Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

In Vitro Hundarnas neutrofila extracellulära fälla bildandet: Dynamiska och kvantitativ analys av fluorescensmikroskopi

Published: August 24, 2018 doi: 10.3791/58083

Summary

Vi beskriva metoder för att isolera Hundarnas neutrofiler från helblod och visualisera NET bildandet i levande neutrofiler med fluorescensmikroskopi. Beskrev också är protokoll att kvantifiera NET bildandet och citrullinerade Histon H3 (citH3) uttryck med hjälp av immunofluorescens mikroskopi.

Abstract

Svar på invaderande patogener, frigör neutrofiler neutrofila extracellulära fällor (nät), dvs extracellulära nätverk av DNA som pryds av histoner och antimikrobiella proteiner. Överdriven NET bildandet (NETosis) och citH3 release under sepsis är associerad med flera organdysfunktion och dödlighet hos mus och människa men dess konsekvenser hos hundar är okänd. Häri, beskriver vi en teknik för att isolera Hundarnas neutrofiler från helblod för observation och kvantifiering av NETosis. Leukocyt-rich plasma, genereras av dextran sedimentering, avskiljs av kommersiellt tillgänglig täthet lutning separation media och granulocyter samlas in för cell count och genomförbarhet testning. För att observera realtid NETosis levande neutrofiler, läggs cell diffusionskoefficient och cell impermeant fluorescerande nukleinsyra fläckar till neutrofiler aktiveras antingen av lipopolysackarid (LPS) eller phorbol 12-isopropylmyristat 13-acetat (PMA). Förändringar i nukleära morfologi och NET bildandet observeras över tid av fluorescensmikroskopi. In vitro NETosis kännetecknas vidare av co-colocalization av cellfria DNA (cfDNA), myeloperoxidas (MPO) och citrullinerade Histon H3 (citH3) använder en modifierad dubbel-immunolabelling-protokoll. För att objektivt kvantifiera NET bildandet och citH3 uttryck med fluorescensmikroskopi, garn och citH3-positiva celler kvantifieras i en blindad sätt använder tillgänglig programvara. Denna teknik är en specifik analys att utvärdera in vitro- kapacitet Hundarnas neutrofiler att genomgå NETosis.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Neutrofiler är kortlivade granulocyter ansvarar för det första försvaret mot invaderande patogener. Neutrofiler, rekryteras till platsen för infektion, eliminera mikroorganismer genom fagocytos, degranulering och generering av reaktivt syre arter (ROS)1. I närvaro av bakterier eller endotoxiner pryds neutrofiler release neutrofila extracellulära fällor (nät), sammansatt av extracellulära kromatin av histoner och granulat proteiner som elastase och myeloperoxidas (MPO)2. Även om nät har oumbärlig antimikrobiella egenskaper, antyder ökande experimentella och kliniska bevis att övernitisk NET bildandet sepsis kan leda till flera organ dysfunktion och död3,4, 5 , 6.

Eftersom nät kan spela en liknande patofysiologiska roll i hundar, kan terapeutiska interventioner att antingen förebygga eller minska NET bildandet tjäna som romanen behandlingsstrategier i septisk djur. Av denna anledning finns det ett behov av en pålitlig teknik för att bedöma och kvantifiera NETosis och NET komponenter hos hundar. NETTO komponenter inklusive cellfria DNA (cfDNA) och nucleosomes har tidigare utvärderats i Hundarnas neutrofiler och plasma från kliniska hundar7,8,9. Med hjälp av fluorescens analyser, funnit Goggs och Letendre att septisk hundar har högre cfDNA än friska hundar8. Även om dessa tekniker är mycket objektiv och kvantitativ, är mätning av cfDNA och nucleosomes som markörer för NETosis icke-specifik eftersom de kan härledas från nekrotiska celler än NETosing neutrofiler. Här beskriver vi en teknik som utnyttjar fluorescensmikroskopi för att undersöka beteenden av levande NETosing neutrofiler. Vi detalj också ett modifierat protokoll med dubbel-immunolabeling subjectively kvantifiera nät och deras komponenter såsom MPO och citH3 i Hundarnas neutrofiler10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla metoderna som beskrivs här godkändes av institutionella djur vård och användning kommittén vid University of California, Davis (protokoll nummer: 18338).

