Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Dynamisk Proteomic og miRNA analyse av Polysomes fra isolert musen hjertet etter Langendorff perfusjon

doi: 10.3791/58079 Published: August 29, 2018

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å utføre polysome profilering på isolerte perfused musen hjertet. Vi beskriver metoder for hjertet perfusjon, polysome profilering og analyse av polysome fraksjoner med hensyn til mRNAs, miRNAs og polysome proteom.

Abstract

Studier i dynamiske endringer i protein oversettelsen krever spesialiserte. Her undersøkte vi endringer i nylig syntetisert proteiner som svar på iskemi og reperfusion bruker isolert perfused musen hjertet kombinert med polysome profilering. For ytterligere å forstå de dynamiske endringene i protein oversettelsen, vi preget mRNAs som var lastet med cytosolic ribosomer (polyribosomes eller polysomes) og gjenopprettet mitokondrie polysomes og sammenlignet mRNA og protein distribusjon i den høy effektivitet brøker (mange ribosomer knyttet til mRNA), lav effektivitet (færre ribosomer vedlagt) som også inkluderte mitokondrie polysomes og ikke oversette fraksjoner. miRNAs kan også knytte til mRNAs som er oversatt, og dermed redusere effektiviteten av oversettelse, undersøkte vi distribusjon av miRNAs over fraksjoner. Distribusjon av mRNAs, miRNAs og proteiner ble undersøkt under basale perfused forhold, på slutten av 30 min global mer iskemi, og etter 30 min av reperfusion. Her presenterer vi metodene som brukes til å utføre denne analysen, spesielt tilnærmingen til optimalisering av protein utvinning fra sukrose gradient, dette har ikke vært beskrevet før- og gi noen representant resultater.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hjertet reagerer på skaden iskemi (I) og reperfusion (R) på en dynamisk måte. Det er imidlertid inn i akutte endringer i proteinsyntese i svaret. For å løse dette, vi tok fordel av den veletablerte polysome profilering1 for å identifisere endringer i protein overflod som gjenspeiler omfordeling av ribosomer og translasjonsforskning regulatoriske forhold fra stoffer til polysomes, og økning i nylig syntetisert proteiner (sprøytebytteprogrammene). I innstillingen for I / R, økningen i nye proteinsyntese oppstår i et tidsrom som er uforenlig med transkripsjon av nye mRNAs2; Videre har discordance mellom mRNA uttrykk nivåer og protein overflod vært rapportert3. For disse grunner valgte vi å analysere endringer i den dynamiske proteom slik protein oversettelsen. Dette gjør vi kvantifisere mRNA i polysome fraksjoner, og analysere protein sammensetningen i polysome fraksjoner. Til slutt, fordi microRNAs (miRs) regulere tilgjengelighet av mRNAs for oversettelse og kan påvirke effektiviteten av protein oversettelsen4,5, undersøkte vi distribusjon av miRs i polysome fraksjoner, med fokus på den svar jeg / R.

Vi valgte å bruke isolert mus Langendorff perfusjonsmåler modell og høstet vev under basale forhold av kontinuerlig perfusjon, etter 30 min global mer iskemi, og etter 30 min av iskemi etterfulgt av 30 min av reperfusion. Vi solubilized hjertet tissue og atskilt polysomes over sukrose gradering, etterfulgt av proteomic analyse og selektiv deteksjon av mRNAs og miRNAs av PCR og microarray, henholdsvis. Denne kombinasjonen av metoder representerer en effektiv tilnærming til å forstå den dynamiske proteom, aktivere samtidig påvisning av mRNA, miRNA, og sprøytebytteprogrammer og omfordeling av regulatoriske proteiner og miRNA mRNA mellom nontranslating fraksjoner, lav effektivitet polysomes og høy effektivitet polysomes (se figur 1). Innsikt i dynamiske regulering av denne prosessen vil utvides ytterligere analyse av fosforylering viktige forskrifter faktorer som eIF2α eller mTOR. Disse individuelle trinnene er nå beskrevet i detalj.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle dyrestudier ble utført institusjonelle retningslinjer og godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen av Cedars-Sinai Medical Center.

1. Langendorff perfusjon av musen hjertet

  1. Langendorff perfusjon av musen hjerte med iskemi og reperfusion
    1. Administrere intraperitoneal pentobarbital natrium 70 mg/kg til voksen mus (8-uke-gamle, mann, C57BL6/j). Bekreft dyp anestesi ved mangel på uttak til tå knipe.
    2. Anticoagulate med intraperitoneal heparin 500 U/kg.
    3. Åpne brystet via sternal snitt. Åpne membranen og kutte langs kyst grensen til den fremre axillaris aksen. Deretter klippet den fremre axillaris aksen til forlemen åpne helt thoracic buret. Etter, visualisere hjertet, klemme stigende aorta med tang og raskt avgiftsdirektoratet hjertet. Døden skyldes exsanguination. Legg hjertet i kalde Krebs (NaCl 6,9 finans, KCl 0,35 finans, NaHCO3 2.1 finans, KH2PO4 0,16 finans, MgSO4 0.141 finans, glukose 2 finans og CaCl2 0.373 finans).
    4. Cannulate aorta med en butt tupp nål og perfuse hjertet retrogradely med Krebs løsning i konstant press-modus.
    5. Etter en stabilisering periode på 15 min, utsett hjertet for en global no-flow ischemia i 30 min etterfulgt av reperfusion i 30 min.
    6. Høste hjerter etter 15 min opprinnelige perfusjon, etter 30 min iskemi, eller etter 30 min reperfusion. Trim av atria, og snapin-fryse vevet i flytende nitrogen.
    7. Lagre på-80 ° C før bruk

2. vev homogenisering, Solubilization og sukrose tetthet gradert sedimentering

  1. Gradient forberedelse
    1. Forberede 2 løsninger (15% og 50%) av 100 mL sukrose, blanding 4 mL av NaCl 2.5 M;
      0,8 mL MgCl2 1,25 M; 1 mL Tris-HCl 1 M, pH 7.5; 15 g eller 50 g av sukrose (15% og 50%, henholdsvis); ultrapure vann til å nå 100 mL; og xylen cyanol (0.02 mg/mL) farge 15% løsningen
    2. Filtrere hver løsning (0.22 µm filterene)
    3. Graderingen som skal brukes, forberede 40 mL av hver sucrose løsning og legge gapestokk til hver løsning å oppnå siste konsentrasjon 100 µg/ml
      1. Bruke en gradient maker for å forberede en blanding mellom 15% og 50% sukrose løsninger
      2. Fyll venstre rommet med 5 mL på 15% sukrose graderingen
      3. Fyll høyre rommet med 50% sukrose gradient
      4. Åpne kranen og slå på pumpen å røre de to små avdelinger med magnetisk rørestang
      5. Bruk et rør knyttet til det andre tappet å tillate blandet sucrose løsning å strømme i en ultra-sentrifugering rør med tynne vegger. Siste volum vil være rundt 10 mL.
    4. Holde graderingene på 4 ° C (overnatting hvis nødvendig, men ikke lengre)
  2. Homogenisering av hjertet vev
    1. Homogenize friske eller frosne hjertet med en polytron i filtrert lyseringsbuffer (endret sukrose gradient fraksjoneres) inneholder 100 mM KCl, 20 mM Tris pH 7.5, 5 mM MgCl2, 0,4% NP-40. Inkluder gapestokk 100 µg/mL for å opprettholde polysome struktur, 0.1 U RNase hemmer og protease hemmer cocktail (1 bord for 50 mL).
    2. Ruge på lysate på is 15 min.
    3. Sentrifuge 18.000 x g i 15 min på 4 ° C å fjerne uløselig materiale og samle nedbryting.
    4. Reservere 50 µL protein besluttsomhet, RNA isolasjon og RNA integritet analyse (se figur 2).
    5. Lag nedbryting (500-100 µL) over graderingene og balansere rør med lyseringsbuffer.
  3. Sedimentering og samling av brøker
    1. Utføre ultracentrifugation for 120 min 37.000 RPM på 4 ° C i en svingende bøtte rotor. Ifølge produsenten tilsvarer dette 228,000 x g ved maksimal radius.
    2. Samle hver forløpning som 17 brøker (rundt 600 µL brøkdel) i microcentrifuge rør med kontinuerlig overvåking av absorbans ved 254 nm (OD254).
    3. Programmere brøkdel samleren som følger:
      1. Kaste den første 3 min samling (tilsvarende væsken i rør før gradient)
      2. Fra 4 til 19 min, samle fraksjoner hastighet på 1 mL/min i 17 fraksjoner.
    4. Plass fraksjoner på isen så snart hver samles. Fryse samples ved-80 ° C, hvis de ikke blir behandlet umiddelbart. En typisk UV densitometric sporing av graderingen er som det samles vist i figur 1.

3. isolering og analyse av mRNAs fra Polysome og Nontranslating fraksjoner

  1. Utvinning av mRNA
    1. Tine fraksjoner på is, om de var flash-frosne etter samling
    2. Overføre 200 µL av hver fraksjon til en frisk rør
      Merk: På dette trinnet to eller flere påfølgende fraksjoner kan samordnes sammen. Det bør gjøres nøye etter analysere OD254 diagrammet slik at polysome og ikke-polysome fraksjoner ikke bli blandet.
    3. Legge 10 ng av luciferase RNA som intern kontroll hvert utvalg for normalisering formål.
      Merk: Luciferase primere bør brukes som en intern kontroll til å normalisere resultatene.
    4. Legge til 700 µL av RNA utvinning reagensen (monophasic løsning av fenol og guanidine isothiocyanate, se Tabellen for materiale) i hver retning. Bland godt og ruge rør i 5 min på RT (romtemperatur).
    5. Legge til 140 µL kloroform og vortex for 15 s. Incubate for 2-3 minutter til RT.
    6. Sentrifuge prøvene i 15 min 12 000 x g på 4 ° C.
    7. Nøye overføre den øvre vandige fasen til en ny tube.
    8. Siden RNA innholdet i fraksjoner ikke er høy, legge til 10 µg av glykogen som bærer i hver retning.
    9. Legge til 350 µL isopropanol hver rør. Bland godt og ruge på 20 ° C 1t å øke avkastningen.
    10. Sentrifuger i 15 min 12 000 x g på 4 ° C.
    11. Forkaste nedbryting og legge 700 µL etanol 75% å vaske RNA-pellets.
    12. Sentrifuge for 5 min 7500 x g på 4 ° C.
    13. Fjern etanol og la pellet luften tørr i 10-15 min.
      Merk: Over tørking RNA pellet hindrer dens fullstendig solubilization i vann.
    14. Resuspend RNA pellet i 50 μL av RNase-gratis ultrapure H2O.
    15. Inkuber prøvene i 10 min på 55 ° C.
    16. Bruk 2 μL av hver prøve å måle kvaliteten og kvantiteten av den utpakkede og lagre resten på-80 ° C.
  2. Omvendt transkripsjon og qPCR
    1. Bruk 4 μL omvendt transkripsjon cDNA syntese kit (se Tabell for materiale) for en 20 μL reaksjon. Forberede supermix av antall eksempler. Overføre et bestemt volum til hver rør og tilsett 5 μL av input RNA hver rør. Dette volumet kan korrigeres for å være relevant for utvalget av Taq polymerase arbeidsforholdene.
    2. Inkuber rør i en termisk cycler med følgende programmet anbefalt av produsenten: 5 min ved 25 ° C, 20 min omvendt transkripsjon for 20 min på 46 ° C og revers transkriptase inaktivering for 1 min på 95 ° C.
    3. Kjør qPCR med optimalisert program for hvert par av primere.
      Merk: For å finne bestemte mRNAs i fraksjoner, like volum fra hver fraksjon (av de isolerte RNA) bør brukes for omvendt transkripsjon.
  3. Analyse av resultatene
    1. Bruke Ct verdien av interessert genet og luciferase beregne delta Ct verdiene
    2. Express hver fraksjon delta Ct verdi som en prosentandel av den totale mRNA verdien i alle fraksjoner visualisere fordelingen av mRNA over forskjellige fraksjoner (tabell 1)

4. isolering og analyse av miRNAs fra Polysome brøker og Nontranslating brøker

  1. Utvinning av mRNA og miRNA
    Merk: Denne protokollen følger produsentens instruksjoner, med noen få endringer.
    1. Tine av glykogen og spike i kontrollen. Hold på is.
    2. Legge til 700 µL av miRNA utvinning reagensen 200 µL av grupperte prøve.
    3. Legg 1 µg/µL av glykogen og homogenize med pipette. Inkuber det i 5 minutter ved romtemperatur.
    4. Legg 3,5 µL av 1.6 x 108 spike-i kontroll og bland det.
    5. Legge til 200 µL kloroform og virvle det i minst 15 sek.
    6. Inkuber for 3 min ved romtemperatur.
    7. Sentrifuger 12.000 x g i 15 min på 4 ° C.
    8. Bruke en pipette, overføre nedbryting til en ny 1,5 mL tube. Kast i midten og nederst faser.
    9. Legge til 1,5 x volum av 100% etanol nedbryting og bland det.
    10. Overføre 700 µL av denne blandingen til kolonnen miRNA utvinning og sentrifuge det i full fart for 15 s RT og Forkast gjennomflytsenhet; Gjenta dette trinnet med alle gjenværende prøve.
    11. Legge til 700 µL av buffer 1 til kolonnen og sentrifuge det i full fart for 15 s på RT; Kast gjennomflytsenhet.
    12. Legg til 500 µL av buffer 2 kolonnen og sentrifuge det i full fart for 15 s på RT; Kast gjennomflytsenhet.
    13. Legg til 500 µL av 80% etanol kolonnen og sentrifuge det i full fart i 2 minutter på RT; Kast gjennomflytsenhet.
    14. Overføre kolonnen en ny 2 mL uncapped rør åpner lokket og sentrifuge det på RT i 5 min på full fart; Kast gjennomflytsenhet.
    15. Legge til 16 µL av RNAse-fritt vann til kolonnen og sentrifuger ved full hastighet for 1 min på RT. holde eluate på is eller lagre ved-80 ° C i fremtidige analyser.
      Merk: To microliters av hvert utvalg kan brukes for OD analyse.
  2. Omvendt transkripsjon
    1. Forberede på is. For hver 20 µL RT PCR reaksjon, legge 4 µL miRNA RT bufferen, 2 µL av nukleinsyrer, 9 µL av totale RNA, 2 µL av enzym og 3 µL RNAse uten vann. Bland den og Nedspinning det kort.
    2. Angi den termiske Cycler som følger:
      37 ° C for 60 min;
      95 ° C i 5 min;
      4 ° C holder.
    3. Fjern rørene fra den termiske cycler og legge 200 µL RNAse uten vann. Lagre på 20 ° C eller fortsette til sanntid PCR.
  3. Sanntid PCR
    Merk: Denne protokollen følger 96 godt plate format. Forberede reaksjonen blanding på is.
    1. Forberede PCR reaksjonen blanding og legge til cDNA (fra miRNAs ovenfor) i henhold til datoområdet akseptert av protokollen. Flere reaksjoner kan tilberedes i batch.
    2. Legge til totalt 25 µL av PCR mix + cDNA i hver brønn.
    3. Forsegle platen bruker en optisk plate segl.
    4. Sentrifuge platen i 1 min 1000 x g ved romtemperatur.
    5. Programmet i sanntid cycler som følger:
      Første aktiveringen på 95 ° C i 15 min;
      3-trinns sykling: rødsprit ved 94 ° C i 15 s; avspenning ved 55 ° C for 30 s; forlengelse på 70 ° C for 30 s (utføre fluorescens datainnsamling); legge til 40 sykluser;
      Smelting-kurven ifølge cycler standard.
  4. Komparativ analyse
    1. Eksempel på normalisering (se tabell 2):
      1. Finn minimumsverdien SCM.
      2. Normalisere alle SCM verdiene til dette minimum.
      3. Trekk verdien fra Ct verdiene for miRNAs av interesse (MOI) og referanse genet (REF).
      4. Analysere data ved hjelp av 2-ΔCt -formelen.

5. Proteomic analyse

  1. Utvinning av proteiner fra polysome brøker
    1. Kombinere samlet sukrose brøker i tre siste fraksjoner. Merk fraksjoner som tunge (høy effektivitet polysomes i grupperte fraksjoner 4, 5, 6 og 7 med den høyeste konsentrasjonen av sukrose, bunnen av gradient rør), lys (lav effektivitet polysomes i grupperte brøkdel 8, 9, 10 og 11, midt i den gradient tube) og ikke-oversette (gruppert fraksjoner 12, 13, 14 og 15 med den laveste konsentrasjonen av sukrose, toppen av gradient rør). Utføre protein analysen på grupperte fraksjoner.
    2. Forberede 100% lager av Trekloredikksyre (TCA) og lagre den på 4 ° C i mørket. Bland 0,5 mL av prøve med 60 µL av 100% TCA og Inkuber på 20 ° C over natten i mørket.
      Merk: Bruke 1,5 mL lav protein oppbevaring rør (se Tabell for materiale).
    3. Etter natten inkubasjon tine prøven på is og sentrifuger 15.000 x g, 4 ° C for 30 min. Forkast nedbryting.
      Merk: 100 µg totale protein i eksemplet gir synlige protein pellet nederst rør.
    4. Pre chill aceton i 20 ° C fryseren. Legg til 0,5 mL kaldt aceton protein pellets og sentrifuger 15.000 x g, 4 ° C i 15 min. Forkast nedbryting. Gjenta dette trinnet to ganger.
    5. Lufttørke pellet. Resuspend pellet i 360 µL av 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8).
      NOTE Hvis nødvendig, bruk en puls sonicator for å resuspend pellet.
    6. Legge til 40 µL av 0.1 M dithiothreitol (siste konsentrasjon 10 mM) og Inkuber ved 55 ° C på shaker for 45 min. legge 50 µL av 0,15 M iodoacetamide (siste konsentrasjon 17 mM) og Inkuber ved romtemperatur på shaker i 30 min i mørket.
    7. Forberede trypsin løsning: resuspend 20 µg av trypsin i 100 µL av 50 mM ammonium bikarbonat. Legge til tilsvarende volumet av trypsin løsning utvalg på 1:50 (w/w) trypsin: protein forhold, sikre at pH er 8 og ruge på shaker på 37 ° C over natten.
      Merk: Legg 1 M ammonium bikarbonat for å bringe pH til 8.
    8. Etter trypsin fordøyelsen, kule prøven, sentrifuger kort i benk sentrifuge, legge til 10% maursyre pH 2-3 å slukke trypsin aktiviteten, og fortsetter med eksemplet avsalte.
      Merk: Bruke μ-elueringsrør plate for eksempel avsalte.
    9. Tilstanden den absorberende i brønnene til 96 godt plate med 200 µL av metanol bruker vakuum tre ganger etterfulgt av condition av 200 µL av 0,1% maursyre tre ganger. Last utvalget og utføre en prøve vask med 200 µL av 0,1% maursyre tre ganger. Elute prøven med 100 µL av 50% acetonitrile/0.1% maursyre to ganger i lav protein oppbevaring 0,5 mL tube.
      Merk: Elute prøven sakte først bruke gravitasjon etterfulgt av lav vakuum på.
    10. Fordampe prøve eluate til tørrhet bruker konsentrator og enten utføre direkte massespektrometri analyse eller butikken ved-80 ° C før bruk.
  2. Massespektrometri analyse
    1. Rekonstituer hver pellet (bestående av tryptic peptider) i 50-100 µL og injisere 1 µL i masse spectrometer.
      Merk: Optimalisere rekonstituering og injeksjon volumer for å få maksimale intensitet LC-/ MS-/ MS signal. I vårt tilfelle, maksimal signalet (totalt ion gjeldende; TIC) i hjertet av søket var i rekke 1E8 til 2E9.
    2. Bruke en felle C18 (300 µm ID x 5 mm, 5 µm, 100A) etterfulgt av peptid separasjon bruker C18 kolonne (75 µm ID x 250 mm, 2 µm, 100A) med en flyt innstillingen på 300 nL/min. sett nano kildekode kapillær temperaturen til 275 ° C og spray spenningen til 2 kV.
    3. Bruke en lineær forløpning 5-35% B for 90 min, 35-95% B for 3 min, holder på 95% B for 7 min og balanse på 5% B for 25 min (A: 0,1% maursyre/vann og B: 0,1% maursyre i acetonitrile). Erverve MS2 spectra for de 15 høyeste intensitet ionene fra hver MS1 skanning bruker CID-modus. Bruk 3 massespektrometri replikerer for hver prøve analysert.
      Merk: Optimalisere og bruke eksperimentelle forhold og parameterne som er egnet for prøver på bestemt massespektrometri instrumentet. Forhold/parametere som nevnes i delen 5.2. ble brukt og optimalisert i vårt laboratorium.
  3. Protein identifikasjon/kvantifisering
    1. Etter massespektrometri analyse, konvertere raw spectra filene til kompatible mzXML filer ved hjelp av MSConvert programvare (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html).
    2. Sende de konverterte filene til SEQUEST søkemotor med søkekriteriene, f.eks UniProtKB/Swiss-beskytte musen databasen (mest oppdaterte kanoniske vurdert); semi enzym digest bruker trypsin (etter KR /-); med opptil 2 savnet cleavages; forløperen massen utvalg: 400 til 4500 amu; statisk endring: carbamidomethyl (C) 57.021465 amu; peptid masse toleranse: 50 ppm; fragment masse type: monoisotopic.
      Merk: Andre protein database søk motorer og data rørledninger kan brukes. Hvis bruker databasen for eksempel rat, som er mindre komplett enn databaser for musen og human, du må søke mot musen (og/eller human) databaser å øke proteom dekning. I dette tilfellet må redundans i protein navn fjernes.
    3. Utføre en post søk analyse. Definere filtre for visning av data. For eksempel angi en minimum protein sannsynlighet (protein terskel) som 95% eller 99%, dvs bare proteiner som innebærer en statistisk analyse 95% eller 99% sannsynlighet for å være tilstede i utvalget vises. Angi filteret for peptid terskelen (f.eks 95%), dvs. en minimum sannsynlighet som skal brukes i å bestemme om et spektrum identifiserer et peptid. Velg antallet peptider som vil avgjøre om det finnes et protein (2 peptider som et minimum for protein identifikasjon anbefales).
    4. Evaluere identifiserte proteiner for kvalitet/kvantitet. Kontroller at proteotypic peptider brukes for kvantifisering. Hvis isoformen identifiseres sikre det er basert på observasjon av en tryptic peptid består av en aminosyresekvens unik for den bestemte isoformen. Noen "lik" eller hypotetiske proteiner bør gjennomgå sammenligning å se om de observerte peptider tilsvarer et kjent protein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

mRNA analyse
mRNA resultater kan uttrykkes som en distribusjon av en bestemt mRNA i hver fraksjon (figur 3A); for kvantifisering, kombinere polyribosomal oversette fraksjoner og sammenligne ikke oversette brøken (figur 3B), presenterer forholdet mRNA overflod oversette nontranslating fraksjoner. Tilleggsinformasjon er oppnådd ved å undersøke høy effektivitet polysome fraksjoner separat fra lav effektivitet polysome brøker (og atskilt fra nontranslating brøker). Dette er spesielt viktig når du analyserer miRNAs, som er beriket med lav effektivitet brøker (hvor de forstyrre protein oversettelsen av deres mål mRNAs).

Representant resultater for en bestemt mRNA som endringer distribusjon over oversette og nontranslating fraksjoner etter musen hjerter ble utsatt for iskemi og iskemi/reperfusion sammenlignet med humbug vises i Figur 4.

miRNA array analysen
Representant resultater fra en miRNA array analysen er vist i figur 5. Her et delsett av miRNAs (spesialdesignede matrise plate) ble analysert i grupperte tunge fraksjoner som indikerer at 22 miRNAs var forbundet med polysomes under iskemi, 9 miRNas under iskemi og reperfusion, med 7 som var felles for begge betingelsene. Dette viser at foreningen av miRNAs er dynamisk svar til spenninger ved iskemi og reperfusion.

Proteomic analyse
Analyse av tunge, lys og ikke-oversette fraksjoner av humbug (kontroll) eksempel:
881 totale proteiner ble identifisert av massespektrometri; 3, 46 og 208 proteiner av totalt var unik for tunge, lys og ikke-trans fraksjoner, henholdsvis (figur 6A). Fleste (88%) av mitokondrie ribosomal proteiner (28S og 39S) ble identifisert i lys brøkdel (36 av 41) og et flertall (88%) av cytosolic ribosomal proteiner (40-årene og 60-tallet) ble identifisert vanligvis i både tunge og lette brøker (53 av 60) bekrefter effektiv separasjon og proteomic evne til å identifiserte tyngre cytosolic vs lettere mitokondrie ribosomal proteiner. Delsettet med identifiserte mitokondrie og cytosolic ribosomal proteiner er vist i figur 6B.

