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Biochemistry

Dinâmica proteómica e miRNA análise de polissomos de coração de rato isolado após Langendorff perfusão

doi: 10.3791/58079 Published: August 29, 2018

Summary

Aqui nós apresentamos um protocolo para realizar polysome de criação de perfil em coração isolado de rato perfundido. Nós descrevemos os métodos para análise das frações no que diz respeito a mRNAs, miRNAs e o proteome polysome polysome, polysome de criação de perfil e perfusão do coração.

Abstract

Estudos em mudanças dinâmicas na tradução de proteínas requerem métodos especializados. Aqui, examinamos as alterações em proteínas recém sintetizadas em resposta à isquemia e reperfusão, usando o coração isolado de rato perfundido juntamente com polysome de criação de perfil. Para se perceber as mudanças dinâmicas na tradução de proteína, caracteriza-se os mRNAs que foram carregados com ribossomas citosólico (poliribosomami ou polissomos) e também recuperou polissomos mitocondriais e comparado a distribuição do mRNA e proteína na frações de alta eficiência (numerosos ribossomos mRNA), baixo-eficiência (menos ribossomos), que também incluiu polissomos mitocondriais e as frações não-traduzindo. os miRNAs pode também associar mRNAs que estão sendo traduzidos, reduzindo assim a eficiência da tradução, examinamos a distribuição dos miRNAs em frações. A distribuição de mRNAs miRNAs e proteínas foi examinada sob condições perfundidas basais, no final de 30 min de isquemia global de não-fluxo e após 30 min de reperfusão. Aqui apresentamos os métodos usados para realizar esta análise — em particular, a abordagem de otimização de extração da proteína do gradiente de sacarose, como este não tem sido descrita antes — e fornecer alguns resultados representativos.

Introduction

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O coração responde para a lesão de reperfusão (R) de forma dinâmica e de isquemia (I). No entanto, há um pequeno insight agudas alterações na síntese de proteínas durante a resposta. Para resolver isso, aproveitamos o método bem estabelecido de polysome1 para identificar alterações na abundância de proteína que refletem a redistribuição dos ribossomas e translacionais fatores regulatórios do citosol para polissomos, de criação de perfil e o aumento de proteínas recém sintetizadas (PTS). Na configuração de I / R, o aumento da síntese de novas proteínas ocorre em um período de tempo que é inconsistente com a transcrição de mRNAs de novo2; Além disso, a discordância entre os níveis de expressão de mRNA e abundância de proteína tem sido relatados3. Por estas razões, nós escolhemos analisar as mudanças na proteome dinâmico como refletido pela tradução da proteína. Para fazer isso, podemos quantificar o mRNA nas fracções polysome e analisar a composição de proteína nas fracções polysome. Finalmente, porque microRNAs (miRs) regular a disponibilidade dos mRNAs para tradução e pode interferir com a eficácia da proteína tradução4,5, examinamos a distribuição de miRs nas fracções polysome, enfocando a resposta a I / r.

Optamos por usar o modelo de perfusão de Langendorff de rato isolado e tecidos colhidos em condições basais de perfusão contínua, após 30 min isquemia global de não-fluxo e após 30 min de isquemia seguida por 30 min de reperfusão. Em seguida, solubilizado no tecido do coração e separados polissomos ao longo de um gradiente de sacarose, seguido de análise proteômica e detecção seletiva de mRNAs e miRNAs por PCR e microarray, respectivamente. Esta combinação de métodos representa uma poderosa abordagem para a compreensão do proteome dinâmico, permitindo a detecção simultânea de mRNA, miRNA e pts, bem como a redistribuição de proteínas reguladoras, miRNA e mRNA entre frações nontranslating, polissomos de baixa eficiência e alta eficiência polissomos (ver Figura 1). Insights sobre o Regulamento dinâmico deste processo serão estendidas por uma análise mais aprofundada da fosforilação de fatores-chave reguladoras como eIF2α ou mTOR. Agora, estas etapas individuais são descritas em detalhes.

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Protocol

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Todos os estudos em animais foram realizados em conformidade com as orientações institucionais e aprovados pelo Comitê de uso do Cedars-Sinai Medical Center e institucional Cuidado Animal.

1. Langendorff perfusão do coração de rato

  1. Perfusão de Langendorff de coração de rato com isquemia e reperfusão
    1. Administrar intraperitoneal de pentobarbital de sódio 70 mg/kg para o rato adulto (8 semanas, macho, C57BL6/j). Confirme a anestesia profunda por falta de retirada aos pés pitada.
    2. Anticoagular com heparina intraperitoneal 500 U/kg.
    3. Abra o baú através de incisão esternal. Abra o diafragma e corte ao longo da borda costal ao eixo axilar anterior. Em seguida, corte o eixo axilar anterior até o membro anterior para abrir completamente a caixa torácica. Depois, visualizando o coração, prenda a aorta ascendente com fórceps e impostos especiais de consumo rapidamente o coração. A morte é devido à perda de sangue. Coloque o coração no frio Krebs (NaCl 6,9 g/L, KCl 0,35 g/L, NaHCO3 2,1 g/L, KH2PO4 0,16 g/L, MgSO4 0,141 g/L, glicose 2 g/L e CaCl2 0,373 g/L).
    4. Canule da aorta com uma agulha de ponta sem corte e perfundir o coração retrogradely com solução de Krebs no modo de pressão constante.
    5. Após um período de estabilização de 15 min, submeta o coração a uma isquemia não-fluxo global por 30 min, seguido de reperfusão por 30 min.
    6. Corações de colheita após a perfusão de linha de base de 15 min, após 30 min de isquemia ou após a reperfusão de 30 min. Retire os átrios e snap-congelar o tecido em nitrogênio líquido.
    7. Armazenar a-80 ° C até o uso

2. sedimentação gradiente de densidade de sacarose, solubilização e homogeneização de tecidos