1. blod insamling

  1. Rita 10 mL blod från antingen cefaliska eller jugulära venen med en 21 G nål genom sprutan aspiration.
  2. För att undvika överdriven skjuvspänning, ta bort nålen från sprutan innan du överför blod i rör som innehåller natriumheparin (75 USP). Vänd försiktigt rören några gånger att säkerställa adekvat blandning av antikoagulans och blod. Kontrollera för tecken på blodproppar eller röd cell aggregat innan placeras proverna på is.

2. neutrofila isolering

  1. Späd Antikoagulerat blod med en lika stor volym iskall Dubeccos fosfatbuffrad koksaltlösning (DPBS) (pH 7,4, utan divalenta katjoner). Överföra 8 mL utspädd blod till en 50 mL polypropylen koniska rör innehållande 25 mL 3% dextran (från Leuconostoc spp. upplöst i 0,9% natriumkloridlösning). Placera röret upprätt i rumstemperatur i 30 min så att aggregering och sedimentering av erytrocyter.
  2. Noggrant lager 5 mL leukocyt-rich plasma (figur 1) ovanpå 5 mL täthet lutning media i ett 14 mL polypropylen runda-botten rör. Var noga med att inte blanda 2 lösningar11.
  3. Centrifugera rören vid 400 x- g med acceleration/retardation (A/D) satt till 0 (ingen broms) under 30 minuter vid rumstemperatur.
  4. Med 5 mL serologiska Pipettera samla granulocyt cell lagret genom att kringgå plasma och perifera mononukleära celler (PBMC) lager (figur 1). Använd en ny Pipettera varje gång att minimera kontaminering.
  5. Plats 4 till 6 mL polymorphnuclear (PMN) cell lagret i en 50 mL polypropylen koniska tub. Eftersom en liten mängd av erytrocyt aggregat kan vara aspirerade tillsammans med PMN lagret, Använd en 1 mL serologiska Pipettera försiktigt bort erytrocyt aggregaten som har kvittats på botten av röret.
  6. Lysera de återstående erytrocyterna med 20 mL kallt ultrarent vatten. Vänd försiktigt röret flera gånger för 30-60 s för att säkerställa adekvat lyseringslösning innan du lägger till en lika stor volym iskall 1,8% natriumkloridlösning.
  7. Centrifugera vid 112 x g i 10 minuter vid 4 ° C, A/D satt till 0.
  8. Upprepa erytrocyt Lys om denna pellet visas i rött. Avlägsna supernatanten noggrant med en serologisk Pipettera och försiktigt återsuspendera pelleten i 100 µL av DPBS (5 mM dextros, 0.9 mM MgCl2, 1,9 mM CaCl2 och 1% bovint serumalbumin, pH 7,3). Kombinera alla återsuspenderade celler och placera på isen.
  9. Utför en cell sammanräkning med en automatisk cell analysator och kontrollerar greven av en hemocytometer. Vid behov koncentrera PMNs på en glasskiva med en cytocentrifuge (1000 rpm, 5 min) och bestämma procentandelen av neutrofiler genom att räkna antalet neutrofiler av det totala antalet celler.
  10. Bestämma lönsamheten för neutrofilerna genom att utföra en trypan blå utslagning test som beskrivs av Strober o.a. 12 framgångsrika isolering bör ge en livskraft från 95 till 100% och neutrofiler bör vara större än 95%.
  11. Bestämma koncentrationen av neutrofiler genom att multiplicera det totala celltalet med procent livskraft och procent neutrofiler. Framgångsrika isolering bör ge en koncentration av neutrofiler från 1,5 till6/6 x 10 ml.
  12. Späd neutrofiler till en slutlig koncentration på 1 x 106/ml med DPBS innehållande 5 mM dextros, 0.9 mM MgCl2, 1,9 mM CaCl2och 1% bovint serumalbumin med pH justeras till 7,3.

3. fluorescerande mikroskopi av levande neutrofiler

  1. Plats 200 till 400 μL av neutrofiler (1 x 10-6/ml) i varje brunn av en poly-L-lysin belagd 12-väl kultur plattan. Tillåta neutrofiler att följa botten av brunnarna av ruvning cellerna vid 37 ° C i 30 min.
  2. Etikett nukleinsyror med 1 μM av en av två nukleinsyra färgämnen, en som fläckar i celler med oskadade hinnor och en som fläckar i celler med högpermeabla membran (se Tabell för material), under 10 minuter vid rumstemperatur.
  3. Aktivera neutrofiler med 100 μg/mL lipopolysackarid (LPS) (E. coli O55. B5), 100 nM phorbol 12-isopropylmyristat 13-acetat (PMA) som positiv kontroll, eller motsvarande mängd DPBS som negativ kontroll för 180 min vid 37 ° C.
  4. Förvärva bilder med hjälp av god Jordbrukarsed (Excitation: 470/22 nm, Emission: 525/50 nm) och Texas Red channels (Excitation: 585/29 nm, Emission: 628/32 nm) på en fluorescensmikroskopi på 40 X förstoring vid följande tidpunkter: 30, 90, 120 och 180 min.

4. netto kvantifiering och upptäckt av NET komponenter med hjälp av immunofluorescens

