 | For pipetting |
| Tips LTS 1 mL Filter | Rainin | RT-L1000F | For pipetting |
| miScript Primer Assay (200) | Qiagen | (it changes according to the miRNA) | For real-time PCR analysis |
| Gradient Master ver 5.3 Model 108 | BioComp Instruments | For preparation of sucrose gradients | |
| trichloroacetic acid | Sigma Aldrich | T6399 | |
| acetone | Sigma Aldrich | 650501 | |
| Tris hydrochloride | Amresco | M108 | |
| dithiothreitol | Fisher Scientific | BP172 | |
| iodoacetamide | Gbiosciences | RC-150 | |
| sequencing grade modified trypsine, porcine | Promega | V5111 | |
| ammonium bicarbonate | BDH | BDH9206 | |
| formic acid, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A117 | |
| methanol, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A454 | |
| acetonitrile, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A996 | |
| Protein LoBind tubes 0.5 mL | Eppendorf AG | 22431064 | |
| Protein LoBind tubes 1.5 mL | Eppendorf AG | 22431081 | |
| HLB µElution plate 30 µm | Oasis | 186001828BA | |
| SpeedVac concentrator | Thermo Scientific | Savant SPD2010 | |
| sonicator | Qsonica | Oasis180 | |
| centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend micro 21R | |
| LC trap column PepMap 100 C18 | Thermo Scientific | 160454 | |
| LC separation column PepMap RSLC C18 | Thermo Scientific | 164536 | |
| mass spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Elite ion trap mass spectrometer | |
| MSConvert software | ProteoWizard Toolkit | ||
| Sorcerer-SEQUEST software | Sage-N Research, Inc. |
References
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