  1. Preparação de gradiente
    1. Prepare-se 2 soluções (15% e 50%) de sacarose 100 mL, misturar 4 mL de NaCl 2.5 M;
      0,8 mL MgCl2 1.25 M; 1 mL de Tris-HCl 1 M, pH 7,5; 15 g ou 50 g de sacarose (15% e 50%, respectivamente); água ultrapura para chegar a 100 mL; e xileno cianol (0,02 mg/mL) para a solução de 15% de cor
    2. Filtrar cada solução (0,22 µm filtros)
    3. O dia em que o gradiente é para ser usado, preparar 40 mL de cada solução de sacarose e acrescentar cicloheximida para cada solução para obter uma concentração final de 100 µ g/mL
      1. Use um gradiente maker para preparar uma mistura entre as soluções de sacarose de 15% e 50%
      2. Encha o recipiente esquerdo com 5 mL do gradiente 15% de sacarose
      3. Encha o recipiente certo com o gradiente de sacarose 50%
      4. Abra a torneira e ligar a bomba para agitar os dois pequenos compartimentos com agitador magnético
      5. Uso um tubo ligado à segunda torneira para permitir que a solução de sacarose misto fluir em um tubo de centrifugação-ultra com paredes finas. Volume final será de cerca de 10 mL.
    4. Manter os gradientes a 4 ° C (durante a noite, se necessário, mas não mais)
  2. Homogeneização do tecido do coração
    1. Homogeneizar o coração fresca ou congelada com um polytron em tampão de Lise filtrada (modificado para fracionamento de gradiente de sacarose) contendo 100 mM KCl, pH do Tris 20mm 7.5, 5 mM MgCl2, 0,4% NP-40. Incluem cicloheximida 100 µ g/mL para manter a estrutura de polysome, inibidor de RNase U 0.1 e inibidor da protease cocktail (1 comprimido de 50 mL).
    2. Incubar o lisado gelo por 15 min.
    3. Centrifugar a 18.000 x g durante 15 min a 4 ° C para remover material insolúvel e recolher o sobrenadante.
    4. Reserva de 50 µ l para determinação da proteína, isolamento de RNA e RNA integridade análise (ver Figura 2).
    5. O sobrenadante (500 – 100 µ l) de camada em cima os gradientes e equilibrar os tubos com tampão de Lise.
  3. Sedimentação e coleção de frações
    1. Execute a ultracentrifugação para 120 min a 37.000 rpm a 4 ° C, em um rotor de balde oscilante. De acordo com o fabricante, isso corresponde a 228.000 x g no raio máximo.
    2. Recolher cada gradiente como 17 frações (fração de cerca de 600 µ l) em tubos de microcentrifuga com monitoramento contínuo de absorbância a 254 nm (OD254).
    3. Programa coletor de fração da seguinte forma:
      1. Descartar o primeiro 3 min da coleção (correspondente ao líquido contido nos tubos antes de gradiente)
      2. De 4 a 19 min, recolha as frações na velocidade de 1 mL/min em 17 fracções.
    4. Coloque as frações no gelo assim que cada um é coletado. Congele as amostras a-80 ° C, se eles não estão sendo processados imediatamente. Um típico UV densitométricos o rastreamento do gradiente como é recolhida é mostrado na Figura 1.

3. isolamento e análise de mRNAs de Polysome e frações Nontranslating

  1. Extração do mRNA
    1. Descongelar as frações no gelo, se fossem congelado após a coleção
    2. Transfira a 200 µ l de cada fração para um tubo fresco
      Nota: Neste passo, duas ou mais fracções consecutivas podem ser agrupadas. Deve ser feito depois de analisar o gráfico de254 OD para que frações de polysome e não-polysome não se envolva com cuidado.
    3. Adicionar 10 ng de luciferase RNA como controle interno de cada amostra para efeito de normalização.
      Nota: As primeiras demão Luciferase devem ser usadas como um controle interno para normalizar os resultados.
    4. Adicione 700 µ l de reagente de extração de RNA (monofásico solução de fenol e guanidina isotiocianato; ver Tabela de materiais) para cada tubo. Misture bem e incubar os tubos durante 5 min à RT (temperatura ambiente).
    5. Adicione 140 clorofórmio µ l e vórtice por 15 s. Incubar durante 2-3 min à RT
    6. Centrifugar as amostras por 15 min a 12.000 x g a 4 ° C.
    7. Transferi com cuidado, a fase aquosa superior para um novo tubo.
    8. Desde que o conteúdo de RNA das frações não é alto, adicione 10 µ g de glicogênio como portador para cada tubo.
    9. Adicione 350 µ l isopropanol para cada tubo. Misture bem e incubar a-20 º C por 1h aumentar o rendimento.
    10. Centrifugar por 15 min a 12.000 x g a 4 ° C.
    11. Desprezar o sobrenadante e adicionar etanol de µ l 700 75% para lavar a pelota do RNA.
    12. Centrifugue por 5 min a 7.500 x g a 4 ° C.
    13. Remover o etanol e deixe o ar de sedimento secar por 10 a 15 min.
      Nota: Ressecamento a pelota do RNA impedirá sua completa solubilização em água.
    14. Resuspenda o pellet de RNA em 50 µ l de RNase-livre ultrapura H2O.
    15. Incubar as amostras por 10 min a 55 ° C.
    16. Use 2 μL de cada amostra para medir a qualidade e a quantidade do RNA extraído e armazenar o restante a-80 ° C.
  2. QPCR e transcrição reversa
    1. Use 4 μL de síntese do cDNA de transcrição reversa kit (veja a Tabela de materiais) para uma reação de 20 μL. Prepare o supermix de acordo com o número de amostras. Transferir o volume necessário para cada tubo e adicionar 5 μL da entrada do RNA para cada tubo. Este volume pode ser corrigido para ser relevante para o alcance das condições de trabalho do polymerase de Taq.
    2. Incubar os tubos em um termociclador com o seguinte programa recomendado pelo fabricante: 5 min a 25 ° C, 20 min de transcrição reversa por 20 min a 46 ° C e inativação de transcriptase reversa por 1 min a 95 ° C.
    3. Execute qPCR com o programa otimizado para cada par de primers.
      Nota: Para detectar a presença de certos mRNAs em frações, volume igual de cada fração (do RNA isolado) deve ser usado para a transcrição reversa.
  3. Análise dos resultados
    1. Use o valor de Ct do gene de interesse e o luciferase para calcular os valores de Ct delta
    2. Express delta cada fração valor de Ct como a porcentagem do valor total do mRNA contido em todas as frações para visualizar a distribuição do mRNA através das diferentes fracções (tabela 1)