  1. Noggrant placera 18 mm diameter Poly-D-lysin belagda täckglas i brunnar 12-väl kultur platta. Märk brunnarna på lämpligt sätt.
  2. Utsäde 100 till 200 μL av isolerade neutrofiler (1 x 106/ml) direkt på coverslips och tillåta neutrofiler att följa täckglas av ruvning cellerna vid 37 ° C i 30 min.
  3. Aktivera neutrofiler som beskrivs i punkt 3.3. Hämmar NET bildandet av förbehandling neutrofiler med 200 µΜ Cl-amidine (15 min, 37 ° C) före aktivering som tidigare beskrivs av Li et al. 13 -se till att rätt fordonskontroll (DMSO) ingår i experimentet.
  4. Ta försiktigt bort täckglas med fin pincett. Lager ett paraffin filma blad över ett provrör stativ och skapa grunda brunnar som du kan placera 2 till 3 droppar 4% PFA i varje väl10. Märk brunnarna på lämpligt sätt och försiktigt lägga täckglas uppochner på PFA-fyllda brunnarna. Tillåta celler att vara fast i rumstemperatur i 20 min.
  5. Tvätta cellerna 3 gånger i DPBS i 5 minuter genom att flytta dem från en brunn till nästa.
  6. Om immunolabelling inte kan utföras kort efter neutrofil aktivering och fixering, tillåta täckglas vara lufttorkad genom att placera täckglas uppåtvända på en absorbans papper. Täckglas kan förvaras i upp till 1 vecka uppåtvänt i en märkt 12-väl kultur plattan vid 4 ° C tills vidare analys. Tvätta cellerna 3 gånger i DPBS för 1 min med samma teknik som beskrivs i 4.4 innan du fortsätter till nästa steg.
  7. För att permeabilize celler, försiktigt lägga täckglaset uppochner på en minskning med 1% NP-40 för 1 min med tekniken beskrivs i 4.4. Tvätta 3 gånger i DPBS för 1 min på en rocker.
  8. Slumpmässigt tilldela varje prov till ett nummer och använda en diamant punkt markör för att märka coverslips med detta.
  9. Förbered och etikett enskilda petriskålar fodrad med paraffin filma och placera 100 till 200 μL av 5% get serumet på filmen (blockerande buffert). Låg coverslips uppochner på det blockerande buffert. Placera på en rocker och inkubera i 1 timme vid 37 ° C.
  10. Tvätta 3 gånger i DPBS för 5 min på en rocker.
  11. Späd den primär antikroppen (1: 400 kanin polyklonala anti-citrullinerade Histon H3 (citH3) i 5% get serum). Inkubera cellerna i märkta petriskålar fodrad med paraffin film. Lägg varje täckglas uppochner på 50 till 100 μL av utspädda antikropp lösningen. Placera på en rocker och inkubera i 1 timme vid 37° C.
  12. Tvätta 3 gånger i DPBS för 5 min på en rocker.
  13. Utspädd sekundär antikropp konjugerat till en fluorophore (1: 200) i 5% get serum. Inkubera cellerna i märkta petriskålar fodrad med paraffin film. Lägg varje täckglas uppochner på 50 till 100 μL av utspädda antikropp lösningen. Placera på en rocker och inkubera 1 h vid 37 ° C i mörker.
  14. Tvätta 3 gånger i DPBS för 5 min på en rocker i mörkret.
  15. För samtidiga upptäckt av myeloperoxidas (MPO) Följ följande steg för en modifierad dubbel immunolabeling protokoll som beskrivs av Li et al. 13
  16. Inkubera cellerna i märkta petriskålar fodrad med paraffin film. Lägg varje täckglas uppochner på 100 till 200 μL 10% kanin serumet under skonsam gunga (övernattning, 4 ° C, i mörkret).
  17. Tvätta 3 gånger i DPBS för 5 min på en rocker i mörkret.
  18. Inkubera cellerna med 50 μg/mL okonjugerat bocken anti-kanin Fab fragment för 2 h i rumstemperatur på en rocker i mörkret.
  19. Tvätta 3 gånger i DPBS för 5 min på en rocker i mörkret.
  20. Späd primär antikropp (1: 200 kanin polyklonala anti-humant MPO antikropp) i 5% get serum. Inkubera cellerna i märkta petriskålar fodrad med paraffin film. Lägg varje täckglas uppochner på 50 till 100 μL av utspädda antikropp lösningen. Placera på en rocker och inkubera 1 h vid 37° C i mörker.
  21. Späd sekundär antikropp konjugerat till en fluorophore i 5% get serum och inkubera som beskrivs i 4.8
  22. Tvätta 3 gånger i DPBS för 5 min på en rocker i mörkret.
  23. Störningar kontroller bör förberedas genom att utesluta inkubation med antingen primära antikroppar i immunförsvaret-märkning steg.
  24. Fläcken DNA med 300 nM 4', 6-Diamidion-2-fenylindol, dihydroklorid (DAPI) för 5 min i mörker vid rumstemperatur.
  25. Tvätta 3 gånger i DPBS för 1 min på en rocker i mörkret.
  26. Applicera en droppe (~ 50 μl) av antifade monteringsmedel på en glasskiva. Knacka försiktigt på kanten av täckglaset på ett absorberande papper att ta bort överflödig buffert innan du monterar täckglaset med celler uppochner. Monteringsmedium bör bilda ett tunt lager mellan täckglaset och glasskiva. Ta bort luftbubblor, mycket försiktigt trycka på täckglaset med fin pincett.
  27. Tillåta prover att bota över natten i mörker vid 4 ° C. Monteringsmedium bör härda för Mikroskopisk analys med nedsänkning linser. Lagra prover i 4 ° C i mörker.

5. neutrofila extracellulära fälla kvantifiering

  1. Blinda de aktörerna förvärva och analysera de Mikroskop bilderna till de experimentella förhållandena.
  2. Med fluorescens Mikroskop med 40 X förstoring, ta 10 bilder slumpmässigt från olika regioner i varje täckglas i ett experiment under respektive kanaler. Säkerställa att exponeringstiden, ljusstyrka och kontrast för varje kanal hålls konsekvent genom hela förvärvet av bilder.
  3. Analysera bilderna med tillgänglig programvara såsom ImageJ (NIH). Identifiera nät baserat på samtidig lokalisering av cfDNA, citH3 och MPO (figur 3A, B). Kvantifiera antalet nät och neutrofiler i 10 slumpmässiga fält för varje experimentella villkor. Nummer av nät släppt kan uttryckas som ett förhållande (antal nät: totala antalet neutrofiler) för varje experimentella villkor.
  4. Utvärdera behandling påverkan på intracellulära citH3 uttryck, räkna antalet neutrofiler med intracellulär citH3 och antalet neutrofiler utan intracellulära citH3 i 10 slumpmässiga fält på 40 X förstoring under de respektive kanalerna ( Figur 3, röda pilar). Intracellulära citH3 uttryck kan uttryckas som förhållandet mellan antalet neutrofiler med intracellulära citH3 till antalet neutrofiler utan intracellulära citH3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Använder det här protokollet för levande cell imaging, kan utredare Observera den nukleära morfologi, plasmamembranet integritet och förekomsten av cfDNA i levande neutrofiler. En cell impermeant nukleära dye fläckar atomkärnor syror röda celler med skadat cellmembran. En annan cell-diffusionskoefficient dye, etiketter intracellulära nukleinsyror i levande celler med intakt plasma membran. Alla intakt neutrofiler, oavsett deras behandlingar, bör visas gröna och uppvisar karakteristiska lobulated kärnorna på 0 till 30 min efter stimulering (figur 2A). Kärnor av PMA-behandlade neutrofiler börjar förlora sin lobulated utseende av ca 60 min och fortsätta decondense tills cfDNA (figur 2B). LP-skivor, en långsammare och mer fysiologiska stimulerande av hundarnas neutrofiler, vanligtvis leder inte i kromatin decondensation eller NETosis tills 90 min efter stimulering (figur 2B). Av 120 min, kan LPS - och PMA-aktiverade neutrofiler ses omgiven av cfDNA. Jämfört med LPS, förlorar mer-PMA aktiverade neutrofiler sin plasmamembranet integritet som de färgas röd av cell impermeant färgämnet (figur 2 c). Ostimulerade neutrofiler (DPBS kontroll) bör hålla lobulated kärnor och intakt plasmamembranet hela inkubationstiden (figur 2A-C).

NETTO komponenter bestående av cfDNA, upptäcks citH3 och MPO granulat med hjälp av dubbel immunolabeling-protokollet. Release av nät, identifieras baserat på samtidig lokalisering av cfDNA, citH3 och MPO, svar på LPS och PMA visas i figur 3A och 3B, respektive. Neutrofiler stimuleras av LPS för 180 min producera diskret web-liknande ställningar av nät i nära närhet till närliggande neutrofiler (figur 3A). Däremot produceras PMA-aktiverade neutrofiler mängder av nät som var betydligt större i området (figur 3B, D). Citrullinering av histoner H3, katalyseras av enzymet peptidylarginine deiminase (PAD), är ett kännetecken för NETosis. PMA, en potent stimulerande av PAD, resulterar i ett högre antal celler som uttrycker intracellulära citH3 jämfört med ostimulerade och LPS-stimulerad neutrofiler (figur 3E).