Figure 1
Figur 1: typisk UV absorbansen profil av polysome fraksjoner på sukrose gradering. De første tre fraksjonene representerer ugyldige volum slangen. Høy effektivitet (høy molekylvekt, HMW) fraksjoner er samlet i fraksjoner 4-7, lav effektivitet (lav molekylvekt, LMW) brøker i 8-11, og de ikke oversette (og gjenværende cytosolic materiale) samles i fraksjoner 12-15 ( nontranslating, NTR). Den røde linjen angir ledningsevne, og blå spor angir UV absorbans ved 254 nm. Til høyre er en tegneserie av et med sukrose gradering, viser distribusjon av polysomes etter sedimentering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: RNA integritet kontroll analyse Bioanalyzer. RNA integritet nummer (RIN) av totalt isolert fra hjertet hele lysate. RIN beregnes etter 18S og 28S toppene. RIN rekkevidde: 1-10, og RIN = 10 representerer en veldig god integritet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: representant profil av mRNA distribusjon i sukrose gradering. Hjerter ble utsatt for basale Langendorff perfusjon eller iskemi og reperfusion (jeg / R). (A) hjertet lysates ble løst på sukrose gradering og mRNA innhold for GAPDH (venstre) og COX4 (høyre) var bestemt i hver fraksjon. Plottet viser relativ mRNA overflod i hver fraksjon (brøkdel nummer på x-aksen) for basale perfusjon (humbug, rød linje og diamanter) og iskemi/reperfusion (jeg / R, blå linjen, og ruter). Lagt på tomten er UV absorbansen indikerer totale mRNA innhold (lys grå kurve) og ledningsevne (rett grå skrå linje). Bokser angir hvordan fraksjoner ble samlet. (B) stolpediagram plottet viser forholdet mellom mRNA overflod oversette (polysomes) vs nontranslating (NT) brøker for GAPDH (venstre) og COX4 (høyre) mRNAs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: representant mRNA resultater. Kvantifisering av en mRNA i grupperte fraksjoner (HMW, LMW, NTR) viser tilpasser forsøksgruppen. Polysome fraksjoneres mus hjerter ble utført etter Langendorff perfusjon. Resultatene tegnes som % av totale mRNA (øvre panel) og forholdet mellom polysomes (HMW + LMW) til nontranslating brøk (NTR). Feilfelt representerer resultater fra 5 hjerter per gruppe (humbug, iskemi, eller jeg / R). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: representant miRNA resultater. Venn-Diagram av en sti fokusert miRNA analyse viser opp og downregulated miRNAs i tunge brøkdel bassenger av mus prøver etter hjerte iskemi eller iskemi og reperfusion. Cut-off verdi: 1,5 ganger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: proteiner identifisert av massespektrometri. (A) Venn-diagram av proteiner felles og unike tunge, lys og ikke-trans fraksjoner. (B) delsett av mitokondrie og cytosolic ribosomal proteiner identifisert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: skjematisk arbeidsflyter for protein utvinning metoder testet. Metodene protein utvinning ble testet med humbug (kontroll) prøve og tunge (høy effektivitet polysomes) brøk med høyeste sukrose innhold. Tall i rødt angir antall proteiner som ble identifisert av massespektrometri; der to tall vises, er de fra to separate forsøk. Den detaljerte beskrivelsen er gitt i teksten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

BRØKER GENE Ct LUCIFERASE Ct ΔCt 2ΔCt SUMMEN AV ALLE FRAKSJONER % AV HVER FRAKSJON Polysome/NTR forholdet
Høy effektivitet (HMW) 28.75 22.79 5,96 0.016 0.046 34.64 2,77
Lav effektivitet (LMW) 28.43 22.63 5,80 0.018 38.81
Ikke oversette (NTR) 29.12 22.77 6.35 0.012 26,55-tommer
Polysome/NTR Ratio = (HMW + LMW) / NTR

Tabell 1: Prøve analyse av mRNA. Metode for analyse av en mRNA vises for forskjellige gruppert fraksjoner (HMW, LMW, NTR) etter kvantitative PCR. ΔCt = genet Ct - luciferase Ct, og 2ΔCt er 2ΔCt.

Finner minimumsverdien SCM: 22.77
Eksempel 1 Eksempel 2 Eksempel 3
CT MOI 22.92 22.36 22.58
CT SCM 22.81 22.77 22,9
CT REF 23.27 23.55 23.19
Normalisere alle SCM verdiene til dette minimum
Eksempel 1 Eksempel 2 Eksempel 3
CT SCM 0,05 0 0,13
Trekke disse verdiene fra Ct verdiene MOI og REF
Eksempel 1 Eksempel 2 Eksempel 3
CT MOI 22.87 22.36 22.45
CT REF 23.22 23.55 23.06

Tabell 2: prøve PCR sanntidsberegning for miRNA uttrykk sammenligning i polysome og nontranslating brøker. miRNAs av interesse (MOI) og referanse genet (REF) ble analysert i grupperte tunge fraksjoner av mus etter ischemia eller iskemi/reperfusion. Ct verdier var først normalisert pigg i kontrollen (SCM) Ct verdi, deretter 2-ΔCt formelen ble brukt til å sammenligne miRNA uttrykk.

Metoden Eksempel volum [mL] antall proteiner identifisert Kommentarer
FASP 1 227 Mesteparten av sukrose igangsatte på filter
aceton nedbør 0,6 372 tyktflytende slam av sukrose nederst rør. 4:1 (reagens: utvalget) volumer; ingen synlige protein pellet
kloroform/metanol nedbør 0,32 389 tyktflytende slam av sukrose nederst rør. 8:1 (reagens: utvalget) volumer; ingen synlige protein pellet
TCA nedbør (på 4 ° C) 0,5 405, 415 ingen sukrose nedbør; 0.12:1 (reagens: utvalget) volumer; synlig pellet nederst rør
Re nedbør 85, 60 flere TCA utfelling av nedbryting etter første pellet innsamlede
TCA nedbør (ved 20 ° C) 0,5 440, 430 ingen sukrose nedbør; 0.12:1 (reagens: utvalget) volumer; synlig pellet nederst rør
Re nedbør 81, 55 flere TCA utfelling av nedbryting etter første pellet innsamlede

Tabell 3: Sammenligning av protein utvinning metoder. FASP, aceton nedbør, kloroform/metanol nedbør og TCA nedbør på 4 ° C og 20 ° C ble evaluert. Målet var å maksimere antall proteiner identifisert. TCA precipitations ble vurdert på en andre batch materiale å bekrefte reproduserbarhet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Polysome profil analyse muliggjør studiet av protein oversettelsen av analysering translasjonsforskning statusen for en bestemt mRNA eller hele transcriptome6,7. Det er også til stor hjelp når lokale oversettelse må studeres som synaptosomes8. Denne metoden innebærer tradisjonelt, separasjon av mono - og polyribosomes og de tilhørende mRNAs sukrose gradering som kan kombineres med genomisk eller proteomic teknikker for å få resultatene6,9. For eksempel, har en fersk undersøkelse utført av vår gruppe avdekket en post-transcriptional regulatoriske mekanisme i hjertet av pasienter som gjennomgår CPB, som etterligner iskemi/reperfusion skade. Dra nytte av polysome profil analyse, vi har vist en økning i oversettelse av kjernefysisk-kodet mitokondrie proteiner i hjertet etter CPB prosedyre2.

Dynamisk proteom polyribosomal profilering tilnærming presenteres her kan avsløre endringer i befolkningen i mRNAs forbundet med polyribosomes og proteiner som blir aktivt oversatt. Som oversettelse av mRNAs er underlagt delvis miRNAs, kan analyse av miRNAs i disse fraksjoner avsløre ytterligere innsikt. Faktisk, har flere studier endret denne metoden og viste seg å være en passende og pålitelig tilnærming til undersøke miRNA modus regulering10,11.

Mange studier har vært gjennomført i det siste tiåret hulene i rollen som miRNAs, vurderer sin betydning i ulike biologiske funksjoner12,13. Siden miRNAs handle gjennom base-sammenkobling med kollega mRNAs for å merke dem til fornedrelse, er polysome profil analyse utført og vist at miRNAs er faktisk funnet i polysome fraksjoner, målretting oversette mRNAs14, 15 , 16. miR-21 er et godt eksempel der det er knyttet en lav undertrykkelse og svake polysomes binding i normale celler, mens i kreftcellene, foreningen med polysomes økes og undertrykkende effekten er mye sterkere17.

I denne studien Real-time PCR analyse ble gjort ved hjelp av Ct verdiene av miRNAs rundt (MOI), Ct verdiene av spike kontrollere miRNA (SCM) for å redusere tekniske variasjoner og Ct verdien av en referanse genet eller miRNA (REF) som stabil blant prøver. Første skritt var å normalisere Ct verdiene i MOI og REF til Ct verdiene av SCM. Så det var en andre trinn normalisering av MOI til REF og resultatverdien ble brukt til å beregne 2-ΔCt formelen. Disse verdier eller fold-endre verdier kan brukes til å vise forskjeller mellom gruppene.

Siden utvinning av proteiner er vanskelig fra polysome fraksjoner, har de fleste studier utført til nå, brukt fraksjoner direkte for western blot analyse. De bare sediment proteininnholdet av hver fraksjon og bland det med SDS lasting buffer bruke SDS side analyse8,18. Her har vi utviklet en metode som tillater oss å ikke bare ekstrakt mRNAs og miRNAs etter fraksjoneres, men også peptider og proteiner med høy kvalitet fortsette massespektrometri analyse.

Denne tilnærmingen kan utvides ytterligere ved å måle aktivt nylig syntetisert proteiner med metabolske merking som biorthogonal aminosyren homolog, som azidohomoalanine (AHA) for metionin19,20. AHA tillater innlemmelse etterfulgt av Klikk kjemi for inkorporering av en biotin kode etterfulgt av streptavidin rensing av alle proteiner som innlemmet AHA. Dette gjør definitive identifikasjon av nylig syntetisert proteiner, den andre delen av den dynamiske proteom. Deteksjon av miRNAs som redistribuerer blant oversette og nontranslating fraksjoner som svar på en stimulans (her jeg / R) lar avhør av dynamisk regulering av protein oversettelsen. Faktorene som rekruttere miRNAs til nærheten av ribosom-bundet mRNA beholdes imidlertid identifisert og systematisk undersøkt.

I vår studie, i tillegg til TCA nedbør, testet vi tre andre metoder for protein utvinning fra polysome fraksjoner: i) FASP (filter-hjulpet eksempel forberedelse)21ii) aceton nedbør og iii) kloroform/metanol nedbør. Hensiktsmessigheten av metodene ble evaluert basert på både muligheten til å behandle brøker med høy konsentrasjon av sukrose (opp til 50%) og antall proteiner identifisert av massespektrometri (figur 7 og tabell 3).

For FASP metoden fulgte vi protokollen for eksempel forberedelse gitt av en FASP Protein fordøyelse Kit som ansatt en ultrafiltrasjon enhet med en relativ molekylær masse cut-off av 30 kDa. Filter enheten fungerte som et verktøy for fjerning av vaskemiddel, buffer exchange, protein fordøyelse og peptid elueringsrør muligheten til å beholde høy-molekylvekt stoffer (proteiner og DNA) som ellers ville forstyrre påfølgende peptid separasjon 21. kort, prøven ble blandet med urea inneholder buffer og lastet på enheten spinn filter med spinning trinnene som iodoacetamide løsning, trypsin løsning og natriumklorid løsning (elueringsrør) ble senere lagt. Siste filtratet som inneholdt fordøyd peptider var sur av TFA avsalte og lagret for massespektrometri analyse. Bruker denne metoden, men mesteparten av utfelt sukrose stadig samlet på filteret gjengivelse av sentrifugering og vask trinnene vanskelig.

Aceton nedbør og kloroform/metanol nedbør, var flere mengder løsningsmidler nødvendig for å utløse proteiner fra ett enkelt volum av prøven. Dette begrenset størrelsen på utvalget volum når nedbør ble utført i 1,5 mL rør (protein lav-oppbevaring rør). Også, tyktflytende slam av sukrose akkumulert nederst i rør etter nedbør i begge og det var ingen synlig pellets nederst rør og flytende grensesnittet etter aceton nedbør og kloroform/metanol nedbør, henholdsvis.

Tabell 3 og figur 7 viser sammenligningen av fire protein utvinning metoder vi pleide å optimalisere vår eksperimentelle arbeidsflyt. De røde tallene på hver metode (figur 7) representerer nummeret av proteiner som ble identifisert av massespektrometri (se delen 5.2 og 5.3). Selv om eksempel volumer brukes for hver metode var annerledes, resulterte kloroform/metanol og TCA precipitations i høyeste antall proteiner identifisert. Men på grunn av ulempene ovenfor (eksempel volumbegrensning og sukrose nedbør), valgte vi TCA nedbør for etterfølgende eksperimenter.

For å finne de optimale vilkårene for prøven behandling, ble TCA nedbør utført ved forskjellige temperaturer og TCA konsentrasjoner22,23,24. Derfor vi utført nedbør med 10,7% TCA 4 ° C og 20 ° C og ytterligere igangsatte supernatants med ytterligere 60 µL av TCA (siste 19.4% TCA) etter pellets ble samlet. Dette resulterte i fire pellets som ble analysert med massespektrometri. I tillegg gjentok vi hele protokollen to ganger for å sikre at fått resultatene var reproduserbare. Arbeidsflyten og antall proteiner identifisert i pellets på både 4 ° C og 20 ° C-forhold med to gjentatte forsøk er vist i figur 7 (tall i rødt). Selv om analysen av pellets avledet fra gitt supernatants et ytterligere antall proteiner (85 og 60 på 4 ° C, 81 og 55 på 20 ° C); et flertall av proteiner ble allerede identifisert i første pellets og derfor vi valgte for å bruke 10,7% TCA for alle etterfølgende eksperimenter. Selv om kloroform/metanol nedbør resultert i et tilsvarende antall proteiner identifisert sammenlignet med TCA nedbør, vi foretrukket TCA nedbør skyldes flere fordeler: jeg) liten mengde løsemiddel måtte føre proteiner (60 µL av TCA vs 1.28 mL kloroform/metanol/vann) muliggjør bruk av større eksempel volumer hvis nødvendig mens praktisk benytter 1,5 mL rør for nedbør, ii) synligheten av pellets tube nederst, og iii) aldri sukrose under nedbør trinn.

Tross tilbyr detaljert funksjonelle informasjon om translasjonsforskning staten, er en stor ulempe med denne metoden behovet for friske og store utgangsmaterialet. Mange studier har forsøkt å optimalisere forholdene med liten mengde eller vev eller legge til trinn for å øke effektiviteten av utdrager RNA og proteiner25. Likevel, vev fra forskjellige dyr under samme eksperimentelle forhold kan trekkes sammen, hvis nødvendig.

Avslutningsvis tillater denne protokollen samtidig analyse av mRNA miRNA og protein fra fraksjoner fra polysome profilering for å studere regulatoriske mekanismer involvert i iskemi/reperfusion. Men videre er studier nødvendig for å se om de oversette mRNAs er indusert etter ischemia eller reperfusion og hvis de vil bli slått av ved fjerning av stress.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

NIH P01 HL112730 (RAG, JVE), NIH R01 HL132075 (RAG, JVE) Barbra Streisand kvinners hjertet Senter (RAG, JVE), Dorothy og E. Phillip Lyon stol i molekylær kardiologi (RAG), Erika Glazer utstyrt stol i kvinnens hjerte helse (JVE) og tsjekkiske vitenskapsakademi Institusjonell støtte RVO: 68081715 (MS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pentobarbital Vortech Phamaceuticals 9373 for euthansia
Heparin Sagent 103424 used in langendorff preparation
forceps Fine Science Tools 91110-10 used to hang the heart
Langendorff system Radnoti + home made n/a A 'four heart' system consisting of custom blown glass, tubing and water baths
NaCl Sigma S7653-5KG Krebs buffer and Sucrose gradient
KCl Sigma P5405 Krebs buffer and Lysis buffer
KH2PO42 Sigma P-5504 Krebs buffer
MgSO4 Sigma M7774-500G Krebs buffer
Glucose Sigma G5767 Krebs buffer
CaCl2 Sigma C1016-500G Krebs buffer
Sucrose powder Sigma S0389-1KG Sucrose gradient
MgCl2 Sigma 208337 Sucrose gradient and Lysis buffer
Tris-base Sigma T1503-1KG Sucrose gradient and Lysis buffer
Xylene Cyanole Sigma X-4126 Sucrose gradient
Cycloheximide Sigma-aldrich 239763 Sucrose gradient and Lysis buffer
RNaseOUT Life Technologies C00019 RNAse inhibitor for Lysis buffer
Igepal CA-360 (NP40) Sigma I3021 Lysis buffer
Protease Inhibitor Cocktail tablets, EDTA free Roche 5056489001
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 mm x 89 mm Beckman Coulter 344059
Ultracentrifuge Beckman LE-80K Ultracentrifugation of the gradients
Rotor Beckman SW41 Ultracentrifugation of the gradients
Biologic LP (pump) Biorad 731-8300 Fractionation of the gradients
BioFrac Biorad 741-0002 Fractionation of the gradients
Eppendorf RNA/DNA LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL tube Sigma Z666513-100EA Gradient fraction and RNA extraction
TRIzol Reagent Life technologies AM9738 RNA extraction
Luciferase Control RNA Promega L4561 RNA extraction
Chloroform Fisher Scientific C606-4 RNA extraction
Glycogen, RNA grade Thermo Fisher Scientific R0551 RNA extraction
Isopropanol Sigma I9516 RNA extraction
Ethanol Sigma E7023-1L RNA extraction
iScript cDNA Synthesis Kit BioRad 170-8891 Reverse transcription
iTaq Universal SYBR Green Supermix BioRad 175-5122 Quantative PCR
miRNeasy Micro Kit (50) Qiagen 217084 Kit for total RNA isolation
miScript II RT Kit (50) Qiagen 218161 Kit for miRNA reverse transcription
miScript Sybr Green PCR Kit (200) Qiagen 218073 Kit for real-time PCR expression analysis of miRNAs
Centrifuge 5424R Eppendorf For centrifugation of 1.5 mL or 2.0 mL tubes at different temperatures. Max speed - 21130 x g
Centrifuge 5810R Eppendorf For real-time PCR plate centrifugation at different temperatures. Max speed - 2039 x g
My Cycler Thermal Cycler Bio-Rad For reverse transcription
CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad For real-time PCR analysis
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control Qiagen 219610 For quality control of RNA isolation
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear Bio-Rad HSP9641 For real-time PCR analysis
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical Bio-Rad MSB1001 For real-time PCR plate sealing
Research plus Single-Channel Pipette, Gray; 0.5-10 µL Eppendorf UX-24505-02 For pipetting
PIPETMAN Classic Pipets, P20 Gilson F123600G For pipetting
PIPETMAN Classic Pipets, P200 Gilson F144565 For pipetting
Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 µL Gilson 17011782 For pipetting
Glycogen, RNA grade Thermo Fisher Scientific R0551 Improves total RNA isolation efficiency
Posi-Click 1.7 mL Tubes, natural color Denville C2170 RNA isolation and storage; reagent mix
Thermal Cycling Tubes -0.2 mL Individual Caps, Standard 0.2 mL tubes with optically Denville C18098-4 (1000910) Reverse transcription reaction
Sharp 10 Precision barrier Tips Denville P1096-FR For pipetting
Sharp 20 Precision barrier Tips Denville P1121 For pipetting
Sharp 200 Precision barrier Tips Denville P1122 For pipetting
Tips LTS 1 mL Filter Rainin RT-L1000F For pipetting
miScript Primer Assay (200) Qiagen (it changes according to the miRNA) For real-time PCR analysis
Gradient Master ver 5.3 Model 108 BioComp Instruments For preparation of sucrose gradients
trichloroacetic acid Sigma Aldrich T6399
acetone Sigma Aldrich 650501
Tris hydrochloride Amresco M108
dithiothreitol Fisher Scientific BP172
iodoacetamide Gbiosciences RC-150
sequencing grade modified trypsine, porcine Promega V5111
ammonium bicarbonate BDH BDH9206
formic acid, Optima LC/MS Fisher Chemical A117
methanol, Optima LC/MS Fisher Chemical A454
acetonitrile, Optima LC/MS Fisher Chemical A996
Protein LoBind tubes 0.5 mL Eppendorf AG 22431064
Protein LoBind tubes 1.5 mL Eppendorf AG 22431081
HLB µElution plate 30 µm Oasis 186001828BA
SpeedVac concentrator Thermo Scientific Savant SPD2010
sonicator Qsonica Oasis180
centrifuge Thermo Scientific Sorvall Legend micro 21R
LC trap column PepMap 100 C18 Thermo Scientific 160454
LC separation column PepMap RSLC C18 Thermo Scientific 164536
mass spectrometer Thermo Scientific Orbitrap Elite ion trap mass spectrometer
MSConvert software ProteoWizard Toolkit
Sorcerer-SEQUEST software Sage-N Research, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pourpirali, S., Valacca, C., Merlo, P., Rizza, S., D’Amico, S., Cecconi, F. Prolonged pseudohypoxia targets ambra1 mrna to p-bodies for translational repression. PLoS ONE. 10, e0129750 (2015).
  2. Andres, A. M., Tucker, K. C., Thomas, A., Taylor, D. J., Sengstock, D., Jahania, S. M., Dabir, R., Pourpirali, S., Brown, J. A., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W., Mentzer, R. M. Jr, Gottlieb, R. A. Mitophagy and mitochondrial biogenesis in atrial tissue of patients undergoing heart surgery with cardiopulmonary bypass. JCI Insight. 2, e89303 (2017).
  3. Kislinger, T., Cox, B., Kannan, A., Chung, C., Hu, P., Ignatchenko, A., Scott, M. S., Gramolini, A. O., Morris, Q., Hallett, M. T., Rossant, J., Hughes, T. R., Frey, B., Emili, A. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: Combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
  4. Kren, B. T., Wong, P. Y., Shiota, A., Zhang, X., Zeng, Y., Steer, C. J. Polysome trafficking of transcripts and micrornas in regenerating liver after partial hepatectomy. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, G1181-G1192 (2009).
  5. Gottlieb, R. A., Pourpirali, S. Lost in translation: Mirnas and mrnas in ischemic preconditioning and ischemia/reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 95, 70-77 (2016).
  6. Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments. (2014).
  7. Lorsch, J. Methods in enzymology. Laboratory methods in enzymology: Rna. Preface. Methods in Enzymology. 530, xxi (2013).
  8. Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mrnas. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
  9. He, S. L., Green, R. Polysome analysis of mammalian cells. Methods in Enzymology. 530, 183-192 (2013).
  10. Molotski, N., Soen, Y. Differential association of micrornas with polysomes reflects distinct strengths of interactions with their mrna targets. RNA. 18, 1612-1623 (2012).
  11. Maroney, P. A., Yu, Y., Fisher, J., Nilsen, T. W. Evidence that micrornas are associated with translating messenger rnas in human cells. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1102-1107 (2006).
  12. Paul, P., Chakraborty, A., Sarkar, D., Langthasa, M., Rahman, M., Bari, M., Singha, R. S., Malakar, A. K., Chakraborty, S. Interplay between mirnas and human diseases. Journal of Cellular Physiology. 233, 2007-2018 (2018).
  13. Rupaimoole, R., Slack, F. J. Microrna therapeutics: Towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 203-222 (2017).
  14. Nelson, P. T., Hatzigeorgiou, A. G., Mourelatos, Z. Mirnp:Mrna association in polyribosomes in a human neuronal cell line. RNA. 10, 387-394 (2004).
  15. Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a mirna blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1108-1114 (2006).
  16. Kim, J., Krichevsky, A., Grad, Y., Hayes, G. D., Kosik, K. S., Church, G. M., Ruvkun, G. Identification of many micrornas that copurify with polyribosomes in mammalian neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 360-365 (2004).
  17. Androsavich, J. R., Chau, B. N., Bhat, B., Linsley, P. S., Walter, N. G. Disease-linked microrna-21 exhibits drastically reduced mrna binding and silencing activity in healthy mouse liver. RNA. 18, 1510-1526 (2012).
  18. Kraushar, M. L., Thompson, K., Wijeratne, H. R., Viljetic, B., Sakers, K., Marson, J. W., Kontoyiannis, D. L., Buyske, S., Hart, R. P., Rasin, M. R. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the rna-binding protein hu antigen r. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. E3815-E3824 (2014).
  19. McClatchy, D. B., Ma, Y., Liu, C., Stein, B. D., Martinez-Bartolome, S., Vasquez, D., Hellberg, K., Shaw, R. J., Yates, J. R. 3rd Pulsed azidohomoalanine labeling in mammals (palm) detects changes in liver-specific lkb1 knockout mice. Journal of Proteome Research. 14, 4815-4822 (2015).
  20. Schiapparelli, L. M., McClatchy, D. B., Liu, H. H., Sharma, P., Yates, J. R. 3rd, Cline, H. T. Direct detection of biotinylated proteins by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13, 3966-3978 (2014).
  21. Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6, 359-362 (2009).
  22. Rajalingam, D., Loftis, C., Xu, J. J., Kumar, T. K. Trichloroacetic acid-induced protein precipitation involves the reversible association of a stable partially structured intermediate. Protein Science. 18, 980-993 (2009).
  23. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31, 3573-3579 (2010).
  24. Sashital, D. G., Greeman, C. A., Lyumkis, D., Potter, C. S., Carragher, B., Williamson, J. R. A combined quantitative mass spectrometry and electron microscopy analysis of ribosomal 30s subunit assembly in e. Coli. Elife. 3, (2014).
  25. Liang, S., Bellato, H. M., Lorent, J., Lupinacci, F. C. S., Oertlin, C., van Hoef, V., Andrade, V. P., Roffé, M., Masvidal, L., Hajj, G. N. M., Larsson, O. Polysome-profiling in small tissue samples. Nucleic Acids Research. 46, e3 (2018).
Dynamisk Proteomic og miRNA analyse av Polysomes fra isolert musen hjertet etter Langendorff perfusjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stastna, M., Thomas, A., Germano, J., Pourpirali, S., Van Eyk, J. E., Gottlieb, R. A. Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion. J. Vis. Exp. (138), e58079, doi:10.3791/58079 (2018).More

Stastna, M., Thomas, A., Germano, J., Pourpirali, S., Van Eyk, J. E., Gottlieb, R. A. Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion. J. Vis. Exp. (138), e58079, doi:10.3791/58079 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter