Summary
نقدم هنا بروتوكولا لأداء polysome التنميط في قلب الماوس perfused معزولة. يصف لنا أساليب للقلب نضح و polysome التنميط والتحليل للكسور بوليسومي فيما يتعلق مرناس وميرناس والبروتين بوليسومي.
Abstract
دراسات في التغيرات الدينامية في ترجمة البروتين تتطلب أساليب متخصصة. هنا قمنا بدراسة التغيرات في البروتينات المركبة حديثا ردا على الاسكيمية وضخه باستخدام القلب معزولة الماوس perfused مقترنة بالتنميط polysome. زيادة فهم التغيرات الدينامية في ترجمة البروتين، نحن تتميز مرناس التي كانت محملة ريبوسوم سيتوسوليك (بوليريبوسوميس أو بوليسوميس) وأيضا استرداد mitochondrial polysomes ومقارنة توزيع مرناً والبروتين في الكسور ذات الكفاءة العالية (ريبوسوم العديدة المرفقة مرناً)، منخفضة الكفاءة (أقل ريبوسوم المرفقة) التي شملت أيضا polysomes الميتوكوندريا، والكسور غير ترجمة. ميرناس يمكنك أيضا إقران مرناس التي يتم ترجمتها، مما يقلل من كفاءة الترجمة، وقمنا بدراسة توزيع ميرناس عبر الكسور. وكان بحث توزيع مرناس، ميرناس، والبروتينات تحت ظروف perfused القاعدية، في نهاية 30 دقيقة عالمية لا التدفق الاسكيمية، وبعد 30 دقيقة من ضخه. نقدم هنا الأساليب المستخدمة لإنجاز هذا التحليل – على وجه الخصوص، لا وصف النهج الأمثل لاستخراج البروتين من التدرج السكروز، كهذا قبل – وتقديم بعض النتائج التمثيلية.
Introduction
يستجيب القلب لإصابة الاسكيمية (ط) وضخه (صاد) بطريقة ديناميكية. ومع ذلك، هناك القليل من التبصر في التغيرات الحادة في تخليق البروتين خلال الاستجابة. لمعالجة هذه المسألة، ونحن استغل طريقة راسخة polysome التنميط1 التعرف على التغيرات في وفرة البروتين التي تعكس إعادة توزيع ريبوسوم والعوامل التنظيمية متعدية الجنسيات من سيتوسول إلى بوليسوميس، الزيادة في البروتينات المركبة حديثا (مسحنا). في الإعداد لانا/R، تحدث الزيادة في تخليق البروتين الجديد في غضون فترة زمنية لا تتسق مع النسخ الجديدة مرناس2؛ وعلاوة على ذلك، كانت الخلافات بين مستويات التعبير مرناً ووفرة البروتين عنها3. لهذه الأسباب، اخترنا لتحليل التغيرات التي طرأت البروتين الحيوي كما يتبين من ترجمة البروتين. للقيام بذلك، قياس مرناً في الكسور بوليسومي، وتحليل تكوين البروتين في كسور polysome. أخيرا، لأن ميكرورناس (ميرس) تنظيم توافر مرناس للترجمة، ويمكن أن تتداخل مع كفاءة البروتين الترجمة4،5قمنا بدراسة توزيع ميرس في الكسور بوليسومي، مع التركيز على واستجابة لانا/ر.
لقد اخترنا باستخدام الماوس المعزولة لانجيندورف نضح النموذجي والأنسجة المقطوع تحت ظروف القاعدية التروية المستمرة، بعد الاسكيمية لا التدفق العالمي و 30 دقيقة، وبعد 30 دقيقة من الاسكيمية التي تليها 30 دقيقة من ضخه. ثم أننا solubilized أنسجة القلب وفصل polysomes عبر تدرج سكروز، يليها تحليل البروتين والكشف الانتقائي مرناس وميرناس بكر وميكرواري، على التوالي. وهذا المزيج من أساليب يمثل نهجاً قويا لفهم البروتين الحيوي، تمكين الكشف المتزامن مرناً وميرنا، ومسحنا، وكذلك إعادة توزيع البروتينات التنظيمية وميرنا ومرناً بين الكسور نونترانسلاتينج، بوليسوميس الكفاءة المنخفضة، وبوليسوميس ذات الكفاءة العالية (انظر الشكل 1). سيتم توسيع رؤى في تنظيم هذه العملية الحيوية بمزيد من التحليل الفسفرة عوامل التنظيمية الرئيسية مثل eIF2α أو mTOR. يتم وصف هذه الخطوات الفردية الآن بالتفصيل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الدراسات الحيوانية بتنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والموافقة عليها برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة لارز سيناء مركز طبي.
1-لانجيندورف التروية للقلب الماوس
-
نضح لانجيندورف من قلب الماوس مع الاسكيمية وضخه
- إدارة داخل بينتوباربيتال الصوديوم 70 ملغ/كغ للماوس الكبار (8-الأسبوع-القديمة، ذكر، C57BL6/j). تأكيد التخدير العميق بعدم الانسحاب إلى أخمص القدمين قرصه.
- Anticoagulate مع الهيبارين داخل 500 يو/كغ.
- فتح الصدر عبر شق القصية. فتح الحجاب الحاجز، وقطع على طول الحدود الساحلية للمحور الابطي الأمامي. بعد ذلك، قص على محور الابطي الأمامي حتى فوريليمب لفتح القفص الصدري تماما. بعد، تصور القلب، المشبك الشريان الاورطي تصاعدي مع الملقط والمكوس سرعة القلب. الموت سبب اكسسانجوينيشن. مكان القلب في كريبس الباردة (كلوريد الصوديوم 6.9 غرام/لتر، بوكل 0.35 غرام/لتر، ناكو3 2.1 غرام/لتر، خ2بو4 0.16 غرام/لتر، مجسو4 0.141 غرام/لتر، والسكر 2 غرام/لتر وكاكل2 0.373 غرام/لتر).
- كانولاتي الشريان الاورطي بإبرة بلانت-نصيحة ونتخلل القلب ريتروجراديلي بحل كريبس في وضع الضغط المستمر.
- وبعد فترة استقرار لمدة 15 دقيقة، رهنا بالقلب الاسكيمية لا التدفق عالمي لمدة 30 دقيقة تليها ضخه لمدة 30 دقيقة.
- حصاد قلوب بعد 15 دقيقة نضح خط الأساس، وبعد 30 دقيقة الاسكيمية، أو بعد 30 دقيقة ضخه. تقليم قبالة في الاذينين، والأداة الإضافية-تجميد الأنسجة في نيتروجين سائل.
- تخزين في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام
2-الترسب التدرج التجانس الأنسجة، سولوبيليزيشن، وكثافة السكروز
-
إعداد التدرج
- إعداد حلول 2 (15% و 50%) السكروز 100 مل، خلط 4 مل من كلوريد الصوديوم 2.5 متر؛
0.8 مل مجكل2 1.25 متر؛ 1 مل تريس-HCl 1 م، درجة الحموضة 7.5؛ ز 15 أو 50 غ من السكروز (15 في المائة و 50 في المائة، على التوالي)؛ الماء عالي النقاوة لتصل إلى 100 مل؛ وزايلين زيلين نفط (0.02 مغ/مل) للون الحل 15% - تصفية كل حل (0.22 ميكرون المرشحات)
- إعداد 40 مل محلول السكروز كل يوم التدرج لاستخدامها، وإضافة سيكلوهيكسيميدي إلى كل الحلول لتحقيق التركيز النهائي من 100 ميكروغرام/مل
- استخدم صانع تدرج لإعداد مزيج بين الحلول السكروز 15% و 50%
- ملء المقصورة اليسرى مع 5 مل من التدرج السكروز 15%
- ملء حجرة الحق مع التدرج السكروز 50%
- فتح الصنبور والتبديل على مضخة لإثارة المقصورات الصغيرة اثنين مع محرض المغناطيسي
- استخدام أنبوب مرتبطة بالحنفية الثانية للسماح بمحلول السكروز مختلطة بالتدفق في أنبوب الترا-الطرد المركزي ذات جدران رقيقة. ستكون وحدة التخزين النهائي حوالي 10 مل.
- الاحتفاظ التدرجات في 4 درجات مئوية (بين عشية وضحاها إذا لزم الأمر، ولكن لم يعد)
- إعداد حلول 2 (15% و 50%) السكروز 100 مل، خلط 4 مل من كلوريد الصوديوم 2.5 متر؛
-
تجانس أنسجة القلب
- مجانسة قلب الطازجة أو المجمدة مع بوليترون في المخزن المؤقت لتحلل المصفاة (تعديل لوجود التدرج السكروز) التي تحتوي على 100 مم بوكل، 20 مم تريس درجة الحموضة 7.5، مجكل2، 5 ملم 0.4% NP-40. وتشمل سيكلوهيكسيميدي 100 ميكروغرام/مل للحفاظ على هيكل بوليسومي، 0.1 "رناسي ش" المانع ومثبط البروتياز كوكتيل (قرص 1 50 مل).
- احتضان الجليد على 15 دقيقة.
- الطرد المركزي في س 18,000 ز لمدة 15 دقيقة عند درجة 4 مئوية لإزالة المواد غير قابلة للذوبان وجمع المادة طافية.
- حجز 50 ميليلتر لتحديد البروتين وعزل الحمض النووي الريبي وتحليل سلامة الحمض النووي الريبي (انظر الشكل 2).
- طبقة المادة طافية (500 – 100 ميليلتر) على رأس التدرجات وتحقيق التوازن بين الأنابيب مع تحلل المخزن المؤقت.
-
الترسب وجمع الكسور
- أداء تنبيذ فائق لمدة 120 دقيقة في دورة في الدقيقة 37,000 في 4 درجات مئوية في دوار دلو يتأرجح. وفقا للشركة المصنعة، وهذا يتوافق مع 228,000 س ز في دائرة نصف قطرها القصوى.
- جمع كل التدرج ككسور 17 (حوالي 600 ميليلتر كل جزء) في أنابيب ميكروسينتريفوجي مع الرصد المستمر لامتصاص في 254 نانومتر (OD254).
- برنامج جامع الكسر كما يلي:
- تجاهل أول 3 دقائق من جمع (المقابلة للسائل الوارد في الأنابيب قبل التدرج)
- من 4 إلى 19 دقيقة، جمع الكسور بسرعة 1 مل/دقيقة في 17 الكسور.
- ضع الكسور على الجليد حالما يتم جمع كل منهما. تجميد عينات في-80 درجة مئوية، إذا هم لم يتم معالجتها فورا. ويرد في الشكل 1تتبع دينسيتوميتريك الأشعة فوق البنفسجية نموذجية للتدرج كما يتم جمعها.
3-عزل وتحليل مرناس من بوليسومي والكسور نونترانسلاتينج
-
استخراج مرناً
- ذوبان الجليد الكسور في الجليد، وإذا كانت مجمدة في الفلاش بعد جمع
- نقل 200 ميليلتر لكل جزء في أنبوب جديد
ملاحظة: في هذه الخطوة، كسور متتالية اثنين أو أكثر يمكن أن تجمع معا. وينبغي أن يتم ذلك بعناية بعد تحليل الرسم البياني OD254 حيث أن لا يحصل مختلطة الكسور بوليسومي وغير بوليسومي. - إضافة 10 نانوغرام لوسيفراس الجيش الملكي النيبالي كالمراقبة الداخلية لكل عينة لغرض التطبيع.
ملاحظة: يجب استخدام كبسولة تفجير لوسيفراس كرقابة داخلية لتطبيع النتائج. - إضافة 700 ميليلتر من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي (حل أحادي الطور isothiocyanate الفينول وغوانيدين؛ انظر الجدول للمواد) لكل أنبوبة. يخلط جيدا واحتضان هذه الأنابيب لمدة 5 دقائق في الرايت (درجة حرارة الغرفة).
- إضافة 140 كلوروفورم ميليلتر ودوامه ل 15 إينكوباتي س. ل 2-3 دقيقة في الرايت
- الطرد المركزي في نماذج لمدة 15 دقيقة في س 12,000 ز في 4 درجات مئوية.
- نقل المرحلة المائية العليا بعناية إلى أنبوب جديد.
- نظراً لمحتوى الحمض النووي الريبي للكسور ليست عالية، إضافة 10 ميكروغرام من الجليكوجين كحاملة لكل أنبوبة.
- إضافة 350 ميليلتر الايزوبروبانول لكل أنبوبة. يخلط جيدا واحتضان في-20 درجة مئوية ح 1 لزيادة الغلة.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في س 12,000 ز في 4 درجات مئوية.
- تجاهل المادة طافية وإضافة 700 ميليلتر الإيثانول 75% لغسل بيليه الجيش الملكي النيبالي.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 7,500 س ز في 4 درجات مئوية.
- إزالة الإيثانول واسمحوا بيليه الهواء الجاف لمدة 10 – 15 دقيقة.
ملاحظة: الإفراط في تجفيف بيليه الحمض النووي الريبي سيمنع به solubilization كاملة في الماء. - ريسوسبيند بيليه الجيش الملكي النيبالي في 50 ميكروليتر خالية رناسي عالي النقاوة H2o.
- احتضان هذه العينات لمدة 10 دقائق في 55 درجة مئوية.
- استخدم 2 ميكروليتر من كل عينة لقياس نوعية وكمية للجيش الملكي النيبالي استخراج وتخزين الباقي في-80 درجة مئوية.
-
عكس النسخ وقبكر
- استخدام ميكروليتر 4 النسخ العكسي كدنا التوليف كيت (انظر الجدول للمواد) لفعل 20 ميكروليتر. إعداد سوبيرميكس وفقا لعدد العينات. نقل وحدة التخزين المطلوبة لكل أنبوبة وإضافة 5 ميكروليتر من الجيش الملكي النيبالي بالإدخال لكل أنبوبة. يمكن تصحيح هذا المجلد لتكون ذات الصلة لمجموعة ظروف العمل بوليميريز بوليميراز.
- احتضان هذه الأنابيب في cycler حرارية مع البرنامج التالي الذي أوصت به الشركة المصنعة: 5 دقيقة عند 25 درجة مئوية، والنسخ العكسي 20 دقيقة لمدة 20 دقيقة في 46 درجة مئوية، والمنظمة المنتسخة العكسية لمدة 1 دقيقة عند 95 درجة مئوية.
- تشغيل قبكر مع البرنامج الأمثل لكل زوج من أجهزة الإشعال.
ملاحظة: للكشف عن وجود بعض مرناس في الكسور، يجب استخدام حجم متساوية من كل جزء (من الجيش الملكي النيبالي المعزول) للنسخ العكسي.
-
تحليل النتائج
- استخدام قيمة الأشعة المقطعية الجينات المعنية ولوسيفراس لحساب القيم المقطعية دلتا
- التعبير عن كل جزء دلتا Ct قيمة كنسبة مئوية من إجمالي قيمة مرناً الواردة في جميع الكسور لتصور توزيع مرناً عبر الكسور المختلفة (الجدول 1)
4-عزل وتحليل ميرناس من بوليسومي الكسور والكسور نونترانسلاتينج
-
استخراج مرناً وميرنا
ملاحظة: هذا البروتوكول يتبع إرشادات الشركة المصنعة، مع بعض التغييرات.- ذوبان الجليد الجليكوجين والمصطلحات الخاصة بعنصر التحكم. الحفاظ على الجليد.
- إضافة 700 ميليلتر من كاشف استخراج ميرنا إلى 200 ميليلتر من العينة المجمعة.
- أضف 1 ميكروغرام/ميليلتر من الجليكوجين وتجانسه باستخدام ماصة. تبني عليه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 3.5 ميليلتر من 1.6 x8 10 سبايك في السيطرة ومزجها.
- إضافة 200 ميليلتر من كلوروفورم ودوامه عليه لمدة 15 ثانية على الأقل.
- احتضان لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- أجهزة الطرد المركزي في 12,000 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- استخدام ماصة، نقل المادة طافية على أنبوب 1.5 مل جديدة. تجاهل في المراحل الوسطى والسفلي.
- إضافة إلى حجم x 1.5 من الإيثانول 100% للمادة طافية ومزجها.
- نقل 700 ميليلتر من هذا الخليط إلى العمود استخراج ميرنا والطرد المركزي أنه بأقصى سرعة ل 15 s RT وتجاهل التدفق عبر؛ كرر هذه الخطوة مع أي نموذج المتبقية.
- إضافة 700 ميليلتر من المخزن المؤقت 1 إلى العمود والطرد المركزي أنه بأقصى سرعة لمدة 15 ثانية في الرايت؛ تجاهل في التدفق من خلال.
- إضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت 2 إلى العمود والطرد المركزي أنه بأقصى سرعة لمدة 15 ثانية في الرايت؛ تجاهل في التدفق من خلال.
- إضافة 500 ميليلتر من الإيثانول 80% إلى العمود والطرد المركزي أنه بأقصى سرعة لمدة 2 دقيقة في الرايت؛ تجاهل في التدفق من خلال.
- نقل العمود إلى أنبوب جديد 2 مل أزم وفتح الغطاء والطرد المركزي في RT لمدة 5 دقائق بأقصى سرعة؛ تجاهل في التدفق من خلال.
- إضافة ميليلتر 16 خالية رناسي المياه إلى العمود وأجهزة الطرد المركزي على كامل بسرعة لمدة 1 دقيقة في إبقاء الرايت النذرة على الجليد أو تخزين في-80 درجة مئوية للتحليل في المستقبل.
ملاحظة: يمكن استخدام ميكروليتيرس اثنين لكل عينة لتحليل التطوير التنظيمي.
-
عكس النسخ
- إعداد على الجليد. لكل رد فعل RT-PCR 20 ميليلتر، إضافة 4 ميليلتر من المخزن المؤقت RT ميرنا، 2 ميليلتر من الأحماض النووية، ميليلتر 9 مجموع الجيش الملكي النيبالي وميليلتر 2 إنزيم 3 ميليلتر من المياه مجاناً رناسي؛ أنها مزيج وأنها تدور إلى أسفل بإيجاز.
- تعيين Cycler الحرارية كما يلي:
37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة؛
95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛
عقد 4 درجات مئوية. - إزالة الأنابيب من cycler الحرارية وإضافة 200 ميليلتر من المياه خالية من رناسي. تخزين في-20 درجة مئوية، أو المضي قدما إلى PCR الوقت الحقيقي.
-
بكر في الوقت الحقيقي
ملاحظة: يتبع هذا البروتوكول 96 لوحة جيدا الشكل. إعداد مزيج رد فعل على الجليد.- إعداد مزيج تفاعل PCR وإضافة كدنا (من ميرناس أعلاه) وفقا لنطاق مقبولة بموجب البروتوكول. يمكن إعداد ردود فعل متعددة دفعة واحدة.
- إضافة إجمالي 25 ميليلتر من مزيج PCR + كدنا في كل بئر.
- ختم اللوحة باستخدام ختم لوحة بصرية.
- الطرد المركزي في اللوحة لمدة 1 دقيقة في 1,000 س ز في درجة حرارة الغرفة.
- برنامج cycler في الوقت الحقيقي كما يلي:
خطوة التنشيط الأولى عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة؛
3-الخطوة ركوب الدراجات: تمسخ في 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية؛ الصلب في 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ ملحق في 70 درجة مئوية لمدة 30 ثانية (القيام بجمع البيانات الفلورية)؛ إضافة دورات 40؛
انصهار-منحنى حسب الافتراضي cycler.
-
التحليل المقارن
- مثال للتطبيع (انظر الجدول 2):
- البحث عن القيمة الدنيا SCM.
- تطبيع جميع قيم المجلس الأعلى للقضاة إلى هذا الحد الأدنى.
- طرح هذه القيمة من قيم Ct ميرناس للفائدة (وزارة الداخلية) وإشارة الجينات (المرجع).
- تحليل البيانات باستخدام الصيغة 2-ΔCt .
- مثال للتطبيع (انظر الجدول 2):
5. تحليل البروتين البشري
-
استخراج البروتينات من الكسور بوليسومي
- الجمع بين الكسور السكروز التي جمعت في ثلاثة كسور النهائي. علامة بالكسور الثقيلة (polysomes عالية الكفاءة في تجميع الكسور 4، 5 و 6 و 7 مع أعلى تركيز السكروز؛ السفلي من الأنبوب التدرج)، الضوء (polysomes انخفاض الكفاءة في كسر المجمعة 8، 9 و 10 و 11؛ والأوسط أنبوب التدرج) و غير ترجمة (كسور المجمعة 12، 13، 14 و 15 مع أدنى تركيز السكروز؛ العلوي من الأنبوب التدرج). إجراء مقايسة البروتين على الكسور المجمعة.
- إعداد الأوراق المالية 100% من حمض التريكلوروسيتيك (TCA) وتخزينها في 4 درجات مئوية في الظلام. مزيج 0.5 مل عينة مع 60 ميليلتر من 100% TCA واحتضان في-20 درجة مئوية خلال الليل في الظلام.
ملاحظة: استخدم البروتين منخفضة 1.5 مل الاحتفاظ بأنابيب (انظر الجدول للمواد). - بعد الاحتضان بين عشية وضحاها، إذابة العينة على الجليد وأجهزة الطرد المركزي في 15,000 س ز، 4 درجة مئوية للمادة 30 دقيقة تجاهل طافية.
ملاحظة: يعطي 100 ميكروغرام من البروتين الكلي في عينة بيليه بروتين مرئية في أسفل الأنبوبة. - قبل chill الأسيتون في الثلاجة-20 درجة مئوية. إضافة 0.5 مل الأسيتون البارد إلى بيليه البروتين وأجهزة الطرد المركزي في 15,000 س ز، 4 درجة مئوية للمادة 15 دقيقة تجاهل طافية. كرر هذه الخطوة مرتين.
- الهواء الجاف بيليه. ريسوسبيند بيليه في 360 ميليلتر من المخزن المؤقت تريس هيدروكلورايد 50 مم (درجة الحموضة 8).
ملاحظة: إذا لزم الأمر، استخدم سونيكاتور نبض إلى ريسوسبيند بيليه. - إضافة 40 ميليلتر من ديثيوثريتول م 0.1 (تركيز نهائي 10 ملم) واحتضان في 55 درجة مئوية على شاكر ل 45 دقيقة إضافة 50 ميليلتر من إيودواسيتاميدي م 0.15 (التركيز النهائي 17 ملم) واحتضان في درجة حرارة الغرفة على شاكر لمدة 30 دقيقة في الظلام.
- إعداد حل التربسين: ريسوسبيند 20 ميكروغرام من التربسين في 100 ميليلتر من بيكربونات الأمونيوم 50 مم. إضافة إلى حجم المقابلة لحل التربسين بعينه في 01:50 (w/w) نسبة التربسين: البروتين، والتأكد من أن درجة الحموضة 8 واحتضان على شاكر على 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظة: إضافة 1 م بيكربونات الأمونيوم تحقيق درجة الحموضة إلى 8. - بعد الهضم التربسين، بارد العينة، الطرد المركزي بإيجاز في مقاعد البدلاء للطرد المركزي، إضافة حمض الفورميك 10% على درجة الحموضة 2 – 3 إخماد النشاط التربسين، والمضي قدما في عينة الملحي.
ملاحظة: استخدم لوحة μ-شطف للعينة الملحي. - شرط مسيل في الآبار 96 لوحة جيدا مع 200 ميليلتر من الميثانول استخدام الفراغ ثلاث مرات متبوعاً بتكييف 200 ميليلتر من حمض الفورميك 0.1% ثلاث مرات. تحميل عينة وأداء يغسل عينة باستخدام 200 ميليلتر من حمض الفورميك 0.1% ثلاث مرات. الوتي العينة مع 100 ميليلتر من حمض الفورميك acetonitrile/0.1% 50% مرتين في أنبوب 0.5 مل الاحتفاظ منخفض البروتين.
ملاحظة: الوتي العينة ببطء في البداية استخدام الجاذبية متبوعاً بفراغ منخفضة. - تتبخر النذرة عينة إلى جفاف استخدام مركزات وأما القيام مباشرة بتحليل الطيف الكتلي أو مخزن في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
-
تحليل الطيف الكتلي
- إعادة تشكيل كل بيليه (تتألف من الببتيدات تريبتيك) في 50 – 100 ميليلتر وحقن 1 ميليلتر في مطياف كتلة.
ملاحظة: تحسين وحدات إعادة تشكيل والحقن للحصول على أقصى شدتها إشارة LC/MS/MS. وفي حالتنا، إشارة الحد الأقصى (مجموع أيون الحالية؛ تيك) في قلب المسح كان في مجموعة من 1E8 إلى 2E9. - استخدام عمود فخ C18 (300 ميكرون الهوية x 5 مم، 5 ميكرومتر، 100Å) تليها الببتيد الفاصل باستخدام عمود C18 (معرف ميكرومتر 75 × 250 ملم، 2 ميكرومتر، 100Å) مع تحديد معدل تدفق في 300 nL/دقيقة مجموعة درجة الحرارة الشعرية نانو-مصدر 275 درجة مئوية والجهد الرذاذ إلى 2 كيلو فولت.
- تطبيق تدرج خطي ب 5 – 35% لمدة 90 دقيقة، وب 35 – 95% لمدة 3 دقائق، عقد في 95% ب 7 دقائق والموازنة 5% ب لمدة 25 دقيقة (ج: 0.1% حمض الفورميك والمياه وب 0.1% حمض الفورميك في الاسيتو الانيتريل). الحصول على الأطياف MS2 للايونات كثافة أعلى 15 من كل عملية مسح MS1 استخدام وضع إدارة البحث الجنائي. 3 استخدام الطيف الكتلي وإنشاء نسخ متماثلة لكل عينة تم تحليلها.
ملاحظة: تحسين واستخدام الظروف التجريبية والمعلمات التي مناسبة للعينات الخاصة بك في صك خاص الطيف الكتلي. الشروط/المعلمات المذكورة في الفرع 5-2. تم استخدامه والأمثل في المختبر.
- إعادة تشكيل كل بيليه (تتألف من الببتيدات تريبتيك) في 50 – 100 ميليلتر وحقن 1 ميليلتر في مطياف كتلة.
-
تحديد بروتين/كوانتيتيشن
- بعد تحليل الطيف الكتلي، تحويل الملفات الخام الأطياف في ملفات مزكسمل متوافقة باستخدام برنامج مسكونفيرت (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html).
- إرسال الملفات المحولة إلى محرك البحث سيكويست مع معايير البحث، مثلاً، أونيبروتكب/السويسرية-بروت الماوس قاعدة (أحدث استعراض الكنسي)؛ هضم إنزيم شبه استخدام التربسين (بعد الخمير الحمر/--)؛ مع الانشقاقات الضائعة تصل إلى 2؛ النطاق الشامل السلائف: 400 إلى 4,500 اتحاد المغرب العربي؛ تعديل ثابت: كارباميدوميثيل (ج) 57.021465 اتحاد المغرب العربي؛ الببتيد التسامح الشامل: 50 جزء في المليون؛ جزء النوع الشامل: مونويسوتوبيك.
ملاحظة: يمكن استخدام أخرى البروتين قاعدة بيانات البحث عن البيانات ومحركات خطوط الأنابيب. في حالة استخدام قاعدة بيانات مثل الفئران، وأقل اكتمالا من قواعد البيانات للماوس والإنسان، فقد تحتاج إلى البحث ضد الماوس (أو الإنسان) قواعد البيانات لزيادة التغطية بالبروتين. وفي هذه الحالة، سوف تحتاج إلى التكرار في أسماء البروتين المراد إزالتها. - إجراء تحليل لبحث فيما بعد. تعيين عوامل التصفية لعرض البيانات. على سبيل المثال، تعيين احتمال الحد أدنى من بروتين (بروتين العتبة) 95% أو 99%، أي، سيتم عرض فقط البروتينات التي ينطوي تحليل إحصائي احتمال 95% أو 99% موجودة في العينة. تعيين عامل تصفية لعتبة الببتيد (مثلاً 95%)، أي احتمال الحد أدنى الذي سيتم استخدامه في تحديد ما إذا كان يعرف طائفة من ببتيد. حدد الحد الأدنى لعدد من الببتيدات التي ستحدد إذا كان بروتين موجود الببتيدات 2 كحد أدنى لتحديد البروتين (مستحسن).
- تقييم البروتينات المحددة للجودة/الكمية. ضمان استخدام الببتيدات بروتيوتيبيك للقياس الكمي. إذا تم التعرف على إيسوفورم التأكد من أنها قواعد على المراقبة الببتيد تريبتيك تتألف من تسلسل الأحماض الأمينية فريدة من نوعها إيسوفورم محددة. وينبغي أن يخضع أي البروتينات "شبيه" أو افتراضية مقارنة معرفة ما إذا كانت الملاحظة الببتيدات تتوافق مع بروتين معروفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تحليل مرناً
ويمكن التعبير عن النتائج مرناً توزيع مرناً معين في كل جزء (الشكل 3 ألف)؛ للتحديد الكمي، الجمع بين الكسور ترجمة بوليريبوسومال ومقارنة للكسر غير ترجمة (الشكل 3B)، تقديم نسبة وفرة مرناً في ترجمة للكسور نونترانسلاتينج. اكتساب معلومات إضافية عن طريق فحص كسور بوليسومي كفاءة عالية بشكل منفصل من الكسور polysome منخفضة الكفاءة (ومنفصلة من الكسور نونترانسلاتينج). هذا مهم خاصة عند تحليل ميرناس، التي هي أثري في كسور منخفضة الكفاءة (حيث أنها تتداخل مع ترجمة البروتين بهم مرناس المستهدفة).
وينتج الممثل مرناً خاصة التي تظهر التغييرات توزيعها عبر الكسور ترجمة ونونترانسلاتينج بعد أن تعرضوا قلوب الماوس الاسكيمية والاسكيميه/ضخه بالمقارنة مع شام في الشكل 4.
تحليل صفيف ميرنا
وتظهر نتائج تمثيلية من تحليل صفيف ميرنا في الشكل 5. هنا، تم تحليل مجموعة فرعية ميرناس (لوحة مصممة خصيصا الصفيف) في كسور ثقيلة مجمعة تشير إلى أن ميرناس 22 قد تقترن polysomes أثناء الاسكيمية، ميرناس 9 خلال الاسكيمية وضخه، مع 7 التي تشترك فيها كل الشروط. وهذا يبين أن رابطة ميرناس دينامية واستجابة للضغوط من الاسكيمية وضخه.
تحليل البروتين
تحليل للكسور الثقيلة والخفيفة وعدم ترجمة عينة الشام (الرقابة):
وحددت 881 مجموع البروتينات الكتلي؛ 3، البروتينات 46 و 208 من إجمالي كانت فريدة من نوعها للكسور الثقيلة والخفيفة وغير العابرة، على التوالي (الشكل 6A). وحددت الأغلبية (88 في المائة) من البروتينات ريبوسومال الميتوكوندريا (28S و 39S) في كسر الخفيفة (36 من أصل 41) وحددت أغلبية (88 في المائة) من البروتينات ريبوسومال سيتوسوليك (40S و 60S) شيوعاً في كسور الثقيلة والخفيفة على حد سواء (53 من أصل 60) يؤكد الفصل بين الكفاءة والبروتين القدرة على تحديد مقابل سيتوسوليك أثقل أخف البروتينات ريبوسومال الميتوكوندريا. ويبين الشكل 6Bمجموعة فرعية البروتينات ريبوسومال الميتوكوندريا وسيتوسوليك التي تم تحديدها.
رقم 1: الشخصية امتصاص "الأشعة فوق البنفسجية نموذجي" polysome الكسور في التدرج السكروز. الكسور الثلاثة الأولى تمثل حجم الفراغ في الأنبوب. العالية الكفاءة (الوزن الجزيئي العالية، حمو) يتم جمع الكسور في الكسور 4-7، الانخفاض الكفاءة (الوزن الجزيئي المنخفض، LMW) يتم جمع الكسور في 8-11، وعدم ترجمة (وتبقى المواد سيتوسوليك) في (الكسور 12-15 نونترانسلاتينج، NTR). الخط الأحمر يشير إلى الموصلية، وتتبع الأزرق يشير إلى امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 254 نانو متر. على اليمين رسم كاريكاتوري أنبوب اختبار مع السكروز التدرج، توزيع عرض polysomes بعد الترسيب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تحليل مراقبة سلامة الجيش النيبالي الملكي في بيواناليزير- رنا سلامة عدد (رين) من مجموع الجيش الملكي النيبالي المعزولة من قلب كله ليساتي. رين ويحسب وفقا لقمم 18S و 28S. مجموعة رين: 1-10، ورين = يمثل 10 سلامة جيدة جداً. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الشخصية التمثيلية للتوزيع مرناً في التدرج السكروز. قلوب وتعرض لنضح لانجيندورف القاعدية أو الاسكيمية وضخه (أنا/R). (أ) سويت ليساتيس القلب على التدرج السكروز وتم تحديد محتوى مرناً جابده (يسار) و COX4 (يمين) في كل جزء. الأرض ويبين الوفرة النسبية مرناً في كل جزء (جزء العدد على محور س) لنضح القاعدية (الشام وخط أحمر والماس) والاسكيمية/ضخه (أنا/R، والخط الأزرق والمربعات). فرضه على الأرض من امتصاص الأشعة فوق البنفسجية التي تشير إلى المحتوى الإجمالي مرناً (منحنى الرمادية الخفيفة) والموصليه (خط مائل مستقيم رمادي). مربعات تبين كيف تم تجميع الكسور. (ب) ارسم رسم بياني شريطي يبين نسبة وفرة مرناً في ترجمة مقابل (بوليسوميس) نونترانسلاتينج (NT) الكسور جابده (يسار) ومرناس COX4 (يمين). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: نتائج مرناً الممثل. كوانتيتيشن من واحد مرناً في كسور المجمعة (حمو، LMW، NTR) تظهر التغييرات وفقا للمجموعة التجريبية. وأجرى تجزئة polysome القلوب الماوس بعد نضح لانجيندورف. النتائج المرسومة كنسبة مئوية من مجموع مرناً (اللوحة العلوية) وكنسبة من بوليسوميس (همو + LMW) إلى كسر نونترانسلاتينج (NTR). أشرطة الخطأ تمثل النتائج من قلوب 5 كل مجموعة (الشام، الاسكيمية، أو/R). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: نتائج ميرنا الممثل. رسم تخطيطي متداخل لمسار ركز التحليل ميرنا تظهر وميرناس دوونريجولاتيد في برك الكسر ثقيلة من عينات الفئران بعد القلب الاسكيمية أو الاسكيمية وضخه. قيمة الوقف: حظيرة 1.5. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: البروتينات التي حددها الكتلي. (أ) رسم تخطيطي متداخل من البروتينات المشتركة وفريدة من نوعها للكسور الثقيلة والخفيفة وغير العابرة. (ب) مجموعة فرعية بروتينات ريبوسومال الميتوكوندريا وسيتوسوليك المحددة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 7: اختبار سير العمل التخطيطي لأساليب استخراج البروتين. تم اختبار أساليب استخراج البروتين باستخدام عينة الشام (المراقبة) والثقيلة (الكفاءة العالية polysomes) الكسر مع محتوى السكروز أعلى. تشير الأرقام باللون الأحمر إلى عدد البروتينات التي تم تعريفها بواسطة الكتلي؛ حيث يتم عرض أرقام اثنين، وهم من تجربتين منفصلتين. ويرد وصف مفصل في النص. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الكسور | Ct الجينات | Ct لوسيفراس | ΔCt | 2ΔCt | مجموع كافة الكسور | % لكل جزء | نسبة بوليسومي/NTR |
| كفاءة عالية (همو) | 28.75 | 22.79 | 5.96 | 0.016 | 0.046 | 34.64 | 2.77 |
| انخفاض كفاءة (LMW) | 28.43 | 22.63 | 5، 80 | 0.018 | 38.81 | ||
| غير ترجمة (آر) | 29.12 | 22.77 | 6.35 | 0.012 | 26.55 | ||
| نسبة بوليسومي/NTR = (همو + LMW)/NTR |
الجدول 1: نموذج تحليل مرناً. أسلوب التحليل مرناً واحد يرد للكسور المختلفة المجمعة (حمو، LMW، NTR) بعد PCR الكمي. ΔCt = الجينات Ct-لوسيفراس Ct، وهو 2ΔCt 2ΔCt.
| البحث عن القيمة الدنيا SCM: 22.77 | |||
| عينة 1 | عينة 2 | نموذج 3 | |
| Ct موي | 22.92 | 22.36 | 22.58 |
| Ct SCM | 22.81 | 22.77 | 22.9 |
| Ct REF | 23.27 | 23.55 | 23.19 |
| تطبيع جميع قيم المجلس الأعلى للقضاة إلى هذا الحد الأدنى | |||
| عينة 1 | عينة 2 | نموذج 3 | |
| Ct SCM | 0.05 | 0 | 0.13 |
| طرح هذه القيم من القيم المقطعية موي والمرجع | |||
| عينة 1 | عينة 2 | نموذج 3 | |
| Ct موي | 22.87 | 22.36 | 22.45 |
| Ct REF | 23.22 | 23.55 | 23.06 |
الجدول 2: نموذج حساب PCR الوقت الحقيقي لمقارنة التعبير ميرنا في بوليسومي والكسور نونترانسلاتينج. ميرناس للفائدة (وزارة الداخلية) وإشارة الجينات (REF) حللت في كسور الثقيلة المجمعة من الفئران بعد الاسكيمية أو الاسكيمية/ضخه. واستخدمت الأشعة المقطعية تم تطبيع القيم أولاً لمراقبة ارتفاع في قيمة الأشعة المقطعية (SCM)، ثم الصيغة 2-ΔCt مقارنة التعبير ميرنا.
| الأسلوب | حجم العينة [مل] | # بروتينات المحددة | تعليقات |
| فاسب | 1 | 227 | الجزء الأكبر سكروز عجلت في عامل تصفية |
| هطول الأمطار الأسيتون | 0.6 | 372 | حماة لزج السكروز في أسفل الأنبوبة؛ حجم 4:1 (كاشف: عينة)؛ لا بيليه بروتين مرئية |
| هطول الأمطار كلوروفورم/ميثانول | 0.32 | 389 | حماة لزج السكروز في أسفل الأنبوبة؛ حجم 8:1 (كاشف: عينة)؛ لا بيليه بروتين مرئية |
| هطول الأمطار كلورفورم الميثيل (عند 4 درجة مئوية) | 0.5 | 405، 415 | لا يوجد ترسيب السكروز؛ وحدات التخزين 0.12:1 (كاشف: عينة)؛ بيليه مرئية في أسفل الأنبوبة |
| إعادة ترسيب | 85، 60 | هطول الأمطار كلورفورم الميثيل إضافية من المادة طافية عقب جمع بيليه الأول | |
| هطول الأمطار كلورفورم الميثيل (في-20 درجة مئوية) | 0.5 | 440، 430 | لا يوجد ترسيب السكروز؛ وحدات التخزين 0.12:1 (كاشف: عينة)؛ بيليه مرئية في أسفل الأنبوبة |
| إعادة ترسيب | 81، 55 | هطول الأمطار كلورفورم الميثيل إضافية من المادة طافية عقب جمع بيليه الأول |
الجدول 3: مقارنة بين أساليب استخراج البروتين. وجرى تقييم FASP والاسيتون هطول الأمطار وهطول الأمطار كلوروفورم/الميثانول وهطول الأمطار TCA في 4 درجة مئوية و-20 درجة مئوية. كان الهدف تحقيق أقصى عدد البروتينات المحددة. وقيمت هطول TCA في دفعة ثانية من المواد للتأكد من إمكانية تكرار نتائج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويتيح تحليل الشخصية polysome لدراسة البروتين الترجمة عن طريق تحليل الدولة المتعدية مرناً محددة أو6،الترنسكربيتوم كله7. كما أنها مساعدة كبيرة عندما الترجمة المحلية يحتاج إلى دراسة مثل سينابتوسوميس8. تقليديا، ينطوي هذا الأسلوب على فصل أحادية الطور و polyribosomes ومرناس المرتبطة بها في تدرج سكروز التي يمكن أن تقترن بالجينوم أو تقنيات البروتين للحصول على النتائج المرجوة6،9. على سبيل المثال، كشفت دراسة أجريت مؤخرا يؤديها مجموعتنا إليه تنظيمية بوستترانسكريبشونال أعدم في قلب المرضى الذين يخضعون للبروتوكول، والذي يحاكي الإصابة الاسكيمية/ضخه. الاستفادة من تحليل الشخصية بوليسومي، نحن قد أظهرت زيادة في ترجمة النووي ترميز البروتينات المتقدرية في القلب بعد CPB الإجراء2.
يمكن أن تكشف عن نهج التنميط بوليريبوسومال البروتين الحيوي المعروضة هنا التغيرات في سكان مرناس المرتبطة بوليريبوسوميس والبروتينات التي يتم ترجمتها بنشاط. كما ترجمة مرناس تحكمها في جزء ميرناس، تحليل ميرناس في هذه الكسور يمكن أن تكشف عن رؤى إضافية. وفي الواقع، عدة دراسات تعديل هذا الأسلوب وأثبتت أن يكون نهج مناسب وموثوق بها للتحقيق في طريقة تنظيم10،11ميرنا.
أجريت دراسات عديدة في آخر العقد الخوض في دور ميرناس، النظر في أهميتها في مختلف الوظائف البيولوجية12،13. منذ ميرناس العمل من خلال قاعدة الاقتران مع نظيره مرناس بغية تمييزها للتدهور، تم إجراء تحليل الشخصية بوليسومي وأظهرت أن ميرناس موجودة في الواقع في كسور polysome، تستهدف ترجمة مرناس14، 15 , 16-مير-21 مثال جيد حيث أنه يرتبط بقمع انخفاض وضعف polysomes ملزمة في الخلايا الطبيعية، في حين يزداد في الخلايا السرطانية، الاشتراك مع بوليسوميس وأثر القمعية كثير أقوى17.
في هذه الدراسة، تم تحليل PCR في الوقت الحقيقي باستخدام قيم Ct ميرناس للفائدة (وزارة الداخلية)، قيم Ct سبايك في التحكم ميرنا (SCM) للحد من الاختلافات التقنية وقيمة الأشعة المقطعية الجينات مرجع أو ميرنا (المرجع) الذي مستقر بين العينات. وكان الخطوة الأولى لتطبيع قيم Ct وزارة الداخلية والمرجع لقيم Ct SCM. ثم كان هناك تطبيع خطوة ثانية من وزارة الداخلية للمرجع، وتم استخدام القيمة الناتجة لحساب الصيغة 2-ΔCt . يمكن استخدام هذه القيم أو إضعاف--تغيير القيم لإظهار الاختلافات بين المجموعات.
حيث من الصعب استخلاص البروتينات من الكسور بوليسومي، استخدمت معظم الدراسات المنجز حتى الآن، الكسور مباشرة لتحليل لطخة غربية. أنها ببساطة الرواسب محتوى البروتين لكل جزء والمزيج مع الحزب الديمقراطي الصربي-تحميل المخزن المؤقت لاستخدامه للحزب الديمقراطي الصربي صفحة تحليل8،18. هنا، قمنا بتطوير أسلوب الذي يسمح لنا ليس فقط لاستخراج مرناس وميرناس بعد تجزئة، ولكن أيضا للحصول على الببتيدات والبروتينات مع جودة عالية المضي قدما في تحليل "الطيف الكتلي".
ويمكن توسيع هذا النهج بقياس نشاط البروتينات المركبة حديثا باستخدام العلامات الاستقلابية مثل بيورثوجونال الأحماض الأمينية هومولوج، مثل أزيدوهوموالانيني (اها) الميثيونين19،20. اها تليها الكيمياء انقر فوق إدراج يسمح بإدراج علامة البيوتين متبوعاً بتنقية ستريبتافيدين من جميع البروتينات التي أدرجت اها. يسمح هذا تحديد قاطع للبروتينات المركبة حديثا – الجزء الآخر من البروتين الحيوي. الكشف عن ميرناس أن إعادة توزيع بين الكسور نونترانسلاتينج وترجمة استجابة لحافز (هنا مع أنا/R) يسمح لاستجواب تنظيم ترجمة البروتين الحيوي. ومع ذلك، تظل العوامل التي تجند ميرناس على مقربة من الريبوسوم زمنياً مرناً يتعين تحديدها والتحقيق فيها بصورة منهجية.
في هذه الدراسة، بالإضافة إلى هطول الأمطار TCA، اختبرنا ثلاث طرق أخرى لاستخراج البروتين من الكسور بوليسومي:21ط) فاسب (إعداد عينة بمساعدة عامل التصفية) والثاني) الأسيتون هطول الأمطار والثالث) كلوروفورم/الميثانول هطول الأمطار. وتم تقييم مدى ملاءمة الأساليب استناداً إلى كلا القدرة على معالجة الكسور بتركيزات عالية من السكروز (تصل إلى 50 ٪) وعدد من البروتينات التي حددها الكتلي (الشكل 7 و الجدول 3).
للأسلوب فاسب، تابعنا بروتوكول إعداد عينة قدمتها "مجموعة الهضم البروتين فاسب" التي تستخدم وحدة أولترافيلتريشن مع وقف كاتشين 30 كتلة جزيئية نسبي. وحدة عامل التصفية هذا بمثابة أداة لإزالة المنظفات وتبادل المخزن المؤقت وهضم البروتين وشطف الببتيد مع القدرة على الاحتفاظ بالمواد عالية الوزن الجزيئي (البروتينات والحمض النووي) وإلا يتعارض مع فصل الببتيد اللاحقة 21-بإيجاز، تمتزج العينة المحتوية على اليوريا المخزن المؤقت وتحميلها على وحدة تصفية تدور مع الغزل خطوات كحل إيودواسيتاميدي، حل التربسين وكلوريد الصوديوم الحل (شطف) في وقت لاحق أضيفت. Filtrate النهائي يحتوي على الببتيدات هضمها المحمضة تفا، ديسالتيد وتخزينها لتحليل الطيف الكتلي. باستخدام هذا الأسلوب، ولكن الجزء الأكبر السكروز سرع اطراد المتراكمة على رأس عامل التصفية، التقديم الطرد المركزي والغسيل الخطوات الصعبة.
لهطول الأمطار الأسيتون وهطول الأمطار كلوروفورم/الميثانول، يلزم وحدات تخزين متعددة من المذيبات يعجل بالبروتينات من حجم واحد من عينة. حد حجم التخزين عينة يطبق عند هطول الأمطار قد أنجز في أنابيب 1.5 مل (البروتين المنخفض-الاحتفاظ بأنابيب). كذلك، الحمأة لزوجة السكروز المتراكمة في الجزء السفلي من الأنابيب بعد هطول الأمطار لكلتا الطريقتين وكانت هناك لا الكريات مرئية في أسفل الأنبوب وفي واجهة السائل بعد هطول الأمطار الأسيتون وهطول الأمطار كلوروفورم/الميثانول، على التوالي.
الجدول 3 و الشكل 7 وتظهر المقارنة بين أربعة أساليب استخراج البروتين ونحن تستخدم لتحسين سير العمل التجريبي لدينا. تمثل الأرقام الحمراء في كل طريقة (الشكل 7) عدد البروتينات التي تم تعريفها بواسطة الطيف الكتلي (انظر القسم 5.2 و 5.3). على الرغم من أن حجم العينة المستخدمة لكل أسلوب مختلف، أسفرت كلوروفورم/الميثانول وهطول كلورفورم الميثيل أعلى عدد من البروتينات المحددة. ومع ذلك، بسبب العيوب المذكورة أعلاه (الحد من حجم العينة وهطول الأمطار السكروز)، اخترنا لهطول الأمطار TCA للتجارب اللاحقة.
لإيجاد الظروف المثلى للحصول على نموذج تجهيز، نفذ TCA هطول الأمطار في مختلف درجات الحرارة و TCA تركيزات22،،من2324. وهكذا، أجرينا هطول الأمطار بنسبة 10.7 في المائة TCA في 4 درجة مئوية و-20 درجة مئوية وكذلك عجلت supernatants مع ميليلتر 60 إضافية من كلورفورم الميثيل (النهائي 19.4% TCA) بعد أن جمعت الكريات. وادي هذا إلى كريات أربع التي حللت مفصولة الكتلي. وباﻹضافة إلى ذلك، كررنا البروتوكول كله مرتين للتأكد من أن النتائج التي تم الحصول عليها تم استنساخه. سير العمل والعدد من البروتينات التي تم تحديدها في الكريات في ظروف 4 درجة مئوية و-20 درجة مئوية مع اثنين من التجارب المتكررة ترد في الشكل 7 (الأرقام باللون الأحمر). على الرغم من أن تحليل الكريات المستمدة من supernatants أسفرت عن عدد إضافي من البروتينات (85 و 60 في 4 درجات مئوية؛ 81 و 55 في-20 درجة مئوية)؛ أغلبية من البروتينات تم تحديدها بالفعل في الكريات الأولى وهكذا، اخترنا أن استخدام 10.7 في المائة TCA لجميع التجارب اللاحقة. على الرغم من هطول الأمطار كلوروفورم/الميثانول أسفر عن عدد مماثل من البروتينات المحددة بالمقارنة مع هطول الأمطار TCA، كنا نفضل TCA هطول الأمطار بسبب العديد من المزايا: أنا) صغيرة الحجم من المذيبات بحاجة إلى التعجيل بالبروتينات (60 ميليلتر من كلورفورم الميثيل مقابل 1.28 مل كلوروفورم/الميثانول/الماء) تمكين استخدام وحدات تخزين العينة أكبر إذا كان يلزم حين مريح باستخدام أنابيب 1.5 مل لهطول الأمطار، ثانيا) رؤية بيليه في أسفل الأنبوبة، والثالث) لا تراكم السكروز أثناء خطوات هطول الأمطار.
على الرغم من تقديم المعلومات الفنية المتعمقة فيما يتعلق بالدولة المتعدية، عيب رئيسي لهذا الأسلوب هو الحاجة إلى مواد انطلاق جديدة وكبيرة. حاولت العديد من الدراسات لتحسين شروط استخدام الحجم الصغير للخلايا أو الأنسجة أو إضافة خطوات لزيادة كفاءة استخراج الحمض النووي الريبي والبروتينات25. لا يزال، الأنسجة التي تم الحصول عليها من الحيوانات المختلفة تحت نفس الظروف التجريبية يمكن أن يكون سحب معا، إذا كان بحاجة إلى أن يكون.
وفي الختام، يسمح هذا البروتوكول لتحليل متزامنة مرناً وميرنا والبروتين من الكسور التي تم الحصول عليها من polysome التنميط لدراسة الآليات التنظيمية التي تشارك في الاسكيمية/ضخه. كذلك دراسات غير مطلوب لمعرفة ما إذا كانت هي التي يسببها مرناس ترجمة بعد الاسكيمية أو ضخه وإذا كان سيتم إيقاف عند إزالة الإجهاد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
HL112730 P01 المعاهد الوطنية للصحة (خرقه، جف)، HL132075 R01 المعاهد الوطنية للصحة (خرقه، جف)، باربرا سترايسند المرأة مركز القلب (خرقه، جف)، يرأس دوروثي وهاء-فيليب ليون في القلب الجزيئية (خرقه)، وهبت جليزر إريكا كرسي في صحة القلب للمرأة (جف) وأكاديمية العلوم التشيكية الدعم المؤسسي رفو: 68081715 (مللي ثانية).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital | Vortech Phamaceuticals | 9373 | for euthansia |
| Heparin | Sagent | 103424 | used in langendorff preparation |
| forceps | Fine Science Tools | 91110-10 | used to hang the heart |
| Langendorff system | Radnoti + home made | n/a | A 'four heart' system consisting of custom blown glass, tubing and water baths |
| NaCl | Sigma | S7653-5KG | Krebs buffer and Sucrose gradient |
| KCl | Sigma | P5405 | Krebs buffer and Lysis buffer |
| KH2PO42 | Sigma | P-5504 | Krebs buffer |
| MgSO4 | Sigma | M7774-500G | Krebs buffer |
| Glucose | Sigma | G5767 | Krebs buffer |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | Krebs buffer |
| Sucrose powder | Sigma | S0389-1KG | Sucrose gradient |
| MgCl2 | Sigma | 208337 | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503-1KG | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| Xylene Cyanole | Sigma | X-4126 | Sucrose gradient |
| Cycloheximide | Sigma-aldrich | 239763 | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| RNaseOUT | Life Technologies | C00019 | RNAse inhibitor for Lysis buffer |
| Igepal CA-360 (NP40) | Sigma | I3021 | Lysis buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail tablets, EDTA free | Roche | 5056489001 | |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | LE-80K | Ultracentrifugation of the gradients |
| Rotor | Beckman | SW41 | Ultracentrifugation of the gradients |
| Biologic LP (pump) | Biorad | 731-8300 | Fractionation of the gradients |
| BioFrac | Biorad | 741-0002 | Fractionation of the gradients |
| Eppendorf RNA/DNA LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL tube | Sigma | Z666513-100EA | Gradient fraction and RNA extraction |
| TRIzol Reagent | Life technologies | AM9738 | RNA extraction |
| Luciferase Control RNA | Promega | L4561 | RNA extraction |
| Chloroform | Fisher Scientific | C606-4 | RNA extraction |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher Scientific | R0551 | RNA extraction |
| Isopropanol | Sigma | I9516 | RNA extraction |
| Ethanol | Sigma | E7023-1L | RNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 170-8891 | Reverse transcription |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 175-5122 | Quantative PCR |
| miRNeasy Micro Kit (50) | Qiagen | 217084 | Kit for total RNA isolation |
| miScript II RT Kit (50) | Qiagen | 218161 | Kit for miRNA reverse transcription |
| miScript Sybr Green PCR Kit (200) | Qiagen | 218073 | Kit for real-time PCR expression analysis of miRNAs |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | For centrifugation of 1.5 mL or 2.0 mL tubes at different temperatures. Max speed - 21130 x g | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | For real-time PCR plate centrifugation at different temperatures. Max speed - 2039 x g | |
| My Cycler Thermal Cycler | Bio-Rad | For reverse transcription | |
| CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | For real-time PCR analysis | |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | For quality control of RNA isolation |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear | Bio-Rad | HSP9641 | For real-time PCR analysis |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-Rad | MSB1001 | For real-time PCR plate sealing |
| Research plus Single-Channel Pipette, Gray; 0.5-10 µL | Eppendorf | UX-24505-02 | For pipetting |
| PIPETMAN Classic Pipets, P20 | Gilson | F123600G | For pipetting |
| PIPETMAN Classic Pipets, P200 | Gilson | F144565 | For pipetting |
| Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 µL | Gilson | 17011782 | For pipetting |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher Scientific | R0551 | Improves total RNA isolation efficiency |
| Posi-Click 1.7 mL Tubes, natural color | Denville | C2170 | RNA isolation and storage; reagent mix |
| Thermal Cycling Tubes -0.2 mL Individual Caps, Standard 0.2 mL tubes with optically | Denville | C18098-4 (1000910) | Reverse transcription reaction |
| Sharp 10 Precision barrier Tips | Denville | P1096-FR | For pipetting |
| Sharp 20 Precision barrier Tips | Denville | P1121 | For pipetting |
| Sharp 200 Precision barrier Tips | Denville | P1122 | For pipetting |
| Tips LTS 1 mL Filter | Rainin | RT-L1000F | For pipetting |
| miScript Primer Assay (200) | Qiagen | (it changes according to the miRNA) | For real-time PCR analysis |
| Gradient Master ver 5.3 Model 108 | BioComp Instruments | For preparation of sucrose gradients | |
| trichloroacetic acid | Sigma Aldrich | T6399 | |
| acetone | Sigma Aldrich | 650501 | |
| Tris hydrochloride | Amresco | M108 | |
| dithiothreitol | Fisher Scientific | BP172 | |
| iodoacetamide | Gbiosciences | RC-150 | |
| sequencing grade modified trypsine, porcine | Promega | V5111 | |
| ammonium bicarbonate | BDH | BDH9206 | |
| formic acid, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A117 | |
| methanol, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A454 | |
| acetonitrile, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A996 | |
| Protein LoBind tubes 0.5 mL | Eppendorf AG | 22431064 | |
| Protein LoBind tubes 1.5 mL | Eppendorf AG | 22431081 | |
| HLB µElution plate 30 µm | Oasis | 186001828BA | |
| SpeedVac concentrator | Thermo Scientific | Savant SPD2010 | |
| sonicator | Qsonica | Oasis180 | |
| centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend micro 21R | |
| LC trap column PepMap 100 C18 | Thermo Scientific | 160454 | |
| LC separation column PepMap RSLC C18 | Thermo Scientific | 164536 | |
| mass spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Elite ion trap mass spectrometer | |
| MSConvert software | ProteoWizard Toolkit | ||
| Sorcerer-SEQUEST software | Sage-N Research, Inc. |
References
- Pourpirali, S., Valacca, C., Merlo, P., Rizza, S., D’Amico, S., Cecconi, F. Prolonged pseudohypoxia targets ambra1 mrna to p-bodies for translational repression. PLoS ONE. 10, e0129750 (2015).
- Andres, A. M., Tucker, K. C., Thomas, A., Taylor, D. J., Sengstock, D., Jahania, S. M., Dabir, R., Pourpirali, S., Brown, J. A., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W., Mentzer, R. M. Jr, Gottlieb, R. A. Mitophagy and mitochondrial biogenesis in atrial tissue of patients undergoing heart surgery with cardiopulmonary bypass. JCI Insight. 2, e89303 (2017).
- Kislinger, T., Cox, B., Kannan, A., Chung, C., Hu, P., Ignatchenko, A., Scott, M. S., Gramolini, A. O., Morris, Q., Hallett, M. T., Rossant, J., Hughes, T. R., Frey, B., Emili, A. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: Combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
- Kren, B. T., Wong, P. Y., Shiota, A., Zhang, X., Zeng, Y., Steer, C. J. Polysome trafficking of transcripts and micrornas in regenerating liver after partial hepatectomy. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, G1181-G1192 (2009).
- Gottlieb, R. A., Pourpirali, S. Lost in translation: Mirnas and mrnas in ischemic preconditioning and ischemia/reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 95, 70-77 (2016).
- Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Lorsch, J. Methods in enzymology. Laboratory methods in enzymology: Rna. Preface. Methods in Enzymology. 530, xxi (2013).
- Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mrnas. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
- He, S. L., Green, R. Polysome analysis of mammalian cells. Methods in Enzymology. 530, 183-192 (2013).
- Molotski, N., Soen, Y. Differential association of micrornas with polysomes reflects distinct strengths of interactions with their mrna targets. RNA. 18, 1612-1623 (2012).
- Maroney, P. A., Yu, Y., Fisher, J., Nilsen, T. W. Evidence that micrornas are associated with translating messenger rnas in human cells. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1102-1107 (2006).
- Paul, P., Chakraborty, A., Sarkar, D., Langthasa, M., Rahman, M., Bari, M., Singha, R. S., Malakar, A. K., Chakraborty, S. Interplay between mirnas and human diseases. Journal of Cellular Physiology. 233, 2007-2018 (2018).
- Rupaimoole, R., Slack, F. J. Microrna therapeutics: Towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 203-222 (2017).
- Nelson, P. T., Hatzigeorgiou, A. G., Mourelatos, Z. Mirnp:Mrna association in polyribosomes in a human neuronal cell line. RNA. 10, 387-394 (2004).
- Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a mirna blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1108-1114 (2006).
- Kim, J., Krichevsky, A., Grad, Y., Hayes, G. D., Kosik, K. S., Church, G. M., Ruvkun, G. Identification of many micrornas that copurify with polyribosomes in mammalian neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 360-365 (2004).
- Androsavich, J. R., Chau, B. N., Bhat, B., Linsley, P. S., Walter, N. G. Disease-linked microrna-21 exhibits drastically reduced mrna binding and silencing activity in healthy mouse liver. RNA. 18, 1510-1526 (2012).
- Kraushar, M. L., Thompson, K., Wijeratne, H. R., Viljetic, B., Sakers, K., Marson, J. W., Kontoyiannis, D. L., Buyske, S., Hart, R. P., Rasin, M. R. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the rna-binding protein hu antigen r. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , E3815-E3824 (2014).
- McClatchy, D. B., Ma, Y., Liu, C., Stein, B. D., Martinez-Bartolome, S., Vasquez, D., Hellberg, K., Shaw, R. J., Yates, J. R. 3rd Pulsed azidohomoalanine labeling in mammals (palm) detects changes in liver-specific lkb1 knockout mice. Journal of Proteome Research. 14, 4815-4822 (2015).
- Schiapparelli, L. M., McClatchy, D. B., Liu, H. H., Sharma, P., Yates, J. R. 3rd, Cline, H. T. Direct detection of biotinylated proteins by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13, 3966-3978 (2014).
- Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6, 359-362 (2009).
- Rajalingam, D., Loftis, C., Xu, J. J., Kumar, T. K. Trichloroacetic acid-induced protein precipitation involves the reversible association of a stable partially structured intermediate. Protein Science. 18, 980-993 (2009).
- Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31, 3573-3579 (2010).
- Sashital, D. G., Greeman, C. A., Lyumkis, D., Potter, C. S., Carragher, B., Williamson, J. R. A combined quantitative mass spectrometry and electron microscopy analysis of ribosomal 30s subunit assembly in e. Coli. Elife. 3, (2014).
- Liang, S., Bellato, H. M., Lorent, J., Lupinacci, F. C. S., Oertlin, C., van Hoef, V., Andrade, V. P., Roffé, M., Masvidal, L., Hajj, G. N. M., Larsson, O. Polysome-profiling in small tissue samples. Nucleic Acids Research. 46, e3 (2018).
