Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Dynamische Proteomic en miRNA analyse van Polysomes van geïsoleerde muis hart na Langendorff perfusie

doi: 10.3791/58079 Published: August 29, 2018

Summary

Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van Polysoom profilering op het hart van de geïsoleerde geperfundeerd muis. We worden methoden beschreven voor perfusie van het hart, Polysoom, profilering en analyse van de fracties van de Polysoom met betrekking tot mRNAs, miRNAs en de Polysoom Proteoom.

Abstract

Studies in dynamische veranderingen in eiwit vertaling vereisen gespecialiseerde methoden. Hier onderzochten we veranderingen in nieuw-gesynthetiseerd eiwitten in reactie op de ischemie en reperfusie met behulp van het hart van de geïsoleerde geperfundeerd muis in combinatie met Polysoom profilering. Om verder te begrijpen de dynamische veranderingen in eiwit vertaling, wij gekenmerkt de mRNAs die werden geladen met cytosolische ribosomen (polyribosomes of polysomes) en ook teruggewonnen mitochondriale polysomes en vergeleken van mRNA en eiwit verdeling in de hoogrenderende breuken (vele ribosomen gekoppeld aan mRNA), laag-efficiëntie (minder ribosomen aangesloten) waaronder ook mitochondriaal polysomes, en de niet-vertalen van breuken. miRNAs kunt ook koppelen aan mRNAs die worden vertaald, waardoor de efficiëntie van de vertaling, onderzochten we de verdeling van de miRNAs over de fracties. De verdeling van mRNAs, miRNAs en eiwitten werd onder basale geperfundeerd voorwaarden, aan het einde van 30 min van globale neen-flow ischemie en na 30 min van reperfusie onderzocht. Hier presenteren we de gebruikte methoden voor het bereiken van deze analyse — met name de benadering van optimalisatie van eiwit extractie uit het verloop van de sucrose, als dit is niet beschreven voordat — en enkele representatieve resultaten opleveren.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het hart komt tegemoet aan de schade van ischemie (I) en reperfusie (R) op een dynamische wijze. Er is echter weinig inzicht in acute wijzigingen in de eiwitsynthese tijdens de reactie. Om aan te pakken dit, wij profiteerde van de gevestigde methode van Polysoom1 ter identificatie van wijzigingen in eiwit overvloed die overeenkomen met herverdeling van ribosomen en translationeel regelgevende factoren van cytosol te polysomes, profilering en de stijging van de nieuw samengestelde eiwitten (OvN's). In de omgeving van I / R, de toename van nieuwe eiwitsynthese plaatsvindt in een tijdsbestek dat strookt met de transcriptie van nieuwe mRNAs2; Bovendien is verschil tussen mRNA uitdrukking niveaus en eiwit overvloed gerapporteerde3geweest. Om deze redenen, die wij hebben gekozen voor het analyseren van de wijzigingen in de dynamische Proteoom, zoals blijkt uit eiwit vertaling. Om dit te doen, we mRNA te kwantificeren in de Polysoom breuken, en analyseren van de samenstelling van eiwit in de Polysoom breuken. Ten slotte, omdat microRNAs (miRs) beschikbaarheid van mRNAs vertaaldienst reguleren en met de efficiëntie van eiwit vertaling4,5 interfereren kan, onderzochten we de verdeling van miRs in de Polysoom-fracties, zich te concentreren op de reactie op ik / R.

We kozen de geïsoleerde Langendorff perfusie muismodel en geoogste weefsel onder basale voorwaarden voor continue perfusie, na 30 min global neen-flow ischemie en na 30 min van ischemie gevolgd door 30 min van reperfusie te gebruiken. We solubilized het hartweefsel en gescheiden polysomes over een helling van sacharose, gevolgd door Proteoom analyse en selectieve opsporing van mRNAs en miRNAs door PCR en microarray, respectievelijk. Deze combinatie van methoden vertegenwoordigt een krachtige aanpak voor het begrip van de dynamische Proteoom, waardoor gelijktijdige opsporing van mRNA, miRNA, en OvN's, evenals de herverdeling van regelgevende eiwitten, miRNA en mRNA tussen de fracties van het nontranslating, lage-efficiëntie polysomes en hoog rendement polysomes (Zie Figuur 1). Inzicht in de dynamische regulering van dit proces zal worden uitgebreid door de verdere analyse van fosforylering van belangrijke regelgevende factoren zoals eIF2α of mTOR. Deze individuele stappen worden nu in detail beschreven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle dierlijke studies werden uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren van de institutionele en goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Cedars-Sinai Medical Center.

1. Langendorff perfusie van het hart van de muis

  1. Langendorff perfusie van muis hart met ischemie en reperfusie
    1. Beheren van intraperitoneaal pentobarbital natrium 70 mg/kg tot de volwassen muis (8-week-oud, man, C57BL6/j). Bevestig diepe verdoving door gebrek aan terugtrekking tot teen snuifje.
    2. Anticoagulate met intraperitoneaal heparine 500 U/kg.
    3. Open de borst via sternale insnijding. Open het middenrif en snijd langs de grens van de ribben aan de anterieure axillaire as. Vervolgens snijd de anterieure axillaire as tot de voorpoot om volledig open de thoracale kooi. Na, het visualiseren van het hart, de oplopende aorta klem met een tang en snel accijnzen het hart. De dood is te wijten aan exsanguination. Plaats van het hart in koude Krebs (NaCl 6.9 g/L, KCl 0.35 g/L, NaHCO3 2,1 g/L, KH2PO4 0.16 g/L, MgSO4 0.141 g/L, glucose 2 g/L en CaCl2 0.373 g/L).
    4. De aorta cannulate met een bot-tip naald en perfuse het hart retrogradely met Krebs oplossing in constante druk modus.
    5. Na een periode van stabilisatie van 15 min, door het hart te onderwerpen aan een globale neen-flow ischemie gedurende 30 minuten gevolgd door reperfusie voor 30 min.
    6. Oogst harten na 15 min basislijn perfusie, na 30 min ischemie, of na 30 min reperfusie. Trim uit de atria en module-freeze het weefsel in vloeibare stikstof.
    7. Bewaren bij-80 ° C tot gebruik

2. de weefsels homogenisering, solubilisatie en Sucrose dichtheid kleurovergang sedimentatie

  1. Kleurovergang voorbereiding
    1. Bereiden van 2 oplossingen (15% en 50%) van 100 mL sacharose, mengen van 4 mL NaCl, 2,5 M;
      0,8 mL MgCl2 1,25 M; 1 mL 1 M Tris-HCl, pH 7.5; 15 g of 50 g van sacharose (voor 15% en 50%, respectievelijk); ultrazuiver water tot 100 mL; en xyleen cyanol (0,02 mg/mL) kleur van de 15%-oplossingligttussen
    2. Filteren van elke oplossing (0,22 µm filters)
    3. De dag die het verloop gebruikt wordt, 40 mL van elk sacharoseoplossing bereiden en cycloheximide toevoegen aan elke oplossing te bereiken van de uiteindelijke concentratie van 100 µg/mL
      1. Een kleurovergang maker gebruiken om te bereiden een mix tussen de 15% en 50% sucrose-oplossingen
      2. Vul het linker compartiment met 5 mL van de 15% sacharose verloop
      3. Vul de juiste compartiment met het kleurverloop 50 gewichtspercenten sacharose
      4. De kraan open en zet de pomp aan het roer van de twee kleine compartimenten met magneetroerder
      5. Gebruik een buis verbonden met de tweede kraan toe de gemengde sacharoseoplossing te stromen in een ultra-centrifugeren buis met dunne wanden. Eindvolume zullen ongeveer 10 mL.
    4. Houden van de hellingen bij 4 ° C (overnachting, indien nodig, maar niet langer)
  2. Homogenisering van hartweefsel
    1. Meng vers of bevroren hart met een polytron in gefilterde lysis-buffermengsel (gewijzigd voor sacharose kleurovergang fractionering) met 100 mM KCl, 20 mM Tris pH 7.5, 5 mM MgCl2, 0,4% NP-40. Cycloheximide 100 µg/mL bewaken Polysoom structuur, 0.1 U RNase remmer en proteaseinhibitor cocktail (1 tablet voor 50 mL) bevatten.
    2. Incubeer de lysate op ijs 15 min.
    3. Centrifugeer bij 18.000 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C tot onoplosbare materiaal verwijderen en het verzamelen van de bovendrijvende substantie.
    4. Reserveren 50 µL voor bepaling van de eiwitten, RNA isolatie en RNA integriteit analyse (Zie Figuur 2).
    5. Het supernatant (500-100 µL) van de laag op de top van de hellingen en de buizen met lysis-buffermengsel in evenwicht te brengen.
  3. Sedimentatie en verzameling van breuken
    1. Ultracentrifugatie voor 120 min op 37.000 rpm bij 4 ° C in een swingende emmer rotor uitvoeren. Volgens de fabrikant, dit komt overeen met 228,000 x g op maximale straal.
    2. Verzamelen van elk verloop als 17 breuken (rond 600 µL elke fractie) in microcentrifuge buizen met continue monitoring van absorptie bij 254 nm (OD254).
    3. Programma van de Fractie collector als volgt:
      1. Gooi de eerste 3 min van collectie (overeenkomend met de vloeistof opgenomen in de buizen voor de kleurovergang)
      2. Van 4 tot 19 min, verzamelen de breuken op de snelheid van 1 mL/min bij 17 breuken.
    4. Plaats de breuken op ijs zodra elk is verzameld. Bevriezen monsters bij-80 ° C, als ze niet onmiddellijk worden verwerkt. Een typische UV densitometric overtrek van het verloop is als het is verzameld afgebeeld in Figuur 1.

3. isolatie en analyse van mRNAs van Polysoom en Nontranslating breuken

  1. Extractie van mRNA
    1. Ontdooi de breuken op ijs, alsof zij flash-bevroren na collectie
    2. Breng 200 µL van elke breuk aan een verse buis
      Opmerking: Bij deze stap twee of meer opeenvolgende breuken kunnen worden samengevoegd samen. Het moet zorgvuldig gebeuren na het analyseren van de OD254 grafiek, zodat Polysoom en niet-Polysoom breuken niet krijgen gemengd.
    3. Voeg 10 ng van luciferase RNA als interne controle aan elk monster voor normalisatie doel.
      Opmerking: Luciferase inleidingen moeten worden gebruikt als een interne controle te normaliseren van de resultaten.
    4. Voeg 700 µL van RNA extractie reagens (monofasische oplossing van fenol en guanidine isothiocyanaat; Zie Tabel van materialen) aan elke buis. Meng goed en Incubeer de buizen voor 5 min op RT (kamertemperatuur).
    5. Toevoegen van 140 µL chloroform en vortex voor 15 s. Incubate voor 2-3 min op RT.
    6. Centrifugeer de monsters gedurende 15 minuten staan bij 12.000 x g bij 4 ° C.
    7. Zorgvuldig overbrengen in de bovenste waterfase een nieuwe buis.
    8. Aangezien de RNA-inhoud van de fracties niet hoog is, toevoegen aan elke buis 10 µg glycogeen als drager.
    9. 350 µL isopropanol toevoegen aan elke buis. Meng goed en Incubeer bij-20 ° C gedurende 1 uur te verhogen van het rendement.
    10. Centrifugeer gedurende 15 min bij 12.000 x g bij 4 ° C.
    11. Verwijder het supernatant en toevoegen van 700 µL ethanol 75% om te wassen van de RNA-pellet.
    12. Centrifugeer gedurende 5 min bij 7.500 x g bij 4 ° C.
    13. Verwijder van ethanol en laat de lucht van de pellet 10 – 15 minuten drogen.
      Opmerking: Overdreven drogen de RNA-pellet voorkomt u dat de volledige solubilisatie in water.
    14. Resuspendeer de pellet RNA in 50 μl van RNase-vrije ultrazuiver H2O.
    15. Incubeer de monsters gedurende 10 minuten bij 55 ° C.
    16. 2 μL van elk monster te gebruiken voor het meten van de kwaliteit en de kwantiteit van de uitgepakte RNA en slaan de rest bij-80 ° C.
  2. Omgekeerde transcriptie en qPCR
    1. Gebruik 4 μL van omgekeerde transcriptie cDNA synthese kit (Zie Tabel of Materials) voor een 20 μL reactie. Bereiden de supermix volgens het aantal monsters. Overdracht van het vereiste volume aan elke buis en 5 μL van de input RNA aan elke buis toe te voegen. Dit volume kan worden gecorrigeerd om relevant zijn voor het bereik van de arbeidsvoorwaarden van Taq polymerase.
    2. Incubeer de buizen in een thermische cycler met het volgende programma dat door de fabrikant aanbevolen: 5 min bij 25 ° C, 20 min omgekeerde transcriptie gedurende 20 minuten bij 46 ° C, en reverse-transcriptase inactivatie voor 1 min bij 95 ° C.
    3. QPCR met de geoptimaliseerde programma voor elk paar inleidingen worden uitgevoerd.
      Opmerking: Voor het detecteren van de aanwezigheid van bepaalde mRNAs in breuken, gelijk volume van elke fractie (van de geïsoleerde RNA) moet worden gebruikt voor omgekeerde transcriptie.
  3. Analyse van de resultaten
    1. De Ct-waarde van het betrokken gen en de luciferase gebruiken voor het berekenen van de delta Ct-waarden
    2. Elke fractie delta Ct waarde wordt uitgedrukt als het percentage van de totaalwaarde van mRNA opgenomen in alle breuken visualiseren van de verdeling van de mRNA in de verschillende fracties (tabel 1)

4. isolatie en analyse van miRNAs van Polysoom breuken en Nontranslating breuken

  1. Winning van mRNA en miRNA
    Opmerking: Dit protocol volgt instructies van de fabrikant, met een paar veranderingen.
    1. Ontdooi de glycogeen en het besturingselement spike-in. Houd op ijs.
    2. 700 µL van miRNA extractie reagens aan 200 µL van gebundelde monster toevoegen.
    3. Voeg 1 µg/µL van glycogeen en meng het met behulp van de pipet. Incubeer het gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Voeg 3,5 µL van 1.6 x 108 spike-controle en meng het.
    5. Voeg 200 µL van chloroform en vortex voor ten minste 15 sec.
    6. Incubeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
    7. Centrifuge op 12.000 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C.
    8. Met behulp van een precisiepipet, overbrengen in het supernatant een nieuwe 1,5 mL-buis. Gooi de middenlaag en fasen.
    9. 1,5 x volume van 100% ethanol toevoegen aan het supernatant en meng het.
    10. Breng 700 µL van dit mengsel aan de miRNA extractie kolom samen en Centrifugeer het bij volledige snelheid voor 15 s bij RT en negeren de doorstroming; Herhaal deze stap met een resterende monster.
    11. 700 µL van de buffer 1 toevoegen aan de kolom samen en Centrifugeer het bij volledige snelheid voor 15 s bij RT; Gooi de doorstroming.
    12. Voeg toe 500 µL van buffer 2 aan de kolom samen en Centrifugeer het bij volledige snelheid voor 15 s bij RT; Gooi de doorstroming.
    13. Voeg 500 µL van 80% ethanol toe aan de kolom samen en Centrifugeer het op volle snelheid gedurende 2 minuten op RT; Gooi de doorstroming.
    14. Overdracht van de kolom een nieuwe 2 mL afgetopte buis, opent u het deksel en Centrifugeer het bij RT gedurende 5 min op volle snelheid; Gooi de doorstroming.
    15. Voeg 16 µL RNAse-gratis water toe aan de kolom en de centrifuge het op volle snelheid voor 1 min op RT. houden het eluaat op ijs of op te slaan bij-80 ° C voor toekomstige analyses.
      Opmerking: Twee microliters van elk monster kan worden gebruikt voor analyse van de OD.
  2. Omgekeerde transcriptie
    1. Voorbereiden op het ijs. Voor elke 20 µL RT-PCR reactie, Voeg 4 µL van de miRNA RT buffer, 2 µL van nucleïnezuren, 9 µL van totale RNA, 2 µL van enzym en 3 µL RNAse-gratis water; Meng het en draai het naar beneden kort.
    2. De thermische Cycler als volgt instellen:
      37 ° C gedurende 60 minuten;
      95 ° C gedurende 5 minuten;
      4 ° C houdt.
    3. Verwijder de buizen uit de thermische cycler en voeg 200 µL RNAse-gratis water. Bewaren bij-20 ° C of doorgaan naar de PCR in real time.
  3. PCR in real time
    Opmerking: Dit protocol volgt 96 goed plaat formaat. De mix van de reactie op ijs bereiden.
    1. Bereiden van PCR reactie mix en toevoegen van cDNA (vanaf miRNAs hierboven) volgens het bereik door het protocol aanvaard. Meerdere reacties kunnen worden opgesteld in de batch.
    2. Voeg een totaal van 25 µL van het PCR-mix + cDNA in elk putje.
    3. Het zegel van de plaat met behulp van een optische plaat zegel.
    4. Centrifugeer de plaat voor 1 min bij 1.000 x g bij kamertemperatuur.
    5. Programma de real-time cycler als volgt:
      Eerste activeringsstap bij 95 ° C gedurende 15 minuten;
      3-staps fietsen: denaturatie bij 94 ° C gedurende 15 s; gloeien bij 55 ° C gedurende 30 s; uitbreiding bij 70 ° C gedurende 30 s (uitvoeren verzamelen van de gegevens van de fluorescentie); Voeg toe 40 cycli;
      Smelten-curve volgens cycler standaard.
  4. Vergelijkende analyse
    1. Voorbeeld van normalisatie (Zie tabel 2):
      1. Vindt u de minimale waarde van SCM.
      2. Normaliseren alle SCM waarden tot dit minimum.
      3. Deze waarde van de Ct-waarden voor miRNAs van belang (MOI) en referentie-gen (REF) aftrekken.
      4. Analyseren van gegevens met behulp van de formule 2-ΔCt .

5. Proteoom-analyse

  1. Winning van eiwitten uit Polysoom breuken
    1. Verzamelde sacharose breuken combineren tot drie definitieve breuken. Markeer de breuken als zware (hoog rendement polysomes in gepoolde fracties 4, 5, 6 en 7 met de hoogste concentratie van sacharose, onderkant van de kleurovergang buis), licht (lage efficiëntie polysomes in gepoolde fractie 8, 9, 10 en 11, midden van de kleurovergang buis) en niet-vertalen (gepoolde fracties 12, 13, 14 en 15 met de laagste concentratie van sacharose; boven aan de helling buis). Eiwit assay uitvoeren op gebundelde breuken.
    2. 100% aandelen van Trichloorazijnzuur (TCA) voor te bereiden en op te slaan bij 4 ° C in het donker. Meng 0,5 mL van het monster met 60 µL van 100% TCA en Incubeer bij-20 ° C's nachts in het donker.
      Opmerking: Gebruik 1,5 mL laag eiwitgehalte retentie buizen (Zie Tabel van materialen).
    3. Na een incubatieperiode van overnachting, ontdooien het monster op ijs en centrifuge 15.000 x g4 ° C gedurende 30 min. Discard supernatant.
      Opmerking: 100 µg totaal eiwit in monster geeft zichtbaar eiwit pellet aan de onderkant van de buis.
    4. Vooraf chill aceton in vriezer van-20 ° C. 0,5 mL koude aceton aan de eiwit pellet en centrifuge 15.000 x g4 ° C gedurende 15 min. Discard supernatant toevoegen. Herhaal deze stap tweemaal.
    5. Lucht drogen de pellet. Resuspendeer de pellet in 360 µL van 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8).
      Opmerking: Indien nodig, gebruik een puls ultrasoonapparaat om resuspendeer de pellet.
    6. Voeg 40 µL van 0,1 M dithiothreitol (eindconcentratie 10 mM) en Incubeer bij 55 ° C op shaker voor 45 min. toevoegen 50 µL van 0,15 M iodoacetamide (eindconcentratie 17 mM) en Incubeer bij kamertemperatuur op shaker gedurende 30 min. in het donker.
    7. Bereid trypsine oplossing: resuspendeer 20 µg trypsine in 100 µL van 50 mM Ammoniumbicarbonaat. Op 1:50 (w/w) overeenkomstige hoeveelheid trypsine oplossing toevoegen aan monster trypsine: eiwitverhouding, ervoor zorgen dat pH 8 en incubeer op shaker bij 37 ° C's nachts.
      Opmerking: Toevoegen 1 M Ammoniumbicarbonaat om pH te brengen tot en met 8.
    8. Na de spijsvertering van de trypsine, cool toevoegen het monster, centrifuge kort in de bench centrifuge, 10% mierenzuur aan pH 2-3 te doven de trypsine-activiteit, en ga verder met monster ontzouten.
      Opmerking: Voor het monster ontzouten µ-elutie plaat gebruiken.
    9. Het sorptiemiddel voorwaarde in de putten van 96 goed plaat met 200 µL van methanol met behulp van vacuüm driemaal gevolgd door conditionering van 200 µL van 0,1% mierenzuur driemaal. Laden van de steekproef en het uitvoeren van een monster wassen met 200 µL van 0,1% mierenzuur drie keer. Elueer de steekproef met 100 µL van 50% acetonitrile/0.1% mierenzuur tweemaal in laag eiwitgehalte retentie 0,5 mL buis.
      Opmerking: Het monster Elueer langzaam aanvankelijk met behulp van de zwaartekracht gevolgd door laag vacuüm op.
    10. Damp monster eluaat volledig in met behulp van de concentrator en hetzij rechtstreeks uitvoeren massaspectrometrie analyse of winkel bij-80 ° C tot gebruik.
  2. Analyse van de Spectrometrie van de massa
    1. Elke pellet (bestaande uit de al peptiden) in 50-100 µL reconstrueren en 1 µL injecteren massaspectrometer.
      Opmerking: Optimaliseren reconstitutie en injectie volumes om te verkrijgen maximale intensiteit LC/MS/MS signaal. In ons geval, het maximale signaal (totale ion huidige; TIC) in het hart van de scan was binnen het bereik van 1E8 tot 2E9.
    2. Gebruik een val kolom C18 (300 µm i.d. x 5 mm, 5 µm, 100A) gevolgd door peptide scheiding met behulp van C18 kolom (75 µm i.d. x 250 mm, 2 µm, 100Å) met een stroom tarief instelling 300 nL/min. Set de nano-source capillaire temperatuur tot 275 ° C en de spanning van de spray 2 kV.
    3. Een lineaire verloop van 5-35% B voor 90 min, B van de 35 – 95% voor 3 min, houden op 95% B voor 7 min en evenwichtsinstelling op 5% B voor 25 min (A: 0,1% mierenzuur/water en B: 0,1% mierenzuur in acetonitril) toepassen. Verwerven MS2 spectra voor de 15 hoogste intensiteit ionen van elke MS1 scan met behulp van de CID-modus. Gebruik 3 massaspectrometrie replicatieonderzoeken voor elk monster geanalyseerd.
      Opmerking: Optimaliseren en de proefomstandigheden en parameters gebruiken die geschikt voor uw monsters op de bijzondere massaspectrometrie instrument zijn. De voorwaarden/parameters vermeld in sectie 5.2. werden gebruikt en geoptimaliseerd in ons laboratorium.
  3. Eiwit identificatie/kwantificatie
    1. Na analyse van de Spectrometrie van de massa, door de ruwe spectra-bestanden te converteren naar compatibele mzXML bestanden met behulp van de MSConvert software (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html).
    2. Indienen van de geconverteerde bestanden in SEQUEST zoekmachine met de zoekcriteria opgeven, bijvoorbeeld UniProtKB/Swiss-Prot muis database (meest up-to-date canonieke herzien); semi-enzym verteren met behulp van trypsine (na KR /-); met maximaal 2 gemiste breuklijnen; voorloper massa bereik: 400 tot 4.500 amu; statische wijziging: carbamidomethyl (C) 57.021465 amu; Peptide massa tolerantie: 50 ppm; fragment van de massale type: exacte.
      Opmerking: Andere eiwit database Zoek motoren en gegevens pijpleidingen kunnen worden gebruikt. Als database gebruikt voor bijvoorbeeld rat, die minder volledig zijn dan databases voor muis en mens is, moet u wellicht te zoeken tegen de muis (of mens) databases te verhogen Proteoom dekking. In dit geval moet redundantie in de namen van het eiwit worden verwijderd.
    3. Een post search-analyses uit te voeren. Stel de filters voor het bekijken van de gegevens. Bijvoorbeeld, stel de waarschijnlijkheid van een minimale eiwit (eiwit drempel) als 95% of 99%, dat wil zeggen, alleen de eiwitten waarvoor een statistische analyse impliceert 95% of 99% kans dat aanwezig in het monster wordt getoond. Instellen van het filter voor peptide drempel (bijvoorbeeld 95%), dat wil zeggen, een minimale kans dat zal worden gebruikt bij het bepalen of een spectrum een peptide identificeert. Selecteer het minimumaantal peptiden die bepalen zullen of een eiwit aanwezig is (2 peptiden als een minimum voor eiwit identificatie wordt aanbevolen).
    4. Evalueren van geïdentificeerde eiwitten voor kwaliteit/kwantiteit. Zorg ervoor dat de proteotypic peptiden voor kwantificering worden gebruikt. Als isovorm wordt aangeduid ervoor zorgen bases op observatie van een al peptide bestaat uit een aminozuur volgorde die uniek zijn voor de specifieke isovorm. Een "vergelijkbaar" of hypothetische eiwitten moeten ondergaan vergelijking om te zien of de waargenomen peptiden correspondeert met een bekende eiwit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

mRNA analyse
mRNA resultaten kunnen worden uitgedrukt als een verdeling van een bepaalde mRNA in elke fractie (figuur 3A); voor kwantificering, polyribosomal vertalen breuken combineren en vergelijken met de niet-vertalen breuk (figuur 3B), presentatie van een verhouding van mRNA overvloed in vertalen naar nontranslating breuken. Aanvullende informatie is verkregen door behandeling van de hoog rendement Polysoom breuken los van lage-efficiëntie Polysoom breuken (en los van nontranslating breuken). Dit is vooral belangrijk bij het analyseren van de miRNAs, die zijn verrijkt in de laag-efficiëntie breuken (waar ze interfereren met eiwit vertaling van hun doel mRNAs).

Vertegenwoordiger resultaten voor een bepaalde mRNA die wijzigingen de verdeling ervan over de breuken van het vertalen en nontranslating nadat de muis harten werden onderworpen aan ischemie en ischemie/reperfusie ten opzichte van sham worden weergegeven in Figuur 4.

miRNA matrix analyse
Representatieve resultaten van een analyse van de matrix miRNA zijn afgebeeld in Figuur 5. Hier, een subset van miRNAs (douane-ontworpen matrix plaat) werden geanalyseerd in de gepoolde zware breuken die aangeeft dat 22 miRNAs werden geassocieerd met polysomes tijdens ischemie, 9 miRNas tijdens ischemie en reperfusie, met 7 die voor beide voorwaarden. Hieruit blijkt dat de vereniging van miRNAs in reactie op de stress van ischemie en reperfusie dynamisch is.

Proteoom-analyse
Analyse van zware, lichte en niet-vertalen van breuken van sham (control) monster:
881 van totale eiwitten werden geïdentificeerd door de Spectrometrie van de massa; 3, 46 en 208 proteïnen van totaal waren uniek naar zwaar, licht en niet-trans breuken, respectievelijk (figuur 6A). Het merendeel (88%) van mitochondriale ribosomal eiwitten (28 en 39S) werden geïdentificeerd in lichte fractie (36 uit 41) en een meerderheid (88%) van cytosolische ribosomal eiwitten (40S en 60S) algemeen werden geïdentificeerd in zowel lichte als zware breuken (53 van 60) bevestiging van efficiënte scheiding en proteomic vermogen naar geïdentificeerde zwaarder cytosolische vs lichter mitochondriale ribosomal eiwitten. De subset van geïdentificeerde ribosomal eiwitten mitochondriaal en cytosolische is afgebeeld in figuur 6B.

Figure 1
Figuur 1: typische UV-absorptie-Profiel van Polysoom breuken op sacharose helling. De eerste drie breuken vertegenwoordigen dode volume in de buis. De hoge efficiëntie (ultrahoog moleculair gewicht, HMW) breuken worden verzameld in breuken 4-7, de lage efficiëntie (laag molecuulgewicht, LMW) breuken in 8-11, en de niet-vertaling (en resterende cytosolische materiaal) wordt verzameld in () breuken 12-15 nontranslating, NTR). De rode lijn duidt geleidbaarheid en de blauwe trace duidt UV-absorptie bij 254 nm. Aan de rechterkant is een cartoon van een reageerbuis met sacharose kleurovergangen, weergegeven: verdeling van polysomes na sedimentatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: RNA integriteit controleanalyse op Bioanalyzer. RNA integrity aantal (RIN) totaal RNA van hart geheel lysate geïsoleerd. RIN is berekend volgens 18S en 28 pieken. RIN bereik: 1-10, en RIN = 10 vertegenwoordigt een zeer goede integriteit. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: vertegenwoordiger Profiel van mRNA distributie in sacharose verloop. Harten werden onderworpen aan basale Langendorff perfusie of ischemie en reperfusie (Ik / R). (A) hart lysates werden opgelost op sacharose helling en mRNA inhoud voor GAPDH (links) en COX4 (rechts) waren vastbesloten in elke fractie. Perceel toont relatieve mRNA overvloed in elke fractie (breuk nummer op x-as) voor basale perfusie (schijnvertoning, rode lijn en diamanten) en ischemie/reperfusie (Ik / R, blauwe lijnen en rechthoeken). Bovenop de plot zijn UV-absorptie met vermelding van de totale mRNA inhoud (licht grijze curve) en geleidbaarheid (rechte grijze glooiende lijn). Vakken geven aan hoe de breuken waren gebundeld. (B) staafdiagram perceel toont verhouding van mRNA overvloed in het vertalen (polysomes) versus nontranslating (NT) breuken voor GAPDH (links) en COX4 (rechts) mRNAs. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: vertegenwoordiger mRNA resultaten. Kwantificatie van één mRNA in de gepoolde fracties (HMW, LMW, NTR) wijzigingen volgens de experimentele groep tonen. Polysoom fractionering van muis hart werd uitgevoerd na Langendorff perfusie. Resultaten worden uitgezet als % van totale mRNA (bovenste deelvenster) en als de verhouding van polysomes (HMW + LMW) naar nontranslating breuk (NTR). Foutbalken geven resultaten uit 5 hart per groep (schijnvertoning, ischemie, of I / R). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: vertegenwoordiger miRNA resultaten. Venn-Diagram van een leertraject gericht miRNA analyse opdagen en werden miRNAs in zware breuk zwembaden van muizen monsters na hart ischemie of ischemie en reperfusie. Cut-off waarde: 1,5 vouwen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: eiwitten geïdentificeerd door massaspectrometrie. (A) Venn-diagram van de eiwitten gemeenschappelijk en uniek voor zwaar, licht en niet-trans breuken. (B) Subset van mitochondriale en cytosolische ribosomal eiwitten die worden geïdentificeerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: schematische werkstromen voor eiwit extractiemethoden getest. De eiwit-extractiemethoden werden getest met behulp van sham (control) monster en zware (hoog rendement polysomes) breuk met hoogste sacharosegehalte. Getallen in rood geven het aantal eiwitten die werden geïdentificeerd door de Spectrometrie van de massa; waar twee nummers worden weergegeven, zijn ze van twee aparte experimenten. De gedetailleerde beschrijving is opgenomen in de tekst. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

BREUKEN GENE Ct LUCIFERASE Ct ΔCt 2ΔCt SOM VAN ALLE BREUKEN % VAN ELKE BREUK Polysoom/NTR verhouding
Hoog rendement (HMW) 28.75 22.79 5.96 0.016 0.046 34.64 2,77
Lage efficiëntie (LMW) 28.43 22.63 5,80 0.018 38.81
Niet vertalen (NTR) 29.12 22.77 6.35 0,012 26.55
Polysoom/NTR Ratio = (HMW + LMW) / NTR

Tabel 1: Analyse van mRNA sample. Analysemethode van één mRNA wordt ook weergegeven voor de verschillende gepoolde fracties (HMW, LMW, NTR) na kwantitatieve PCR. ΔCt = gene Ct - luciferase Ct, en de 2ΔCt is 2ΔCt.

Vindt u de minimale waarde van SCM: 22.77
Voorbeeld 1 Voorbeeld 2 Monster 3
CT MOI 22.92 22.36 22,58
CT SCM 22.81 22.77 22,9
CT REF 23.27 23,55 23.19
Normaliseren alle SCM waarden tot dit minimum
Voorbeeld 1 Voorbeeld 2 Monster 3
CT SCM 0,05 0 0.13
Deze waarden van de Ct-waarden van de MOI en REF aftrekken
Voorbeeld 1 Voorbeeld 2 Monster 3
CT MOI 22.87 22.36 22.45
CT REF 23.22 23,55 23.06

Tabel 2: proeven van real-time PCR-berekening voor miRNA expressie vergelijking in Polysoom en nontranslating breuken. miRNAs van belang (MOI) en referentie-gen (REF) werden geanalyseerd in de gepoolde zware fracties van muizen na ischemie of ischemie/reperfusie. De Ct-waarden werden eerst genormaliseerd naar de piek-controle (SCM) Ct waarde, dan de 2-ΔCt -formule werd gebruikt voor het vergelijken van miRNA expressie.

Methode Monstervolume [mL] # van eiwitten geïdentificeerd Opmerkingen
FASP 1 227 bulk van sacharose neergeslagen op filter
aceton neerslag 0.6 372 viskeuze slib van sacharose aan de onderkant van de buis; 4:1 (reagens: monster) volumes; geen zichtbare eiwit pellet
chloroform/methanol neerslag 0.32 389 viskeuze slib van sacharose aan de onderkant van de buis; 8:1 (reagens: monster) volumes; geen zichtbare eiwit pellet
TCA neerslag (bij 4 ° C) 0,5 405, 415 geen sacharose neerslag; 0.12:1 (reagens: monster) volumes; zichtbaar pellet aan de onderkant van de buis
opnieuw neerslag 85, 60 extra TCA neerslag van het supernatans dat na het verzamelen van eerste pellet
TCA neerslag (bij-20 ° C) 0,5 440, 430 geen sacharose neerslag; 0.12:1 (reagens: monster) volumes; zichtbaar pellet aan de onderkant van de buis
opnieuw neerslag 81, 55 extra TCA neerslag van het supernatans dat na het verzamelen van eerste pellet

Tabel 3: Vergelijking van eiwit-extractiemethoden. FASP, neerslag van aceton, chloroform/methanol neerslag en TCA neerslag bij 4 ° C en -20 ° C werden geëvalueerd. Het doel was om te maximaliseren van het aantal eiwitten geïdentificeerd. TCA neerslag werden geëvalueerd op een tweede partij van materiaal te bevestigen reproduceerbaarheid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Polysoom profiel-analyse zorgt voor de studie van eiwit-vertaling door het analyseren van de translationeel status van een specifieke mRNA of de hele transcriptome6,7. Het is ook van groot nut wanneer lokale vertaling moet worden bestudeerd zoals synaptosomes8. Deze methode houdt traditioneel, de scheiding van mono - en polyribosomes en de bijbehorende mRNAs op een verloop van sacharose die kan gepaard gaan met genomic of proteomic technieken te verkrijgen van de beoogde resultaten6,9. Een recente studie uitgevoerd door onze fractie heeft bijvoorbeeld een post-transcriptional reguleringsmechanisme uitgevoerd in het hart van patiënten die een CPB, die ischemie/reperfusie letsel bootst geopenbaard. Voordeel halend uit Polysoom profiel analyse, hebben wij een verhoging in vertaling van nucleaire-gecodeerd mitochondriale eiwitten in hart na CPB procedure2getoond.

De dynamische Proteoom polyribosomal profiling hier gepresenteerde benadering kan onthullen wijzigingen in de bevolking van mRNAs geassocieerd met polyribosomes en de eiwitten die actief worden vertaald. Als vertaling van mRNAs wordt gedeeltelijk bepaald door miRNAs, kan analyse van miRNAs in deze breuken onthullen aanvullende inzichten. In feite, hebben verscheidene studies bewerkt deze methode en bleek het een geschikte en betrouwbare aanpak te onderzoeken de miRNA modus van voorschrift10,11.

Veel studies zijn uitgevoerd in het laatste decennium speuren in de rol van miRNAs, gezien hun belang in verschillende biologische functies12,13. Aangezien miRNAs optreden door middel van base-paring met tegenhanger mRNAs te markeren voor afbraak, is Polysoom profiel analyse verricht en aangetoond dat miRNAs in feite te in de Polysoom breuken vinden zijn, gericht op vertalen mRNAs14, 15 , 16. miR-21 is een goed voorbeeld waar het wordt geassocieerd met een lage repressie en zwakke polysomes bindend in normale cellen, terwijl in kankercellen, de associatie met de polysomes wordt verhoogd en de repressieve effect veel sterker17 is.

In deze studie, Real-time PCR analyse werd gedaan met behulp van de Ct-waarden van de miRNAs van belang (MOI), de Ct-waarden van de spike bepalen miRNA (SCM) technische variaties en de Ct-waarde van een referentie-gen of miRNA (REF) te verminderen die stabiel onder monsters. De eerste stap was om te normaliseren van de Ct-waarden van de MOI en de REF met de Ct-waarden van de SCM. Vervolgens was er een tweede stap normalisatie van de MOI aan de REF en de resulterende waarde werd gebruikt voor de berekening van de 2-ΔCt -formule. Deze waarden of vouw-verandering kan worden gebruikt om aan te tonen van de verschillen tussen de groepen.

Aangezien de extractie van eiwitten is moeilijk Polysoom breuken, hebt allermeest naar de studies die tot nu toe uitgevoerd gebruikt de breuken direct westelijke vlekkenanalyse. Ze gewoon sediment het eiwitgehalte van elke fractie en meng het met SDS-loading buffer te gebruiken voor SDS-pagina analyse8,18. Hier hebben we een methode die ons in om niet alleen uittreksel mRNAs en miRNAs staat na fractionering, maar ook voor het verkrijgen van peptides en proteïnen met een hoge kwaliteit om door te gaan met de analyse van de Spectrometrie van de massa.

Deze aanpak kan worden uitgebreid door actief het meten van de nieuw samengestelde eiwitten met behulp van metabole labeling zoals biorthogonal aminozuur homolog, zoals azidohomoalanine (AHA) voor methionine19,20. AHA zorgt opneming gevolgd door klik chemie voor opneming van een Biotine label, gevolgd door daar zuivering van alle eiwitten die AHA opgenomen. Hierdoor definitieve identificatie van onlangs gesynthetiseerde eiwitten — het andere deel van de dynamische Proteoom. Detectie van miRNAs die onder de breuken van het vertalen en nontranslating in reactie op een prikkel verspreiden (hier met I / R) kunt ondervraging van de dynamische regulering van eiwit vertaling. De factoren die miRNAs tot de omgeving van ribosoom gebonden mRNA werven blijft echter om te worden geïdentificeerd en systematisch onderzocht.

In onze studie, naast TCA neerslag, we drie andere methoden voor het eiwit extractie van Polysoom breuken getest: i) FASP (filter-aided monstervoorbereiding)21, ii) aceton neerslag, en iii) chloroform/methanol neerslag. De geschiktheid van de methoden werd geëvalueerd op basis van zowel de mogelijkheid voor het verwerken van breuken met een hoge concentratie van sacharose (tot 50%) en aantal eiwitten geïdentificeerd door massaspectrometrie (Figuur 7 en tabel 3).

Voor de FASP methode, wij het protocol van de bereiding van de monsters gegeven door een FASP eiwit spijsvertering Kit die in dienst van een eenheid van de ultrafiltratie met een relatieve moleculaire massa licht-donkerscheiding van 30 kDa gevolgd. Deze filter eenheid diende als een instrument voor wasmiddel verwijdering, buffer uitwisseling, vertering van de eiwitten en peptide elutie met de mogelijkheid om een hoog-moleculair-gewicht stoffen (eiwitten en DNA) die anders met de latere peptide scheiding interfereren zou behouden 21. kort, het monster werd gemengd met ureum-bevattende buffer en geladen op eenheid spin filter met draaiende stappen als iodoacetamide oplossing, trypsine oplossing en natriumchloride-oplossing (elutie) werden later toegevoegd. Definitieve filtraat die verteerd peptiden was aangezuurde door TFA, ontzout en opgeslagen voor spectrometrische analyse. Met behulp van deze methode, echter het grootste deel van geprecipiteerde sacharose gestaag opgelopen op de bovenkant van het filter, waardoor het centrifugeren en wassen stappen moeilijk.

Voor aceton neerslag en chloroform/methanol neerslag, werden meerdere volumes van oplosmiddelen te precipiteren eiwitten uit een enkele hoeveelheid monster nodig. Dit beperkt de grootte van monstervolume toegepast bij de precipitatie werd uitgevoerd in 1,5 mL buisjes (eiwit laag-retentie buizen). Ook de viskeuze slib van sacharose verzameld op de bodem van de buizen na neerslag voor beide methoden en waren er geen zichtbare pellets aan de onderkant van de buis en de vloeibare interface na aceton neerslag en chloroform/methanol neerslag, respectievelijk.

Tabel 3 en Figuur 7 weergeven de vergelijking van vier eiwit extractiemethoden die we gebruikt om te optimaliseren onze experimentele workflow De rode cijfers gegeven bij elke methode (Figuur 7) vertegenwoordigen het aantal eiwitten die werden geïdentificeerd door de Spectrometrie van de massa (zie hoofdstuk 5.2 en 5.3). Hoewel monster volumes zijn opgebruikt voor elke methode verschilden, chloroform/methanol en TCA neerslag geleid tot hoogste aantal eiwitten geïdentificeerd. Echter, als gevolg van de nadelen hierboven (monster volumebeperking en sacharose neerslag) vermeld, hebben we gekozen voor TCA neerslag voor latere experimenten.

Om te zoeken naar de optimale voorwaarden voor het monster verwerking, werd TCA neerslag uitgevoerd bij verschillende temperaturen en TCA concentraties22,23,24. Zo, wij uitgevoerd een neerslag met 10,7% TCA bij 4 ° C en -20 ° C en verder neergeslagen het supernatant met extra 60 µL van TCA (laatste 19,4% TCA) nadat pellets werden verzameld. Dit resulteerde in vier pellets die werden geanalyseerd gescheiden door massaspectrometrie. Bovendien, herhaald wij het hele protocol tweemaal om ervoor te zorgen dat de verkregen resultaten reproduceerbaar zijn. De workflow en het aantal eiwitten in de pellets op zowel 4 ° C en -20 ° C voorwaarden aangegeven met twee herhaalde experimenten worden weergegeven in Figuur 7 (getallen in het rood). Hoewel de analyse van de pellets afgeleid van leverde het supernatant een aantal extra eiwitten (85 en 60 bij 4 ° C; 81 en 55 bij-20 ° C); een meerderheid van de eiwitten al in de eerste pellets werden geïdentificeerd en dus, hebben we gekozen voor het gebruik van 10,7% TCA voor alle latere experimenten. Hoewel de chloroform/methanol neerslag resulteerde in een vergelijkbaar aantal eiwitten geïdentificeerd ten opzichte van TCA neerslag, wij voorkeur TCA neerslag te wijten aan verschillende voordelen: ik) kleine hoeveelheid oplosmiddel die nodig zijn om het neerslaan van de eiwitten (60 µL van TCA vs 1,28 mL chloroform/methanol/water) waardoor het gebruik van grotere volumes van het monster als nodig terwijl gemakshalve gebruiken 1,5 mL tubes voor neerslag, ii) zichtbaarheid van de pellet aan de onderkant van de buis, en iii) geen accumulatie van sacharose tijdens neerslag stappen.

Ondanks het aanbieden van gedetailleerde functionele informatie met betrekking tot de translationeel staat, is een groot nadeel van deze methode de noodzaak voor verse en grote grondstof. Vele studies hebben geprobeerd te optimaliseren de voorwaarden gebruik kleine volume van cellen of weefsels of stappen te verhogen van de efficiëntie van uitgepakt RNA en eiwitten25toevoegen. Nog steeds, weefsels verkregen van andere dieren onder de dezelfde proefomstandigheden kunnen worden getrokken samen, als nodig.

Kortom, zorgt dit protocol voor gelijktijdige analyse van mRNA, miRNA en eiwit uit breuken Polysoom profilering te studeren de regulerende mechanismen die betrokken zijn bij ischemie/reperfusie verkregen. Echter, verdere studies zijn nodig om te zien of de vertalen mRNAs zijn geïnduceerd na ischemie of reperfusie en als ze wordt uitgeschakeld na de verwijdering van stress.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

NIH P01 HL112730 (RAG, JVE) NIH R01 HL132075 (RAG, JVE), Barbra Streisand Women's Heart Center (RAG, JVE), Dorothy en E. Phillip Lyon stoel in moleculaire cardiologie (RAG), Erika Glazer begiftigd stoel in gezondheid (JVE) van het hart van de vrouw en de Tsjechische Academie van Wetenschappen Institutionele steun RVO: 68081715 (MS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pentobarbital Vortech Phamaceuticals 9373 for euthansia
Heparin Sagent 103424 used in langendorff preparation
forceps Fine Science Tools 91110-10 used to hang the heart
Langendorff system Radnoti + home made n/a A 'four heart' system consisting of custom blown glass, tubing and water baths
NaCl Sigma S7653-5KG Krebs buffer and Sucrose gradient
KCl Sigma P5405 Krebs buffer and Lysis buffer
KH2PO42 Sigma P-5504 Krebs buffer
MgSO4 Sigma M7774-500G Krebs buffer
Glucose Sigma G5767 Krebs buffer
CaCl2 Sigma C1016-500G Krebs buffer
Sucrose powder Sigma S0389-1KG Sucrose gradient
MgCl2 Sigma 208337 Sucrose gradient and Lysis buffer
Tris-base Sigma T1503-1KG Sucrose gradient and Lysis buffer
Xylene Cyanole Sigma X-4126 Sucrose gradient
Cycloheximide Sigma-aldrich 239763 Sucrose gradient and Lysis buffer
RNaseOUT Life Technologies C00019 RNAse inhibitor for Lysis buffer
Igepal CA-360 (NP40) Sigma I3021 Lysis buffer
Protease Inhibitor Cocktail tablets, EDTA free Roche 5056489001
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 mm x 89 mm Beckman Coulter 344059
Ultracentrifuge Beckman LE-80K Ultracentrifugation of the gradients
Rotor Beckman SW41 Ultracentrifugation of the gradients
Biologic LP (pump) Biorad 731-8300 Fractionation of the gradients
BioFrac Biorad 741-0002 Fractionation of the gradients
Eppendorf RNA/DNA LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL tube Sigma Z666513-100EA Gradient fraction and RNA extraction
TRIzol Reagent Life technologies AM9738 RNA extraction
Luciferase Control RNA Promega L4561 RNA extraction
Chloroform Fisher Scientific C606-4 RNA extraction
Glycogen, RNA grade Thermo Fisher Scientific R0551 RNA extraction
Isopropanol Sigma I9516 RNA extraction
Ethanol Sigma E7023-1L RNA extraction
iScript cDNA Synthesis Kit BioRad 170-8891 Reverse transcription
iTaq Universal SYBR Green Supermix BioRad 175-5122 Quantative PCR
miRNeasy Micro Kit (50) Qiagen 217084 Kit for total RNA isolation
miScript II RT Kit (50) Qiagen 218161 Kit for miRNA reverse transcription
miScript Sybr Green PCR Kit (200) Qiagen 218073 Kit for real-time PCR expression analysis of miRNAs
Centrifuge 5424R Eppendorf For centrifugation of 1.5 mL or 2.0 mL tubes at different temperatures. Max speed - 21130 x g
Centrifuge 5810R Eppendorf For real-time PCR plate centrifugation at different temperatures. Max speed - 2039 x g
My Cycler Thermal Cycler Bio-Rad For reverse transcription
CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad For real-time PCR analysis
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control Qiagen 219610 For quality control of RNA isolation
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear Bio-Rad HSP9641 For real-time PCR analysis
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical Bio-Rad MSB1001 For real-time PCR plate sealing
Research plus Single-Channel Pipette, Gray; 0.5-10 µL Eppendorf UX-24505-02 For pipetting
PIPETMAN Classic Pipets, P20 Gilson F123600G For pipetting
PIPETMAN Classic Pipets, P200 Gilson F144565 For pipetting
Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 µL Gilson 17011782 For pipetting
Glycogen, RNA grade Thermo Fisher Scientific R0551 Improves total RNA isolation efficiency
Posi-Click 1.7 mL Tubes, natural color Denville C2170 RNA isolation and storage; reagent mix
Thermal Cycling Tubes -0.2 mL Individual Caps, Standard 0.2 mL tubes with optically Denville C18098-4 (1000910) Reverse transcription reaction
Sharp 10 Precision barrier Tips Denville P1096-FR For pipetting
Sharp 20 Precision barrier Tips Denville P1121 For pipetting
Sharp 200 Precision barrier Tips Denville P1122 For pipetting
Tips LTS 1 mL Filter Rainin RT-L1000F For pipetting
miScript Primer Assay (200) Qiagen (it changes according to the miRNA) For real-time PCR analysis
Gradient Master ver 5.3 Model 108 BioComp Instruments For preparation of sucrose gradients
trichloroacetic acid Sigma Aldrich T6399
acetone Sigma Aldrich 650501
Tris hydrochloride Amresco M108
dithiothreitol Fisher Scientific BP172
iodoacetamide Gbiosciences RC-150
sequencing grade modified trypsine, porcine Promega V5111
ammonium bicarbonate BDH BDH9206
formic acid, Optima LC/MS Fisher Chemical A117
methanol, Optima LC/MS Fisher Chemical A454
acetonitrile, Optima LC/MS Fisher Chemical A996
Protein LoBind tubes 0.5 mL Eppendorf AG 22431064
Protein LoBind tubes 1.5 mL Eppendorf AG 22431081
HLB µElution plate 30 µm Oasis 186001828BA
SpeedVac concentrator Thermo Scientific Savant SPD2010
sonicator Qsonica Oasis180
centrifuge Thermo Scientific Sorvall Legend micro 21R
LC trap column PepMap 100 C18 Thermo Scientific 160454
LC separation column PepMap RSLC C18 Thermo Scientific 164536
mass spectrometer Thermo Scientific Orbitrap Elite ion trap mass spectrometer
MSConvert software ProteoWizard Toolkit
Sorcerer-SEQUEST software Sage-N Research, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pourpirali, S., Valacca, C., Merlo, P., Rizza, S., D’Amico, S., Cecconi, F. Prolonged pseudohypoxia targets ambra1 mrna to p-bodies for translational repression. PLoS ONE. 10, e0129750 (2015).
  2. Andres, A. M., Tucker, K. C., Thomas, A., Taylor, D. J., Sengstock, D., Jahania, S. M., Dabir, R., Pourpirali, S., Brown, J. A., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W., Mentzer, R. M. Jr, Gottlieb, R. A. Mitophagy and mitochondrial biogenesis in atrial tissue of patients undergoing heart surgery with cardiopulmonary bypass. JCI Insight. 2, e89303 (2017).
  3. Kislinger, T., Cox, B., Kannan, A., Chung, C., Hu, P., Ignatchenko, A., Scott, M. S., Gramolini, A. O., Morris, Q., Hallett, M. T., Rossant, J., Hughes, T. R., Frey, B., Emili, A. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: Combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
  4. Kren, B. T., Wong, P. Y., Shiota, A., Zhang, X., Zeng, Y., Steer, C. J. Polysome trafficking of transcripts and micrornas in regenerating liver after partial hepatectomy. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, G1181-G1192 (2009).
  5. Gottlieb, R. A., Pourpirali, S. Lost in translation: Mirnas and mrnas in ischemic preconditioning and ischemia/reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 95, 70-77 (2016).
  6. Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments. (2014).
  7. Lorsch, J. Methods in enzymology. Laboratory methods in enzymology: Rna. Preface. Methods in Enzymology. 530, xxi (2013).
  8. Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mrnas. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
  9. He, S. L., Green, R. Polysome analysis of mammalian cells. Methods in Enzymology. 530, 183-192 (2013).
  10. Molotski, N., Soen, Y. Differential association of micrornas with polysomes reflects distinct strengths of interactions with their mrna targets. RNA. 18, 1612-1623 (2012).
  11. Maroney, P. A., Yu, Y., Fisher, J., Nilsen, T. W. Evidence that micrornas are associated with translating messenger rnas in human cells. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1102-1107 (2006).
  12. Paul, P., Chakraborty, A., Sarkar, D., Langthasa, M., Rahman, M., Bari, M., Singha, R. S., Malakar, A. K., Chakraborty, S. Interplay between mirnas and human diseases. Journal of Cellular Physiology. 233, 2007-2018 (2018).
  13. Rupaimoole, R., Slack, F. J. Microrna therapeutics: Towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 203-222 (2017).
  14. Nelson, P. T., Hatzigeorgiou, A. G., Mourelatos, Z. Mirnp:Mrna association in polyribosomes in a human neuronal cell line. RNA. 10, 387-394 (2004).
  15. Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a mirna blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1108-1114 (2006).
  16. Kim, J., Krichevsky, A., Grad, Y., Hayes, G. D., Kosik, K. S., Church, G. M., Ruvkun, G. Identification of many micrornas that copurify with polyribosomes in mammalian neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 360-365 (2004).
  17. Androsavich, J. R., Chau, B. N., Bhat, B., Linsley, P. S., Walter, N. G. Disease-linked microrna-21 exhibits drastically reduced mrna binding and silencing activity in healthy mouse liver. RNA. 18, 1510-1526 (2012).
  18. Kraushar, M. L., Thompson, K., Wijeratne, H. R., Viljetic, B., Sakers, K., Marson, J. W., Kontoyiannis, D. L., Buyske, S., Hart, R. P., Rasin, M. R. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the rna-binding protein hu antigen r. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. E3815-E3824 (2014).
  19. McClatchy, D. B., Ma, Y., Liu, C., Stein, B. D., Martinez-Bartolome, S., Vasquez, D., Hellberg, K., Shaw, R. J., Yates, J. R. 3rd Pulsed azidohomoalanine labeling in mammals (palm) detects changes in liver-specific lkb1 knockout mice. Journal of Proteome Research. 14, 4815-4822 (2015).
  20. Schiapparelli, L. M., McClatchy, D. B., Liu, H. H., Sharma, P., Yates, J. R. 3rd, Cline, H. T. Direct detection of biotinylated proteins by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13, 3966-3978 (2014).
  21. Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6, 359-362 (2009).
  22. Rajalingam, D., Loftis, C., Xu, J. J., Kumar, T. K. Trichloroacetic acid-induced protein precipitation involves the reversible association of a stable partially structured intermediate. Protein Science. 18, 980-993 (2009).
  23. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31, 3573-3579 (2010).
  24. Sashital, D. G., Greeman, C. A., Lyumkis, D., Potter, C. S., Carragher, B., Williamson, J. R. A combined quantitative mass spectrometry and electron microscopy analysis of ribosomal 30s subunit assembly in e. Coli. Elife. 3, (2014).
  25. Liang, S., Bellato, H. M., Lorent, J., Lupinacci, F. C. S., Oertlin, C., van Hoef, V., Andrade, V. P., Roffé, M., Masvidal, L., Hajj, G. N. M., Larsson, O. Polysome-profiling in small tissue samples. Nucleic Acids Research. 46, e3 (2018).
Dynamische Proteomic en miRNA analyse van Polysomes van geïsoleerde muis hart na Langendorff perfusie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stastna, M., Thomas, A., Germano, J., Pourpirali, S., Van Eyk, J. E., Gottlieb, R. A. Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion. J. Vis. Exp. (138), e58079, doi:10.3791/58079 (2018).More

Stastna, M., Thomas, A., Germano, J., Pourpirali, S., Van Eyk, J. E., Gottlieb, R. A. Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion. J. Vis. Exp. (138), e58079, doi:10.3791/58079 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter