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Biochemistry

गतिशील Proteomic और Langendorff छिड़काव के बाद अलग माउस दिल से Polysomes के miRNA विश्लेषण

doi: 10.3791/58079 Published: August 29, 2018

Summary

यहाँ हम अलग perfused माउस दिल पर polysome रूपरेखा प्रदर्शन करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । हम दिल छिड़काव, polysome रूपरेखा के लिए तरीकों का वर्णन है, और mRNAs, miRNAs, और polysome proteome के संबंध में polysome अंशों का विश्लेषण ।

Abstract

प्रोटीन अनुवाद में गतिशील परिवर्तन में अध्ययन के लिए विशेष तरीकों की आवश्यकता होती है । यहां हम ischemia और reperfusion अलग perfused माउस polysome रूपरेखा के साथ युग्मित दिल का उपयोग कर के जवाब में नव संश्लेषित प्रोटीन में परिवर्तन की जांच की । आगे प्रोटीन अनुवाद में गतिशील परिवर्तन को समझने के लिए, हम mRNAs कि cytosolic ribosomes (polyribosomes या polysomes) के साथ भरी हुई थी और भी mitochondrial polysomes और तुलना में mRNA और प्रोटीन वितरण में बरामद की विशेषता उच्च दक्षता भिंन (mRNA से जुड़ी कई ribosomes), कम दक्षता (कम ribosomes संलग्न) जिसमें mitochondrial polysomes भी शामिल थे, और गैर अनुवाद अंश । miRNAs भी mRNAs के साथ संबद्ध कर सकते है कि अनुवाद किया जा रहा है, जिससे अनुवाद की दक्षता को कम करने, हम भागों भर में miRNAs के वितरण की जांच की । mRNAs, miRNAs के वितरण, और प्रोटीन बेसल perfused शर्तों के तहत जांच की थी, वैश्विक नहीं प्रवाह के ischemia के 30 मिनट के अंत में, और reperfusion के 30 मिनट के बाद । यहां हम इस विश्लेषण को पूरा करने के लिए इस्तेमाल की विधियां प्रस्तुत-विशेष रूप से, सुक्रोज ढाल से प्रोटीन निष्कर्षण के अनुकूलन के लिए दृष्टिकोण, के रूप में यह पहले नहीं बताया गया है-और कुछ प्रतिनिधि परिणाम प्रदान करते हैं ।

Introduction

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दिल के ischemia (I) और reperfusion (आर) की चोट का जवाब एक गतिशील फैशन में । हालांकि, वहां प्रतिक्रिया के दौरान प्रोटीन संश्लेषण में तीव्र परिवर्तन में थोड़ा अंतर्दृष्टि है । यह पता करने के लिए, हम polysome की अच्छी तरह से स्थापित विधि का लाभ ले लिया1 के लिए प्रोटीन बहुतायत में परिवर्तन की पहचान है कि cytosol से ribosomes और शोधों विनियामक कारकों के पुनर्वितरण को प्रतिबिंबित polysomes, और नव संश्लेषित प्रोटीन (NSPs) में वृद्धि । I/R की सेटिंग में, नए प्रोटीन संश्लेषण में वृद्धि नई mRNAs2की प्रतिलेखन के साथ असंगत है कि एक समय सीमा में होता है; इसके अलावा, mRNA अभिव्यक्ति स्तर और प्रोटीन बहुतायत के बीच कलह3बताया गया है । इन कारणों के लिए, हम के रूप में प्रोटीन अनुवाद द्वारा परिलक्षित गतिशील proteome में परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए चुना है । ऐसा करने के लिए, हम polysome भागों में mRNA मात्रा, और polysome भागों में प्रोटीन संरचना का विश्लेषण । अंत में, क्योंकि microRNAs (miRs) अनुवाद के लिए mRNAs की उपलब्धता को विनियमित और प्रोटीन अनुवाद की दक्षता के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं4,5, हम polysome अंशों में miRs के वितरण की जांच की, पर ध्यान केंद्रित मैं प्रतिक्रिया/

हम लगातार छिड़काव की बेसल शर्तों के तहत अलग माउस Langendorff छिड़काव मॉडल और काटा ऊतक का उपयोग करें, 30 मिनट के बाद वैश्विक नहीं प्रवाह ischemia, और ischemia के 30 मिनट के बाद reperfusion के 30 मिनट के बाद चुना । हम तो दिल के ऊतकों solubilized और एक सुक्रोज ढाल पर polysomes अलग, proteomic विश्लेषण और पीसीआर और mRNAs द्वारा miRNAs और microarray के चुनिंदा पता लगाने के बाद क्रमशः । तरीकों का यह संयोजन गतिशील proteome को समझने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है, mRNA, miRNA, और NSPs का एक साथ पता लगाने को सक्षम करने के साथ ही विनियामक प्रोटीन के पुनर्वितरण, miRNA, और mRNA के बीच विअनुवाद अंश, कम दक्षता polysomes, और उच्च दक्षता polysomes ( चित्रा 1देखें) । इस प्रक्रिया के गतिशील विनियमन में अंतर्दृष्टि eIF2α या mTOR जैसे प्रमुख विनियामक कारकों के फास्फारिलीकरण के आगे विश्लेषण द्वारा विस्तारित किया जाएगा । ये व्यक्तिगत कदम अब विस्तार से बताए गए हैं ।

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Protocol

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सभी पशु अध्ययन संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया और देवदारों-सिनाई मेडिकल सेंटर के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित ।

1. माउस दिल के Langendorff छिड़काव

  1. Langendorff ischemia और reperfusion के साथ माउस दिल की छिड़काव
    1. प्रशासन intraperitoneal pentobarbital सोडियम ७० मिलीग्राम/वयस्क चूहे के लिए (8 सप्ताह पुराने, पुरुष, C57BL6/ पैर की अंगुली चुटकी के लिए वापसी की कमी से गहरी संज्ञाहरण की पुष्टि करें ।
    2. Anticoagulate के साथ intraperitoneal हेपरिन ५०० यू. ग्रा./
    3. स्टर्नल चीरा के माध्यम से छाती खोलो । डायाफ्राम खोलें और पूर्वकाल कांख धुरी के लिए लागत वाली सीमा के साथ कटौती । फिर, पूर्वकाल कांख अक्ष forelimb करने के लिए पूरी तरह से वक्ष पिंजरे खोलने के लिए काट । के बाद, दिल visualizing, संदंश के साथ आरोही महाधमनी दबाना और तेजी से दिल उत्पाद । मौत exsanguination के कारण हो रही है । दिल को ठंडी Krebs में रखें (NaCl ६.९ g/l, KCl ०.३५ g/l, NaHCO3 २.१ g/l, KH2PO4 ०.१६ g/l, MgSO4 ०.१४१ g/l, ग्लूकोज 2 g/l और CaCl2 ०.३७३ g/l
    4. कुंद-टिप सुई के साथ महाधमनी Cannulate और लगातार दबाव मोड में Krebs समाधान के साथ दिल प्रतिगामी perfuse ।
    5. 15 मिनट के एक स्थिरीकरण अवधि के बाद, 30 मिनट के लिए reperfusion द्वारा पीछा के लिए एक वैश्विक नहीं प्रवाह के लिए दिल के ischemia ।
    6. हार्वेस्ट दिल 15 मिनट के बाद आधारभूत छिड़काव, 30 मिनट के ischemia के बाद, या 30 मिनट reperfusion के बाद । बंद atria ट्रिम कर दीजिए, और स्नैप-तरल नाइट्रोजन में ऊतक फ्रीज ।
    7. पर स्टोर-८० ° c उपयोग तक

2. ऊतक Homogenization, Solubilization, और सुक्रोज घनत्व ढाल अवसादन

  1. ग्रेडिएंट तैयारी
    1. तैयार 2 समाधान (15% और ५०%) १०० मिलीलीटर सुक्रोज, NaCl २.५ M के 4 मिलीलीटर मिश्रण;
      ०.८ एमएल MgCl2 १.२५ मीटर; 1 मिलीलीटर Tris-एचसीएल 1 एम, पीएच ७.५; 15 ग्राम या ५० ग्राम सुक्रोज (15% के लिए और ५०%, क्रमशः); ultrapure पानी १०० मिलीलीटर तक पहुंचने के लिए; और xylene cyanol (०.०२ मिलीग्राम/एमएल) 15% समाधान रंग करने के लिए
    2. प्रत्येक समाधान फ़िल्टर करें (०.२२ µm फ़िल्टर)
    3. जिस दिन ढाल के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, प्रत्येक सुक्रोज समाधान के ४० मिलीलीटर तैयार करने और प्रत्येक समाधान के लिए cycloheximide जोड़ने के लिए १०० µ g/एमएल के अंतिम एकाग्रता प्राप्त
      1. 15% और ५०% सुक्रोज समाधानों के बीच एक मिश्रण तैयार करने के लिए ग्रेडिएंट मेकर का उपयोग करें
      2. 15% सुक्रोज ढाल के 5 मिलीलीटर के साथ बाएं डिब्बे भरें
      3. ५०% सुक्रोज ढाल के साथ सही डिब्बे भरें
      4. नल खोलें और चुंबकीय सरगर्मी के साथ दो छोटे डिब्बों हलचल करने के लिए पंप पर स्विच
      5. एक दूसरे नल से जुड़े ट्यूब का उपयोग करने के लिए मिश्रित सुक्रोज पतली दीवारों के साथ एक अल्ट्रा-केंद्रापसारक ट्यूब में प्रवाह के लिए समाधान की अनुमति । अंतिम मात्रा 10 मिलीलीटर के आसपास होगी ।
    4. ग्रेडिएंट्स को 4 ° c पर रखें (यदि आवश्यक हो तो रात भर, लेकिन अब नहीं)
  2. दिल के ऊतकों की Homogenization
    1. Homogenize ताजा या जमे हुए दिल में एक polytron के साथ फ़िल्टर lysis बफर (सुक्रोज ढाल भिन्नीकरण के लिए संशोधित) युक्त १०० मिमी KCl, 20 मिमी Tris पीएच ७.५, 5 मिमी MgCl2, ०.४% NP-४०. cycloheximide १०० µ जी/एमएल polysome संरचना, ०.१ U RNase अवरोध करनेवाला और चिढ़ाना अवरोधक कॉकटेल (५० एमएल के लिए 1 गोली) बनाए रखने के लिए शामिल हैं ।
    2. बर्फ पर lysate गर्मी 15 मिनट ।
    3. 15 मिनट के लिए १८,००० x g पर 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अघुलनशील सामग्री को हटाने और supernatant इकट्ठा ।
    4. आरक्षित ५० µ एल प्रोटीन निर्धारण, आरएनए अलगाव और आरएनए अखंडता विश्लेषण के लिए ( चित्रा 2देखें) ।
    5. परत supernatant (500-100 µ एल) ढाल के शीर्ष पर और lysis बफर के साथ ट्यूब संतुलन ।
  3. अवसादन और अंशों का संग्रह
    1. एक झूल बाल्टी रोटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर ३७,००० rpm पर १२० मिनट के लिए ultracentrifugation प्रदर्शन । निर्माता के अनुसार, यह अधिक से अधिक त्रिज्या में २२८,००० x g से मेल खाती है ।
    2. प्रत्येक ढाल के रूप में ले लीजिए 17 अंश (लगभग ६०० µ l प्रत्येक अंश) microcentrifuge ट्यूबों में अवशोषक की सतत निगरानी के साथ २५४ एनएम (आयुध डिपो२५४) ।
    3. भिन्न संग्राहक निम्नानुसार प्रोग्राम:
      1. संग्रह के पहले 3 मिनट त्यागें (ढलान से पहले ट्यूबों में निहित तरल करने के लिए इसी)
      2. 4 से 19 मिनट के लिए, 17 अंशों में 1 एमएल/मिनट की गति से अंशों को एकत्र करें ।
    4. जैसे ही प्रत्येक एकत्र किया जाता है बर्फ पर भागों प्लेस । -८० डिग्री सेल्सियस पर नमूने फ्रीज, अगर वे तुरंत संसाधित नहीं किया जा रहा है । एक ठेठ यूवी densitometric के रूप में यह एकत्र की है ढाल के अनुरेखण चित्रा 1में दिखाया गया है ।

3. अलगाव और Polysome और अनुवाद भिन्नताओं से mRNAs का विश्लेषण

  1. mRNA का निष्कर्षण
    1. पिघल रहे अंशों को बर्फ पर, यदि वे संग्रह के बाद फ़्लैश-जमे हुए थे
    2. स्थानांतरण २०० प्रत्येक अंश के µ एल एक ताजा ट्यूब करने के लिए
      नोट: इस चरण में, दो या अधिक क्रमिक भिन्न हो सकते हैं एक साथ परित । यह आयुध डिपो२५४ ग्राफ का विश्लेषण करने के बाद सावधानी से किया जाना चाहिए ताकि polysome और गैर polysome अंश मिश्रित न हो ।
    3. मानकीकरण प्रयोजन के लिए प्रत्येक नमूने के लिए आंतरिक नियंत्रण के रूप में luciferase आरएनए के 10 एनजी जोड़ें.
      नोट: Luciferase प्राइमरों के परिणामों को सामान्य करने के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
    4. आरएनए निष्कर्षण रिएजेंट के ७०० µ एल जोड़ें (phenol और guanidine isothiocyanate के monophasic समाधान; सामग्री की तालिकादेखें) प्रत्येक ट्यूब के लिए । अच्छी तरह से मिश्रण और आरटी (कमरे के तापमान) पर 5 मिनट के लिए ट्यूबों गर्मी ।
    5. १४० µ एल क्लोरोफॉर्म और भंवर 15 एस के लिए आरटी में 2-3 मिनट के लिए मशीन जोड़ें ।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर १२,००० x g पर 15 मिनट के लिए नमूने केंद्रापसारक ।
    7. ध्यान से एक नई ट्यूब के लिए ऊपरी जलीय चरण हस्तांतरण ।
    8. चूंकि भिन्नताओं की आरएनए सामग्री अधिक नहीं है, प्रत्येक ट्यूब के लिए वाहक के रूप में ग्लाइकोजन के 10 µ g जोड़ें.
    9. प्रत्येक ट्यूब में ३५० µ l isopropanol जोड़ें । उपज बढ़ाने के लिए 1 एच के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर अच्छी तरह से मिलाएं और मशीन ।
    10. 4 डिग्री सेल्सियस पर १२,००० x g पर 15 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
    11. supernatant त्यागें और आरएनए गोली धोने के लिए ७०० µ एल इथेनॉल ७५% जोड़ें ।
    12. 4 डिग्री सेल्सियस पर ७,५०० x g पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
    13. इथेनॉल निकालें और दो गोली हवा 10 के लिए शुष्क-15 मिनट ।
      नोट: पर-आरएनए गोली सुखाने पानी में अपनी पूरी solubilization को रोकने जाएगा ।
    14. RNase-मुक्त ultrapure एच2ओ के ५० μL में आरएनए गोली resuspend ।
    15. ५५ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए नमूनों की मशीन ।
    16. प्रत्येक नमूने के 2 μL का उपयोग करने के लिए गुणवत्ता और निकाली आरएनए की मात्रा को मापने और शेष की दुकान पर-८० ° c.
  2. रिवर्स प्रतिलेखन और qPCR
    1. रिवर्स प्रतिलेखन सीडीएनए संश्लेषण किट के 4 μL का प्रयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) एक 20 μL प्रतिक्रिया के लिए । नमूनों की संख्या के अनुसार supermix तैयार करें । प्रत्येक ट्यूब के लिए आवश्यक मात्रा स्थानांतरण और प्रत्येक ट्यूब के लिए इनपुट आरएनए के 5 μL जोड़ें. इस खंड Taq पोलीमरेज़ कार्य स्थितियों की श्रेणी के लिए प्रासंगिक होने के लिए सही किया जा सकता है ।
    2. निंनलिखित कार्यक्रम के निर्माता द्वारा अनुशंसित के साथ एक थर्मल साइकिल चालक में ट्यूब मशीन: 25 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट, 20 मिनट ४६ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए रिवर्स प्रतिलेखन, और रिवर्स transcriptase सक्रियण 1 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर ।
    3. प्राइमरों की प्रत्येक जोड़ी के लिए अनुकूलित कार्यक्रम के साथ qPCR भागो ।
      नोट: भागों में कुछ mRNAs की उपस्थिति का पता लगाने के लिए, (पृथक आरएनए के) प्रत्येक अंश से बराबर मात्रा रिवर्स प्रतिलेखन के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
  3. परिणामों का विश्लेषण
    1. रुचि जीन और luciferase के सीटी मूल्य का उपयोग करने के लिए डेल्टा सीटी मूल्यों की गणना
    2. सभी भिन्न भिन्न अंशों में mRNA के वितरण की कल्पना करने के लिए सभी अंशों में निहित कुल mRNA मान के प्रतिशत के रूप में प्रत्येक भिन्न डेल्टा सीटी मान व्यक्त करें (तालिका 1)

4. अलगाव और Polysome भिन्न और विअनुवाद अंश से miRNAs का विश्लेषण

  1. mRNA और miRNA का निष्कर्षण
    नोट: यह प्रोटोकॉल निर्माता के निर्देशों का अनुसरण करता है, कुछ परिवर्तनों के साथ ।
    1. ग्लाइकोजन और कील-नियंत्रण में गल । बर्फ पर रखो ।
    2. जोड़ें ७०० µ l के लिए miRNA निष्कर्षण रिएजेंट के लिए २०० µ l pooled नमूना.
    3. जोड़ें 1 µ g/µ l के ग्लाइकोजन और homogenize यह पिपेट का उपयोग कर । यह कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन ।
    4. जोड़ें ३.५ µ एल के १.६ x 108 स्पाइक-नियंत्रण में है और यह मिश्रण ।
    5. जोड़ें २०० µ क्लोरोफॉर्म के एल और भंवर यह कम से 15 सेकंड के लिए ।
    6. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए मशीन ।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए १२,००० x g पर केंद्रापसारक ।
    8. एक पिपेट का उपयोग कर, supernatant एक नया १.५ एमएल ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण । मध्य और निचले चरणों को छोड़ें ।
    9. supernatant के लिए १००% इथेनॉल की 1.5 x मात्रा जोड़ें और इसे मिलाएं ।
    10. स्थानांतरण ७०० µ इस मिश्रण के एल miRNA निष्कर्षण कॉलम करने के लिए और यह पूर्ण गति पर 15 एस आरटी पर के लिए और प्रवाह के माध्यम से त्यागना; इस चरण को किसी भी बचे हुए नमूने के साथ दोहराएं ।
    11. स्तंभ के लिए 1 बफर के ७०० µ एल जोड़ें और यह पूरी गति से के लिए आरटी पर 15 एस के केंद्रापसारक; प्रवाह के माध्यम से त्यागें ।
    12. स्तंभ के लिए 2 बफर के ५०० µ एल जोड़ें और यह पूरी गति से के लिए आरटी पर 15 एस के केंद्रापसारक; प्रवाह के माध्यम से त्यागें ।
    13. स्तंभ के लिए ८०% इथेनॉल के ५०० µ एल जोड़ें और आरटी में 2 मिनट के लिए पूरी गति से यह केंद्रापसारक; प्रवाह के माध्यम से त्यागें ।
    14. एक नया 2 मिलीलीटर uncapp ट्यूब के लिए कॉलम स्थानांतरण, ढक्कन खुला और पूरी गति से 5 मिनट के लिए आर टी पर यह केंद्रापसारक; प्रवाह के माध्यम से त्यागें ।
    15. RNAse के 16 µ एल जोड़ें-कॉलम को नि: शुल्क पानी और यह पूर्ण गति से प्रारंभ पर 1 मिनट के लिए आर टी । भविष्य के विश्लेषण के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर बर्फ या स्टोर पर eluate रखें ।
      नोट: प्रत्येक नमूने के दो microliters का उपयोग ओडी विश्लेषण के लिए किया जा सकता है ।
  2. रिवर्स प्रतिलेखन
    1. बर्फ पर तैयार करते हैं । प्रत्येक 20 µ एल आरटी के लिए-पीसीआर रिएक्शन, miRNA आरटी बफर के 4 µ एल, न्यूक्लिक एसिड के 2 µ एल, कुल आरएनए के 9 µ एल, एंजाइम के 2 µ एल और µ के 3 RNAse एल-मुक्त पानी; यह मिश्रण और संक्षेप में नीचे स्पिन ।
    2. इस प्रकार के रूप में थर्मल साइकिल चालक सेट करें:
      ६० मिनट के लिए ३७ ° c;
      5 मिनट के लिए ९५ ° c;
      4 ° c पकड़ो ।
    3. थर्मल साइकिल चालक से ट्यूबों निकालें और RNAse-मुक्त पानी की २०० µ एल जोड़ें । -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर या वास्तविक समय पीसीआर के लिए आगे बढ़ना ।
  3. रीयल टाइम पीसीआर
    नोट: यह प्रोटोकॉल इस प्रकार ९६ अच्छी तरह प्लेट प्रारूप । बर्फ पर प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें ।
    1. पीसीआर रिएक्शन मिक्स तैयार करें और प्रोटोकॉल द्वारा स्वीकृत सीमा के अनुसार सीडीएनए (ऊपर miRNAs से) जोड़ें । एकाधिक प्रतिक्रियाओं बैच में तैयार किया जा सकता है ।
    2. प्रत्येक कुआं में पीसीआर मिक्स + सीडीएनए की कुल 25 µ एल जोड़ें ।
    3. एक ऑप्टिकल प्लेट सील का उपयोग कर प्लेट सील ।
    4. कमरे के तापमान पर १,००० x g पर 1 मिनट के लिए थाली केंद्रापसारक ।
    5. कार्यक्रम के रूप में वास्तविक समय साइकिल चालक:
      प्रारंभिक सक्रियकरण चरण 15 मिनट के लिए ९५ ° c;
      3-चरण सायक्लिंग: 15 एस के लिए ९४ ° c पर विकार; 30 s के लिए ५५ ° c पर एनीलिंग; 30 s के लिए ७० ° c पर एक्सटेंशन (प्रतिदीप्ति डेटा संग्रह निष्पादित); ४० चक्र जोड़ें;
      पिघलने-वक्र चक्रीय डिफ़ॉल्ट के अनुसार ।
  4. तुलनात्मक विश्लेषण
    1. सामान्यीकरण का उदाहरण ( तालिका 2देखें):
      1. SCM ंयूनतम मान ढूंढें ।
      2. इस न्यूनतम करने के लिए सभी SCM मानों को सामान्य करें ।
      3. miRNAs ब्याज (MOI) और संदर्भ जीन (रेफरी) के सीटी मूल्यों से इस मूल्य घटाना ।
      4. 2-ΔCt सूत्र का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें ।

5. Proteomic विश्लेषण

  1. polysome अंशों से प्रोटीन का निष्कर्षण
    1. तीन अंतिम भागों में एकत्र सुक्रोज भागों गठबंधन । चिह्नित अंशों के रूप में भारी (उच्च दक्षता polysomes pooled अंशों में 4, 5, 6 और 7 सुक्रोज की उच्चतम एकाग्रता के साथ; ग्रैडिएंट ट्यूब के नीचे), प्रकाश (कम क्षमता polysomes में परित अंश 8, 9, 10 और 11; मध्य का ग्रैडिएंट ट्यूब) और गैर अनुवाद (परित भिंन 12, 13, 14 और सुक्रोज के सबसे कम एकाग्रता के साथ 15; ढाल ट्यूब के ऊपर) । परित अंशों पर प्रोटीन परख करते हैं ।
    2. trichloroacetic एसिड (टीसीए) के १००% शेयर तैयार करें और इसे अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । १००% टीसीए के ६० µ एल के साथ नमूना के ०.५ मिलीलीटर मिक्स और अंधेरे में रात-20 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी ।
      नोट: का प्रयोग करें १.५ मिलीलीटर कम प्रोटीन प्रतिधारण ट्यूबों ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    3. रात भर की गर्मी के बाद, गल बर्फ पर नमूना और १५,००० x g, 30 मिनट के लिए 4 ° c पर केंद्रापसारक । supernatant त्यागें ।
      नोट: १०० µ जी में कुल प्रोटीन का नमूना ट्यूब तल पर दिखाई प्रोटीन गोली देता है ।
    4. पूर्व चिल एसीटोन-20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में । प्रोटीन गोली के लिए ठंडा एसीटोन के ०.५ मिलीलीटर जोड़ें और १५,००० x जी, 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक supernatant त्यागें । इस चरण को दो बार दोहराएं ।
    5. हवा गोली सूखी । ५० mM Tris-एचसीएल बफर (पीएच 8) के ३६० µ एल में गोली resuspend ।
      नोट: यदि आवश्यक हो, एक पल्स sonicator का उपयोग करने के लिए गोली स्थगित ।
    6. जोड़ें ०.१ एम dithiothreitol के ४० µ एल (अंतिम एकाग्रता 10 मिमी) और ४५ मिनट के लिए शेखर पर ५५ डिग्री सेल्सियस पर मशीन जोड़ें ५० एम iodoacetamide (अंतिम एकाग्रता 17 मिमी) और कमरे के तापमान पर में 30 मिनट के लिए के लिए शेखर पर गर्मी की गर्मी अंधेरे में ।
    7. trypsin हल तैयार करें: ५० mM अमोनियम बिकारबोनिट के १०० µ l में trypsin के 20 µ g को पुनर्निलंबित । 1:50 (w/w) trypsin पर नमूना के लिए trypsin समाधान की इसी मात्रा जोड़ें: प्रोटीन अनुपात, यह सुनिश्चित करें कि पीएच 8 है और ३७ डिग्री सेल्सियस पर शेखर रात भर में मशीन ।
      नोट: 8 में पीएच लाने के लिए 1 मीटर अमोनियम बिकारबोनिट जोड़ें ।
    8. trypsin पाचन के बाद, नमूना शांत, बेंच केंद्रापसारक में संक्षेप में, 2 पीएच करने के लिए 10% फार्मिक एसिड जोड़ने-3 trypsin गतिविधि बुझाने के लिए, और नमूना नमकीन के साथ आगे बढ़ना ।
      नोट: सैंपल को नमकीन करने के लिए µ-रेफरेंस प्लेट का इस्तेमाल करें ।
    9. हालत sorbent के कुएं में ९६ अच्छी तरह से थाली के साथ २०० µ एल के मेथनॉल का उपयोग कर वैक्यूम तीन बार कंडीशनिंग के द्वारा २०० µ एल द्वारा ०.१% फार्मिक एसिड तीन बार । नमूना लोड और ०.१% फार्मिक एसिड की २०० µ एल का उपयोग कर एक नमूना धोने प्रदर्शन तीन बार. Elute १०० µ एल के साथ नमूना ५०% acetonitrile/0.1% फार्मिक एसिड दो बार कम प्रोटीन प्रतिधारण ०.५ मिलीलीटर ट्यूब में ।
      नोट: Elute पर कम वैक्यूम के बाद गुरुत्वाकर्षण का उपयोग करते हुए पहले धीरे से नमूना ।
    10. ध्यान केंद्रित का उपयोग कर सूखापन के लिए नमूना eluate लुप्त हो जाना और या तो सीधे बाहर मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण ले या दुकान पर-८० ° c उपयोग तक ।
  2. मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण
    1. प्रत्येक गोली का पुनर्गठन (tryptic पेप्टाइड्स से मिलकर) 50 में-100 µ l और मास स्पेक्ट्रोमीटर में 1 µ l इंजेक्षन.
      नोट: पुनर्गठन और इंजेक्शन संस्करणों अधिकतम तीव्रता नियंत्रण प्राप्त करने के लिए ऑप्टिमाइज़ करें/ हमारे मामले में, अधिकतम संकेत (कुल आयन वर्तमान; टिक स्कैन के दिल में) 1E8 की सीमा में था 2E9 के लिए ।
    2. एक ट्रैप स्तंभ C18 का प्रयोग करें (३०० µm आईडी x 5 मिमी, 5 µm, 100Å) C18 कॉलम का उपयोग पेप्टाइड जुदाई द्वारा पीछा (७५ µm आईडी एक्स २५० मिमी, 2 µm, 100Å) एक प्रवाह की दर के साथ ३०० nL/न्यूनतम करने के लिए सेट नैनो स्रोत केशिका तापमान २७५ ° c और स्प्रे वोल्टेज के लिए 2 केवी.
    3. ९० मिनट के लिए 5 – 35% B का रेखीय ग्रेडिएंट लागू करें, 35 – 95% b 3 मिनट के लिए, ९५% b पर 7 min और equilibration के लिए 5% b पर 25 मिनट के लिए (a: ०.१% फार्मल एसिड/पानी और बी: ०.१% acetonitrile में अंलीय एसिड) । प्रत्येक MS1 सीआईडी मोड का उपयोग कर स्कैन से 15 उच्चतम तीव्रता आयनों के लिए MS2 स्पेक्ट्रा प्राप्त करें । का प्रयोग करें 3 मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रत्येक नमूने के लिए प्रतिकृति विश्लेषण ।
      नोट: ऑप्टिमाइज़ करें और विशेष जन स्पेक्ट्रोमेट्री साधन पर अपने नमूनों के लिए उपयुक्त हैं कि प्रयोगात्मक शर्तों और मापदंडों का उपयोग. धारा ५.२ में उल्लिखित शर्तों/ इस्तेमाल किया और हमारी प्रयोगशाला में अनुकूलित कर रहे थे ।
  3. प्रोटीन पहचान quantitation/
    1. मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के बाद, MSConvert सॉफ्टवेयर (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html) का उपयोग कर संगत mzXML फ़ाइलों में कच्चे स्पेक्ट्रा फ़ाइलों को परिवर्तित ।
    2. SEQUEST खोज इंजन में कनवर्ट की गई फ़ाइलों को खोज मापदंड के साथ सबमिट करें, उदा., UniProtKB/स्विस-Prot माउस डेटाबेस (सबसे ऊपर दिनांक विहित समीक्षित); अर्द्ध एंजाइम डाइजेस्ट trypsin का उपयोग कर (के बाद केआर/ अप करने के लिए के साथ 2 छूटी दरारें; प्रणेता जन सीमा: ४०० से ४,५०० एएमयू; स्थैतिक संशोधन: carbamidomethyl (C) ५७.०२१४६५ एएमयू; पेप्टाइड जन सहिष्णुता: ५० पीपीएम; टुकड़ा जन प्रकार: monoisotopic ।
      नोट: अंय प्रोटीन डेटाबेस खोज इंजन और डेटा पाइपलाइनों का इस्तेमाल किया जा सकता है । यदि चूहे, जो माउस और मानव के लिए डेटाबेस की तुलना में कम पूरा हो गया है के लिए डेटाबेस का उपयोग कर, आप के खिलाफ खोज करने की आवश्यकता हो सकती है माउस (और/proteome कवरेज बढ़ाने के लिए मानव डेटाबेस) । इस मामले में, प्रोटीन के नाम में अतिरेक को दूर करने की आवश्यकता होगी ।
    3. पोस्ट-खोज विश्लेषण निष्पादित करें । डेटा देखने के लिए फ़िल्टर्स सेट करें. उदाहरण के लिए, ९५% या ९९% के रूप में एक न्यूनतम प्रोटीन संभाव्यता (प्रोटीन थ्रेशोल्ड) सेट करें, अर्थात, केवल वे प्रोटीन जिनके लिए एक सांख्यिकीय विश्लेषण का तात्पर्य ९५% या ९९% है जो नमूने में मौजूद होने की संभाव्यता प्रदर्शित की जाएगी. पेप्टाइड थ्रेशोल्ड के लिए फ़िल्टर सेट करें (उदा., ९५%), यानी, न्यूनतम प्रायिकता जो निर्धारित करने में उपयोग की जाएगी कि क्या स्पेक्ट्रम किसी पेप्टाइड की पहचान करता है. एक प्रोटीन मौजूद है, तो निर्धारित करेगा जो पेप्टाइड्स की न्यूनतम संख्या का चयन करें (2 पेप्टाइड्स प्रोटीन पहचान के लिए एक न्यूनतम के रूप में अनुशंसित है) ।
    4. गुणवत्ता/मात्रा के लिए पहचाने गए प्रोटीन का मूल्यांकन करें । सुनिश्चित करें कि proteotypic पेप्टाइड्स ठहराव के लिए उपयोग किया जाता है । यदि isoform की पहचान की है यह एक tryptic एक अमीनो एसिड विशिष्ट isoform के लिए अद्वितीय अनुक्रम के शामिल पेप्टाइड के अवलोकन पर कुर्सियां है सुनिश्चित करें । किसी भी "के समान" या काल्पनिक प्रोटीन तुलना से गुजरना चाहिए देखने के लिए अगर मनाया पेप्टाइड्स एक ज्ञात प्रोटीन के अनुरूप है ।

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Representative Results

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mRNA विश्लेषण
mRNA परिणाम प्रत्येक अंश (चित्रा 3ए) में एक विशेष mRNA के वितरण के रूप में व्यक्त किया जा सकता है; ठहराव के लिए, भिंन अनुवाद polyribosomal का मिश्रण है और गैर अनुवाद अंश (चित्र बी) के लिए तुलना, अनुवाद भागों में अनुवाद करने में mRNA बहुतायत का अनुपात पेश । अतिरिक्त जानकारी उच्च दक्षता polysome भिन्नताओं को कम-कुशलता polysome भिन्नताओं (और गैर-अनुवाद अंशों से अलग) की जाँच करके प्राप्त की जाती है. यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब miRNAs विश्लेषण, जो कम दक्षता भागों में समृद्ध कर रहे है (जहां वे अपने लक्ष्य mRNAs के प्रोटीन अनुवाद के साथ हस्तक्षेप) ।

एक विशेष mRNA के लिए प्रतिनिधि परिणाम है कि अनुवाद और अनुवाद अंश भर में अपने वितरण परिवर्तन के बाद माउस दिल ischemia और ischemia के अधीन थे/reperfusion अन्तर्वासना की तुलना में 4 चित्रामें दिखाए गए हैं ।

miRNA सरणी विश्लेषण
एक miRNA सरणी विश्लेषण से प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 5में दिखाए जाते हैं. यहां, miRNAs के एक सबसेट (कस्टम-सरणी प्लेट डिजाइन) का संकेत दिया है कि 22 miRNAs ischemia, ischemia और reperfusion के दौरान 9 miRNAs के दौरान polysomes के साथ जुड़े थे, 7 कि दोनों स्थितियों के लिए आम थे के साथ परित भारी अंशों में विश्लेषण किया गया । यह पता चलता है कि miRNAs के संघ के ischemia और reperfusion के तनाव के जवाब में गतिशील है ।

Proteomic विश्लेषण
अन्तर्वासना के भारी, प्रकाश और गैर अनुवाद अंशों का विश्लेषण (control) नमूना:
कुल प्रोटीन की ८८१ जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पहचान की गई; कुल के 3, ४६ और २०८ प्रोटीन भारी, प्रकाश और गैर ट्रांस अंश, क्रमशः (चित्रा 6A) के लिए अद्वितीय थे । mitochondrial राइबोसोमल प्रोटीन (28S और 39S) के बहुमत (८८%) प्रकाश अंश (४१ से ३६) और एक बहुमत (८८%) cytosolic राइबोसोमल प्रोटीन (40 और 60 के दशक) में आमतौर पर दोनों भारी और प्रकाश भागों में पहचान की गई थी (५३ से बाहर की) पुष्टि कुशल जुदाई और proteomic की पहचान करने के लिए भारी cytosolic बनाम हल्का mitochondrial राइबोसोमल प्रोटीन की क्षमता । निधार्रित mitochondrial और cytosolic राइबोसोमल प्रोटीन के सबसेट को चित्रा घमण्डमें दिखाया गया है ।

Figure 1
चित्रा 1: सुक्रोज ढाल पर polysome भागों के ठेठ यूवी अवशोषक प्रोफ़ाइल । पहले तीन अंशों टयूबिंग में शूंय मात्रा का प्रतिनिधित्व करते हैं । उच्च दक्षता (उच्च आणविक भार, HMW) भिन्न भिन्न 4-7 में एकत्र कर रहे हैं, कम दक्षता (कम आणविक भार, LMW) 8-11 में भिन्न, और गैर अनुवाद (और शेष cytosolic सामग्री) भागों में एकत्र किया जाता है 12-15 ( अनुवाद, NTR) । लाल रेखा चालकता इंगित करता है, और नीले निशान २५४ एनएम पर यूवी अवशोषक इंगित करता है । सही पर सुक्रोज ढाल के साथ एक परीक्षण ट्यूब का एक कार्टून, अवसादन के बाद polysomes के वितरण दिखा रहा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: आरएनए अखंडता नियंत्रण विश्लेषक पर विश्लेषण । कुल आरएनए की आरएनए वफ़ादारी संख्या (रिण) दिल पूरी lysate से अलग. रिण की गणना 18S और 28S चोटियों के अनुसार की जाती है. रिन रेंज: 1-10, और रिन = 10 एक बहुत अच्छी अखंडता का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: सुक्रोज ढाल में mRNA वितरण के प्रतिनिधि प्रोफ़ाइल । दिल बेसल Langendorff छिड़काव या ischemia और reperfusion (आर) के अधीन थे । (क) हृदय lysates सुक्रोज ढाल पर हल किए गए थे और GAPDH (बाएँ) के लिए mRNA सामग्री और COX4 (दाएँ) प्रत्येक अंश में निर्धारित किए गए थे. भूखंड प्रत्येक अंश में सापेक्ष mRNA बहुतायत दिखाता है (x-अक्ष पर भिंन संख्या) बेसल छिड़काव के लिए (अन्तर्वासना, लाल रेखा और हीरे) और ischemia/reperfusion (मैं/ भूखंड पर आरोपित यूवी अवशोषक कुल mRNA सामग्री (प्रकाश ग्रे वक्र) और कंडक्टर (सीधे ग्रे ढलान लाइन) का संकेत कर रहे हैं । बक्से इंगित करते है कि कैसे भिंन परित किए गए थे । (ख) बार ग्राफ भूखंड अनुवाद में mRNA बहुतायत का अनुपात दिखाता है (polysomes) बनाम अनुवाद (NT) अंशों के लिए GAPDH (बाएँ) और COX4 (दाएँ) mRNAs. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: प्रतिनिधि mRNA परिणाम । प्रायोगिक समूह के अनुसार परिवर्तन दर्शाते हुए परित अंशों (HMW, LMW, NTR) में एक-एक mRNA का Quantitation. माउस दिलों की Polysome अंश Langendorff छिड़काव के बाद प्रदर्शन किया गया था । परिणाम कुल mRNA (ऊपरी पैनल) के% के रूप में और polysomes (HMW + LMW) के अनुपात के रूप में अनुवाद अंश (NTR) के लिए साजिश रची है । त्रुटि पट्टियां प्रति समूह 5 दिलों से परिणाम का प्रतिनिधित्व (अन्तर्वासना, ischemia, या मैं/ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा ५: प्रतिनिधि miRNA परिणाम. एक मार्ग के वेन आरेख miRNA विश्लेषण दिखा और दिल के ischemia या ischemia और reperfusion के बाद चूहों के नमूनों की भारी अंश ताल में downregulated miRNAs । कट ऑफ मूल्य: १.५ गुना । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पहचान प्रोटीन । (क) प्रोटीन आम और भारी, प्रकाश और गैर ट्रांस अंश के लिए अद्वितीय का वेन आरेख । (ख) mitochondrial और cytosolic राइबोसोमल प्रोटीन की पहचान के सबसेट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: परीक्षण प्रोटीन निष्कर्षण तरीकों के लिए योजनाबद्ध कार्यप्रवाह । प्रोटीन निष्कर्षण विधियों का उपयोग करके परीक्षण किया गया अन्तर्वासना (नियंत्रण) नमूना और भारी (उच्च दक्षता polysomes) अंश उच्चतम सुक्रोज सामग्री के साथ. लाल रंग में संख्या उन प्रोटीन की संख्या दर्शाती है जो मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पहचाने गए थे; जहां दो नंबर दिखाए जाते हैं, वे दो अलग से प्रयोगों से होते हैं । विस्तृत वर्णन पाठ में दिया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

भिन्न जीन सीटी LUCIFERASE सीटी ΔCt 2ΔCt सभी अंशों का योग प्रत्येक अंश का% Polysome/NTR अनुपात
उच्च दक्षता (HMW) २८.७५ २२.७९ ५.९६ ०.०१६ ०.०४६ ३४.६४ २.७७
कम दक्षता (LMW) २८.४३ २२.६३ ५.८० ०.०१८ ३८.८१
गैर अनुवाद (NTR) २९.१२ २२.७७ ६.३५ ०.०१२ २६.५५
Polysome/NTR अनुपात = (HMW + LMW)/NTR

तालिका 1: mRNA के नमूना विश्लेषण । एक mRNA के विश्लेषण की विधि मात्रात्मक पीसीआर के बाद विभिन्न परित भिन्न (HMW, LMW, NTR) के लिए दिखाया गया है । ΔCt = जीन सीटी-luciferase सीटी, और 2ΔCt 2ΔCtहै ।

SCM ंयूनतम मान ढूंढें: २२.७७
नमुना १ नमूना 2 नमुना ३
सीटी MOI २२.९२ २२.३६ २२.५८
सीटी SCM २२.८१ २२.७७ २२.९
सीटी रेफरी २३.२७ २३.५५ २३.१९
इस न्यूनतम करने के लिए सभी SCM मानों को सामान्य
नमुना १ नमूना 2 नमुना ३
सीटी SCM ०.०५ 0 ०.१३
MOI और REF के सीटी मानों से ये मान घटाना
नमुना १ नमूना 2 नमुना ३
सीटी MOI २२.८७ २२.३६ २२.४५
सीटी रेफरी २३.२२ २३.५५ २३.०६

तालिका 2: polysome और गैर अनुवाद भिन्नताओं में miRNA व्यंजक तुलना के लिए नमूना रीयल-टाइम पीसीआर परिकलन. miRNAs ऑफ इंटरेस्ट (MOI) और संदर्भ जीन (रेफरी) ischemia या ischemia/reperfusion के बाद चूहों के परित भारी अंशों में विश्लेषण किया गया । सीटी मान पहले स्पाइक नियंत्रण (SCM) सीटी मान के लिए सामान्यीकृत थे, तब 2-ΔCt सूत्र miRNA अभिव्यक्ति की तुलना करने के लिए उपयोग किया गया था ।

विधि नमूना मात्रा [एमएल] # प्रोटीन की पहचान की टिप्पणियाँ
FASP 1 २२७ सुक्रोज के थोक फिल्टर पर उपजी
एसीटोन वर्षण ०.६ ३७२ ट्यूब तल पर सुक्रोज के चिपचिपा कीचड़; 4:1 (एजेंट: नमूना) वॉल्यूम; कोई दिखाई प्रोटीन गोली
क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल वर्षण ०.३२ ३८९ ट्यूब तल पर सुक्रोज के चिपचिपा कीचड़; 8:1 (एजेंट: नमूना) वॉल्यूम; कोई दिखाई प्रोटीन गोली
टीसीए वर्षण (4 डिग्री सेल्सियस पर) ०.५ ४०५, ४१५ सं सुक्रोज वर्षण; 0.12:1 (एजेंट: नमूना) वॉल्यूम; ट्यूब तल पर दिखाई गोली
पुनः वर्षा ८५, ६० पहली गोली के बाद supernatant के अतिरिक्त टीसीए वर्षा एकत्र किया गया था
टीसीए वर्षण (पर-20 डिग्री सेल्सियस) ०.५ ४४०, ४३० सं सुक्रोज वर्षण; 0.12:1 (एजेंट: नमूना) वॉल्यूम; ट्यूब तल पर दिखाई गोली
पुनः वर्षा ८१, ५५ पहली गोली के बाद supernatant के अतिरिक्त टीसीए वर्षा एकत्र किया गया था

तालिका 3: प्रोटीन निष्कर्षण तरीकों की तुलना । FASP, एसीटोन वर्षण, क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल वर्षा, और 4 डिग्री सेल्सियस और-20 डिग्री सेल्सियस पर टीसीए वर्षा का मूल्यांकन किया गया । लक्ष्य की पहचान प्रोटीन की संख्या को अधिकतम करने के लिए किया गया था । टीसीए वेग reproducibility की पुष्टि करने के लिए सामग्री के एक दूसरे बैच पर मूल्यांकन किया गया.

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Discussion

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Polysome प्रोफ़ाइल विश्लेषण एक विशिष्ट mRNA या पूरे transcriptome6,7के शोधों की स्थिति का विश्लेषण करके प्रोटीन अनुवाद के अध्ययन के लिए अनुमति देता है । यह बहुत मदद की भी है जब स्थानीय अनुवाद ऐसे synaptosomes8के रूप में अध्ययन किया जाना चाहिए । परंपरागत रूप से, इस विधि मोनो की जुदाई शामिल है और polyribosomes और एक सुक्रोज ढाल जो जीनोमिक या proteomic तकनीकों के साथ युग्मित किया जा सकता है पर संबद्ध mRNAs उद्देश्य6,9प्राप्त करने के लिए । उदाहरण के लिए, एक हाल ही में हमारे समूह द्वारा किए गए एक अध्ययन के बाद transcriptional विनियामक CPB, जो ischemia/reperfusion चोट के दौर से गुजर रोगियों के दिल में मार डाला तंत्र से पता चला है । polysome प्रोफाइल विश्लेषण का लाभ उठाते हुए, हम CPB प्रक्रिया2के बाद परमाणु इनकोडिंग दिल में mitochondrial प्रोटीन के अनुवाद में वृद्धि दिखाई है ।

गतिशील proteome polyribosomal रूपरेखा यहां प्रस्तुत दृष्टिकोण polyribosomes और प्रोटीन है कि सक्रिय रूप से अनुवाद किया जा रहा है के साथ जुड़े mRNAs की आबादी में परिवर्तन प्रकट कर सकते हैं । mRNAs के अनुवाद के रूप में भाग में miRNAs द्वारा संचालित है, इन भागों में miRNAs का विश्लेषण अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्रकट कर सकते हैं । वास्तव में, कई अध्ययनों से इस पद्धति को संशोधित किया है और यह साबित करने के लिए एक उपयुक्त और विश्वसनीय दृष्टिकोण miRNA मोड की जांच करने के लिए विनियमन10,11.

कई अध्ययनों से पिछले दशक में आयोजित किया गया है miRNAs की भूमिका में तल्लीन करना, विभिंन जैविक कार्यों में उनके महत्व पर विचार12,13। के बाद से आधार के माध्यम से miRNAs अधिनियम-समकक्ष mRNAs के साथ बाँधना ताकि उंहें क्षरण के लिए चिह्नित करने के लिए, polysome प्रोफ़ाइल विश्लेषण किया गया है और दिखाया गया है कि miRNAs वास्तव में polysome अंशों में पाया जाता है,14 mRNAs अनुवाद लक्ष्यीकरण, 15 , 16. मीर-21 एक अच्छा उदाहरण है जहां यह सामांय कोशिकाओं में एक कम दमन और कमजोर polysomes बंधन के साथ जुड़ा हुआ है, जबकि कैंसर की कोशिकाओं में, polysomes के साथ सहयोग बढ़ जाता है और दमन प्रभाव बहुत मजबूत है17

इस अध्ययन में, वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण miRNAs ब्याज की सीटी मूल्यों का उपयोग किया गया था (MOI), स्पाइक के सीटी मूल्यों-नियंत्रण miRNA (SCM) में तकनीकी बदलाव और एक संदर्भ जीन या miRNA (रेफरी) के सीटी मूल्य कम है जो नमूनों के बीच स्थिर है । पहला कदम MOI और SCM के सीटी मूल्यों को रेफरी के सीटी मूल्यों को सामान्य करने के लिए किया गया था । फिर वहां एक दूसरा कदम MOI के रेफरी को सामांय और परिणामी मान था 2-ΔCt सूत्र की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । ये मान या फ़ोल्ड-परिवर्तन मान समूहों के बीच अंतर को प्रदर्शित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है ।

के बाद से प्रोटीन की निकासी polysome भागों से मुश्किल है, अब तक प्रदर्शन अध्ययन के सबसे, भागों पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए सीधे इस्तेमाल किया है । वे सिर्फ प्रत्येक अंश के प्रोटीन सामग्री तलछट और यह एसडीएस-लोड हो रहा है बफर के साथ मिश्रण एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण के लिए उपयोग करने के लिए8,18। यहां, हम एक विधि है जो हमें न केवल mRNAs और miRNAs अंश के बाद निकालने के लिए, लेकिन यह भी एक उच्च गुणवत्ता के साथ पेप्टाइड्स और प्रोटीन प्राप्त करने के लिए जन स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के साथ आगे बढ़ना की अनुमति देता है विकसित किया है ।

इस दृष्टिकोण को सक्रिय रूप से नए संश्लेषित प्रोटीन जैसे biorthogonal एमिनो एसिड homolog जैसे azidohomoalanine (अहा) के रूप में methionine19,20के लिए चयापचय लेबलिंग का उपयोग करके आगे बढ़ाया जा सकता है । अहा शामिल होने के बाद रसायन विज्ञान एक बायोटिन टैग के समावेश के लिए अनुमति देता है सभी प्रोटीन की streptavidin शुद्धि द्वारा पीछा किया है कि आहा । यह नए संश्लेषित प्रोटीन की निश्चित पहचान-गतिशील proteome के अंय भाग की अनुमति देता है । miRNAs का पता लगाना है कि अनुवाद और एक उत्तेजना के जवाब में भिंन अनुवाद के बीच redistribute (यहां मैं के साथ/प्रोटीन अनुवाद के गतिशील विनियमन के पूछताछ की अनुमति देता है । हालांकि, ribosome-बाउंड mRNA के आसपास के miRNAs को भर्ती करने वाले कारक पहचाने जाने और व्यवस्थित रूप से जांच करने में रहते हैं ।

हमारे अध्ययन में, टीसीए वर्षण के अलावा, हमने polysome अंशों से प्रोटीन निष्कर्षण के लिए तीन अन्य विधियों का परीक्षण किया: i) FASP (फ़िल्टर-एडेड नमूना तैयारी)21, ii) एसीटोन वर्षण, और iii) क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल वर्षण. तरीकों की उपयुक्तता दोनों सुक्रोज के उच्च एकाग्रता के साथ भिन्न प्रक्रिया करने की क्षमता के आधार पर मूल्यांकन किया गया था (अप करने के लिए ५०%) और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा की पहचान प्रोटीन की संख्या (चित्रा 7 और तालिका 3).

FASP विधि के लिए, हम नमूना एक FASP प्रोटीन पाचन किट है कि एक रिश्तेदार आणविक जन की कटौती के साथ एक ultrafiltration इकाई कार्यरत 30 केडीए के बंद द्वारा दिए गए तैयारी के प्रोटोकॉल का पालन किया । इस फिल्टर इकाई डिटर्जेंट हटाने के लिए एक उपकरण के रूप में कार्य किया, बफर एक्सचेंज, प्रोटीन पाचन और उच्च आणविक वजन पदार्थों (प्रोटीन और डीएनए) है कि अंयथा बाद पेप्टाइड जुदाई के साथ हस्तक्षेप होगा रखने की क्षमता के साथ पेप्टाइड रेफरेंस 21. संक्षेप में, नमूना यूरिया युक्त बफर के साथ मिलाया गया था और iodoacetamide समाधान के रूप में कताई कदम के साथ इकाई स्पिन फिल्टर पर लोड, trypsin समाधान और सोडियम क्लोराइड समाधान (रेफरेंस) बाद में जोड़ा गया । अंतिम निस्पंदन कि निहित पचा पेप्टाइड्स TFA द्वारा acidified था, नमकीन और जन स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए संग्रहीत । इस विधि का उपयोग, तथापि, उपजी सुक्रोज तेजी से फिल्टर के शीर्ष पर जमा की थोक, केंद्रापसारक प्रतिपादन और मुश्किल कदम धुलाई ।

एसीटोन वर्षण और क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल वर्षण के लिए, सॉल्वैंट्स के कई संस्करणों के नमूने की एक मात्रा से प्रोटीन हाला की जरूरत थी । इस सीमित नमूना मात्रा का आकार १.५ मिलीलीटर ट्यूबों (प्रोटीन कम प्रतिधारण ट्यूबों) में किया गया था जब लागू होता है । के रूप में अच्छी तरह से, सुक्रोज के चिपचिपा कीचड़ दोनों तरीकों के लिए वर्षण के बाद ट्यूबों के तल पर जमा और वहां ट्यूब नीचे और तरल अंतरफलक पर नहीं दिखाई छर्रों थे एसीटोन वर्षण और क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल वर्षण के बाद, क्रमशः.

तालिका 3 और 7 चित्रा चार प्रोटीन निष्कर्षण तरीकों हम अपने प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह अनुकूलित करने के लिए इस्तेमाल की तुलना दिखाओ । प्रत्येक विधि (चित्रा 7) पर दिया लाल संख्या प्रोटीन है कि जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा की पहचान की गई संख्या का प्रतिनिधित्व (५.२ अनुभाग और ५.३ देखें) । हालांकि प्रत्येक विधि के लिए इस्तेमाल किया नमूना मात्रा अलग थे, क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल और टीसीए वर्षाें की पहचान की सबसे अधिक संख्या में प्रोटीन के परिणामस्वरूप. हालांकि, इसके बाद के संस्करण (नमूना मात्रा सीमा और सुक्रोज वर्षण) उपर्युक्त नुकसान के कारण, हम बाद में प्रयोगों के लिए टीसीए वर्षण के लिए चुना.

नमूना प्रसंस्करण के लिए इष्टतम शर्तों को खोजने के लिए, टीसीए वर्षण विभिन्न तापमानों और टीसीए सांद्रता22,23,24पर किया गया था । इस प्रकार, हमने 4 ° c और-20 ° c में १०.७% टीसीए के साथ वर्षण किया और आगे छर्रों एकत्र किए जाने के बाद टीसीए (अंतिम १९.४% टीसीए) के अतिरिक्त ६० µ l के साथ supernatants को तेज कर दिया । यह चार छर्रों है कि बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा अलग विश्लेषण किया गया था के परिणामस्वरूप । इसके अलावा, हम पूरे दो बार प्रोटोकॉल को सुनिश्चित करने के लिए कि प्राप्त परिणाम reproducible थे दोहराया । कार्यप्रवाह और दो दोहराया प्रयोगों के साथ दोनों 4 डिग्री सेल्सियस और-20 ° c शर्तों पर छर्रों में पहचान प्रोटीन की संख्या चित्रा 7 में दिखाया गया है (लाल रंग में संख्या). हालांकि supernatants से व्युत्पंन छर्रों के विश्लेषण प्रोटीन की एक अतिरिक्त संख्या (८५ और ६० 4 डिग्री सेल्सियस पर उपज, ८१ और ५५ पर-20 डिग्री सेल्सियस); प्रोटीन के बहुमत पहले से ही पहले छर्रों में पहचान की गई थी और इस प्रकार, हम सभी बाद में प्रयोगों के लिए १०.७% टीसीए का उपयोग करने के लिए चुना. हालांकि क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल वर्षा टीसीए वर्षण की तुलना में पहचाने गए प्रोटीन की एक समान संख्या के परिणामस्वरूप, हम टीसीए वर्षण कई फायदों की वजह से पसंद: i) विलायक के प्रोटीन (६० µ एल के छोटे आयतन की आवश्यकता बनाम क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल/पानी की १.२८ मिलीलीटर) बड़ी नमूना मात्रा के उपयोग को सक्षम करने के लिए अगर जरूरत समय सुविधा का उपयोग कर वर्षा के लिए १.५ मिलीलीटर ट्यूबों, द्वितीय) ट्यूब नीचे गोली की दृश्यता, और iii) के दौरान सुक्रोज का कोई संचय तेज़ी से कदम ।

में गहराई कार्यात्मक शोधों की स्थिति के बारे में जानकारी देने के बावजूद, इस विधि का एक प्रमुख दोष ताजा और बड़े शुरू सामग्री के लिए की जरूरत है । कई अध्ययनों से कोशिकाओं या ऊतकों की छोटी मात्रा का उपयोग कर या आरएनए और प्रोटीन25निकालने की क्षमता को बढ़ाने के लिए कदम जोड़ने के लिए शर्तों का अनुकूलन करने की कोशिश की है । फिर भी, एक ही प्रयोगात्मक शर्तों के तहत विभिंन जानवरों से प्राप्त ऊतकों को एक साथ खींचा जा सकता है, अगर जरूरत है ।

अंत में, इस प्रोटोकॉल mRNA, miRNA के एक साथ विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, और polysome के ischemia में शामिल विनियामक तंत्र का अध्ययन करने के लिए रूपरेखा से प्राप्त अंश से प्रोटीन/reperfusion । हालांकि, आगे के अध्ययन देखना है कि क्या अनुवाद mRNAs ischemia या reperfusion के बाद प्रेरित कर रहे है और यदि वे तनाव को हटाने पर बंद कर दिया जाएगा की आवश्यकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

NIH P01 HL112730 (चीर, JVE), NIH R01 HL132075 (चीर, JVE), Barbra Streisand महिला हार्ट सेंटर (चीर, JVE), डोरोथी और ई. में फिलिप ल्यों कुर्सी आणविक कार्डियोलोजी (चीर), एरिका घुटा हुआ महिला हार्ट हेल्थ में संपंन कुर्सी (JVE) और चेक विज्ञान अकादमी संस्थागत सहायता RVO: ६८०८१७१५ (MS) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pentobarbital Vortech Phamaceuticals 9373 for euthansia
Heparin Sagent 103424 used in langendorff preparation
forceps Fine Science Tools 91110-10 used to hang the heart
Langendorff system Radnoti + home made n/a A 'four heart' system consisting of custom blown glass, tubing and water baths
NaCl Sigma S7653-5KG Krebs buffer and Sucrose gradient
KCl Sigma P5405 Krebs buffer and Lysis buffer
KH2PO42 Sigma P-5504 Krebs buffer
MgSO4 Sigma M7774-500G Krebs buffer
Glucose Sigma G5767 Krebs buffer
CaCl2 Sigma C1016-500G Krebs buffer
Sucrose powder Sigma S0389-1KG Sucrose gradient
MgCl2 Sigma 208337 Sucrose gradient and Lysis buffer
Tris-base Sigma T1503-1KG Sucrose gradient and Lysis buffer
Xylene Cyanole Sigma X-4126 Sucrose gradient
Cycloheximide Sigma-aldrich 239763 Sucrose gradient and Lysis buffer
RNaseOUT Life Technologies C00019 RNAse inhibitor for Lysis buffer
Igepal CA-360 (NP40) Sigma I3021 Lysis buffer
Protease Inhibitor Cocktail tablets, EDTA free Roche 5056489001
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 mm x 89 mm Beckman Coulter 344059
Ultracentrifuge Beckman LE-80K Ultracentrifugation of the gradients
Rotor Beckman SW41 Ultracentrifugation of the gradients
Biologic LP (pump) Biorad 731-8300 Fractionation of the gradients
BioFrac Biorad 741-0002 Fractionation of the gradients
Eppendorf RNA/DNA LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL tube Sigma Z666513-100EA Gradient fraction and RNA extraction
TRIzol Reagent Life technologies AM9738 RNA extraction
Luciferase Control RNA Promega L4561 RNA extraction
Chloroform Fisher Scientific C606-4 RNA extraction
Glycogen, RNA grade Thermo Fisher Scientific R0551 RNA extraction
Isopropanol Sigma I9516 RNA extraction
Ethanol Sigma E7023-1L RNA extraction
iScript cDNA Synthesis Kit BioRad 170-8891 Reverse transcription
iTaq Universal SYBR Green Supermix BioRad 175-5122 Quantative PCR
miRNeasy Micro Kit (50) Qiagen 217084 Kit for total RNA isolation
miScript II RT Kit (50) Qiagen 218161 Kit for miRNA reverse transcription
miScript Sybr Green PCR Kit (200) Qiagen 218073 Kit for real-time PCR expression analysis of miRNAs
Centrifuge 5424R Eppendorf For centrifugation of 1.5 mL or 2.0 mL tubes at different temperatures. Max speed - 21130 x g
Centrifuge 5810R Eppendorf For real-time PCR plate centrifugation at different temperatures. Max speed - 2039 x g
My Cycler Thermal Cycler Bio-Rad For reverse transcription
CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad For real-time PCR analysis
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control Qiagen 219610 For quality control of RNA isolation
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear Bio-Rad HSP9641 For real-time PCR analysis
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical Bio-Rad MSB1001 For real-time PCR plate sealing
Research plus Single-Channel Pipette, Gray; 0.5-10 µL Eppendorf UX-24505-02 For pipetting
PIPETMAN Classic Pipets, P20 Gilson F123600G For pipetting
PIPETMAN Classic Pipets, P200 Gilson F144565 For pipetting
Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 µL Gilson 17011782 For pipetting
Glycogen, RNA grade Thermo Fisher Scientific R0551 Improves total RNA isolation efficiency
Posi-Click 1.7 mL Tubes, natural color Denville C2170 RNA isolation and storage; reagent mix
Thermal Cycling Tubes -0.2 mL Individual Caps, Standard 0.2 mL tubes with optically Denville C18098-4 (1000910) Reverse transcription reaction
Sharp 10 Precision barrier Tips Denville P1096-FR For pipetting
Sharp 20 Precision barrier Tips Denville P1121 For pipetting
Sharp 200 Precision barrier Tips Denville P1122 For pipetting
Tips LTS 1 mL Filter Rainin RT-L1000F For pipetting
miScript Primer Assay (200) Qiagen (it changes according to the miRNA) For real-time PCR analysis
Gradient Master ver 5.3 Model 108 BioComp Instruments For preparation of sucrose gradients
trichloroacetic acid Sigma Aldrich T6399
acetone Sigma Aldrich 650501
Tris hydrochloride Amresco M108
dithiothreitol Fisher Scientific BP172
iodoacetamide Gbiosciences RC-150
sequencing grade modified trypsine, porcine Promega V5111
ammonium bicarbonate BDH BDH9206
formic acid, Optima LC/MS Fisher Chemical A117
methanol, Optima LC/MS Fisher Chemical A454
acetonitrile, Optima LC/MS Fisher Chemical A996
Protein LoBind tubes 0.5 mL Eppendorf AG 22431064
Protein LoBind tubes 1.5 mL Eppendorf AG 22431081
HLB µElution plate 30 µm Oasis 186001828BA
SpeedVac concentrator Thermo Scientific Savant SPD2010
sonicator Qsonica Oasis180
centrifuge Thermo Scientific Sorvall Legend micro 21R
LC trap column PepMap 100 C18 Thermo Scientific 160454
LC separation column PepMap RSLC C18 Thermo Scientific 164536
mass spectrometer Thermo Scientific Orbitrap Elite ion trap mass spectrometer
MSConvert software ProteoWizard Toolkit
Sorcerer-SEQUEST software Sage-N Research, Inc.

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References

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गतिशील Proteomic और Langendorff छिड़काव के बाद अलग माउस दिल से Polysomes के miRNA विश्लेषण
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Stastna, M., Thomas, A., Germano, J., Pourpirali, S., Van Eyk, J. E., Gottlieb, R. A. Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion. J. Vis. Exp. (138), e58079, doi:10.3791/58079 (2018).More

Stastna, M., Thomas, A., Germano, J., Pourpirali, S., Van Eyk, J. E., Gottlieb, R. A. Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion. J. Vis. Exp. (138), e58079, doi:10.3791/58079 (2018).

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