4. isolamento e análise de miRNAs de Polysome frações e frações Nontranslating

  1. Extração de mRNA e miRNA
    Nota: Este protocolo segue as instruções do fabricante, com algumas mudanças.
    1. Descongele o glicogênio e o pico-no controle. Manter-se no gelo.
    2. Adicione 700 µ l de reagente de extração de miRNA para 200 µ l de amostra em pool.
    3. Adicionar 1 µ g / µ l de glicogênio e homogeneizá-lo usando a pipeta. -Incube durante 5 min à temperatura ambiente.
    4. Adicionar 3,5 µ l de 1,6 x 108 pico-no controle e misture.
    5. Adicionar 200 µ l de clorofórmio e vortex, durante pelo menos 15 segundos.
    6. Incube durante 3 min à temperatura ambiente.
    7. Centrifugar a 12.000 x g por 15 min a 4 ° C.
    8. Utilizando uma pipeta, transfira o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL. Descarte as fases médio e inferior.
    9. Adicione 1,5 x volume, de etanol 100% ao sobrenadante e misture.
    10. Transferência de 700 µ l desta mistura para a coluna de extração de miRNA e centrifugue-lo a toda a velocidade para 15 s no RT e descarte o escoamento; Repita este passo com qualquer amostra restante.
    11. Adicione 700 µ l de tampão 1 à coluna e centrifugue-lo a toda a velocidade para 15 s no RT; Descarte o escoamento.
    12. Adicionar 500 µ l de tampão de 2 à coluna e centrifuga-lo a toda a velocidade para 15 s no RT; Descarte o escoamento.
    13. Adicionar 500 µ l de etanol a 80% para a coluna e centrifuga-lo a toda a velocidade por 2 min em RT; Descarte o escoamento.
    14. Transferir a coluna para um novo 2ml estreantes tubo, abra a tampa e centrifugá-lo a RT por 5 min na velocidade máxima; Descarte o escoamento.
    15. Adicione 16 µ l de água livre de RNAse para a coluna e centrífuga em cheio a velocidade para 1 min a RT. conservar o eluato no gelo ou armazenar a-80 ° C para análise futura.
      Nota: Dois microlitros de cada amostra podem ser usados para análise de OD.
  2. Transcrição reversa
    1. Prepara-se em gelo. Para cada reação de RT-PCR de 20 µ l, adicionar 4 µ l de buffer miRNA RT, 2 µ l de ácidos nucleicos, 9 µ l de RNA total, 2 µ l da enzima e 3 µ l de água livre de RNAse; misturar e girá-lo para baixo rapidamente.
    2. O termociclador definido da seguinte forma:
      37 ° C por 60 min;
      95 ° C por 5 min;
      Espera de 4 ° C.
    3. Retirar os tubos do termociclador e adicionar 200 µ l de água livre de RNAse. Armazenar a-20 ° C ou prosseguir para o PCR em tempo real.
  3. PCR em tempo real
    Nota: Este protocolo segue 96 formato de placa bem. Prepare a mistura de reação no gelo.
    1. Preparar a mistura de reação de PCR e adicionar cDNA (de miRNAs acima) de acordo com o intervalo aceitado pelo protocolo. Reações múltiplas podem ser preparadas em lote.
    2. Adicione um total de 25 µ l de mistura PCR + cDNA em cada poço.
    3. A placa usando um selo da placa óptica do selo.
    4. Centrifugue a placa por 1 min a 1.000 x g , à temperatura ambiente.
    5. Programa o reciclador em tempo real, como segue:
      Etapa de ativação inicial a 95 ° C por 15 min;
      Passo 3-ciclismo: desnaturação a 94 ° C por 15 s; Recozimento a 55 ° C por 30 s; extensão a 70 ° C por 30 s (Executar coleta de dados de fluorescência); adicionar 40 ciclos;
      Derretendo-curva de acordo com o padrão do reciclador.
  4. Análise comparativa
    1. Exemplo de normalização (ver quadro 2):
      1. Encontre o valor mínimo de SCM.
      2. Normalize todos os valores SCM a este mínimo.
      3. Subtrai esse valor a partir dos valores de Ct de miRNAs de interesse (MOI) e gene de referência (REF).
      4. Analise os dados usando a fórmula de 2-ΔCt .

5. Proteomic Analysis

  1. Extração de proteínas de frações polysome
    1. Combine fracções recolhidas sacarose em três frações finais. Marque as frações como pesado (polissomos de alta eficiência em fracções em pool, 4, 5, 6 e 7 com a maior concentração de sacarose, inferior do tubo gradiente), luz (polissomos baixa eficiência em fração em pool, 8, 9, 10 e 11; meio da tubo de gradiente) e não-traduzindo (frações em pool, 12, 13, 14 e 15 com a menor concentração de sacarose; parte superior do tubo gradiente). Realize o ensaio da proteína em fracções em pool.
    2. Prepare o estoque de 100% de ácido tricloroacético (TCA) e armazená-lo em 4 ° C, no escuro. Misturar 0,5 mL da amostra com 60 µ l de 100% TCA e incubar a-20 º C durante a noite, no escuro.
      Nota: Use tubos de retenção de baixa proteína de 1,5 mL (ver Tabela de materiais).
    3. Após a incubação durante a noite, descongele a amostra em gelo e centrifugação a 15.000 x g, 4 ° C por 30 min. Discard sobrenadante.
      Nota: 100 µ g de proteína total na amostra dá pelota de proteína visível na parte inferior do tubo.
    4. Pre-calma acetona no congelador-20 ° C. Adicione 0,5 mL de acetona gelada para a pelota de proteína e centrifugação a 15.000 x g, 4 ° C por 15 min. Discard sobrenadante. Repita duas vezes.
    5. Ar seco a pelota. Resuspenda o pellet em 360 µ l de tampão Tris-HCl de 50mm (pH 8).
      Nota: Se necessário, use um sonicador de pulso para Ressuspender o precipitado.
    6. Adicionar 40 µ l de ditiotreitol 0,1 M (concentração final 10 mM) e incubar a 55 ° C, agitador por 45 min. Adicionar 50 µ l de iodoacetamide de 0,15 M (concentração final 17 mM) e incubar a temperatura ambiente agitador por 30 min no escuro.
    7. Preparar a solução de tripsina: Resuspenda 20 µ g de tripsina em 100 µ l de bicarbonato de amónio de 50 mM. Adicionar o correspondente volume de solução de tripsina a amostra em 01:50 (w/w) proporção de tripsina: proteína, certifique-se de que o pH é 8 e incubar agitador a 37 ° C durante a noite.
      Nota: Adicione M 1 bicarbonato de amónio para trazer pH 8.
    8. Após a digestão do trypsin, legal a amostra, centrífuga brevemente em centrífuga de bancada, adicionar 10% de ácido fórmico a pH 2 – 3 saciar a atividade de tripsina e proceder com a amostra de dessalinização.
      Nota: Use chapa µ-eluição para dessalinização de amostra.
    9. Condição do adsorvente a nos poços da placa bem 96 com 200 µ l de metanol usando vácuo três vezes seguido pelo condicionamento de 200 µ l de solução de ácido fórmico 0,1% três vezes. Amostra de carregar e executar uma lavagem de amostra usando a 200 µ l de solução de ácido fórmico 0,1% três vezes. Eluir a amostra com 100 µ l de solução de ácido fórmico 50% acetonitrile/0.1% duas vezes num tubo de 0,5 mL de retenção de baixa proteína.
      Nota: Eluir a amostra lentamente no começo usar gravitação seguido por baixo vácuo.
    10. Evaporar o eluído amostra à dessecação concentrador e também diretamente realizar análise de espectrometria de massa ou loja a-80 ° C até o uso.
  2. Análise de espectrometria de massa
    1. Reconstituir cada pellet (consistindo dos peptides tryptic) em 50 a 100 µ l e injetar 1 µ l no espectrômetro de massa.
      Nota: Otimize a reconstituição e injeção de volumes para obter a máxima intensidade de sinal LC/MS/MS. No nosso caso, o sinal máximo (íon total atual; TIC) no coração da varredura foi no intervalo de 1E8 para 2E9.
    2. Usar uma armadilha coluna C18 (300 µm identificação x 5 mm, 5 µm, 100Å) seguido de separação de peptídeo usando coluna C18 (75 µm identificação x 250 mm, 2 µm, 100Å) com uma configuração de taxa de fluxo em 300 nL/min. Set a temperatura capilar nano-fonte a 275 ° C e a tensão do pulverizador de 2 kV.
    3. Aplica um gradiente linear de B 5 – 35% para 90 min, 35 – 95% B por 3 min, mantendo em 95% B por 7 min e equilibrio de 5% B para 25 min (r: 0,1% de ácido fórmico/água e b: 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila). Adquira MS2 espectros para os 15 íons de intensidade mais altos de cada verificação MS1 usando o modo de CID. Espectrometria de massa uso 3 repetições para cada amostra analisada.
      Nota: Otimizar e utilizar os parâmetros que são apropriados para suas amostras no instrumento particular espectrometria de massa e condições experimentais. Os condições/parâmetros mencionados na secção 5.2. foram utilizadas e otimizadas em nosso laboratório.
  3. Identificação/quantificação da proteína
    1. Após análise de espectrometria de massa, converta os arquivos de espectros brutos em arquivos de mzXML compatível, utilizando o software MSConvert (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html).
    2. Enviar os arquivos convertidos num motor de busca SEQUEST com os critérios de pesquisa, por exemplo, UniProtKB/Swiss-Prot do mouse banco de dados (mais actualizado canônica revisado); síntese de enzima semi usando tripsina (após KR /-); com até 2 decotes não atendidas; intervalo de massa precursor: 400 a 4.500 amu; modificação de estática: carbamidomethyl (C) 57,021465 amu; tolerância em massa do peptide: 50 ppm; fragmento de massa tipo: monoisotópico.
      Nota: Outras proteínas de banco de dados pesquisa motores dados condutas e podem ser usadas. Se usando o banco de dados , por exemplo, o rato, que é menos completos do que os bancos de dados para mouse e humanos, pode ser necessário pesquisar contra mouse (e/ou humanos) bancos de dados para aumentar a cobertura do proteoma. Neste caso, a redundância em nomes de proteína precisará ser removido.
    3. Realizar uma análise post-pesquisa. Ajuste os filtros para visualizar os dados. Por exemplo, defina uma probabilidade mínima de proteína (limiar de proteína) como 95% ou 99%, ou seja, serão exibidas somente as proteínas para que uma análise estatística implica em 95% ou 99% de probabilidade de estar presente na amostra. Definir o filtro para o limiar do peptide (por exemplo, 95%), ou seja, uma probabilidade mínima que será usada para determinar se um espectro identifica um peptídeo. Selecione o número mínimo de peptídeos que vai determinar se uma proteína está presente (recomenda-se 2 peptídeos como um mínimo para identificação de proteínas).
    4. Avalie as proteínas identificadas para a qualidade/quantidade. Certifique-se de que proteotypic peptídeos são utilizados para a quantificação. Se isoform é identificado garantir é bases na observação de um peptídeo tryptic composto por uma sequência de aminoácidos, exclusiva para a isoforma específica. Qualquer "similares" ou hipotéticas proteínas devem ser submetidos a comparação para ver se o observado peptídeos correspondem a uma proteína conhecida.

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Representative Results

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análise do mRNA
resultados de mRNA podem ser expressa como uma distribuição de um mRNA específico em cada fração (Figura 3A); para quantificação, combinar polyribosomal frações de traduzir e comparar com a fração não-traduzindo (Figura 3B), apresentando uma relação de abundância de mRNA em traduzir para frações nontranslating. Informações adicionais de são adquiridas, examinando as frações de polysome de alta eficiência separadamente das fracções de baixa eficiência polysome (e frações nontranslating separado). Isto é particularmente importante quando se analisa os miRNAs, ricos nas frações de baixa eficiência (onde eles interferem com a tradução de proteínas dos seus mRNAs de alvo).

Representante de resultados para um mRNA específico que alterações de sua distribuição entre as frações de tradução e nontranslating depois que os corações de rato foram submetidos a isquemia e isquemia/reperfusão comparada com sham são mostradas na Figura 4.

análise da matriz de miRNA
Resultados representativos de uma análise de matriz de miRNA são mostrados na Figura 5. Aqui, um subconjunto de miRNAs (placa matriz personalizados) foram analisados as frações pesadas em pool, indicando que os 22 miRNAs foram associados com polissomos durante a isquemia, 9 miRNas durante a isquemia e reperfusão, com 7, que eram comuns a ambas as condições. Isto mostra que a associação de miRNAs é dinâmica em resposta ao stress da isquemia e reperfusão.

Análise proteômica
Análise de frações pesadas, leves e não-tradução da amostra de Souza (controle):
881 de proteínas totais foram identificados por espectrometria de massa; 3, proteínas 46 e 208 do total eram únicas para frações pesadas, luz e não-trans, respectivamente (figura 6A). A maioria (88%) de proteínas ribossomais mitocondriais (28S e 39S) foram identificada na fracção leve (36 de 41) e a maioria (88%) de proteínas ribossomais citosólica (anos 40 e 60) foram identificados comumente em frações pesadas e leves (53 de 60) confirmando a proteómica e separação eficiente capacidade identificadas mais pesado vs citosólica isqueiro mitochondrial proteínas ribossomais. O subconjunto de identificadas proteínas ribossomais mitocondriais e citosólico é mostrado na Figura 6B.

Figure 1
Figura 1: perfil de absorvância UV típico de frações de polysome em gradiente de sacarose. As três primeiras frações representam volume vazio no tubo. A alta eficiência (elevado peso molecular HMW) frações são coletadas em frações 4-7, a baixa eficiência (baixo peso molecular, HBPM) fracções em 8-11 e o não-tradução (e restante material citosólico) é coletado em fracções de 12-15 ( nontranslating, NTR). A linha vermelha indica a condutividade e o traço azul indica absorvância UV em 254 nm. À direita é um desenho de um tubo de ensaio com sacarose gradiente, apresentando distribuição de polissomos após a sedimentação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: análise de controle de integridade do RNA no Bioanalyzer. Número de integridade do RNA (RIN) do RNA total isolado do coração toda lisada. RIN é calculado de acordo com picos 18S e 28S. Gama RIN: 1-10 e RIN = 10 representa uma integridade muito bom. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: perfil representativo da distribuição de mRNA em gradiente de sacarose. Corações foram submetidas a perfusão de Langendorff basal ou isquemia e reperfusão (eu / R). (A) coração lisados foram resolvidos em gradiente de sacarose e teor de mRNA para GAPDH (à esquerda) e COX4 (à direita) foram determinados em cada fração. Enredo mostra a abundância relativa de mRNA em cada fração (número de fração no eixo x) para perfusão basal (sham, linha vermelha e diamantes) e isquemia/reperfusão (eu / R, linha azul e quadrados). Sobreposta sobre a trama são absorvância UV indicando o conteúdo total mRNA (curva de luz de cinza) e condutância (em linha reta cinza linha inclinada). Caixas indicam como frações foram agrupadas. (B) trama do gráfico de barras mostra relação de abundância de mRNA na tradução de frações de nontranslating (NT) (polissomos) vs para GAPDH (à esquerda) e COX4 (à direita) mRNAs. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: resultados representativos do mRNA. Quantificação de um mRNA nas fracções em pool (HMW, HBPM, NTR) mostrando as alterações de acordo com o grupo experimental. Fracionamento de polysome de corações de rato foi realizado após a perfusão de Langendorff. Os resultados são plotados em % do total do mRNA (painel superior) e como razão de polissomos (HMW + HBPM) a fração nontranslating (NTR). Barras de erro representam resultados de 5 corações por grupo (Souza, isquemia ou I / R). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: resultados do representante miRNA. Diagrama de Venn de um caminho focado miRNA análise aparecendo e ativador miRNAs em piscinas de fração pesada de amostras de ratos após coração isquemia ou isquemia e reperfusão. Valor de Cut-off: dobra 1.5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: proteínas identificadas por espectrometria de massa. (A) diagrama de Venn das proteínas comuns e exclusivos para frações pesadas, luz e não-trans. (B) subconjunto de proteínas ribossomais mitocondriais e citosólica identificado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: fluxos de trabalho esquemáticos para métodos de extração de proteínas testaram. Os métodos de extração de proteínas foram testados usando amostra de Souza (controle) e pesados (polissomos de alta eficiência) fração com maior teor de sacarose. Números em vermelho indicam o número de proteínas que foram identificados por espectrometria de massa; onde dois números são exibidos, eles são de dois experimentos separados. A descrição detalhada é dada no texto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

FRACÇÕES Ct do GENE LUCIFERASE Ct ΔCt 2ΔCt SOMA DE TODAS AS FRAÇÕES % DE CADA FRAÇÃO Relação polysome/NTR
Alta eficiência (HMW) 28,75 22,79 5,96 0.016 0,046 34.64 2,77
Baixa eficiência (HBPM) 28.43 22,63 5,80 0,018 38.81
Não traduzir (NTR) 29.12 22.77 6.35 0,012 26,55
Relação polysome/NTR = (HMW + HBPM) / NTR

Tabela 1: Análise do mRNA da amostra. Método de análise de um mRNA é mostrado para as diferentes frações em pool (HMW, HBPM, NTR) após PCR quantitativo. ΔCt = gene Ct - luciferase Ct, e o 2ΔCt é 2ΔCt.

Encontrar o valor mínimo de SCM: 22.77
Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3
CT MOI 22,92 22.36 22,58
CT SCM 22.81 22.77 22.9
CT REF 23,27 23,55 23,19
Normalizar todos os valores SCM para este mínimo
Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3
CT SCM 0.05 0 0.13
Subtrair esses valores a partir dos valores de Ct de MOI e REF
Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3
CT MOI 22,87 22.36 22.45
CT REF 23.22 23,55 23.06

Tabela 2: exemplo de cálculo de PCR em tempo real para comparação de expressão miRNA em polysome e frações nontranslating. os miRNAs de interesse (MOI) e gene de referência (REF) foram analisados nas fracções pesadas em pool de ratos após isquemia ou isquemia/reperfusão. O Ct primeiro os valores foram normalizados para o controle de pico-no valor de Ct (SCM), então a fórmula 2-ΔCt foi utilizado para comparar a expressão de miRNA.

Método Volume de amostra [mL] # de proteínas identificadas Comentários
FASP 1 227 em massa de sacarose precipitou no filtro
precipitação de acetona 0.6 372 lodo viscoso de sacarose na parte inferior do tubo; volumes de 4:1 (reagente: amostra); nenhum sedimento visível da proteína
precipitação de clorofórmio/metanol 0.32 389 lodo viscoso de sacarose na parte inferior do tubo; volumes de 8:1 (reagente: amostra); nenhum sedimento visível da proteína
Precipitação de TCA (a 4 ° C) 0,5 405, 415 sem precipitação de sacarose; volumes de 0.12:1 (reagente: amostra); sedimento visível na parte inferior do tubo
Re-precipitação 85, 60 precipitação de TCA adicional do sobrenadante após primeira pelota foi coletada
Precipitação de TCA (a-20 ° C) 0,5 440, 430 sem precipitação de sacarose; volumes de 0.12:1 (reagente: amostra); sedimento visível na parte inferior do tubo
Re-precipitação 81, 55 precipitação de TCA adicional do sobrenadante após primeira pelota foi coletada

Tabela 3: Comparação de métodos de extração da proteína. Avaliaram-se a FASP, precipitação de acetona, precipitação de metanol/clorofórmio e precipitação de TCA a 4 ° C e -20 ° C. O objetivo era maximizar o número de proteínas identificadas. Precipitações de TCA foram avaliadas em um segundo lote de material para confirmar a reprodutibilidade.

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Discussion

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Análise do perfil de polysome permite o estudo da tradução de proteínas, analisando o estado translacional de um mRNA específico ou o transcriptoma toda6,7. Também é de grande ajuda quando a tradução local precisa ser estudado como sinaptossomas8. Tradicionalmente, este método envolve a separação de mono e poliribosomami e os mRNAs associados em um gradiente de sacarose, que pode ser acoplado a genômica ou técnicas de proteômica para obter os resultados pretendidos6,9. Por exemplo, um estudo recente realizado por nosso grupo, revelou um mecanismo regulatório pós-transcricional executado no coração de pacientes submetidos à CEC, que imita a lesão de isquemia/reperfusão. Aproveitando-se da análise do perfil de polysome, mostraram um aumento na tradução das proteínas mitocondriais nuclear codificado no coração após CEC procedimento2.

A abordagem de criação de perfil polyribosomal proteome dinâmico apresentada aqui pode revelar alterações na população de mRNAs associados com poliribosomami e as proteínas que estão sendo traduzidas ativamente. Como tradução de mRNAs é regulada em parte por miRNAs, análise de miRNAs nestas frações pode revelar ideias adicionais. Na verdade, vários estudos têm modificado esse método e provaram que uma abordagem adequada e confiável para investigar o modo de miRNA de regulamento10,11.

Muitos estudos têm sido realizados na última década investigando o papel dos miRNAs, considerando a sua importância em diversas funções biológicas12,13. Desde que os miRNAs agir através de base-emparelhamento com contrapartida mRNAs a fim de marcá-los para degradação, análise de perfil de polysome foi realizada e mostrou que os miRNAs na verdade são encontrados nas fracções polysome, visando traduzir os mRNAs14, 15 , 16. miR-21 é um bom exemplo onde é associado com uma repressão baixa e fracos polissomos obrigatório em células normais, enquanto em células de câncer, a associação com polissomos é aumentada e o efeito repressivo é muito mais forte,17.

Neste estudo, foi feito análise de PCR em tempo real usando os valores de Ct dos miRNAs de interesse (MOI), os valores de Ct de pico-a controlam miRNA (SCM) para reduzir as variações técnicas e o valor de Ct de um gene de referência ou miRNA (REF), que é estável entre amostras. O primeiro passo foi normalizar os valores de Ct da MOI e o árbitro para os valores de Ct de SCM. Então houve uma normalização passo segunda do MOI para o juiz e o valor resultante foi usado para calcular a fórmula 2-ΔCt . Estes valores ou alteração de dobra pode ser usado para demonstrar as diferenças entre os grupos.

Desde a extração de proteínas é difícil de frações de polysome, a maioria dos estudos realizados até agora, tenho usado as frações diretamente para análise ocidental do borrão. Eles simplesmente o conteúdo de proteína de cada fração e misture com SDS-carregamento do buffer a ser usado para análise de SDS-PAGE8,18de sedimentos. Aqui, nós desenvolvemos um método que nos permite não só extrato mRNAs e miRNAs após fracionamento, mas também para obtenção de peptídeos e proteínas com uma alta qualidade para prosseguir com a análise de espectrometria de massa.

Esta abordagem poderia ser estendida ainda mais ativamente medindo as proteínas recém sintetizadas usando rotulagem metabólicas tais como biorthogonal homólogo de aminoácido, tais como azidohomoalanine (AHA) para metionina19,20. AHA incorporação seguida por clique química permite a incorporação de uma marca de biotina, seguida por streptavidin purificação de todas as proteínas que incorporou AHA. Isto permite a identificação definitiva de proteínas recém sintetizadas — a outra parte do proteome dinâmico. Deteção de miRNAs que redistribuir entre as frações de tradução e nontranslating em resposta a um estímulo (aqui com I / R) permite interrogatório do Regulamento dinâmico de translação de proteína. No entanto, os fatores que recrutam miRNAs até as proximidades de mRNA ribossomo-limite continuam a ser identificado e sistematicamente investigado.

Em nosso estudo, além de precipitação do TCA, testamos três outros métodos para extração de proteína de frações de polysome: i) FASP (preparação de amostra auxiliado por filtro)21, precipitação ii) acetona e precipitação iii) clorofórmio/metanol. A adequação dos métodos foi avaliada com base em ambos a capacidade de processar fracções com alta concentração de sacarose (até 50%) e o número de proteínas identificados por espectrometria de massa (Figura 7 e tabela 3).

Para o método FASP, seguimos o protocolo da preparação da amostra dada por um Kit de digestão de proteína FASP que emprega uma unidade de ultrafiltração com um corte de massa molecular relativa de 30 kDa. Esta unidade de filtro serviu como uma ferramenta para remoção do detergente, troca de amortecedor, digestão de proteínas e eluição de peptídeo com a capacidade de reter substâncias de alto peso molecular (proteínas e DNA) que caso contrário iria interferir com separação posterior do peptide 21. brevemente, a amostra foi misturada com ureia contendo buffer e carregado no filtro de unidade de rotação com fiação passos como solução de iodoacetamide, solução de tripsina e solução de cloreto de sódio (eluição) foram subsequentemente adicionados. Filtrado final que continha peptídeos digeridos foi acidificado pelo TFA, posto e armazenado para análise de espectrometria de massa. Usando este método, no entanto, a maior parte da sacarose precipitada constantemente acumulado na parte superior do filtro, tornando a centrifugação e lavagem passos difíceis.

Para precipitação de acetona e clorofórmio/metanol precipitação, vários volumes de solventes eram necessários para precipitar proteínas de um único volume da amostra. Esse limitado o tamanho do volume de amostra aplicado quando a precipitação foi realizada em tubos de 1,5 mL (tubos de baixo-retenção de proteína). Também, o lodo viscoso de sacarose acumulados no fundo dos tubos após precipitação para ambos os métodos e havia sem pelotas visíveis na parte inferior do tubo e na interface líquido após precipitação de acetona e clorofórmio/metanol precipitação, respectivamente.

Tabela 3 e Figura 7 mostram a comparação de quatro métodos de extração da proteína que costumávamos otimizar nosso fluxo de trabalho experimental. Os números vermelhos dados em cada método (Figura 7) representam o número de proteínas que foram identificados por espectrometria de massa (ver secção 5.2 e 5.3). Apesar de diferentes volumes de amostra usadas para cada método, clorofórmio/metanol e precipitações de TCA resultaram em maior número de proteínas identificadas. No entanto, devido às desvantagens mencionadas acima (limitação de volume de amostra e precipitação de sacarose), optou-se por precipitação de TCA para experimentos subsequentes.

Para encontrar as melhores condições para a amostra de processamento, precipitação de TCA foi realizada em várias temperaturas e concentrações de TCA a22,23,24. Assim, realizamos uma precipitação com 10,7% TCA a 4 ° C e -20 ° C e precipitou ainda mais os sobrenadantes com adicionais µ l 60 de TCA (final 19,4% TCA) depois de pelotas foram coletadas. Isto resultou em quatro pelotas que foram analisadas separadas por espectrometria de massa. Além disso, repetimos o protocolo inteiro duas vezes para garantir que os resultados obtidos foram reprodutíveis. O fluxo de trabalho e o número de proteínas identificadas em pelotas em condições de 4 ° C e -20 ° C com duas experiências repetidas são mostrados na Figura 7 (números em vermelho). Embora a análise das pelotas derivado os sobrenadantes renderam um número adicional de proteínas (85 e 60 em 4 ° C; 81 e 55 a-20 ° C); a maioria das proteínas já foram identificados em Pelotas primeiras e assim, optamos por usar 10,7% TCA para todas as experiências subsequentes. Embora a precipitação de clorofórmio/metanol resultou em um número similar de proteínas identificadas em relação à precipitação do TCA, preferimos a precipitação de TCA devido a diversas vantagens: eu) pequeno volume de solvente necessária para precipitar as proteínas (60 µ l de TCA vs 1,28 mL de clorofórmio/metanol/água) permitindo o uso de maiores volumes de amostra se necessário enquanto convenientemente utilizando tubos de 1,5 mL para a precipitação, ii) visibilidade do sedimento no fundo do tubo e iii) sem acúmulo de sacarose durante etapas de precipitação.

Apesar de oferecer informação funcional aprofundada sobre o estado de translação, uma grande desvantagem deste método é a necessidade de matérias-primas frescas e grande. Muitos estudos tentaram otimizar as condições usando o pequeno volume de células ou tecidos ou adicionar etapas para aumentar a eficiência de extração de RNA e proteínas25. Ainda, tecidos provenientes de diferentes animais nas mesmas condições experimentais poderiam ser puxados juntos, se necessário.

Em conclusão, este protocolo permite a análise simultânea de mRNA, miRNA e proteína de frações obtidas a partir de polysome de criação de perfil para estudar os mecanismos reguladores envolvidos na isquemia/reperfusão. No entanto, mais estudos são necessários para ver se a tradução de mRNAs são induzidos após isquemia ou reperfusão e se eles serão desligados após a remoção do estresse.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

HL112730 NIH P01 (pano, JVE), NIH R01 HL132075 (pano, JVE), centro do coração feminino-Barbra Streisand (pano, JVE), Dorothy e Lyon de Phillip E. cadeira em Cardiologia Molecular (RAG), Erika Glazer dotado cadeira na saúde do coração feminino (JVE) e a Academia de Ciências da República Checa Apoio institucional RVO: 68081715 (MS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pentobarbital Vortech Phamaceuticals 9373 for euthansia
Heparin Sagent 103424 used in langendorff preparation
forceps Fine Science Tools 91110-10 used to hang the heart
Langendorff system Radnoti + home made n/a A 'four heart' system consisting of custom blown glass, tubing and water baths
NaCl Sigma S7653-5KG Krebs buffer and Sucrose gradient
KCl Sigma P5405 Krebs buffer and Lysis buffer
KH2PO42 Sigma P-5504 Krebs buffer
MgSO4 Sigma M7774-500G Krebs buffer
Glucose Sigma G5767 Krebs buffer
CaCl2 Sigma C1016-500G Krebs buffer
Sucrose powder Sigma S0389-1KG Sucrose gradient
MgCl2 Sigma 208337 Sucrose gradient and Lysis buffer
Tris-base Sigma T1503-1KG Sucrose gradient and Lysis buffer
Xylene Cyanole Sigma X-4126 Sucrose gradient
Cycloheximide Sigma-aldrich 239763 Sucrose gradient and Lysis buffer
RNaseOUT Life Technologies C00019 RNAse inhibitor for Lysis buffer
Igepal CA-360 (NP40) Sigma I3021 Lysis buffer
Protease Inhibitor Cocktail tablets, EDTA free Roche 5056489001
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 mm x 89 mm Beckman Coulter 344059
Ultracentrifuge Beckman LE-80K Ultracentrifugation of the gradients
Rotor Beckman SW41 Ultracentrifugation of the gradients
Biologic LP (pump) Biorad 731-8300 Fractionation of the gradients
BioFrac Biorad 741-0002 Fractionation of the gradients
Eppendorf RNA/DNA LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL tube Sigma Z666513-100EA Gradient fraction and RNA extraction
TRIzol Reagent Life technologies AM9738 RNA extraction
Luciferase Control RNA Promega L4561 RNA extraction
Chloroform Fisher Scientific C606-4 RNA extraction
Glycogen, RNA grade Thermo Fisher Scientific R0551 RNA extraction
Isopropanol Sigma I9516 RNA extraction
Ethanol Sigma E7023-1L RNA extraction
iScript cDNA Synthesis Kit BioRad 170-8891 Reverse transcription
iTaq Universal SYBR Green Supermix BioRad 175-5122 Quantative PCR
miRNeasy Micro Kit (50) Qiagen 217084 Kit for total RNA isolation
miScript II RT Kit (50) Qiagen 218161 Kit for miRNA reverse transcription
miScript Sybr Green PCR Kit (200) Qiagen 218073 Kit for real-time PCR expression analysis of miRNAs
Centrifuge 5424R Eppendorf For centrifugation of 1.5 mL or 2.0 mL tubes at different temperatures. Max speed - 21130 x g
Centrifuge 5810R Eppendorf For real-time PCR plate centrifugation at different temperatures. Max speed - 2039 x g
My Cycler Thermal Cycler Bio-Rad For reverse transcription
CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad For real-time PCR analysis
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control Qiagen 219610 For quality control of RNA isolation
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear Bio-Rad HSP9641 For real-time PCR analysis
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical Bio-Rad MSB1001 For real-time PCR plate sealing
Research plus Single-Channel Pipette, Gray; 0.5-10 µL Eppendorf UX-24505-02 For pipetting
PIPETMAN Classic Pipets, P20 Gilson F123600G For pipetting
PIPETMAN Classic Pipets, P200 Gilson F144565 For pipetting
Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 µL Gilson 17011782 For pipetting
Glycogen, RNA grade Thermo Fisher Scientific R0551 Improves total RNA isolation efficiency
Posi-Click 1.7 mL Tubes, natural color Denville C2170 RNA isolation and storage; reagent mix
Thermal Cycling Tubes -0.2 mL Individual Caps, Standard 0.2 mL tubes with optically Denville C18098-4 (1000910) Reverse transcription reaction
Sharp 10 Precision barrier Tips Denville P1096-FR For pipetting
Sharp 20 Precision barrier Tips Denville P1121 For pipetting
Sharp 200 Precision barrier Tips Denville P1122 For pipetting
Tips LTS 1 mL Filter Rainin RT-L1000F For pipetting
miScript Primer Assay (200) Qiagen (it changes according to the miRNA) For real-time PCR analysis
Gradient Master ver 5.3 Model 108 BioComp Instruments For preparation of sucrose gradients
trichloroacetic acid Sigma Aldrich T6399
acetone Sigma Aldrich 650501
Tris hydrochloride Amresco M108
dithiothreitol Fisher Scientific BP172
iodoacetamide Gbiosciences RC-150
sequencing grade modified trypsine, porcine Promega V5111
ammonium bicarbonate BDH BDH9206
formic acid, Optima LC/MS Fisher Chemical A117
methanol, Optima LC/MS Fisher Chemical A454
acetonitrile, Optima LC/MS Fisher Chemical A996
Protein LoBind tubes 0.5 mL Eppendorf AG 22431064
Protein LoBind tubes 1.5 mL Eppendorf AG 22431081
HLB µElution plate 30 µm Oasis 186001828BA
SpeedVac concentrator Thermo Scientific Savant SPD2010
sonicator Qsonica Oasis180
centrifuge Thermo Scientific Sorvall Legend micro 21R
LC trap column PepMap 100 C18 Thermo Scientific 160454
LC separation column PepMap RSLC C18 Thermo Scientific 164536
mass spectrometer Thermo Scientific Orbitrap Elite ion trap mass spectrometer
MSConvert software ProteoWizard Toolkit
Sorcerer-SEQUEST software Sage-N Research, Inc.

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References

  1. Pourpirali, S., Valacca, C., Merlo, P., Rizza, S., D’Amico, S., Cecconi, F. Prolonged pseudohypoxia targets ambra1 mrna to p-bodies for translational repression. PLoS ONE. 10, e0129750 (2015).
  2. Andres, A. M., Tucker, K. C., Thomas, A., Taylor, D. J., Sengstock, D., Jahania, S. M., Dabir, R., Pourpirali, S., Brown, J. A., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W., Mentzer, R. M. Jr, Gottlieb, R. A. Mitophagy and mitochondrial biogenesis in atrial tissue of patients undergoing heart surgery with cardiopulmonary bypass. JCI Insight. 2, e89303 (2017).
  3. Kislinger, T., Cox, B., Kannan, A., Chung, C., Hu, P., Ignatchenko, A., Scott, M. S., Gramolini, A. O., Morris, Q., Hallett, M. T., Rossant, J., Hughes, T. R., Frey, B., Emili, A. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: Combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
  4. Kren, B. T., Wong, P. Y., Shiota, A., Zhang, X., Zeng, Y., Steer, C. J. Polysome trafficking of transcripts and micrornas in regenerating liver after partial hepatectomy. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, G1181-G1192 (2009).
  5. Gottlieb, R. A., Pourpirali, S. Lost in translation: Mirnas and mrnas in ischemic preconditioning and ischemia/reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 95, 70-77 (2016).
  6. Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments. (2014).
  7. Lorsch, J. Methods in enzymology. Laboratory methods in enzymology: Rna. Preface. Methods in Enzymology. 530, xxi (2013).
  8. Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mrnas. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
  9. He, S. L., Green, R. Polysome analysis of mammalian cells. Methods in Enzymology. 530, 183-192 (2013).
  10. Molotski, N., Soen, Y. Differential association of micrornas with polysomes reflects distinct strengths of interactions with their mrna targets. RNA. 18, 1612-1623 (2012).
  11. Maroney, P. A., Yu, Y., Fisher, J., Nilsen, T. W. Evidence that micrornas are associated with translating messenger rnas in human cells. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1102-1107 (2006).
  12. Paul, P., Chakraborty, A., Sarkar, D., Langthasa, M., Rahman, M., Bari, M., Singha, R. S., Malakar, A. K., Chakraborty, S. Interplay between mirnas and human diseases. Journal of Cellular Physiology. 233, 2007-2018 (2018).
  13. Rupaimoole, R., Slack, F. J. Microrna therapeutics: Towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 203-222 (2017).
  14. Nelson, P. T., Hatzigeorgiou, A. G., Mourelatos, Z. Mirnp:Mrna association in polyribosomes in a human neuronal cell line. RNA. 10, 387-394 (2004).
  15. Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a mirna blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1108-1114 (2006).
  16. Kim, J., Krichevsky, A., Grad, Y., Hayes, G. D., Kosik, K. S., Church, G. M., Ruvkun, G. Identification of many micrornas that copurify with polyribosomes in mammalian neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 360-365 (2004).
  17. Androsavich, J. R., Chau, B. N., Bhat, B., Linsley, P. S., Walter, N. G. Disease-linked microrna-21 exhibits drastically reduced mrna binding and silencing activity in healthy mouse liver. RNA. 18, 1510-1526 (2012).
  18. Kraushar, M. L., Thompson, K., Wijeratne, H. R., Viljetic, B., Sakers, K., Marson, J. W., Kontoyiannis, D. L., Buyske, S., Hart, R. P., Rasin, M. R. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the rna-binding protein hu antigen r. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. E3815-E3824 (2014).
  19. McClatchy, D. B., Ma, Y., Liu, C., Stein, B. D., Martinez-Bartolome, S., Vasquez, D., Hellberg, K., Shaw, R. J., Yates, J. R. 3rd Pulsed azidohomoalanine labeling in mammals (palm) detects changes in liver-specific lkb1 knockout mice. Journal of Proteome Research. 14, 4815-4822 (2015).
  20. Schiapparelli, L. M., McClatchy, D. B., Liu, H. H., Sharma, P., Yates, J. R. 3rd, Cline, H. T. Direct detection of biotinylated proteins by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13, 3966-3978 (2014).
  21. Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6, 359-362 (2009).
  22. Rajalingam, D., Loftis, C., Xu, J. J., Kumar, T. K. Trichloroacetic acid-induced protein precipitation involves the reversible association of a stable partially structured intermediate. Protein Science. 18, 980-993 (2009).
  23. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31, 3573-3579 (2010).
  24. Sashital, D. G., Greeman, C. A., Lyumkis, D., Potter, C. S., Carragher, B., Williamson, J. R. A combined quantitative mass spectrometry and electron microscopy analysis of ribosomal 30s subunit assembly in e. Coli. Elife. 3, (2014).
  25. Liang, S., Bellato, H. M., Lorent, J., Lupinacci, F. C. S., Oertlin, C., van Hoef, V., Andrade, V. P., Roffé, M., Masvidal, L., Hajj, G. N. M., Larsson, O. Polysome-profiling in small tissue samples. Nucleic Acids Research. 46, e3 (2018).
Dinâmica proteómica e miRNA análise de polissomos de coração de rato isolado após Langendorff perfusão
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Stastna, M., Thomas, A., Germano, J., Pourpirali, S., Van Eyk, J. E., Gottlieb, R. A. Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion. J. Vis. Exp. (138), e58079, doi:10.3791/58079 (2018).More

Stastna, M., Thomas, A., Germano, J., Pourpirali, S., Van Eyk, J. E., Gottlieb, R. A. Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion. J. Vis. Exp. (138), e58079, doi:10.3791/58079 (2018).

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