Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Polysome Profilierung auf das Herz isoliert PERFUNDIERTEN Maus durchführen. Wir beschreiben Methoden für Herz Perfusion, Polysome Profilierung und Analyse der Polysome Fraktionen in Bezug auf mRNAs, MiRNAs und Polysome Proteom.
Abstract
Studien in dynamischen Änderungen im Protein Übersetzung erfordern spezialisierte Methoden. Hier untersuchten wir Veränderungen in neu synthetisierten Proteine als Reaktion auf Ischämie und Reperfusion mit isoliert PERFUNDIERTEN Maus Herzen gepaart mit Polysome Profilierung. Um die dynamischen Änderungen im Protein Übersetzung besser zu verstehen, wir zeichnen die mRNAs, die wurden mit cytosolische Ribosomen (Polyribosomes oder Polysomes) geladen und auch erholt mitochondriale Polysomes und verglichen mRNA und Protein-Verteilung in der Hocheffizienz Fraktionen (zahlreiche Ribosomen an mRNA befestigt), niedrig-Effizienz (weniger Ribosomen befestigt) darunter auch mitochondriale Polysomes und die Fraktionen nicht übersetzen. MiRNAs können auch mit mRNAs, die übersetzt werden werden, wodurch die Effizienz der Übersetzung zuordnen, untersuchten wir die Verteilung der MiRNAs in die Brüche. Die Verteilung der mRNAs, MiRNAs und Proteine wurde unter basalen PERFUNDIERTEN Bedingungen am Ende des 30 min des globalen keine-Flow-Ischämie und nach 30 min der Reperfusion untersucht. Hier präsentieren wir Ihnen die Methoden verwendet, um diese Analyse zu erreichen – unter anderem wurde der Ansatz zur Optimierung der Proteingewinnung aus Saccharose Neigung, als dies nicht vor beschrieben — und einige repräsentative Ergebnisse liefern.
Introduction
Das Herz reagiert auf die Verletzung von (I) Ischämie und Reperfusion (R) in einer dynamischen Art und Weise. Allerdings gibt es wenig Einblick in akute Veränderungen bei der Proteinsynthese während der Reaktion. Um dieses Problem anzugehen, wir nutzten die etablierte Methode der Polysome Profilierung1 zur Identifizierung von Änderungen im Protein-Überfluss, die Umverteilung von Ribosomen und Translationale regulatorische Faktoren vom Zytosol zu Polysomes, zu reflektieren und die Anstieg der neu synthetisierten Proteine (NSP). In der Umgebung von I / R, die Zunahme der neuen Protein-Synthese erfolgt in einem Zeitrahmen, die nicht übereinstimmen mit Transkription des neuen mRNAs2; Darüber hinaus wurde Discordance zwischen mRNA Ausdruck und Protein Fülle gemeldeten3. Aus diesen Gründen haben wir die Änderungen in der dynamischen Proteomforschung zu analysieren, wie Protein Übersetzung widerspiegelt. Um dies zu tun, wir mRNA in den Polysome Fraktionen zu quantifizieren, und analysieren die Proteinzusammensetzung in den Polysome Fraktionen. Schließlich, da MicroRNAs (MiRs) Verfügbarkeit von mRNAs für die Übersetzung zu regulieren und Effizienz von Protein Übersetzung4,5stören können, untersuchten wir die Verteilung der MiRs in den Polysome Fraktionen, mit Schwerpunkt auf der Antwort auf I / r.
Wir entschieden uns für die isolierten Langendorff Perfusion Mausmodell und geernteten Gewebe unter basalen Bedingungen der kontinuierliche Perfusion, nach 30 min global keine-Flow-Ischämie und nach 30 min von Ischämie, gefolgt von 30 min der Reperfusion verwenden. Wir dann solubilisiert Herzgewebe und Polysomes über einen Saccharose Gradienten getrennt gefolgt von Proteomic Analysen und selektive Detektion von mRNAs und MiRNAs durch PCR und Microarray, beziehungsweise. Diese Kombination von Methoden steht einen leistungsfähigen Ansatz zum Verständnis der dynamischen Proteom, ermöglicht simultane Detektion von mRNA und MiRNA, Nadel-, sowie die Umverteilung von regulatorischen Proteinen, MiRNA und mRNA zwischen nontranslating Brüchen, niedrige Effizienz Polysomes und Hochleistungs-Polysomes (siehe Abbildung 1). Einblicke in die dynamische Regulierung dieses Prozesses werden durch weitere Analysen der Phosphorylierung wichtige regulatorische Faktoren wie eIF2α oder mTOR verlängert werden. Diese einzelnen Schritte sind nun detailliert beschrieben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Tierversuche in Übereinstimmung mit Richtlinien durchgeführt und von der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee of Cedars-Sinai Medical Center genehmigt.
(1) Langendorff Perfusion der Maus Herz
-
Langendorff Perfusion der Maus Herz mit Ischämie und reperfusion
- Verwalten intraperitoneale Pentobarbital-Natrium 70 mg/kg an die Erwachsenen Maus (8 Woche alt, männlich, C57BL6/j). Bestätigen Sie Tiefe Narkose durch Mangel an Rückzug bis zu den Zehen Prise.
- Anticoagulate mit intraperitonealer Heparin 500 U/kg.
- Öffne die Truhe über sternale Schnitt. Öffnen Sie das Zwerchfell und entlang der Küsten Grenze zur vorderen axillären Achse schneiden. Dann schneiden Sie die vordere Axilläre Achse bis zu der vordergliedmaße, vollständig den Brustkorb zu öffnen. Nach Visualisierung von Herzen, Klemmen Sie der Aorta ascendens mit Pinzette und Verbrauchsteuern Sie rasch das Herz. Der Tod ist durch Entbluten. Legen Sie das Herz in kalten Krebs (NaCl 6,9 g/L KCl 0,35 g/L, Nahco33 2,1 g/L, KH2PO4 0,16 g/L, MgSO4 0,141 g/L, Glukose 2 g/L und CaCl2 0,373 g/L).
- Cannulate der Aorta mit einer stumpfen Spitze Nadel und Herzen doppelthebel mit Krebs Lösung im Modus konstanter Druck durchspülen.
- Nach einer Stabilisierung von 15 min vorbehaltlich der Herzen eine globale Ischämie der keine-Flow für 30 min, gefolgt von Reperfusion für 30 min.
- Ernten Sie Herz, nach 15 min Baseline Perfusion, nach 30 min Ischämie oder nach 30 min Reperfusion. Schneiden Sie die Vorhöfe und Snap-Einfrieren des Gewebes in flüssigem Stickstoff.
- Bei-80 ° C bis zur Verwendung aufbewahren
(2) Gewebe Homogenisierung, Solubilisierung und Saccharose Dichte Gradienten Sedimentation
-
Gradient Vorbereitung
- Bereiten Sie 2 Lösungen (15 % und 50 %) von 100 mL Saccharose, Mischen von 4 mL NaCl 2,5 M;
0,8 mL MgCl2 1,25 M; 1 mL Tris-HCl 1 M, pH 7,5; 15 g oder 50 g Saccharose (für 15 % und 50 %, beziehungsweise); Reinstwasser, 100 mL zu erreichen; und Xylol Cyanol (0,02 mg/mL) um die 15 % ige Lösung zu färben - Jede Lösung (0,22 µm Filter) filtern
- Der Tag ist der Farbverlauf verwendet werden, bereiten Sie 40 mL jeder Saccharose-Lösung und jede Lösung Endkonzentration von 100 µg/mL zu erreichen fügen Cycloheximide hinzu
- Verwenden Sie eine Farbverlauf Maker, um eine Mischung zwischen 15 % und 50 % Saccharose-Lösungen vorzubereiten
- Füllen Sie das linke Fach mit 5 mL 15 % Saccharose-Gradienten
- Füllen Sie das richtige Fach mit dem 50 % Saccharose-Gradienten
- Öffnen Sie den Hahn und schalten Sie die Pumpe zwei kleine Fächer mit Magnetrührer gerührt
- Verwendung einer Röhre in Verbindung mit dem zweiten Hahn die gemischte Saccharoselösung fließen in einem Ultra-Zentrifugation Rohr mit dünnen Wänden ermöglichen. Endvolumen werden ca. 10 mL.
- Halten Sie die Steigungen bei 4 ° C (Übernachtung bei Bedarf, aber nicht länger)
- Bereiten Sie 2 Lösungen (15 % und 50 %) von 100 mL Saccharose, Mischen von 4 mL NaCl 2,5 M;
-
Homogenisierung von Herzgewebe
- Homogenisieren frische oder gefrorene Herz mit Polytron in gefilterten Lyse Puffer (modifiziert für Saccharose gradient Fraktionierung) mit 100 mM KCl, 20 mM Tris pH 7.5, 5 mM MgCl2, 0,4 % NP-40. Enthalten Sie Cycloheximide 100 µg/mL um Polysome Struktur, 0,1 U RNase-Inhibitor und Protease-Inhibitor cocktail (1 Tablette für 50 mL) erhalten.
- Inkubieren der lysate 15 min auf Eis.
- Zentrifugieren Sie bei 18.000 X g für 15 min bei 4 ° C zu unlöslichen Material entfernen und den überstand zu sammeln.
- Reservieren Sie 50 µL zur Proteinbestimmung, RNA Isolation und RNA Integritätsanalyse (siehe Abbildung 2).
- Schicht des Überstands (500 – 100 µL) auf den Steigungen und das Gleichgewicht der Rohre mit Lyse Puffer.
-
Sedimentation und Sammlung von Fraktionen
- Durchführen Sie Ultrazentrifugation für 120 min bei 37.000 u/min bei 4 ° C in einem schwingenden Rotor Eimer. Dies entspricht laut Hersteller 228.000 X g bei maximaler Radius.
- Jeder Verlauf als 17 Brüche (rund 600 µL Bruch) zu sammeln, in Mikrozentrifugenröhrchen mit kontinuierlicher Überwachung der Extinktion bei 254 nm (OD-254).
- Programm der Fraktionssammler wie folgt:
- Entsorgen Sie die erste 3 min Sammlung (entsprechend der Flüssigkeit in den Röhrchen vor der Steigung)
- Von 4 bis 19 min sammeln Sie die Fraktionen mit der Geschwindigkeit von 1 mL/min in 17 Fraktionen.
- Legen Sie die Fraktionen auf Eis, sobald jeder gesammelt werden. Eingefroren Sie Proben bei-80 ° C, wenn sie nicht sofort verarbeitet werden. Eine typische UV densitometrische Rückverfolgung des Farbverlaufs wie sie erfasst werden, ist in Abbildung 1dargestellt.
3. Isolierung und Analyse von mRNAs aus Polysome und Nontranslating Brüche
-
Gewinnung von mRNA
- Tauen Sie die Fraktionen auf dem Eis auf, wenn sie Blitz eingefroren nach der Entnahme waren
- Übertragen Sie 200 µL der einzelnen Fraktionen zu einem frischen Schlauch
Hinweis: In diesem Schritt können zwei oder mehr aufeinander folgenden Fraktionen zusammengefasst werden. Es sollte sorgfältig durchgeführt werden, nach der Analyse der OD254 Grafik, so dass Polysome und nicht Polysome Fraktionen nicht durcheinander geraten. - Fügen Sie 10 ng der Luciferase RNA als interne Kontrolle für jede Probe für Normalisierung Zweck.
Hinweis: Luciferase Primer sollte als interne Kontrolle verwendet werden, um die Ergebnisse zu normalisieren. - Jedes Rohr 700 µL RNA-Extraktion-Reagenz (monophasisch Lösung von Phenol und Guanidin erfolgt; siehe Tabelle of Materials) hinzufügen. Mischen Sie gut und inkubieren Sie die Rohre für 5 min bei RT (Raumtemperatur).
- Fügen Sie 140 µL Chloroform und Wirbel für 15 S. Inkubation für 2-3 min bei RT
- Zentrifugieren Sie Proben für 15 min bei 12.000 X g bei 4 ° C.
- Übertragen Sie die oberen wässrige Phase sorgfältig auf einen neuen Schlauch.
- Da der RNA-Gehalt der Fraktionen nicht hoch ist, fügen Sie hinzu, 10 µg von Glykogen als Träger jedes Rohr.
- Jedes Rohr 350 µL Isopropanol hinzufügen. Gut mischen und Inkubation bei-20 ° C für 1 h, um den Ertrag zu steigern.
- Zentrifuge für 15 min bei 12.000 X g bei 4 ° C.
- Verwerfen Sie den überstand und fügen Sie 700 µL Ethanol 75 % um die RNA-Pellet zu waschen.
- Zentrifuge für 5 min bei 7.500 X g bei 4 ° C.
- Ethanol zu entfernen und die Pellet-Luft für 10 – 15 min. trocknen lassen.
Hinweis: Über Trocknung der RNA-Pellet wird seine komplette Solubilisierung im Wasser verhindern. - Aufschwemmen der RNA Pellet in 50 μl RNase-freie ultrapure H2O.
- Inkubieren Sie die Proben für 10 min bei 55 ° c
- Verwenden Sie 2 μL jeder Probe zu messen, die Qualität und Quantität der extrahierten RNA und speichern den Rest bei-80 ° C.
-
Reversen Transkription und qPCR
- Verwenden Sie 4 μL der reversen Transkription cDNA Synthese kit (siehe Tabelle der Materialien) für eine 20 μL Reaktion. Vorbereiten der Supermix entsprechend der Anzahl der Proben. Jedes Rohr 5 μL der Eingabe RNA hinzufügen und das erforderliche Volumen auf jedes Rohr übertragen. Dieses Volumen kann korrigiert werden, um für den Bereich der Taq Polymerase Arbeitsbedingungen relevant sein.
- Inkubieren Sie die Rohre in einem Thermocycler mit dem folgenden Programm vom Hersteller empfohlen: 5 min bei 25 ° C, 20 min reversen Transkription für 20 min bei 46 ° C und Inaktivierung der reversen Transkriptase für 1 min bei 95 ° C.
- Das optimierte Programm für jedes Paar Zündkapseln qPCR mitlaufen.
Hinweis: Um das Vorhandensein bestimmter mRNAs in Sekundenbruchteilen zu erkennen, sollte gleiches Volumen aus jeder Fraktion (der isolierten RNA) für reverse Transkription verwendet werden.
-
Analyse der Ergebnisse
- Verwenden Sie den Ct Wert interessiert Gens und die Luciferase Delta Ct-Werte berechnen
- Zum Ausdruck bringen Sie jeden Bruchteil Delta Ct Wert als Prozentsatz des Gesamtwerts mRNA enthalten in allen Fraktionen, die Verteilung der mRNA über die verschiedenen Fraktionen (Tabelle 1) zu visualisieren
4. Isolierung und Analyse von MiRNAs aus Polysome Brüche und Nontranslating Brüche
-
Gewinnung von mRNA und miRNA
Hinweis: Dieses Protokoll folgt des Herstellers, mit ein paar Änderungen.- Tauen Sie das Glykogen und das Spike-Steuerelement. Halten Sie auf dem Eis.
- 200 µL der gepoolten Probe 700 µL MiRNA Extraktion Reagenz hinzufügen.
- Fügen Sie 1 µg/µL von Glykogen und homogenisieren Sie es mit der Pipette zu. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- 3,5 µL 1,6 x 108 Spike-Steuerelement hinzufügen und mischen.
- Fügen Sie 200 µL Chloroform und Vortex es mindestens 15 Sekunden lang.
- 3 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Zentrifuge bei 12.000 X g für 15 min bei 4 ° C.
- Mit einer Pipette, den überstand auf eine neue 1,5 mL Tube übertragen. Die mittleren und unteren Phasen zu verwerfen.
- Der Überstand 1,5 X Volumen von 100 % Ethanol hinzu und mischen Sie es.
- Übertragen Sie 700 µL dieser Mischung auf die MiRNA-Extraktion-Spalte und Zentrifugieren sie mit voller Geschwindigkeit für 15 s bei RT und entsorgen der durchströmten; Wiederholen Sie diesen Schritt mit einer verbleibenden Probe.
- Die Spalte 700 µL Puffer 1 hinzu und Zentrifugieren sie mit voller Geschwindigkeit für 15 s bei RT; entsorgen Sie den Durchfluss.
- Die Spalte 500 µL Puffer 2 hinzufügen und Zentrifugieren sie mit voller Geschwindigkeit für 15 s bei RT; entsorgen Sie den Durchfluss.
- Die Spalte 500 µL von 80 % Ethanol hinzu und mit voller Geschwindigkeit für 2 min bei RT Zentrifugieren; entsorgen Sie den Durchfluss.
- Die Spalte, um eine neue 2 mL uncapped Rohr, öffnen Sie den Deckel und Zentrifugieren es bei RT 5 min mit voller Geschwindigkeit zu übertragen; entsorgen Sie den Durchfluss.
- Hinzufügen der Spalte und die Zentrifuge es bei voller Geschwindigkeit für 1 min bei RT. halten Sie das Eluat auf Eis oder bei-80 ° C zur späteren Analyse speichern 16 µL RNAse-freies Wasser.
Hinweis: Zwei Mikroliter jeder Probe kann für OD Analyse verwendet werden.
-
Reverse Transkription
- Vorbereitung auf dem Eis. Fügen Sie für jeweils 20 µL RT-PCR-Reaktion 4 µL des Puffers MiRNA RT, 2 µL von Nukleinsäuren, 9 µL Gesamt-RNS, 2 µL Enzym und 3 µL RNAse-freies Wasser hinzu; mischen und kurz nach unten zu drehen.
- Richten Sie den Thermocycler folgendermaßen:
37 ° C für 60 min;
95 ° C für 5 min;
4 ° C zu halten. - Entfernen Sie die Rohre aus den Thermocycler und fügen Sie 200 µL RNAse-freies Wasser hinzu. Bei-20 ° C lagern Sie oder fahren Sie mit der Real-Time PCR.
-
Real-Time PCR
Hinweis: Dieses Protokoll folgt 96-well-Platte-Format. Bereiten Sie die Reaktion Mischung auf Eis.- Bereiten Sie PCR Reaktion Mischung zu und cDNA (von MiRNAs oben) nach der Reihe durch das Protokoll angenommen. Mehrfache Reaktionen können im Batch vorbereitet werden.
- Fügen Sie eine Gesamtmenge von 25 µL des PCR-Mixes + cDNA in jede Vertiefung.
- Die Dichtplatte mit einer optischen Platte Dichtung.
- Zentrifugieren Sie die Platte für 1 min bei 1.000 X g bei Raumtemperatur.
- Programm der Echtzeit-Cycler wie folgt:
Erstaktivierung Schritt bei 95 ° C für 15 min;
3-Stufen-Radfahren: Denaturierung bei 94 ° C für 15 s; Glühen bei 55 ° C für 30 s; Erweiterung bei 70 ° C für 30 s (Fluoreszenz-Datenerfassung durchführen); Hinzufügen von 40 Zyklen;
Schmelzen-Kurve nach Cycler Standard.
-
Vergleichende Analyse
- Beispiel der Normalisierung (siehe Tabelle 2):
- Finden Sie der SCM minimalen Wert.
- Die SCM-Werte auf das Minimum zu normalisieren.
- Dieser Wert von der Ct-Werte von MiRNAs (MOI) und Referenz-gen (REF) subtrahieren.
- Analysieren von Daten mit Hilfe der Formel 2-ΔCt .
- Beispiel der Normalisierung (siehe Tabelle 2):
5. Proteomic Analysen
-
Extraktion von Proteinen aus Polysome Brüche
- Kombinieren Sie gesammelten Saccharose Brüche in drei Endkörnungen. Markieren Sie die Brüche als schwere (hocheffiziente Polysomes in gepoolten Bruchteilen 4, 5, 6 und 7 mit der höchsten Konzentration von Saccharose, Boden des Röhrchens gradient), Licht (geringe Effizienz Polysomes in gepoolten Bruch 8, 9, 10 und 11; Mitte der Gradient Rohr) und nicht zu übersetzen (gepoolte Brüche 12, 13, 14 und 15 mit der niedrigsten Konzentration von Saccharose; Oberseite des Gradienten Rohres). Führen Sie Protein Assay auf gepoolten Brüche.
- 100 % Aktien der Trichloressigsäure Säure (TCA) bereiten und bei 4 ° C im Dunkeln lagern. Mischen Sie 0,5 mL der Probe mit 60 µL 100 % TCA und bei-20 ° C über Nacht im Dunkeln inkubieren.
Hinweis: Verwenden Sie 1,5 mL eiweißarme Aufbewahrung Rohre (siehe Tabelle der Materialien). - Nach der Inkubation über Nacht Auftauen der Probe auf Eis und Zentrifuge bei 15.000 X g, 4 ° C für 30 min. verwerfen überstand.
Hinweis: 100 µg des gesamten Proteins in Probe gibt sichtbar Protein Pellet am unteren Rohr. - Pre-chill Aceton bei-20 ° C-Gefrierschrank. Die Protein-Pellet und Zentrifuge bei 15.000 X g, 4 ° C für 15 min. verwerfen überstand 0,5 mL kaltem Aceton hinzufügen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
- Das Pellet der Luft trocknen lassen. Das Pellet in 360 µL 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8) aufzuwirbeln.
Hinweis: Bei Bedarf verwenden Sie eine Puls-sonikator um das Pellet aufzuwirbeln. - Hinzufügen von 40 µL 0.1 M Dithiothreitol (Endkonzentration 10 mM) und inkubieren Sie bei 55 ° C auf Shaker für 45 min. hinzufügen 50 µL 0,15 M Iodoacetamide (Endkonzentration 17 mM) und bei Raumtemperatur auf Shaker für 30 Minuten im Dunkeln inkubieren.
- Bereiten Sie Trypsin Lösung: 20 µg von Trypsin in 100 µL 50 mM Ammonium Bicarbonat aufzuwirbeln. Probe bei 01:50 (w/w) entsprechende Volumen der Trypsin-Lösung hinzufügen Trypsin: Protein-Verhältnis zu gewährleisten, dass pH ist 8 und über Nacht auf Shaker bei 37 ° C inkubieren.
Hinweis: Fügen Sie 1 M Ammonium Bicarbonat pH 8 zu bringen. - Nach Trypsin-Verdauung coole Probe, Zentrifuge in Bank-Zentrifuge, kurz hinzufügen, 10 % Ameisensäure pH 2 – 3 und die Trypsin-Aktivität zu stillen, und fahren mit der Probe Entsalzung.
Hinweis: Verwenden Sie µ-Elution Platte für Probe Entsalzung. - Zustand der Sorbens in den Vertiefungen der 96-well-Platte mit 200 µL Methanol mittels Vakuum dreimal gefolgt von Konditionierung von 200 µL 0.1 % Ameisensäure dreimal. Probe zu laden und eine Probe waschen mit 200 µL 0.1 % Ameisensäure dreimal durchführen. Eluieren Sie die Probe mit 100 µL 50 % acetonitrile/0.1% Ameisensäure zweimal in eiweißarme Aufbewahrung 0,5 mL Röhrchen.
Hinweis: Eluieren Probe langsam zunächst mit Gravitation gefolgt von Grobvakuum auf. - Verdampfen Probe Eluat, Trockenheit mit Konzentrator und entweder direkt durchführen, Massenspektrometrie-Analyse oder Store bei-80 ° C bis zur Verwendung.
-
Massenspektrometrie-Analyse
- Jedes Pellet (bestehend aus den Folgen Peptide) in 50-100 µL rekonstruieren und in Massen-Spektrometer 1 µL injizieren.
Hinweis: Optimieren Sie Rekonstitution und Injektion Bände um maximale Intensität, die LC/MS/MS-signal zu erhalten. In unserem Fall das maximale Signal (total Ionenstrom; TIC) in das Herz des Scans war im Bereich der 1E8, 2E9. - Verwenden Sie eine Trap-Säule C18 (i.d. 300 µm x 5 mm, 5 µm, 100Å) gefolgt von Peptid-Abscheidung mittels C18-Säule (i.d. 75 µm x 250 mm, 2 µm, 100Å) mit einem Fluss Kursstellung bei 300 nL/min Set Nano Quelltemperatur Kapillare bis 275 ° C und die Spray-Spannung, 2 kV.
- Beantragen Sie einen linearen Farbverlauf von 5 – 35 % B für 90 min, 35 – 95 % B für 3 min bei 95 % B für 7 min und Gleichgewichtherstellung at 5 % B für 25 min (A: 0,1 % Ameisensäure/Wasser und B: 0,1 % Ameisensäure in Acetonitril). MS2-Spektren für die 15 höchsten Intensität Ionen aus jedem MS1-Scan mit CID-Modus zu erwerben. Verwenden Sie 3 Massenspektrometrie Wiederholungen für jede Probe analysiert.
Hinweis: Optimieren Sie und nutzen Sie die experimentellen Bedingungen und Parameter, die für Ihre Proben auf dem bestimmten Massenspektrometrie Instrument geeignet sind. In Abschnitt 5.2 genannten Bedingungen/Parameter. verwendet wurden und in unserem Labor optimiert.
- Jedes Pellet (bestehend aus den Folgen Peptide) in 50-100 µL rekonstruieren und in Massen-Spektrometer 1 µL injizieren.
-
Protein-Identifikation/Quantifizierung
- Nach Analyse der Massenspektrometrie wandeln Sie die rohen Spektren Dateien in kompatibel MzXML Dateien mit MSConvert Software (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html).
- Senden Sie die konvertierten Dateien in SEQUEST Suchmaschine mit den Suchkriterien, z. B. UniProtKB/Swiss-Prot Maus Datenbank (aktuellsten kanonische überprüft); Semi-Enzym Digest mit Trypsin (nach KR /-); mit bis zu 2 verpasste Spaltungen; Vorläufer Massenbereich: 400 bis 4.500 amu; statische Änderung: Carbamidomethyl (C) 57,021465 amu; Peptid Masse Toleranz: 50 ppm; Masse Typ Fragment: Monoisotopic.
Hinweis: Andere Protein-Datenbank-Suche Motoren und Daten Pipelines können verwendet werden. Wenn Datenbank für z.B. Ratte, die als Datenbanken für Maus und Mensch weniger abgeschlossen ist, müssen Sie gegen/Maus (oder Menschen) suchen Datenbanken Proteom Abdeckung zu erhöhen. In diesem Fall müssen die Redundanz in Protein-Namen entfernt werden. - Führen Sie eine Post-Suche-Analyse. Setzen Sie Filter für die Anzeige der Daten. Legen Sie beispielsweise eine minimale Protein Wahrscheinlichkeit (Protein-Schwelle) als 95 % oder 99 %, d. h. , die nur die Proteine, für die eine statistische Analyse 95 % oder 99 % Wahrscheinlichkeit beinhaltet des Seins in der Probe vorhanden, angezeigt werden. Setzen Sie den Filter für Peptid-Schwelle (z.B. 95 %), d. h. eine minimale Wahrscheinlichkeit, die bei der Bestimmung, ob ein Spektrum eine Peptid identifiziert verwendet werden. Wählen Sie die Mindestanzahl von Peptiden, die bestimmen, ob ein Protein vorhanden ist (2 Peptide als ein Minimum für Proteinidentifizierung wird empfohlen).
- Identifizierte Proteine für Qualität/Quantität zu bewerten. Stellen Sie sicher, dass Proteotypic Peptide für die Quantifizierung verwendet werden. Wenn Isoform identifiziert wird sicherstellen Sie, dass es basiert auf der Beobachtung eines tryptic Peptids, bestehend aus einer Aminosäure-Sequenz für die Spezifische Isoform eindeutig ist. Alle "ähnlich" oder hypothetische Proteine sollten unterziehen Vergleich zu sehen, ob die beobachteten Peptide entsprechen zu einem bekannten Protein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
mRNA-Analyse
mRNA-Ergebnisse können als Gewinnausschüttung einer bestimmten mRNA in jedem Bruchteil (Abbildung 3A); Kombinieren Sie für die Quantifizierung polyribosomal Übersetzung Brüche und vergleichen Sie nicht übersetzen Bruchteil (Abb. 3 b), präsentiert ein Verhältnis von mRNA Fülle nontranslating Fraktionen zu übersetzen. Weitere Informationen gewinnt man durch die Untersuchung der hocheffiziente Polysome Fraktionen getrennt von niedrig-Effizienz Polysome Fraktionen (und getrennt vom nontranslating Brüche). Dies ist besonders wichtig bei der Analyse von MiRNAs, die in den Low-Effizienz-Fraktionen angereichert sind (wo sie Protein Übersetzung ihrer Ziel-mRNAs stören).
Vertreter ergibt sich für einen bestimmten mRNA, die Änderungen ihrer Verteilung auf die Übersetzungs- und nontranslating Brüche, nachdem die Mäuseherzen Ischämie und Ischämie/Reperfusion ausgesetzt waren im Vergleich zum Schein in Abbildung 4gezeigt werden.
MiRNA-Array-Analysen
Repräsentative Ergebnisse von MiRNA-Array-Analysen sind in Abbildung 5dargestellt. Hier, eine Teilmenge der MiRNAs (speziell angefertigte Array Platte) wurden in der gepoolten schweren Fraktionen darauf hinweist, dass 22 MiRNAs standen im Zusammenhang mit Polysomes während Ischämie, 9 MiRNas während Ischämie und Reperfusion, mit 7, die für beide Bedingungen wurden analysiert. Dies zeigt, dass die Vereinigung von MiRNAs dynamische Reaktion auf die Belastungen des Ischämie und Reperfusion.
Proteomic Analysen
Analyse der schwere, leicht und nicht zu übersetzen Bruchteile von Sham (Kontrolle) Probe:
881 Gesamt Proteine wurden durch Massenspektrometrie identifiziert; 3, 46 und 208 Proteine von insgesamt waren einzigartig, Heavy, Licht und nicht-Trans Brüche, bzw. (Abb. 6A). Die Mehrheit (88 %) der mitochondriale ribosomale Proteine (28 s und 39 s) wurden in Leichtfraktion (36 von 41) und eine Mehrheit (88 %) der cytosolischen ribosomale Proteine (40er und 60er Jahren) wurden häufig in schwere und leichte Brüche (53 von 60) gekennzeichnet effiziente Trennung und Proteomic bestätigt Fähigkeit zu identifizierten schwerer cytosolischen Vs leichter mitochondriale ribosomale Proteine. Die Teilmenge der identifizierten mitochondriale und cytosolischen ribosomale Proteine ist in Abbildung 6dargestellt.
Abbildung 1: typische UV-Absorption Profil Polysome Fraktionen auf Saccharose Steigung. Die ersten drei Fraktionen vertreten Hohlraumvolumen im Schlauch. Die hohe Effizienz (hohes Molekulargewicht, HMW) Brüche werden gesammelt in Sekundenbruchteilen 4-7, die niedrige Effizienz (niedermolekularen, LMW) Brüche in 8-11, und das nicht übersetzen (und verbleibende cytosolischen Material) wird in Sekundenbruchteilen 12-15 (gesammelt nontranslating, NTR). Die rote Linie kennzeichnet Leitfähigkeit und die blaue Spur UV-Absorption bei 254 nm. Auf der rechten Seite ist eine Karikatur eines reagenzglases mit Saccharose Gefälle, zeigt Verteilung der Polysomes nach der Sedimentation. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: RNA Kontrolle Integritätsanalyse auf Bioanalyzer. RNA Integrität Anzahl (RIN) von Gesamt-RNS von Herzen ganz lysate isoliert. RIN wird berechnet nach 18 und 28 s Gipfeln. RIN-Reichweite: 1-10, und RIN = 10 stellt eine sehr gute Integrität. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Repräsentative Profil der mRNA Verteilung in Saccharose Farbverlauf. Herzen basale Langendorff Perfusion oder Ischämie und Reperfusion ausgesetzt waren (ich / R). (A) Herz Lysates wurden auf Saccharose Steigung gelöst und mRNA Inhalte für GAPDH (links) und COX4 (rechts) wurden in jede Fraktion bestimmt. Plot zeigt die relative Häufigkeit der mRNA in jedem Bruchteil (Bruchteil Zahl auf der x-Achse) für basale Perfusion (Schein, rote Linie und Diamanten) und Ischämie/Reperfusion (ich / R, blaue Linie und Quadrate). Auf dem Grundstück überlagert sind UV-Absorption totale mRNA Inhalt angibt (leichte graue Kurve) und Leitfähigkeit (gerade graue abfallenden Linie). Kästchen zeigen an, wie Brüche zusammengefasst wurden. (B) Balkendiagramm Plot zeigt Verhältnis der mRNA Fülle (Polysomes) Vs nontranslating (NT) Brüche für GAPDH (links) und COX4 (rechts) mRNAs zu übersetzen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Ergebnisse der repräsentativen mRNA. Quantifizierung von einem mRNA in den gepoolten Fraktionen (HMW, LMW, NTR) ändert sich entsprechend der Experimentalgruppe zeigen. Polysome Fraktionierung von Mäuseherzen erfolgte nach Langendorff Perfusion. Ergebnisse sind als % der gesamten mRNA (obere Abdeckung) und als Verhältnis von Polysomes (HMW + LMW) auf nontranslating Bruchteil (NTR) dargestellt. Fehlerbalken stellen Ergebnisse aus 5 Herzen pro Gruppe (Schein oder Ischämie / R). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Vertreter MiRNA Ergebnisse. Venn-Diagramm eines Pfades konzentrierte sich MiRNA Analyse auftauchen und herunterreguliert MiRNAs in schwere Fraktion Pools von Mäusen Proben nach Herzen Ischämie oder Ischämie und Reperfusion. Cut-Off-Wert: 1,5 fache. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Proteine, die durch Massenspektrometrie identifiziert. (A) Venn-Diagramm der Proteine gemeinsame und einzigartig für schwere, Licht und nicht-Trans-Fraktionen. (B) Teilmenge der mitochondrialen und cytosolischen ribosomale Proteine identifiziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: Schematische Workflows für Protein Extraktionsmethoden getestet. Die Protein Extraktionsmethoden wurden getestet, indem Sham (Kontrolle) Probe und schwere (hocheffiziente Polysomes) Bruch mit höchsten Saccharose-Gehalt. Zahlen in rot geben die Anzahl der Proteine, die durch Massenspektrometrie identifiziert wurden; wo zwei Zahlen angezeigt werden, sind sie aus zwei getrennten Experimenten. Die ausführliche Beschreibung ist im Text angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| FRAKTIONEN | GEN Ct | LUCIFERASE Ct | ΔCt | 2ΔCt | SUMME ALLER FRAKTIONEN | % DER EINZELNEN FRAKTIONEN | Polysome/NTR-Verhältnis |
| Hoher Wirkungsgrad (HMW) | 28,75 | 22.79 | 5.96 | 0,016 | 0.046 | 34.64 | 2,77 |
| Geringe Effizienz (LMW) | 28.43 | 22.63 | 5,80 | 0,018 | 38.81 | ||
| Nicht übersetzen (NTR) | 29.12. | 22.77 | 6,35 | 0,012 | 26,55 | ||
| Polysome/NTR-Verhältnis = (HMW + LMW) / NTR |
Tabelle 1: Analyse der mRNA probieren. Methode zur Analyse des einer mRNA wird nach quantitativen PCR für die verschiedenen gepoolten Fraktionen (HMW, LMW, NTR) angezeigt. ΔCt = gen Ct - Luciferase Ct, und die 2ΔCt ist 2ΔCt.
| Den SCM-Mindestwert zu finden: 22.77 | |||
| Beispiel 1 | Beispiel 2 | Beispiel 3 | |
| CT MOI | 22.92 | 22.36 | 22,58 |
| CT SCM | 22.81 | 22.77 | 22,9 |
| CT REF | 23,27 | 23.55 | 23,19 |
| Die SCM-Werte auf das Minimum zu normalisieren | |||
| Beispiel 1 | Beispiel 2 | Beispiel 3 | |
| CT SCM | 0.05 | 0 | 0.13 |
| Subtrahieren Sie diese Werte aus der Ct-Werte von MOI und REF | |||
| Beispiel 1 | Beispiel 2 | Beispiel 3 | |
| CT MOI | 22,87 | 22.36 | 22.45 Uhr |
| CT REF | 23.22 | 23.55 | 23.06. |
Tabelle 2: Probieren Sie Echtzeit-PCR-Berechnung für MiRNA Ausdruck Vergleiche Polysome und nontranslating Brüche. MiRNAs (MOI) und Referenz-gen (REF) wurden in der gepoolten schweren Fraktionen von Mäusen nach Ischämie oder Ischämie/Reperfusion analysiert. Die Ct, die Werte zuerst auf das Spike-Steuerelement (SCM) Ct Wert, dann die 2-ΔCt -Formel normalisiert wurden diente, MiRNA Ausdruck zu vergleichen.
| Methode | Probenvolumen [mL] | # der Proteine identifiziert | Kommentare |
| FASP | 1 | 227 | Großteil der Saccharose ausgefällt auf filter |
| Aceton-Niederschlag | 0,6 | 372 | zähflüssigen Schlamm von Saccharose am unteren Rohr; 4:1 (Reagenz: Probe) Bände; keine sichtbaren Protein pellet |
| Chloroform/Methanol-Niederschlags | 0,32 | 389 | zähflüssigen Schlamm von Saccharose am unteren Rohr; 8:1 (Reagenz: Probe) Bände; keine sichtbaren Protein pellet |
| TCA Niederschlag (bei 4 ° C) | 0,5 | 405, 415 | keine Saccharose Niederschlag; 0.12:1 (Reagenz: Probe) Bände; sichtbare Pellet am unteren Rohr |
| erneute Niederschläge | 85, 60 | Weitere TCA Niederschlag überstand nach ersten Pellet gesammelt wurden | |
| TCA Niederschlag (bei-20 ° C) | 0,5 | 440, 430 | keine Saccharose Niederschlag; 0.12:1 (Reagenz: Probe) Bände; sichtbare Pellet am unteren Rohr |
| erneute Niederschläge | 81, 55 | Weitere TCA Niederschlag überstand nach ersten Pellet gesammelt wurden |
Tabelle 3: Vergleich von Protein Extraktionsmethoden. FASP, Aceton Niederschlag und Chloroform/Methanol-Niederschlags TCA Niederschlag bei 4 ° C und-20 ° C wurden ausgewertet. Ziel war es, möglichst viele Proteine identifiziert. TCA Niederschläge wurden auf eine zweite Charge von Material, Reproduzierbarkeit zu bestätigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Polysome Profilanalyse ermöglicht die Untersuchung von Protein-Übersetzung durch die Analyse von translationalen Bundesstaat eine spezifische mRNA oder die ganze Transkriptom-6,-7. Es ist auch eine große Hilfe, wenn lokale Übersetzung werden, wie z. B. Synaptosomes8 untersucht muss. Diese Methode umfasst traditionell die Trennung von Mono - und Polyribosomes und die damit verbundenen mRNAs auf einer Saccharose-Steigung welche mit genomischen gekoppelt werden könnte oder Proteomic Techniken, um die gewünschten Ergebnisse6,9zu erhalten. Beispielsweise ergab eine aktuelle Studie, durchgeführt von unserer Fraktion Posttranskriptionale Regelmechanismus im Herzen des Patienten, CPB, die Ischämie/Reperfusion Verletzungen imitiert ausgeführt. Unter Ausnutzung der Polysome Profilanalyse, haben wir eine Zunahme in der Übersetzung von nuklearen-kodierten mitochondrialen Proteine im Herzen nach CPB Verfahren2gezeigt.
Der dynamische Proteom polyribosomal Profilerstellung Ansatz hier vorgestellten kann Veränderungen in der Bevölkerung von mRNAs, die Polyribosomes und die Proteine, die aktiv übersetzt sind zugeordnete offenbaren. Als Übersetzung von mRNAs MiRNAs teilweise geregelt ist, kann Analyse der MiRNAs in diese Fraktionen zusätzliche Einblicke zeigen. In der Tat haben mehrere Studien diese Methode modifiziert und bewies ein geeigneter und zuverlässiger Ansatz zu untersuchen, den MiRNA-Modus der Verordnung10,11.
Viele Studien haben in den letzten zehn Jahren Eintauchen in die Rolle der MiRNAs, in Anbetracht ihrer Bedeutung in verschiedenen biologischen Funktionen12,13. Da MiRNAs wirken durch Base pairing mit Gegenstück mRNAs um sie für den Abbau markieren, Polysome-Profil-Analyse durchgeführt und gezeigt, dass MiRNAs in der Tat in den Polysome Fraktionen fand sind, gezielt übersetzen mRNAs14, 15 , 16. MiR-21 ist ein gutes Beispiel, wo es eine niedrige Unterdrückung und schwach Polysomes verbindlich in normale Zellen in Krebszellen, die Assoziation mit Polysomes wird erhöht und die hemmende Wirkung ist viel stärker17zugeordnet ist.
In dieser Studie, Real-Time PCR Analyse erfolgte mit Hilfe der Ct-Werte von MiRNAs von Interesse (MOI), die Ct-Werte der Spike-in Steuern MiRNA (SCM), technische Varianten und der Ct-Wert eines Referenz-gen oder MiRNA (REF) zu reduzieren, die stabil unter Proben. Der erste Schritt war die Ct-Werte des Innenministeriums und der REF auf die Ct-Werte des SCM zu normalisieren. Dann gab es eine zweite Schritt Normalisierung des Innenministeriums, die REF und der resultierende Wert wurde verwendet, um die 2-ΔCt -Formel zu berechnen. Diese Werte oder Falten-Änderung kann verwendet werden, um Unterschiede zwischen den Gruppen zu demonstrieren.
Da die Extraktion von Proteinen aus Polysome Fraktionen schwierig ist, habe die meisten der bisher durchgeführten Studien die Fraktionen direkt für western-Blot Analyse. Sie einfach Sediment der Proteingehalt der einzelnen Bruchteil und mischen es mit SDS-Loading buffer für SDS-PAGE Analyse8,18verwenden. Hier haben wir eine Methode entwickelt, die uns nicht nur Extrakt mRNAs und MiRNAs nach Fraktionierung, sondern auch Peptide und Proteine mit einer hohen Qualität mit Mass Spectrometry Analyse fortfahren zu können.
Dieser Ansatz könnte erweitert werden durch Messung aktiv die neugebildete Proteine mit metabolischen Kennzeichnung wie Biorthogonal Aminosäure Homolog, z. B. Azidohomoalanine (AHA) für Methionin19,20weiter. AHA erlaubt Aufnahme gefolgt von Click Chemie eine Einarbeitung eines Biotin-Tags, gefolgt von Streptavidin Reinigung aller Proteine, die AHA integriert. Dies ermöglicht die endgültige Identifizierung neu synthetisierte Proteine – der andere Teil des dynamischen Proteoms. Erkennung von MiRNAs, die unter die Übersetzungs- und nontranslating Fraktionen in Reaktion auf einen Reiz zu verteilen (hier mit I / R) ermöglicht die Vernehmung der dynamische Regelung der Protein-Übersetzung. Allerdings müssen noch die Faktoren, die MiRNAs in die Nähe des Ribosom-gebundenen mRNA rekrutieren erkannt und systematisch untersucht werden.
In unserer Studie, neben TCA Niederschlag, wir testeten drei andere Methoden zur Proteingewinnung aus Polysome Brüche: i) FASP (Filter-gestützte Probenvorbereitung)21, Ii) Aceton Niederschlag und (Iii) Chloroform/Methanol-Niederschlags. Die Eignung der Methoden wurde anhand des sowohl die Fähigkeit, Brüche mit einer hohen Konzentration von Saccharose zu verarbeiten (bis zu 50 %) und die Anzahl der Proteine identifiziert durch Massenspektrometrie (Abbildung 7 und Tabelle 3).
FASP Methode folgten wir das Protokoll der Probenvorbereitung gegeben durch ein FASP Protein-Verdauung-Kit, das mit einem relative molekulare Masse-Cut-off von 30 kDa eine Ultrafiltration Einheit eingesetzt. Dieser Filter-Einheit diente als ein Werkzeug für Reinigungsmittel entfernen, Buffer Tausch, Proteinverdauung und Peptid Elution mit hohem Molekulargewicht Substanzen (Proteine und DNA) beibehalten, die sonst mit nachfolgenden Peptid Trennung stören würde 21. kurz, die Probe war gemischt mit Harnstoff-haltige Puffern und geladen auf Einheit Spin Filter mit spinning-Schritte als Iodoacetamide Lösung, Trypsin-Lösung und Natrium-chlorid-Lösung (Elution) wurden nachträglich hinzugefügt. Endgültige Filtrat, die verdauten Peptide enthalten war angesäuert von TFA, entsalzt und zur Massenspektrometrie Auswertung gespeichert. Mit dieser Methode gesammelt jedoch der Großteil der ausgefällten Saccharose stetig an der Oberseite des Filters, Rendern der Zentrifugation und Waschschritte schwierig.
Für Aceton Niederschlag und Chloroform/Methanol-Niederschlags waren mehrere Volumes von Lösungsmitteln nötig, um Proteine aus einem einzigen Band Probe auszufällen. Dies begrenzt die Größe des Probenvolumen angewendet, wenn der Niederschlag in 1,5 mL Röhrchen (Protein Low Retention Röhren) durchgeführt wurde. Als auch der zähflüssige Schlamm von Saccharose gesammelt am Ende der Rohre nach Niederschlägen für beide Methoden und nach Aceton Niederschlag und Chloroform/Methanol Niederschlag gab es keine sichtbaren Pellets am unteren Rohr und an der flüssigen Schnittstelle, bzw..
Tabelle 3 und Abbildung 7 zeigen den Vergleich der vier Protein Extraktionsmethoden verwendeten wir unsere experimentelle Workflow zu optimieren. Die roten Zahlen bei jeder Methode (Abbildung 7) stehen für die Anzahl von Proteinen, die durch Massenspektrometrie identifiziert wurden (siehe Abschnitt 5.2 und 5.3). Obwohl Probenvolumina verwendet für jede Methode unterschiedlich waren, führten Chloroform/Methanol und TCA Niederschläge die Höchstanzahl von Proteinen identifiziert. Jedoch aufgrund der Nachteile erwähnt (Probe Volumenbegrenzung und Saccharose Niederschlag), entschieden wir uns für TCA Niederschlag für spätere Experimente.
Um die optimalen Bedingungen für die Verarbeitung von Probe zu finden, erfolgte TCA Niederschlag bei verschiedenen Temperaturen und TCA Konzentrationen22,23,24. So führten wir eine Fällung mit 10,7 % TCA bei 4 ° C und-20 ° C und weitere ausgefällt Überstände mit zusätzlichen 60 µL des TCA (endgültige 19,4 % TCA) nach Pellets gesammelt wurden. Dies führte zu vier Pellets, die analysiert wurden durch Massenspektrometrie getrennt. Darüber hinaus haben wir wiederholt das ganze Protokoll zweimal, um sicherzustellen, dass die erzielten Ergebnisse reproduzierbar waren. Der Workflow und die Zahl der Proteine in den Pellets bei 4 ° C und-20 ° C mit zwei wiederholte Experimente identifiziert sind in Abbildung 7 (Zahlen in rot) dargestellt. Obwohl die Analyse der Pellets abgeleitet ergab die Überstände eine zusätzliche Anzahl von Proteinen (85 und 60 bei 4 ° C; 81 und 55 bei-20 ° C); ein Großteil der Proteine wurden bereits im ersten Pellets identifiziert und so entschieden wir uns um 10,7 % verwenden TCA für alle nachfolgenden Experimente. Obwohl Chloroform/Methanol Niederschlag führte zu eine ähnliche Anzahl von Proteinen identifiziert, im Vergleich zum TCA Niederschlag, bevorzugten wir TCA Niederschlag durch mehrere Vorteile: ich) kleines Volumen des Lösungsmittels benötigt, um Proteine (60 µL des TCA Niederschlag Vs 1,28 mL Chloroform/Methanol/Wasser) ermöglicht die Verwendung von größeren Probenaufkommen wenn benötigt zwar bequem mit 1,5 mL Röhrchen für Niederschlag, Ii) Sichtbarkeit des Pellet-Rohr unten und Iii) keine Ansammlung von Saccharose während Niederschlag-Schritte.
Trotz bietet eingehende funktionelle Informationen über den translationalen Zustand, ist ein großer Nachteil dieser Methode die Notwendigkeit für frische und große Ausgangsmaterial. Viele Studien haben versucht, die Bedingungen, die kleine Menge an Zellen oder Gewebe zu optimieren oder Schritte zur Steigerung der Effizienz der Extraktion von RNA und Proteine25hinzufügen. Dennoch konnte Gewebe von verschiedenen Tieren unter den gleichen Versuchsbedingungen gewonnen zusammen gezogen werden, wenn sein müssen.
Zusammenfassend kann dieses Protokoll für simultane Analyse von mRNA, MiRNA und Protein aus Bruchteilen von Polysome zur Untersuchung der Regulationsmechanismen beteiligt Ischämie/Reperfusion Profilerstellung erhalten. Allerdings sind weitere Untersuchungen nötig zu sehen, ob die Übersetzung mRNAs nach Ischämie und Reperfusion induziert werden und wenn sie sich auf die Beseitigung von Stress ausgeschaltet werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
NIH P01 HL112730 (RAG, JVE), NIH R01 HL132075 (RAG, JVE), Barbra Streisand Frauen-Herz-Zentrum (RAG, JVE), Dorothy und E. Phillip Lyon Stuhl in Molekulare Kardiologie (RAG), Erika Glazer Stiftungslehrstuhl im Herzgesundheit der Frau (JVE) und Tschechische Akademie der Wissenschaften Institutionelle Unterstützung RVO: 68081715 (MS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital | Vortech Phamaceuticals | 9373 | for euthansia |
| Heparin | Sagent | 103424 | used in langendorff preparation |
| forceps | Fine Science Tools | 91110-10 | used to hang the heart |
| Langendorff system | Radnoti + home made | n/a | A 'four heart' system consisting of custom blown glass, tubing and water baths |
| NaCl | Sigma | S7653-5KG | Krebs buffer and Sucrose gradient |
| KCl | Sigma | P5405 | Krebs buffer and Lysis buffer |
| KH2PO42 | Sigma | P-5504 | Krebs buffer |
| MgSO4 | Sigma | M7774-500G | Krebs buffer |
| Glucose | Sigma | G5767 | Krebs buffer |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | Krebs buffer |
| Sucrose powder | Sigma | S0389-1KG | Sucrose gradient |
| MgCl2 | Sigma | 208337 | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503-1KG | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| Xylene Cyanole | Sigma | X-4126 | Sucrose gradient |
| Cycloheximide | Sigma-aldrich | 239763 | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| RNaseOUT | Life Technologies | C00019 | RNAse inhibitor for Lysis buffer |
| Igepal CA-360 (NP40) | Sigma | I3021 | Lysis buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail tablets, EDTA free | Roche | 5056489001 | |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | LE-80K | Ultracentrifugation of the gradients |
| Rotor | Beckman | SW41 | Ultracentrifugation of the gradients |
| Biologic LP (pump) | Biorad | 731-8300 | Fractionation of the gradients |
| BioFrac | Biorad | 741-0002 | Fractionation of the gradients |
| Eppendorf RNA/DNA LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL tube | Sigma | Z666513-100EA | Gradient fraction and RNA extraction |
| TRIzol Reagent | Life technologies | AM9738 | RNA extraction |
| Luciferase Control RNA | Promega | L4561 | RNA extraction |
| Chloroform | Fisher Scientific | C606-4 | RNA extraction |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher Scientific | R0551 | RNA extraction |
| Isopropanol | Sigma | I9516 | RNA extraction |
| Ethanol | Sigma | E7023-1L | RNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 170-8891 | Reverse transcription |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 175-5122 | Quantative PCR |
| miRNeasy Micro Kit (50) | Qiagen | 217084 | Kit for total RNA isolation |
| miScript II RT Kit (50) | Qiagen | 218161 | Kit for miRNA reverse transcription |
| miScript Sybr Green PCR Kit (200) | Qiagen | 218073 | Kit for real-time PCR expression analysis of miRNAs |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | For centrifugation of 1.5 mL or 2.0 mL tubes at different temperatures. Max speed - 21130 x g | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | For real-time PCR plate centrifugation at different temperatures. Max speed - 2039 x g | |
| My Cycler Thermal Cycler | Bio-Rad | For reverse transcription | |
| CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | For real-time PCR analysis | |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | For quality control of RNA isolation |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear | Bio-Rad | HSP9641 | For real-time PCR analysis |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-Rad | MSB1001 | For real-time PCR plate sealing |
| Research plus Single-Channel Pipette, Gray; 0.5-10 µL | Eppendorf | UX-24505-02 | For pipetting |
| PIPETMAN Classic Pipets, P20 | Gilson | F123600G | For pipetting |
| PIPETMAN Classic Pipets, P200 | Gilson | F144565 | For pipetting |
| Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 µL | Gilson | 17011782 | For pipetting |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher Scientific | R0551 | Improves total RNA isolation efficiency |
| Posi-Click 1.7 mL Tubes, natural color | Denville | C2170 | RNA isolation and storage; reagent mix |
| Thermal Cycling Tubes -0.2 mL Individual Caps, Standard 0.2 mL tubes with optically | Denville | C18098-4 (1000910) | Reverse transcription reaction |
| Sharp 10 Precision barrier Tips | Denville | P1096-FR | For pipetting |
| Sharp 20 Precision barrier Tips | Denville | P1121 | For pipetting |
| Sharp 200 Precision barrier Tips | Denville | P1122 | For pipetting |
| Tips LTS 1 mL Filter | Rainin | RT-L1000F | For pipetting |
| miScript Primer Assay (200) | Qiagen | (it changes according to the miRNA) | For real-time PCR analysis |
| Gradient Master ver 5.3 Model 108 | BioComp Instruments | For preparation of sucrose gradients | |
| trichloroacetic acid | Sigma Aldrich | T6399 | |
| acetone | Sigma Aldrich | 650501 | |
| Tris hydrochloride | Amresco | M108 | |
| dithiothreitol | Fisher Scientific | BP172 | |
| iodoacetamide | Gbiosciences | RC-150 | |
| sequencing grade modified trypsine, porcine | Promega | V5111 | |
| ammonium bicarbonate | BDH | BDH9206 | |
| formic acid, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A117 | |
| methanol, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A454 | |
| acetonitrile, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A996 | |
| Protein LoBind tubes 0.5 mL | Eppendorf AG | 22431064 | |
| Protein LoBind tubes 1.5 mL | Eppendorf AG | 22431081 | |
| HLB µElution plate 30 µm | Oasis | 186001828BA | |
| SpeedVac concentrator | Thermo Scientific | Savant SPD2010 | |
| sonicator | Qsonica | Oasis180 | |
| centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend micro 21R | |
| LC trap column PepMap 100 C18 | Thermo Scientific | 160454 | |
| LC separation column PepMap RSLC C18 | Thermo Scientific | 164536 | |
| mass spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Elite ion trap mass spectrometer | |
| MSConvert software | ProteoWizard Toolkit | ||
| Sorcerer-SEQUEST software | Sage-N Research, Inc. |
References
- Pourpirali, S., Valacca, C., Merlo, P., Rizza, S., D’Amico, S., Cecconi, F. Prolonged pseudohypoxia targets ambra1 mrna to p-bodies for translational repression. PLoS ONE. 10, e0129750 (2015).
- Andres, A. M., Tucker, K. C., Thomas, A., Taylor, D. J., Sengstock, D., Jahania, S. M., Dabir, R., Pourpirali, S., Brown, J. A., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W., Mentzer, R. M. Jr, Gottlieb, R. A. Mitophagy and mitochondrial biogenesis in atrial tissue of patients undergoing heart surgery with cardiopulmonary bypass. JCI Insight. 2, e89303 (2017).
- Kislinger, T., Cox, B., Kannan, A., Chung, C., Hu, P., Ignatchenko, A., Scott, M. S., Gramolini, A. O., Morris, Q., Hallett, M. T., Rossant, J., Hughes, T. R., Frey, B., Emili, A. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: Combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
- Kren, B. T., Wong, P. Y., Shiota, A., Zhang, X., Zeng, Y., Steer, C. J. Polysome trafficking of transcripts and micrornas in regenerating liver after partial hepatectomy. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, G1181-G1192 (2009).
- Gottlieb, R. A., Pourpirali, S. Lost in translation: Mirnas and mrnas in ischemic preconditioning and ischemia/reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 95, 70-77 (2016).
- Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Lorsch, J. Methods in enzymology. Laboratory methods in enzymology: Rna. Preface. Methods in Enzymology. 530, xxi (2013).
- Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mrnas. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
- He, S. L., Green, R. Polysome analysis of mammalian cells. Methods in Enzymology. 530, 183-192 (2013).
- Molotski, N., Soen, Y. Differential association of micrornas with polysomes reflects distinct strengths of interactions with their mrna targets. RNA. 18, 1612-1623 (2012).
- Maroney, P. A., Yu, Y., Fisher, J., Nilsen, T. W. Evidence that micrornas are associated with translating messenger rnas in human cells. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1102-1107 (2006).
- Paul, P., Chakraborty, A., Sarkar, D., Langthasa, M., Rahman, M., Bari, M., Singha, R. S., Malakar, A. K., Chakraborty, S. Interplay between mirnas and human diseases. Journal of Cellular Physiology. 233, 2007-2018 (2018).
- Rupaimoole, R., Slack, F. J. Microrna therapeutics: Towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 203-222 (2017).
- Nelson, P. T., Hatzigeorgiou, A. G., Mourelatos, Z. Mirnp:Mrna association in polyribosomes in a human neuronal cell line. RNA. 10, 387-394 (2004).
- Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a mirna blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1108-1114 (2006).
- Kim, J., Krichevsky, A., Grad, Y., Hayes, G. D., Kosik, K. S., Church, G. M., Ruvkun, G. Identification of many micrornas that copurify with polyribosomes in mammalian neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 360-365 (2004).
- Androsavich, J. R., Chau, B. N., Bhat, B., Linsley, P. S., Walter, N. G. Disease-linked microrna-21 exhibits drastically reduced mrna binding and silencing activity in healthy mouse liver. RNA. 18, 1510-1526 (2012).
- Kraushar, M. L., Thompson, K., Wijeratne, H. R., Viljetic, B., Sakers, K., Marson, J. W., Kontoyiannis, D. L., Buyske, S., Hart, R. P., Rasin, M. R. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the rna-binding protein hu antigen r. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , E3815-E3824 (2014).
- McClatchy, D. B., Ma, Y., Liu, C., Stein, B. D., Martinez-Bartolome, S., Vasquez, D., Hellberg, K., Shaw, R. J., Yates, J. R. 3rd Pulsed azidohomoalanine labeling in mammals (palm) detects changes in liver-specific lkb1 knockout mice. Journal of Proteome Research. 14, 4815-4822 (2015).
- Schiapparelli, L. M., McClatchy, D. B., Liu, H. H., Sharma, P., Yates, J. R. 3rd, Cline, H. T. Direct detection of biotinylated proteins by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13, 3966-3978 (2014).
- Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6, 359-362 (2009).
- Rajalingam, D., Loftis, C., Xu, J. J., Kumar, T. K. Trichloroacetic acid-induced protein precipitation involves the reversible association of a stable partially structured intermediate. Protein Science. 18, 980-993 (2009).
- Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31, 3573-3579 (2010).
- Sashital, D. G., Greeman, C. A., Lyumkis, D., Potter, C. S., Carragher, B., Williamson, J. R. A combined quantitative mass spectrometry and electron microscopy analysis of ribosomal 30s subunit assembly in e. Coli. Elife. 3, (2014).
- Liang, S., Bellato, H. M., Lorent, J., Lupinacci, F. C. S., Oertlin, C., van Hoef, V., Andrade, V. P., Roffé, M., Masvidal, L., Hajj, G. N. M., Larsson, O. Polysome-profiling in small tissue samples. Nucleic Acids Research. 46, e3 (2018).