Figure 1
Figur 1: en schematisk bild som visar stegen i Hundarnas neutrofila isolering. Utspädda hepariniserad helblod först blandas med 3% dextran för sedimentering av röda blodkroppar (RBC). Leukocyt-rich plasma då samlas och lager på lika stora volymer av kommersiellt tillgänglig täthet lutning separation media. Efter centrifugering (400 x g, 30 min), RBC-granulocyt lagret utvinns och de kvarvarande röda blodkropparna tas bort av hypoton lysis. Efter tillsats av 1,8% NaCl, granulocyter är spunnen ner (112 x g, 5 min) och resuspended i dedikerad buffert. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: representativa fluorescerande bilder av levande hund neutrofiler. Isolerade neutrofiler aktiverades med 100 µg/mL LPS, 100 nM PMA eller motsvarande volym av Dubeccos fosfatbuffrad koksaltlösning (DPBS) som negativ kontroll för sammanlagt 180 min. nukleinsyror i levande intakt neutrofiler var målat grön med hjälp av en cell-diffusionskoefficient Dye medan cfDNA och neutrofiler med komprometterad cellmembran var färgas röd med ett cell-impermeant färgämne. (A, D) DPBS - och LPS-behandlade neutrofiler alla underhålls en intakt cellmembranet med lobulated kärnor (asterisk). (A, E) Atomkärnor av PMA-aktiverade neutrofiler började genomgå decondensation (pilspetsar). (B, F) Av 90 min, hade de flesta kärnor i LPS - eller PMA-aktiverade neutrofiler förlorat sin lobulated utseende (blå pilar). (C) efter 120 min, alla PMA-aktiverade neutrofiler hade genomsläpplig plasma membran omgivet av cfDNA medan cfDNA kunde ses kring ett litet antal LPS-aktiverade neutrofiler (pilar). Ostimulerade neutrofiler producerar inte cfDNA heller hade äventyras cellmembranet oavsett tidpunkt (A-C). (A-B) Ursprungliga 40 X förstoring. Skalstapeln = 100 µm. (D-F) 80 X förstoring. Skalstapeln = 30 µm. Experiment duplicerades två gånger från neutrofiler isolerade från 3 olika givare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: NET bildandet. (A-C) Representanten Immunofluorescerande bilder av in vitro- NET bildandet. Isolerade neutrofiler från en enda donator fastställdes, permeabilized och färgas för DNA (blå), myeloperoxidas (MPO, grön) och citrullinerade Histon H3 (citH3, röd) efter stimulering med (A), 100 µg/mL LPS, (B) 100 nM PMA eller (C) DPBS för 180 min. är förtjänar, identifieras genom samtidig lokalisering av cfDNA, MPO och citH3, konturerade (streckade linjer) på (A) LPS- och (B) PMA-aktiverade neutrofiler. Exempel på intracellulära uttryck för citH3 anges med röda pilar. (C) nr nät eller intracellulära citH3 ses i ostimulerade neutrofiler. Skalstapeln = 100 µm. (D, E) representativa box och morrhår tomter NET bildandet och intracellulära citH3 uttryck i neutrofiler isolerade från 4 hundar. Rutan sträcker sig från den 25: e till 75: e percentilerna och morrhår spänner från de minsta till det största värdet. LP-skivor och PMA stimulering resulterade i betydande (D) netto bildandet och (E) intracellulära citH3 uttryck jämfört ostimulerade neutrofiler. + representerar medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vi presenterar här ett protokoll för att observera förändringar i atomkärnor konformation och cfDNA release i levande hund neutrofiler med både en cell diffusionskoefficient färgämne och en cell impermeant dye. Den största fördelen med denna analys är att det tillåter realtid detektering av NET bildandet av högupplösande mikroskopi i levande neutrofiler utan cell fixering, därför ger en enkel och värdefullt verktyg för observation av in vitro- NET bildandet. Eftersom denna analys inte kräver antikroppar för påvisande av NET komponenter, är det perfekt för att studera NETosis hos arter med begränsat antal artspecifika antikroppar. Med denna analys, författarna visade att Hundarnas neutrofiler genomgå kromatin decondensation under LPS eller PMA stimulering före NETosis13. En stor nackdel med denna teknik är att det inte är specifika för NETosis. Eftersom cellen impermeant färgämnet fläckar också nukleinsyror i nekrotiska celler eller nukleinsyror som släppt från lyserat neutrofiler, kunde cfDNA eller cell impermeant-positiva celler tolkas felaktigt som nät eller NETosing neutrofiler. Alternativt kan NETosis specificitet ökas genom inklusive PMA - eller LPS-aktiverade neutrofiler som är förbehandlade med PAD4-hämmaren Cl-amidine. Vi visade här vikten av sterilitet och korrekt hantering av neutrofiler i hela processen isolering som förorening och sheer krafter kan leda till in vitro- nekros och cell lysis. Vi rekommenderar också uppfyller de tillräckliga temperaturerna i hela protokollen och förebygga långvarig (> 1 min) hypoton lysis. För att bekräfta isolerade neutrofiler övertid livskraft, rekommenderas ett Trypan blå utslagning test samt en negativ kontroll bestående av ostimulerade neutrofiler.

Eftersom cfDNA upptäcks av cell-impermeable nukleinsyra färgämnen inte är specifikt för NETosis, utvecklade vi ett dubbel-immunolabeling protokoll för kvantifiering av in vitro- NET bildandet och intracellulära citH3 uttryck i Hundarnas neutrofiler. När neutrofiler frigör granulat proteiner som MPO tillsammans med cfDNA och citH3 i det extracellulära utrymmet, är netto kvantifiering baserat på samtidig lokalisering av cfDNA, citH3 och MPO mer specifika jämfört med andra analyser såsom cfDNA, nucleosomes eller DNA-MPO komplex 14. på grund av den begränsade tillgången av antikroppar som korsreagerar med Hundarnas proteiner, vi använde primära antikroppar som härstammar från en annan art (kanin). För att förhindra att fånga av primära antikroppar av kvarvarande gratis bindningsställen på sekundära antikroppar i antingen steg i processen färgning, utnyttjade vi först kaninserum följt av okonjugerat Fab fragment att mätta gratis bindningsställen. Ett kritiskt steg i denna procedur är att säkerställa tillräcklig tvätt för att förhindra överskott bindningen av immunglobuliner och Fab fragment som kan störa upptäckt av proteinet andra sevärdheter. Vi rekommenderar också testa olika spädningar av primära och sekundära antikroppar att minimera ospecifik bindning och störningar. För att säkerställa att de sekundära antikropparna från antingen immunolabelling steg binder specifikt till dess primär antikropp, bör utredare innehålla 2 olika kontroller som utesluter antingen primär antikropp i immunolabelling steg. Icke-specifik bindning uppstår när signaler från både sekundära antikroppar upptäcks.

Histon avsikten eller deaminering, katalyseras av enzymet peptidylarginine deminase 4 (PAD4), är viktigt i bakterier-associerade NETosis i möss och människor15,16. Med denna analys, kunde vi bestämma att LPS-inducerad NETosis hos hundar också kräver Histon H3 avsikten av PAD13. För att testa om stimulerande sevärdheter inducerar NETosis av PAD4 aktivering, rekommenderar vi införandet av positiva kontroller använder kända PAD4 aktivatorer som PMA eller den kalcium jonofor, A2318717. Om neutrofiler visar negativ färgning för citH3 i de positiva kontrollproverna, måste protokollet revideras tills en tillräcklig positiv färgning är resulterade. Vi rekommenderar också införlivandet av biologiska negativa kontroller, bestående av antingen ostimulerade neutrofiler eller neutrofiler behandlas med PAD-hämmaren Cl-amidine.

Korrekt identifiering av distinkta nät struktur kan vara svårt med denna teknik. Detta kan vara särskilt svårt i prover med omfattande NETosis, som en sammanslagning av NET strukturer släppt från flera intilliggande neutrofiler kan leda till en underskattning av NETotic händelser. Resultaten av denna analys kan vara korrelerade med andra mer objektiva analyser som flödescytometri eller ELISA, som inte har ännu validerats för användning i Hundarnas neutrofiler. För att undvika bildandet av konfluenta NET struktur, kan utredarna frö en lägre koncentration av celler. Alternativt, minskar den totala inkubationstiden kan undvika omfattande NETosis och sammanslagning av NET strukturer. Även om detta protokoll kan användas för att undersöka NETosis hos andra arter, baserat på författarnas erfarenhet, kan neutrofilsvaret LPS eller PMA variera kraftigt mellan olika arter.

Upptäckten av nät i hundar framhåller att NETosis är ett bevarat mekanismen av den medfödda immuniteten under mikrobiella infektioner och immunmedierade sjukdomar. De analyser som presenteras här kan vara ett värdefullt verktyg för studier av NETosis hos hundar och andra arter. En bättre förståelse av sepsis-inducerad NETosis kommer att underlätta ytterligare forskning in i utvecklingen av nya behandlingsstrategier för sepsis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Motsvarande författaren finansierades av stiftelsen Morris djur (D15CA-907). Studien har finansierats genom medel från University of California, Davis, Center för Equine hälsa och centrum för Companion Animal Health (2016-24-F). Författarna vill erkänna Geena Ng för hennes hjälp med siffror och Nghi Nguyen för hennes hjälp med video.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dextran from Leuconostoc spp. Sigma 31392 Molecular weight 450,000 – 650,000
Ficoll-Paque PLUS GE Life Sciences 17144002
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher Scientific A1285801 With divalent cations
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher Scientific 14190136 Without divalent cations
E. coli O55:B5 InvivoGen
SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain ThermoFisher Scientific S11368 5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes
SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain ThermoFisher Scientific S7578 1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes
Surface-Amps NP-40 Pierce 28324
Poly-D-Lysine coated coverslips neuVitro H-12-pdl 12 mm diameter
Anti-citrullinated histone H3 antibody Abcam Ab5103
Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments Jackson ImmunoResearch 111-007-003 Specificity: IgG (H+L)
Anti- Myeloperoxidase antibody Dako A0398
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) Life Technologies Corporation D1306

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6, (3), 173-182 (2006).
  2. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs. Nature Reviews Microbiology. 5, (8), 577-582 (2007).
  3. Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: Double-edged swords of innate immunity. The Journal of Immunology. 189, (6), 2689-2695 (2012).
  4. Czaikoski, P. G., et al. Neutrophil Extracellular Traps Induce Organ Damage during Experimental and Clinical Sepsis. PLoS One. 11, (2), e0148142 (2016).
  5. Dwivedi, D. J., et al. Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis. Critical Care. 16, (4), R151 (2012).
  6. Mai, S. H., et al. Delayed but not Early Treatment with DNase Reduces Organ Damage and Improves Outcome in a Murine Model of Sepsis. Shock. 44, (2), 166-172 (2015).
  7. Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Veterinary Immunology and Immunopathology. 168, (3-4), 262-268 (2015).
  8. Letendre, J. A., Goggs, R. Measurement of plasma cell-free DNA concentrations in dogs with sepsis, trauma, and neoplasia. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 27, (3), 307-314 (2017).
  9. Jeffery, U., Gray, R. D., LeVine, D. N. A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release. J Vis Exp. (117), (2016).
  10. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of Visualized Experiments. (36), (2010).
  11. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
  12. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, (2015).
  13. Li, R. H. L., Ng, G., Tablin, F. Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase. Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).
  14. Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
  15. Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207, (9), 1853-1862 (2010).
  16. Leshner, M., et al. PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures. Frontiers in Immunology. 3, 307 (2012).
  17. Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. Biochemistry. 45, (39), 11727-11736 (2006).
<em>In Vitro</em> Hundarnas neutrofila extracellulära fälla bildandet: Dynamiska och kvantitativ analys av fluorescensmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, R. H. L., Tablin, F. In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e58083, doi:10.3791/58083 (2018).More

Li, R. H. L., Tablin, F. In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e58083, doi:10.3791/58083 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter