Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

פרוטיאומיה מבנית ודינמיקה miRNA ניתוח של Polysomes מן הלב העכבר מבודדים לאחר זלוף Langendorff

Published: August 29, 2018 doi: 10.3791/58079

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע polysome פרופיל על הלב העכבר perfused מבודדים. אנו מתארים שיטות הלב זלוף, polysome פרופיל של ניתוח של שברים polysome ביחס mRNAs miRNAs, את פרוטאום polysome.

Abstract

לימודי שינויים דינמיים בתרגום חלבונים דורשים שיטות מיוחדות. כאן נבחנו שינויים בחלבונים מסונתז לאחרונה, בתגובה איסכמיה, פגיעה reperfusion באמצעות הלב העכבר perfused מבודדים בשילוב עם polysome פרופיל. כדי להבין עוד יותר את השינויים הדינמיים בתרגום חלבונים, אנחנו מאופיין mRNAs זה היו מפוצצות ריבוזומים cytosolic (polyribosomes או polysomes) וגם התאושש polysomes מיטוכונדריאלי ו לעומת התפלגות mRNA וחלבון ב יעילות גבוהה שברים (מצורף mRNA הריבוזומים רבים), נמוך-יעילות (פחות ריבוזומים מצורף) אשר כללה גם את polysomes מיטוכונדריאלי, השברים ללא תרגום. miRNAs ניתן גם לשייך mRNAs זה מתורגם, ובכך להפחית את היעילות של תרגום, שבדקנו את חלוקת miRNAs לאורך השברים. ההתפלגות של mRNAs, miRNAs חלבונים נבדק בתנאים perfused הבזליים, בקצה של 30 דקות של איסכמיה זרימה לא גלובלי, ואחרי 30 דקות של פגיעה reperfusion. כאן אנו מציגים את שיטות השתמשו כדי לבצע ניתוח זה — בפרט, הגישה אופטימיזציה של חלבון החילוץ של מעבר הצבע סוכרוז, כמו זה לא תואר קודם — ולספק תוצאות נציג.

Introduction

הלב מגיב לפציעה של איסכמיה (I), פגיעה reperfusion (R) בצורה דינמית. עם זאת, יש קצת תובנה חריפה לשינויים סינתזת חלבונים במהלך התגובה. כדי לטפל בבעיה זו, לקחנו היתרון של השיטה ומבוססת של polysome פרופיל1 כדי לזהות שינויים בשפע חלבון המשקפים הפצה של הריבוזומים ו translational גורמים רגולטוריים מ ציטוזול כדי polysomes, ו לודיג לאחרונה מסונתז חלבונים (NSPs). בסביבה של אני / R, הגדלת סינתזת החלבון החדש מתרחש במסגרת זמן זה אינו עולה בקנה אחד עם שעתוק של mRNAs חדש2; יתר על כן, הכתבים בין רמות הביטוי mRNA ושפע חלבון כבר דווח על3. מסיבות אלה, בחרנו לנתח השינויים פרוטאום דינמי כפי שהיא משתקפת תרגום החלבון. כדי לעשות זאת, אנחנו לכמת mRNA שברים polysome, ולנתח את הרכב החלבון בשברים polysome. לבסוף, מאחר מיקרו Rna (מירס) לווסת את הזמינות של mRNAs לתרגום יכולים להפריע היעילות של חלבון תרגום4,5, בדקנו את ההפצה של מירס בחלקים polysome, התמקדות תגובה / רבי

בחרנו להשתמש בעכבר מבודד Langendorff זלוף המודל לבין רקמת שנקטפו בתנאים הבזליים של רציף זלוף, אחרי איסכמיה זרימה לא גלובלי 30 דקות, ואחרי 30 דקות של איסכמיה ואחריו 30 דקות של פגיעה reperfusion. אנחנו solubilized את רקמת הלב ואז מופרדים polysomes מעבר הדרגתי סוכרוז, ואחריו פרוטיאומיה מבנית ניתוח וזיהוי סלקטיבי של mRNAs ושל miRNAs ע י PCR microarray, בהתאמה. שילוב זה של שיטות מייצג גישה רב-עוצמה להבנת פרוטאום דינמי, המאפשר זיהוי סימולטני של mRNA, miRNA, NSPs, כמו גם הפצה מחדש של חלבוני, miRNA ו- mRNA בין שברים nontranslating, יעילות נמוכה polysomes, יעילות גבוהה polysomes (ראה איור 1). תובנות ברגולציה דינמי של תהליך זה יורחב על ידי ניתוח נוסף של זירחון של גורמים רגולטוריים מרכזיים כגון eIF2α או mTOR. צעדים בודדים אלה מתוארים עכשיו בפירוט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל היו שבוצעה בהתאם המוסדיים הנחיות ואושר על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של Cedars-Sinai Medical Center.

1. Langendorff זלוף העכבר לב

  1. Langendorff זלוף העכבר לב עם איסכמיה, פגיעה reperfusion
    1. לנהל סודיום פנטוברביטל בקרום הבטן 70 מ"ג/ק"ג העכבר בוגרים (8-בת שבוע, זכר, C57BL6/j). לאשר הרדמה עמוקה על ידי חוסר משיכה שאורך צביטה.
    2. Anticoagulate עם הפרין בקרום הבטן 500 U/ק"ג.
    3. . תפתח את התיבה דרך החתך בחזה ובצלעות פתח הסרעפת וחותכים לאורך הגבול costal לציר בבית השחי הקדמי. . תעצור את הציר הקדמי בבית השחי עד forelimb כדי לפתוח לגמרי את כלוב בית החזה. לאחר מכן, להמחיש את הלב, תהדק את העורקים עם מלקחיים, במהירות לסלק את הלב. המוות הוא עקב דימום למוות. מקום בלב קר קרבס (NaCl 6.9 g/L, אשלגן כלורי 0.35 g/L, NaHCO3 2.1 g/L, ח'2PO4 0.16 g/L, MgSO4 0.141 g/L, גלוקוזה, 2 g/L ו- CaCl2 0.373 g/L).
    4. נקרר את העורקים עם מחט וקהה, perfuse את הלב retrogradely עם פתרון קרבס במצב לחץ קבוע.
    5. לאחר ייצוב פרק זמן של 15 דקות, נושא את הלב איסכמיה גלובלית זרימה לא למשך 30 דקות ולאחריו פגיעה reperfusion למשך 30 דקות.
    6. הקציר לבבות לאחר 15 דקות בסיסית זלוף, לאחר 30 דקות איסכמיה או לאחר פגיעה reperfusion 30 דקות. לקצץ את אטריה, snap-הקפאת הרקמה של חנקן נוזלי.
    7. לאחסן ב- 80 ° C עד לשימוש

2. רקמת המגון, Solubilization, צפיפות סוכרוז שקיעת מעבר צבע

  1. הכנה מעבר צבע
    1. להכין 2 פתרונות (15% ו- 50%) של סוכרוז 100 מ ל, ערבוב 4 מ"ל של NaCl 2.5 מ';
      MgCl 0.8 מ ל2 1.25 מ'; 1 מ"ל טריס-HCl 1 מ', pH 7.5; 15 גרם או 50 גר' סוכרוז (עבור 15% ו- 50%, בהתאמה); הנדסה גנטית מים כדי להגיע 100 מ; קסילן cyanol (0.02 נקודות mg/mL) לצבע הפתרון 15%
    2. לסנן את כל הפתרונות (0.22 מסננים מיקרומטר)
    3. היום שמעבר הצבע היא לשמש, להכין 40 מ של כל פתרון סוכרוז, להוסיף cycloheximide כל פתרון כדי להשיג את הריכוז הסופי של µg 100/mL
      1. שימוש מכונת מעבר צבע כדי להכין שילוב בין 15% ל- 50% סוכרוז הפתרונות
      2. למלא את התא השמאלי עם 5 מ של המילוי ההדרגתי 15% סוכרוז
      3. למלא את התא הנכון במעבר 50% סוכרוז
      4. לפתוח את הברז ולעבור על המשאבה להניע את שני תאים קטנים עם פגים
      5. שימוש צינור קשורה בהקשה השנייה כדי לאפשר את הפתרון סוכרוז מעורב לזרום בצינור אולטרה-צנטריפוגה עם קירות דקים. נפח הסופי יהיה בסביבות 10 מ"ל.
    4. לשמור על מעברי הצבע ב 4 ° C (לילה אם יש צורך, אבל לא יותר)
  2. המגון רקמת הלב
    1. Homogenize טרי או קפוא הלב עם polytron במאגר פירוק מסוננים (שונה עבור fractionation הדרגתיות סוכרוז) המכיל 100 מ מ אשלגן כלורי, 20 מ מ טריס pH 7.5, 5 מ מ MgCl2, 0.4% NP-40. כוללים 100 cycloheximide µg/mL כדי לשמור על מבנה polysome, 0.1 U RNase מעכב, מעכבי פרוטאז קוקטייל (1 טבליה עבור 50 מ ל).
    2. דגירה של lysate על קרח 15 דקות.
    3. צנטריפוגה ב x 18,000 g למשך 15 דקות ב 4 ° C כדי להסיר חומרים לא מסיסים ולאסוף את תגובת שיקוע.
    4. הזמינו µL 50 עבור קביעת חלבון, בידוד RNA וניתוח RNA תקינות (ראה איור 2).
    5. שכבה את תגובת שיקוע (500 – 100 µL) על מעברי הצבע ולאזן את הצינורות עם פירוק מאגר.
  3. שקיעת ואוסף של שברים
    1. בצע ultracentrifugation עבור 120 דקות-37,000 סל ד ב 4 ° C ברוטור דלי מתנדנדים. לדברי היצרן, זה מקביל x 228,000 g ב- radius מקסימלי.
    2. לאסוף את כל מעבר צבע כשברים 17 (כ-600 µL כל שבר) microcentrifuge צינורות עם ניטור רציף של ספיגת-254 ננומטר (OD254).
    3. תוכנית האספן שבר כדלקמן:
      1. למחוק את 3 דקות הראשונה של האוסף (תואם להנוזל הכלול הצינורות לפני מעבר הצבע)
      2. בין 4 ל- 19 דקות, לאסוף את השברים במהירות של 1 מ"ל לדקה בחלקים 17.
    4. למקם השברים בקרח ברגע אחד נאסף. הקפאת דגימות ב-80 מעלות צלזיוס, אם הם לא המעובדות מיד. עקיבה densitometric UV טיפוסי של מעבר הצבע כמו זה נאסף מוצג באיור1.

3. בידוד וניתוח של mRNAs Polysome, שברים Nontranslating

  1. הפקת mRNA
    1. הפשרת השברים בקרח, אם הם היו קפואה לאחר אוסף
    2. µL 200 של כל שבר להעביר צינור טריים
      הערה: בשלב זה, שברים ברציפות שתיים או יותר יכול להיות איחדו ביחד. זה צריך להיעשות בזהירות לאחר ניתוח הגרף254 OD כך polysome ו- polysome ללא שברים לא מבלבל.
    3. להוסיף 10 ng של לוציפראז RNA כמו בקרה פנימית על כל דגימה לצורך נורמליזציה.
      הערה: לוציפראז תחל צריך לשמש פקד פנימי לנרמל את התוצאות.
    4. להוסיף 700 µL של ריאגנט החילוץ RNA (תמיסת monophasic פנול, guanidine isothiocyanate; ראה טבלה של חומרים) כל שפופרת. מערבבים היטב, דגירה של הצינורות עבור 5 דקות ב RT (טמפרטורת החדר).
    5. הוסף 140 µL כלורופורם, מערבולת על Incubate ס' 15 דקות 2-3-RT.
    6. Centrifuge את הדגימות למשך 15 דקות x 12,000 g ב- 4 מעלות צלזיוס.
    7. להעביר בזהירות מימית השלב העליון צינור חדש.
    8. מאז בתוכן הרנ א של השברים אינה גבוהה, להוסיף 10 µg של גליקוגן כנשא כל שפופרת.
    9. להוסיף אלכוהול איזופרופיל µL 350 כל שפופרת. מערבבים היטב, דגירה ב-20 ° C עבור h 1 כדי להגדיל את התשואה.
    10. צנטריפוגה למשך 15 דקות x 12,000 g ב- 4 מעלות צלזיוס.
    11. למחוק את תגובת שיקוע והוסף 700 אתנול µL 75% לשטוף בגדר RNA.
    12. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב x 7,500 g ב- 4 מעלות צלזיוס.
    13. הסר אתנול, תנו לאוויר צניפה יבש למשך 10-15 דקות.
      הערה: ייבוש יתר בגדר RNA תמנע שלה solubilization מלאה במים.
    14. Resuspend בגדר RNA ב- 50 μL של RNase ללא הנדסה גנטית H2O.
    15. דגירה הדגימות 10 דקות-55 מעלות צלזיוס.
    16. השתמש μL 2 של כל מדגם למדוד את האיכות והכמות של RNA שחולצו ולאחסן את השארית ב-80 מעלות צלזיוס.
  2. שעתוק במהופך, qPCR
    1. השתמש 4 μL שעתוק במהופך cDNA סינתזה של קיט (ראה טבלה של חומרים) לתגובה 20 μL. הכינו את supermix על פי מספר דוגמאות. להעביר את אמצעי האחסון הדרושים כל שפופרת ולהוסיף 5 μL של הקלט RNA כל שפופרת. ניתן לתקן אמצעי אחסון זה להיות רלוונטי עבור הטווח לתנאי העבודה של פולימראז Taq.
    2. דגירה של צינורות הצנטרפוגה תרמי עם התוכנית הבאה המומלץ על ידי היצרן: 5 דקות 25 ° c, 20 דקות שעתוק במהופך למשך 20 דקות ב 46 ° C, איון רוורס טרנסקריפטאז עבור 1 דקות ב- 95 מעלות צלזיוס.
    3. הפעל את qPCR עם התוכנית ממוטב עבור כל זוג של צבעי יסוד.
      הערה: כדי לזהות הנוכחות של mRNAs מסויימים בחלקים, נפח שווה של כל שבר (של RNA מבודד) יש להשתמש עבור שעתוק במהופך.
  3. ניתוח של התוצאות
    1. השתמש בערך Ct של הגן מעוניין, את לוציפראז כדי לחשב את הערכים Ct דלתא
    2. אקספרס דלתא שבר כל ערך Ct כאחוז מתוך סה כ ערך mRNA הכלול כל השברים להמחיש את ההפצה של mRNA מעבר שברים שונים (טבלה 1)

4. בידוד וניתוח של miRNAs מ Polysome שברים שברים Nontranslating

  1. הפקת mRNA, miRNA
    הערה: פרוטוקול זה עוקב אחר הוראות היצרן, עם כמה שינויים.
    1. להפשיר את הגליקוגן ואת הפקד ספייק-אין. לשמור על הקרח.
    2. להוסיף 700 µL של miRNA החילוץ ריאגנט µL 200 מדגם במאגר.
    3. הוסף µg 1/µL של גליקוגן, homogenize אותו בעזרת פיפטה. תקופת דגירה זה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. מוסיפים 3.5 µL של 1.6 x8 10 ספייק-אין שליטה ומערבבים אותו.
    5. להוסיף 200 µL של כלורופורם, מערבולת זה במשך 15 שניות לפחות.
    6. תקופת דגירה של 3 דקות בטמפרטורת החדר.
    7. צנטריפוגה ב 12,000 x g למשך 15 דקות ב 4 º C.
    8. באמצעות פיפטה של, להעביר את תגובת שיקוע צינור 1.5 מ. למחוק את שלבי האמצעי והתחתון.
    9. להוסיף 1.5 x נפח של 100% אתנול תגובת שיקוע, ולערבב.
    10. העברת 700 µL של תערובת זו לעמודה החילוץ miRNA ו- centrifuge זה במלוא המהירות עבור 15 s ב RT, להשליך הזרימה דרך; חזור על שלב זה עם דוגמה הנותרים.
    11. להוסיף 700 µL מאגר 1 לעמודה, centrifuge זה במלוא המהירות עבור 15 s ב RT; למחוק את הזרימה דרך.
    12. להוסיף 500 µL מאגר 2 העמודה, centrifuge זה במלוא המהירות עבור 15 s ב RT; למחוק את הזרימה דרך.
    13. להוסיף 500 µL של 80% אתנול העמודה, centrifuge זה במלוא המהירות למשך 2 דקות ב RT; למחוק את הזרימה דרך.
    14. להעביר את העמודה mL 2 חדש uncapped צינור, פותחים את המכסה, centrifuge זה ב RT במשך 5 דקות במהירות מלאה; למחוק את הזרימה דרך.
    15. להוסיף 16 µL של מים נטולי RNAse העמודה ואת צנטריפוגה זה מלא מהירות של 1 דקות ב- RT. שמור את eluate על הקרח או לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס לצורך ניתוח עתידי.
      הערה: שני microliters של כל מדגם יכול לשמש לניתוח יתר.
  2. שעתוק במהופך
    1. הכן על קרח. עבור כל תגובה RT-PCR 20 µL, להוסיף 4 µL של המאגר RT miRNA, 2 µL של חומצות גרעין, µL 9 של RNA הכולל, 2 µL של האנזים µL 3 RNAse ללא מים; לערבב את זה ואת זה ספין למטה בקצרה.
    2. הגדר הצנטרפוגה תרמי כדלקמן:
      37 º C למשך 60 דקות;
      95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות;
      4 ° C החזק.
    3. להסיר את הצינורות הצנטרפוגה תרמי ולהוסיף µL 200 RNAse ללא מים. ב-20 ° C או להמשיך ה-PCR בזמן אמת.
  3. PCR בזמן אמת
    הערה: פרוטוקול זה עוקב אחר עיצוב הצלחת היטב 96. מכינים את תערובת התגובה על קרח.
    1. להכין תערובת התגובה PCR ולהוסיף cDNA (מתוך miRNAs לעיל) על פי הטווח התקבלה על-ידי הפרוטוקול. ניתן להכין תגובות מרובות באצווה.
    2. להוסיף סך של 25 µL של ה-PCR מיקס + cDNA מכל קידוח.
    3. חותם את הצלחת בעזרת חותם על צלחת אופטי.
    4. Centrifuge את הצלחת. בשביל 1 דקות ב- 1,000 x g בטמפרטורת החדר.
    5. תוכנית הצנטרפוגה בזמן אמת כדלקמן:
      שלב ההפעלה הראשונית ב 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות;
      3-צעד רכיבה על אופניים: דנטורציה ב 94 ° C 15 s; חישול ב 55 ° C ל 30 s; סיומת ב 70 ° C ל 30 s (לבצע איסוף נתונים קרינה פלואורסצנטית); להוסיף 40 מחזורי;
      התכה-עיקול על פי הצנטרפוגה ברירת המחדל.
  4. ניתוח השוואתי
    1. דוגמה של נורמליזציה (ראה טבלה 2):
      1. למצוא את הערך המינימלי של SCM.
      2. לנרמל את כל הערכים SCM למינימום הזה.
      3. לחסר ערך זה לפי הערכים Ct של miRNAs של עניין (MOI) הפניה ג'ין (שופט).
      4. ניתוח נתונים באמצעות הנוסחה 2-ΔCt .

5. פרוטיאומיה מבנית ניתוח

  1. מיצוי של חלבונים של שברים polysome
    1. לשלב סוכרוז שנאספו שברים שברים סופית שלוש. לסמן השברים כבד (יעילות גבוהה polysomes בחלקים במאגר 4, 5, 6 ו-7 עם הריכוז הגבוה ביותר של סוכרוז; התחתון של צינור מעבר צבע), אור (יעילות נמוכה polysomes ב שבר במאגר 8, 9, 10 ו- 11; אמצע שפופרת צבע) או ללא תרגום (שברים במאגר 12, 13, 14 ו 15 עם הריכוז הנמוך ביותר של סוכרוז; העליון של הצינור מעבר צבע). לבצע חלבון assay בשברים במאגר.
    2. להכין מלאי 100% של חומצת חומץ טריכלור (TCA) ואחסן אותו ב 4 ° C בחושך. מערבבים 0.5 מ של דגימה עם 60 µL של 100% TCA דגירה ב-20 ° C בלילה בחושך.
      הערה: השתמש 1.5 mL חלבון נמוכה השמירה צינורות (ראה טבלה של חומרים).
    3. לאחר דגירה לילה, להפשיר את הדגימה על קרח, צנטריפוגה ב 15,000 x g, 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות להשליך תגובת שיקוע.
      הערה: µg 100 של חלבון הכולל דוגמה נותן חלבון גלוי צניפה בתחתית צינור.
    4. מראש מקררים אצטון במקפיא-20 ° C. להוסיף 0.5 מ של אצטון קר חלבון צניפה, צנטריפוגה ב 15,000 x g, 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות להשליך תגובת שיקוע. חזור על שלב זה פעמיים.
    5. האוויר יבש בגדר. Resuspend בגדר ב 360 µL מאגר טריס-HCl 50 מ מ (pH 8).
      הערה: אם יש צורך, להשתמש sonicator הדופק כדי resuspend בגדר.
    6. להוסיף 40 µL של 0.1 M dithiothreitol (ריכוז סופי 10 מ מ) דגירה -55 מעלות צלזיוס על שאכר במשך 45 דקות להוסיף 50 µL של 0.15 מ' iodoacetamide (ריכוז סופי 17 מ"מ) דגירה בטמפרטורת החדר על שייקר למשך 30 דקות בחושך.
    7. להכין פתרון טריפסין: resuspend 20 µg של טריפסין ב 100 µL של 50 מ מ אמוניום ביקרבונט. להוסיף נפח המתאימים של טריפסין פתרון מדגם 1:50 (w/w) יחס טריפסין: חלבון, ודא כי ה-pH 8, דגירה על שאכר ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
      הערה: להוסיף 1 מ' אמוניום ביקרבונט כדי להביא pH 8.
    8. לאחר עיכול טריפסין, מגניב המדגם, צנטריפוגה בקצרה בצנטריפוגה ספסל, להוסיף 10% חומצה פורמית pH 2-3 כדי להרוות את הפעילות טריפסין, ולהמשיך עם מדגם desalting.
      הערה: השתמש בצלחת • ממוצע-תנאי עבור מדגם desalting.
    9. במצב sorbent הבארות של 96 טוב צלחת עם 200 µL של מתנול באמצעות ואקום שלוש פעמים ולאחריו על ידי מיזוג µL 200 חומצה פורמית 0.1% שלוש פעמים. לטעון מדגם ולבצע שטיפה מדגם באמצעות µL 200 חומצה פורמית 0.1% שלוש פעמים. Elute הדגימה עם 100 µL 50% acetonitrile/0.1% חומצה פורמית פעמיים לתוך חלבון נמוכה השמירה 0.5 mL שפופרת.
      הערה: Elute המדגם לאט בהתחלה באמצעות הכבידה ואחריו ואקום נמוכה.
    10. להתאדות מדגם eluate ליובש באמצעות רכז, גם ישירות לבצע ניתוח ספקטרומטר מסה או חנות ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.
  2. ניתוח ספקטרומטר מסה
    1. לשקם כל גלולה (המורכב פפטידים tryptic) ב- 50 – 100 µL, להזריק 1 µL לתוך ספקטרומטר מסה.
      הערה: מטב שיחזור ומסוג הזרקת כדי לקבל את העוצמה המקסימלית LC/MS/MS אות. במקרה שלנו, האות המרבי (סה כ יון הנוכחי; טיק) בתוך הלב של הסריקה היה בטווח של 1E8 כדי 2E9.
    2. להשתמש בעמודה מלכודת סי18 (300 µm זהות x 5 מ מ, 5 מיקרומטר, 100Å) ואחריו פפטיד הפרדה באמצעות סי18 עמודה (75 µm זהות x 250 מ מ, 2 מיקרומטר, 100Å) עם קביעת קצב זרימה-300 nL לדקה סט הטמפרטורה נימי ננו-מקור 275 מעלות צלזיוס, המתח ספריי 2 kV.
    3. להחיל מעבר צבע ליניארי של 5 – 35% B במשך 90 דקות, 35 – 95% B במשך 3 דקות, מחזיק ב- 95% B עבור 7 דקות ו- equilibration ב-5% B במשך 25 דקות (a: 0.1% חומצה פורמית/מים וב': 0.1% חומצה פורמית ב- acetonitrile). רוכשים MS2 spectra עבור היונים 15 בעוצמה הגבוהה ביותר של כל סריקה MS1 באמצעות מצב CID. עבור כל דגימה לבדיקה לצפות בקבצים יש להשתמש בתוכנת עריכה התומכת בפורמט 3 משכפל ספקטרומטר מסה.
      הערה: מיטוב ולהשתמש את הפרמטרים המתאימים לדוגמאות שלך על הכלי ספקטרומטר מסה מסוימת ותנאים ניסיוני. התנאים/הפרמטרים שהוזכרו בסעיף 5.2. היו בשימוש וממוטב במעבדה שלנו.
  3. זיהוי חלבונים/כימות
    1. אחרי ניתוח ספקטרומטר מסה, להמיר את קבצי raw ספקטרה mzXML תואם את הקבצים באמצעות תוכנת MSConvert (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html).
    2. להגיש את הקבצים שעברו המרה לתוך SEQUEST מנוע חיפוש עם קריטריוני החיפוש, למשל, UniProtKB/שוויצרי-פרוט העכבר מסד (וברקוד שנסקרו קנונית); תקציר אנזים למחצה באמצעות טריפסין (לאחר KR /-); עם אדמירל שלא נענתה עד 2; טווח המוני קודמן: 400 עד 4,500 אמו; השינוי סטטי: carbamidomethyl (ג) 57.021465 אמו; רגישות מסה פפטיד: 50 דפים לדקה; קטע המוני מסוג: monoisotopic.
      הערה: אחרים חלבון מסד נתונים חיפוש מנועי ונתונים צינורות ניתן להשתמש. אם משתמש מסד הנתונים עבור למשל עכברוש, אשר תושלם פחות מאשר מסדי נתונים עבור האדם של עכבר, ייתכן שיהיה עליך לחפש נגד העכבר (או האדם) מסדי נתונים כדי להגדיל פרוטאום כיסוי. במקרה זה, יתירות בשמות חלבון יהיה צורך להסירו.
    3. ביצוע ניתוח שלאחר חיפוש. הגדר את מסנני לתצוגת הנתונים. לדוגמה, הגדר הסתברות המינימלי חלבון (חלבון מפתן) 95% או 99%, קרי, יוצג רק את החלבונים שעבורם ניתוח סטטיסטי מרמז על 95% או 99% ההסתברות להיות נוכח במדגם. להגדיר את המסנן על הסף פפטיד (למשל, 95%), קרי, הסתברות המינימלי שישמש לקביעת אם קשת מזהה פפטיד. בחר את המספר המינימלי של פפטידים שיקבעו אם חלבון קיים (2 פפטידים מינימום לזיהוי חלבון מומלצת).
    4. הערכת חלבונים מזוהה עבור כמות/איכות. ודא כי פפטידים proteotypic משמשים על כימות. אם isoform מזוהה להבטיח שזה בסיסים על תצפיות של tryptic פפטיד המורכב מרצף חומצה אמינית ייחודית isoform ספציפיים. כל החלבונים "דומה" או היפותטי צריך לעבור השוואה כדי לראות אם התצפיות פפטידים שיתאימו חלבון ידוע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניתוח ה-mRNA
תוצאות ה-mRNA ניתן לבטא הפצת mRNA מסוים בתוך כל שבר (איור 3 א); על כימות, לשלב שברים תרגום polyribosomal, להשוות תרגומים שאינם השבר (איור 3B), מציג יחס של mRNA שפע בתרגום כדי שברים nontranslating. פרטים נוספים נרכשת על ידי בחינת שברים polysome יעילות גבוהה בנפרד מן יעילות נמוכה polysome שברים (, ונבדלת שברים nontranslating). הדבר חשוב במיוחד בעת ניתוח miRNAs, אשר הם מועשרים בשברים יעילות נמוכה (איפה הם מפריעים חלבון תרגום של mRNAs היעד שלהם).

נציג תוצאות עבור mRNA מסוים זה שינויים תפוצתו ברחבי שברים תרגום ו nontranslating לאחר הלבבות העכבר היה נתון איסכמיה איסכמיה/פגיעה reperfusion לעומת שאם מוצגים באיור4.

ניתוח מערך miRNA
נציג תוצאות ניתוח מערך miRNA מוצגים באיור5. . הנה, תת-קבוצה של miRNAs (צלחת אישית מעוצבת מערך) נותחו בחלקים כבדים במאגר 22 miRNAs היו משויכים polysomes במהלך איסכמיה, 9 miRNas במהלך איסכמיה, פגיעה reperfusion, עם 7 שהיו נהוגים שני תנאים. זה מראה כי איגוד miRNAs הוא דינאמי בתגובה הלחצים של איסכמיה, פגיעה reperfusion.

ניתוח פרוטיאומיה מבנית
ניתוח של שברים כבד, קל, ללא תרגום דמה (בקרה) מדגם:
881 של חלבונים סה כ אותרו באמצעות ספקטרומטר מסה; 3, חלבונים 46 ו- 208 של סה כ היו ייחודיים לכבד, אור, טרנס ללא שברים, בהתאמה (איור 6A). הרוב (88%) של חלבונים ribosomal מיטוכונדריאלי (28S ו 39S) זוהו ב שבר אור (36 מתוך 41), רוב (88%) של חלבונים ribosomal cytosolic (40 ו-60) זוהו נפוץ בחלקים כבדים וגם אור (53 מתוך 60) המאשר הפרדה יעילה ו פרוטיאומיה מבנית היכולת לזהות כבד לעומת cytosolic מצית חלבונים ribosomal מיטוכונדריאלי. ערכת המשנה של חלבונים ribosomal מזוהה מיטוכונדריאלי, cytosolic מוצג באיור 6B.

Figure 1
איור 1: UV הטיפוסי פרופיל ספיגת polysome שברים על הדרגה סוכרוז. שברים שלושת מייצגים נפח חלל הצנרת. הגבוה יעילות (משקל מולקולרי גבוה, HMW) נאספים שברים שברים 4-7, הנמוכה יעילות (משקל מולקולרי נמוך, LMW) שברים 8-11, את הלא-התרגום (ואת הנותר חומר cytosolic) נאספת במאגרים (שברים 12-15 nontranslating, NTR). הקו האדום מציין מוליכות, ומציין האיתור כחול ספיגת UV-254 ננומטר. בצד הימין הוא קריקטורה של מבחנה עם סוכרוז ההדרגתי, מראה חלוקת polysomes לאחר שקיעת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: ניתוח בקרת תקינות RNA על Bioanalyzer. RNA תקינות מספר (RIN) הכולל RNA מבודד בלב שלם lysate. רין מחושב לפי פסגות 18S, 28S. רין מגוון: 1-10, ורין = 10 מייצג של שלמות טוב מאוד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: פרופיל נציג של mRNA התפלגות הצבע סוכרוז. לבבות היו נתונים הבזליים זלוף Langendorff או איסכמיה, פגיעה reperfusion (אני / R). (א) הלב lysates שנפתרו על הדרגה סוכרוז, mRNA תוכן עבור GAPDH (משמאל) ו- COX4 (מימין) נקבעו בכל שבר. העלילה מציגה יחסית שפע mRNA של כל שבר (מספר שברים על ציר x) זלוף הבזליים (המזויפים, הקו האדום ויהלומים) ו איסכמיה/פגיעה reperfusion (אני / R, הקו הכחול וריבועים). יונחו על העלילה הם UV ספיגת המציין תוכן הכולל mRNA (עיקול אפור בהיר) מוליכות (קו ישר אפור משופע). תיבות מציינות כיצד היו איחדו שברים. (B) מגרש גרף עמודות מציג יחס של mRNA שפע בתרגום (polysomes) לעומת שברים (NT) nontranslating GAPDH (משמאל) ו mRNAs (מימין) COX4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: mRNA נציג תוצאות. כימות של mRNA אחת בחלקים במאגר (HMW, LMW, NTR) מציג שינויים על פי קבוצת הניסוי. Polysome fractionation הלבבות העכבר בוצעה לאחר Langendorff זלוף. תוצאות מותוות % של סך ה-mRNA (החלונית העליונה) וכן יחס של polysomes (HMW + LMW) כדי nontranslating שבר (NTR). קווי שגיאה לייצג תוצאות מ 5 לבבות לכל קבוצה (המזויפים, איסכמיה או אני / R). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: תוצאות נציג miRNA. דיאגרמת ון של שביל התמקד בניתוח miRNA להופיע downregulated miRNAs בבריכות שבר כבד של עכברים דגימות אחרי הלב איסכמיה או איסכמיה, פגיעה reperfusion. ניתוק הערך: קיפול 1.5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: חלבונים המזוהה באמצעות ספקטרומטר מסה. (א) דיאגרמת ון של החלבונים נפוצות וייחודיות כבד, אור, טרנס ללא שברים. קבוצת משנה של חלבונים ribosomal מיטוכונדריאלי, cytosolic מזוהה (B) . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: סכימטי זרימות עבודה עבור שיטות החילוץ חלבונים נבדק. השיטות החילוץ חלבון נבדקו באמצעות דגימת דמה (בקרה), כבד (יעילות גבוהה polysomes) שבר עם תוכן סוכרוז הגבוהה ביותר. מספרים באדום מציינים את מספר חלבונים אשר זוהו על ידי ספקטרומטר מסה; איפה שני המספרים מוצגים, הם שני ניסויים נפרדים. תיאור מפורט ניתנת בטקסט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

שברים ג'ין Ct לוציפראז Ct ΔCt 2ΔCt סכום כל שברים % של כל שבר Polysome/NTR יחס
יעילות גבוהה (HMW) 28.75 22.79 5.96 0.016 0.046 34.64 2.77
יעילות נמוכה (LMW) 28.43 22.63 5.80 0.018 38.81
ללא תרגום (NTR) 29.12 22.77 6.35 0.012 26.55
Polysome/NTR יחס = (HMW + LMW) / NTR

טבלה 1: לטעום ניתוח של mRNA. שיטת הניתוח של mRNA אחת מוצג לשברים במאגר שונים (HMW, LMW, NTR) לאחר ה-PCR כמותי. ΔCt = ג'ין Ct - לוציפראז Ct, והוא 2ΔCt 2ΔCt.

למצוא את הערך המינימלי של SCM: 22.77
דוגמה 1 דוגמה 2 דוגמה 3
Ct MOI 22.92 22.36 22.58
Ct SCM 22.81 22.77 22.9
Ct REF 23.27 23.55 23.19
לנרמל את כל הערכים SCM למינימום הזה
דוגמה 1 דוגמה 2 דוגמה 3
Ct SCM 0.05 0 0.13
חיסור ערכים אלה לפי הערכים Ct של MOI ו REF
דוגמה 1 דוגמה 2 דוגמה 3
Ct MOI 22.87 22.36 22.45
Ct REF 23.22 23.55 23.06

בטבלה 2: לטעום בזמן אמת חישוב ה-PCR להשוואה הביטוי miRNA polysome, שברים nontranslating. miRNAs של עניין (MOI) הפניה ג'ין (שופט) נותחו בחלקים כבדים במאגר של עכברים אחרי איסכמיה או איסכמיה/פגיעה reperfusion. ה-Ct הערכים היו קודם מנורמל לפקד ספייק-ב Ct (SCM) ערך, אז הנוסחה 2-ΔCt שימש כדי להשוות את הביטוי miRNA.

שיטה נפח דגימה [mL] # של חלבונים מזוהה הערות
FASP 1 227 חלק הארי של סוכרוז זירז במסנן
אצטון משקעים 0.6 372 בוצה צמיגה של סוכרוז בתחתית צינור; 4:1 (ריאגנט: דוגמה) כרכים; אין גלולה חלבון גלוי
כלורופורם/מתנול משקעים 0.32 נקודות 389 בוצה צמיגה של סוכרוז בתחתית צינור; 8:1 (ריאגנט: דוגמה) כרכים; אין גלולה חלבון גלוי
TCA משקעים (ב 4 ° C) 0.5 405, 415 אין משקעים סוכרוז; 0.12:1 (ריאגנט: דוגמה) כרכים; צניפה גלוי בתחתית צינור
משקעים מחדש 85, 60 משקעים TCA נוספים של תגובת שיקוע לאחר תעופה ראשונה נאסף
TCA משקעים (ב-20 ° C) 0.5 440, 430 אין משקעים סוכרוז; 0.12:1 (ריאגנט: דוגמה) כרכים; צניפה גלוי בתחתית צינור
משקעים מחדש 81, 55 משקעים TCA נוספים של תגובת שיקוע לאחר תעופה ראשונה נאסף

טבלה 3: השוואה בין שיטות החילוץ חלבון. FASP, אצטון משקעים, כלורופורם/מתנול משקעים ו TCA משקעים ב 4 ° C ו-20 ° C הוערכו. המטרה היא להגדיל את מספר חלבונים מזוהה. TCA precipitations הוערכו על מנה שנייה של חומר כדי לאשר הפארמצבטית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ניתוח הפרופיל polysome מאפשר המחקר של תרגום חלבונים על-ידי ניתוח המדינה translational של mRNA ספציפי או את כל transcriptome6,7. זה גם לעזר רב כאשר תרגום מקומי צריך להילמד כמו synaptosomes8. באופן מסורתי, שיטה זו כרוכה ההפרדה של מונו - polyribosomes ואת mRNAs המשויך את הדרגה סוכרוז אשר יכול להיות בשילוב עם גנומית או פרוטיאומיה מבנית הטכניקות להשגת תוצאות המיועד6,9. למשל, מחקר שנערך לאחרונה שבוצעה על-ידי הקבוצה שלנו גילה מנגנון רגולטורי post-transcriptional להורג בלב של מטופלים שעברו משטרת שיקאגו, אשר מחקה איסכמיה/פגיעה reperfusion פציעה. תוך ניצול של ניתוח פרופיל polysome, אנחנו הראו עלייה בתרגום של חלבונים מיטוכונדריאלי גרעיני מקודד בלב לאחר הליך משטרת שיקאגו2.

פרוטאום דינמי polyribosomal פרופיל הגישה המובאת כאן יכול לחשוף שינויים באוכלוסייה mRNAs הקשורים polyribosomes את החלבונים זה מתורגם באופן פעיל. כל תרגום של mRNAs נשלט בחלקו על ידי miRNAs, ניתוח של miRNAs בחלקים אלה יכול לחשוף תובנות נוספות. למעשה, מספר מחקרים יש שינוי בשיטה זו, הוכיח שזה יהיה בגישה מתאים ואמין כדי לחקור את מצב miRNA בתקנה10,11.

מחקרים רבים נערכו על שעבר עשור להתעמק תפקיד miRNAs, שוקל את החשיבות של תפקודים ביולוגיים שונים12,13. מאז miRNAs פועלים באמצעות בסיס-זיווג עם עמיתו mRNAs כדי לסמן אותם כדי השפלה, ניתוח פרופיל polysome שבוצעה, הראו כי miRNAs למעשה נמצאו שברים polysome, מיקוד תרגום mRNAs14, 15 , 16. מיר-21 היא דוגמה טובה איפה זה משויך של דיכוי נמוך, polysomes חלש מחייב על תאים נורמליים, ואילו של תאים סרטניים, השיוך polysomes מוגברת ההשפעה דכאניים היא הרבה יותר חזקה17.

במחקר זה, בוצע ניתוח PCR בזמן אמת באמצעות ערכי Ct miRNAs עניין (MOI), הערכים Ct ספייק-אין לשלוט miRNA (SCM) כדי להפחית וריאציות טכני ואת הערך Ct של ג'ין הפניה או miRNA (שופט) אשר יציב בין הדגימות. הצעד הראשון היה לנרמל את הערכים Ct למשרד הפנים, השופט לערכים Ct של ה-SCM. לאחר מכן היה נורמליזציה בשלב השני של למשרד הפנים אל השופט, הערך המתקבל שימש כדי לחשב את הנוסחה 2-ΔCt . אלה ערכים או קיפול-שינוי ערכי יכול לשמש כדי להדגים את ההבדלים בין הקבוצות.

מאז החילוץ של חלבונים היא קשה מפני שברים polysome, רוב המחקרים שבוצעו עד עכשיו, השתמשו השברים ישירות לניתוח תספיג חלבון. הם פשוט משקעים תכולת החלבון של כל שבר, לערבב אותו עם העמסה מרחביות מאגר לשימוש עבור מרחביות-עמוד ניתוח8,18. . הנה, פיתחנו שיטה אשר מאפשר לנו לא רק תמצית mRNAs, miRNAs לאחר fractionation, אלא גם להשיג פפטידים וחלבונים באיכות גבוהה כדי להמשיך עם ניתוח ספקטרומטריית.

גישה זו אפשרות להאריך עוד יותר על ידי מדידת באופן פעיל את החלבונים מסונתז לאחרונה באמצעות תיוג מטבוליות כגון חומצת אמינו biorthogonal homolog, כגון azidohomoalanine (AHA) מתיונין19,20. רב אחא בר התאגדות ולאחר מכן לחץ על כימיה מאפשר תיאגוד תג ביוטין ואחריו streptavidin טיהור של כל החלבונים המביאות AHA. זה מאפשר לנו זיהוי ודאי של חלבונים מסונתז לאחרונה – החלק השני של פרוטאום דינמי. זיהוי של miRNAs זה להפיץ בין שברים תרגום ו- nontranslating בתגובה לגירוי (כאן. עם אני / R) מאפשר חקירה של ויסות דינאמי תרגום החלבון. עם זאת, הגורמים לגייס miRNAs עד ריבוזום מכורך mRNA להישאר להיות מזוהה, נחקרו בשיטתיות.

במחקר שלנו, בנוסף TCA משקעים, בדקנו שלוש שיטות אחרות לחילוץ חלבון של שברים polysome:21i) FASP (הכנת הדוגמא בעזרת מסנן), משקעים ii) אצטון, משקעים iii) כלורופורם/מתנול. התאמת השיטות הוערך המבוסס על שני את. היכולת לעבד שברים עם ריכוז גבוה של סוכרוז (עד 50%) ואת מספר חלבונים המזוהה באמצעות ספקטרומטר מסה (איור 7 , טבלה 3).

עבור שיטה FASP, עקבנו הפרוטוקול של הכנת הדוגמא שנתן ערכת עיכול חלבון FASP שהפעיל יחידת אולטראפילטרציה עם ניתוק יחסי מסה מולקולרית של 30 kDa. יחידת מסנן זה שימש כלי להסרת דטרגנט, מאגר exchange, לעיכול חלבונים, • תנאי פפטיד עם היכולת לשמור על חומרים גבוהה משקל מולקולרי (חלבונים ו- DNA) כי אחרת יפריע ההפרדה פפטיד עוקבות 21. בקצרה, המדגם היה מעורב עם המכילות אוריאה מאגר והוספו טעון על יחידת מסנן ספין עם ספינינג צעדים כפתרון iodoacetamide, טריפסין פתרון והפתרון נתרן כלורי (• תנאי) לאחר מכן. פילטרט של סופי שהכיל פפטידים מתעכל היה acidified על ידי TFA, desalted ומאוחסנת לניתוח ספקטרומטר מסה. באמצעות שיטה זו, עם זאת, חלק הארי של סוכרוז זירז בהתמדה שהצטברו בראש המסנן, עיבוד של צנטריפוגה ושטיפת צעדים קשים.

אצטון משקעים, כלורופורם/מתנול משקעים, מספר אמצעי אחסון של ממיסים היו נחוצים כדי לזרז חלבונים מאמצעי אחסון יחיד מדגם. זה מוגבל בגודל של נפח דגימה מיושם כאשר המשקעים בוצעה ב 1.5 mL צינורות (חלבון נמוכה-שימור צינורות). כמו כן, כל הטינופת צמיגה של סוכרוז שהצטברו בתחתית של צינורות לאחר משקעים עבור שתי שיטות והיו אין כדורי גלוי בתחתית צינור, הממשק נוזלי לאחר אצטון משקעים והמשקעים כלורופורם/מתנול, בהתאמה.

טבלה 3 ואיור 7 הצג את ההשוואה של ארבע שיטות החילוץ של חלבונים, שהשתמשנו כדי לייעל את זרימת העבודה ניסיוני שלנו. המספרים אדום שניתנו בכל שיטה (איור 7) מייצגים את מספר חלבונים אשר זוהו על ידי ספקטרומטר מסה (ראה סעיף 5.2 ו 5.3). למרות אמצעי אחסון הדגימה המשמש עבור כל שיטת היו שונים, כלורופורם/מתנול ו TCA precipitations הביא המספר הגבוה ביותר של חלבונים מזוהה. עם זאת, בשל החסרונות שהוזכרו לעיל (הגבלת נפח דגימה והמשקעים סוכרוז), הסכמנו על משקעים TCA לניסויים הבאים.

כדי למצוא את התנאים האופטימליים עבור המדגם עיבוד, משקעים TCA בוצע ב טמפרטורות שונות TCA ריכוזים22,23,24. לפיכך, ביצענו ממשקעים עם 10.7% TCA-4 ° C ו-20 ° C, עוד יותר זירז את supernatants עם µL 60 נוספים של TCA (הסופית 19.4% TCA) אחרי כדורי שנאספו. כתוצאה מכך שלג ארבעה נותחו כשהם מופרדים באמצעות ספקטרומטר מסה. בנוסף, אנחנו חזר על פרוטוקול כל פעמיים כדי להבטיח כי תוצאות שהושג היו לשחזור. זרימת העבודה ואת המספר של חלבונים מזוהה בכדורי-תנאים הן 4 ° C ו-20 ° C עם שני ניסויים חוזרים ונשנים מוצגים באיור 7 (מספרים באדום). למרות הניתוח של כדורי נגזר supernatants הניב מספר נוסף של חלבונים (85 ו 60-4 מעלות צלזיוס; 81 ו 55 ב-20 ° C); רוב החלבונים זוהו כבר כדורי קודם לכן, אנחנו העדיפו להשתמש 10.7% TCA לניסויים הבאים כל. למרות המשקעים כלורופורם/מתנול, גרמו למספר דומה של חלבונים מזוהה בהשוואה ל- TCA משקעים, העדפנו TCA המשקעים עקב מספר יתרונות: אני) נפח קטן של הממס הדרושים כדי לזרז את החלבונים (µL 60 של TCA לעומת 1.28 מיליליטר כלורופורם/מתנול/מים) ומאפשר שימוש אחסון מדגם גדולים יותר אם הצורך בעוד בנוחות באמצעות צינורות 1.5 mL עבור משקעים, ii) הנראות של בגדר בחלק התחתון שפופרת, השלישי) אין הצטברות של סוכרוז במהלך צעדים משקעים.

למרות המציע מידע פונקציונלי מעמיק לגבי המדינה translational, החיסרון העיקרי של שיטה זו הוא הצורך חומר המוצא טריים וגדולים. מחקרים רבים ניסו לייעל את התנאים באמצעות אחסון קטן של תאים או רקמות או להוסיף שלבים כדי להגביר את היעילות של RNA לחילוץ, חלבונים25. עדיין, רקמות המתקבל בעלי חיים שונים בתנאים ניסיוני באותו יכול להיות שלף יחד, אם יהיה צורך.

לסיכום, פרוטוקול זה מאפשר ניתוח בו זמנית של mRNA, miRNA חלבון של שברים המתקבל polysome פרופיל ללמוד את מנגנוני הרגולציה מעורב איסכמיה/פגיעה reperfusion. עם זאת, בהמשך לימודי נדרשים כדי לראות אם mRNAs התרגום הם המושרה אחרי איסכמיה או פגיעה reperfusion, אם הם תבוטל עם הסרת הלחץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

HL112730 NIH P01 (סמרטוט, JVE), NIH R01 HL132075 (סמרטוט, JVE), מרכז הלב של ברברה סטרייסנד נשים (סמרטוט, JVE), דורותי, ליון פיליפ אי יו ר בקרדיולוגיה מולקולרית (סמרטוט), אריקה גלייזר ניחן כסא בריאות הלב של האישה (JVE), האקדמיה למדעים הצ'כי תמיכה מוסדית RVO: 68081715 (MS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pentobarbital Vortech Phamaceuticals 9373 for euthansia
Heparin Sagent 103424 used in langendorff preparation
forceps Fine Science Tools 91110-10 used to hang the heart
Langendorff system Radnoti + home made n/a A 'four heart' system consisting of custom blown glass, tubing and water baths
NaCl Sigma S7653-5KG Krebs buffer and Sucrose gradient
KCl Sigma P5405 Krebs buffer and Lysis buffer
KH2PO42 Sigma P-5504 Krebs buffer
MgSO4 Sigma M7774-500G Krebs buffer
Glucose Sigma G5767 Krebs buffer
CaCl2 Sigma C1016-500G Krebs buffer
Sucrose powder Sigma S0389-1KG Sucrose gradient
MgCl2 Sigma 208337 Sucrose gradient and Lysis buffer
Tris-base Sigma T1503-1KG Sucrose gradient and Lysis buffer
Xylene Cyanole Sigma X-4126 Sucrose gradient
Cycloheximide Sigma-aldrich 239763 Sucrose gradient and Lysis buffer
RNaseOUT Life Technologies C00019 RNAse inhibitor for Lysis buffer
Igepal CA-360 (NP40) Sigma I3021 Lysis buffer
Protease Inhibitor Cocktail tablets, EDTA free Roche 5056489001
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 mm x 89 mm Beckman Coulter 344059
Ultracentrifuge Beckman LE-80K Ultracentrifugation of the gradients
Rotor Beckman SW41 Ultracentrifugation of the gradients
Biologic LP (pump) Biorad 731-8300 Fractionation of the gradients
BioFrac Biorad 741-0002 Fractionation of the gradients
Eppendorf RNA/DNA LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL tube Sigma Z666513-100EA Gradient fraction and RNA extraction
TRIzol Reagent Life technologies AM9738 RNA extraction
Luciferase Control RNA Promega L4561 RNA extraction
Chloroform Fisher Scientific C606-4 RNA extraction
Glycogen, RNA grade Thermo Fisher Scientific R0551 RNA extraction
Isopropanol Sigma I9516 RNA extraction
Ethanol Sigma E7023-1L RNA extraction
iScript cDNA Synthesis Kit BioRad 170-8891 Reverse transcription
iTaq Universal SYBR Green Supermix BioRad 175-5122 Quantative PCR
miRNeasy Micro Kit (50) Qiagen 217084 Kit for total RNA isolation
miScript II RT Kit (50) Qiagen 218161 Kit for miRNA reverse transcription
miScript Sybr Green PCR Kit (200) Qiagen 218073 Kit for real-time PCR expression analysis of miRNAs
Centrifuge 5424R Eppendorf For centrifugation of 1.5 mL or 2.0 mL tubes at different temperatures. Max speed - 21130 x g
Centrifuge 5810R Eppendorf For real-time PCR plate centrifugation at different temperatures. Max speed - 2039 x g
My Cycler Thermal Cycler Bio-Rad For reverse transcription
CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad For real-time PCR analysis
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control Qiagen 219610 For quality control of RNA isolation
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear Bio-Rad HSP9641 For real-time PCR analysis
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical Bio-Rad MSB1001 For real-time PCR plate sealing
Research plus Single-Channel Pipette, Gray; 0.5-10 µL Eppendorf UX-24505-02 For pipetting
PIPETMAN Classic Pipets, P20 Gilson F123600G For pipetting
PIPETMAN Classic Pipets, P200 Gilson F144565 For pipetting
Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 µL Gilson 17011782 For pipetting
Glycogen, RNA grade Thermo Fisher Scientific R0551 Improves total RNA isolation efficiency
Posi-Click 1.7 mL Tubes, natural color Denville C2170 RNA isolation and storage; reagent mix
Thermal Cycling Tubes -0.2 mL Individual Caps, Standard 0.2 mL tubes with optically Denville C18098-4 (1000910) Reverse transcription reaction
Sharp 10 Precision barrier Tips Denville P1096-FR For pipetting
Sharp 20 Precision barrier Tips Denville P1121 For pipetting
Sharp 200 Precision barrier Tips Denville P1122 For pipetting
Tips LTS 1 mL Filter Rainin RT-L1000F For pipetting
miScript Primer Assay (200) Qiagen (it changes according to the miRNA) For real-time PCR analysis
Gradient Master ver 5.3 Model 108 BioComp Instruments For preparation of sucrose gradients
trichloroacetic acid Sigma Aldrich T6399
acetone Sigma Aldrich 650501
Tris hydrochloride Amresco M108
dithiothreitol Fisher Scientific BP172
iodoacetamide Gbiosciences RC-150
sequencing grade modified trypsine, porcine Promega V5111
ammonium bicarbonate BDH BDH9206
formic acid, Optima LC/MS Fisher Chemical A117
methanol, Optima LC/MS Fisher Chemical A454
acetonitrile, Optima LC/MS Fisher Chemical A996
Protein LoBind tubes 0.5 mL Eppendorf AG 22431064
Protein LoBind tubes 1.5 mL Eppendorf AG 22431081
HLB µElution plate 30 µm Oasis 186001828BA
SpeedVac concentrator Thermo Scientific Savant SPD2010
sonicator Qsonica Oasis180
centrifuge Thermo Scientific Sorvall Legend micro 21R
LC trap column PepMap 100 C18 Thermo Scientific 160454
LC separation column PepMap RSLC C18 Thermo Scientific 164536
mass spectrometer Thermo Scientific Orbitrap Elite ion trap mass spectrometer
MSConvert software ProteoWizard Toolkit
Sorcerer-SEQUEST software Sage-N Research, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pourpirali, S., Valacca, C., Merlo, P., Rizza, S., D’Amico, S., Cecconi, F. Prolonged pseudohypoxia targets ambra1 mrna to p-bodies for translational repression. PLoS ONE. 10, e0129750 (2015).
  2. Andres, A. M., Tucker, K. C., Thomas, A., Taylor, D. J., Sengstock, D., Jahania, S. M., Dabir, R., Pourpirali, S., Brown, J. A., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W., Mentzer, R. M. Jr, Gottlieb, R. A. Mitophagy and mitochondrial biogenesis in atrial tissue of patients undergoing heart surgery with cardiopulmonary bypass. JCI Insight. 2, e89303 (2017).
  3. Kislinger, T., Cox, B., Kannan, A., Chung, C., Hu, P., Ignatchenko, A., Scott, M. S., Gramolini, A. O., Morris, Q., Hallett, M. T., Rossant, J., Hughes, T. R., Frey, B., Emili, A. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: Combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
  4. Kren, B. T., Wong, P. Y., Shiota, A., Zhang, X., Zeng, Y., Steer, C. J. Polysome trafficking of transcripts and micrornas in regenerating liver after partial hepatectomy. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, G1181-G1192 (2009).
  5. Gottlieb, R. A., Pourpirali, S. Lost in translation: Mirnas and mrnas in ischemic preconditioning and ischemia/reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 95, 70-77 (2016).
  6. Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
  7. Lorsch, J. Methods in enzymology. Laboratory methods in enzymology: Rna. Preface. Methods in Enzymology. 530, xxi (2013).
  8. Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mrnas. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
  9. He, S. L., Green, R. Polysome analysis of mammalian cells. Methods in Enzymology. 530, 183-192 (2013).
  10. Molotski, N., Soen, Y. Differential association of micrornas with polysomes reflects distinct strengths of interactions with their mrna targets. RNA. 18, 1612-1623 (2012).
  11. Maroney, P. A., Yu, Y., Fisher, J., Nilsen, T. W. Evidence that micrornas are associated with translating messenger rnas in human cells. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1102-1107 (2006).
  12. Paul, P., Chakraborty, A., Sarkar, D., Langthasa, M., Rahman, M., Bari, M., Singha, R. S., Malakar, A. K., Chakraborty, S. Interplay between mirnas and human diseases. Journal of Cellular Physiology. 233, 2007-2018 (2018).
  13. Rupaimoole, R., Slack, F. J. Microrna therapeutics: Towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 203-222 (2017).
  14. Nelson, P. T., Hatzigeorgiou, A. G., Mourelatos, Z. Mirnp:Mrna association in polyribosomes in a human neuronal cell line. RNA. 10, 387-394 (2004).
  15. Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a mirna blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1108-1114 (2006).
  16. Kim, J., Krichevsky, A., Grad, Y., Hayes, G. D., Kosik, K. S., Church, G. M., Ruvkun, G. Identification of many micrornas that copurify with polyribosomes in mammalian neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 360-365 (2004).
  17. Androsavich, J. R., Chau, B. N., Bhat, B., Linsley, P. S., Walter, N. G. Disease-linked microrna-21 exhibits drastically reduced mrna binding and silencing activity in healthy mouse liver. RNA. 18, 1510-1526 (2012).
  18. Kraushar, M. L., Thompson, K., Wijeratne, H. R., Viljetic, B., Sakers, K., Marson, J. W., Kontoyiannis, D. L., Buyske, S., Hart, R. P., Rasin, M. R. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the rna-binding protein hu antigen r. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , E3815-E3824 (2014).
  19. McClatchy, D. B., Ma, Y., Liu, C., Stein, B. D., Martinez-Bartolome, S., Vasquez, D., Hellberg, K., Shaw, R. J., Yates, J. R. 3rd Pulsed azidohomoalanine labeling in mammals (palm) detects changes in liver-specific lkb1 knockout mice. Journal of Proteome Research. 14, 4815-4822 (2015).
  20. Schiapparelli, L. M., McClatchy, D. B., Liu, H. H., Sharma, P., Yates, J. R. 3rd, Cline, H. T. Direct detection of biotinylated proteins by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13, 3966-3978 (2014).
  21. Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6, 359-362 (2009).
  22. Rajalingam, D., Loftis, C., Xu, J. J., Kumar, T. K. Trichloroacetic acid-induced protein precipitation involves the reversible association of a stable partially structured intermediate. Protein Science. 18, 980-993 (2009).
  23. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31, 3573-3579 (2010).
  24. Sashital, D. G., Greeman, C. A., Lyumkis, D., Potter, C. S., Carragher, B., Williamson, J. R. A combined quantitative mass spectrometry and electron microscopy analysis of ribosomal 30s subunit assembly in e. Coli. Elife. 3, (2014).
  25. Liang, S., Bellato, H. M., Lorent, J., Lupinacci, F. C. S., Oertlin, C., van Hoef, V., Andrade, V. P., Roffé, M., Masvidal, L., Hajj, G. N. M., Larsson, O. Polysome-profiling in small tissue samples. Nucleic Acids Research. 46, e3 (2018).

Tags

ביוכימיה גיליון 138 איסכמיה פגיעה reperfusion פרוטאום דינמי polysome שימוש בפרופילים miRNA mRNA מסונתז לאחרונה חלבונים תרגום החלבון שקיעת הדרגתי של צפיפות סוכרוז העכבר מבודד בלב זלוף Langendorff זלוף פרוטאומיקס.
פרוטיאומיה מבנית ודינמיקה miRNA ניתוח של Polysomes מן הלב העכבר מבודדים לאחר זלוף Langendorff
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stastna, M., Thomas, A., Germano,More

Stastna, M., Thomas, A., Germano, J., Pourpirali, S., Van Eyk, J. E., Gottlieb, R. A. Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion. J. Vis. Exp. (138), e58079, doi:10.3791/58079 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter