Summary
该方案的目的是测量大鼠膝关节运动的扩展范围。各种疾病增加膝关节僵硬的影响和治疗的有效性可以量化。
Abstract
正常的膝盖运动范围 (rom) 对健康至关重要, 并允许一个人进行基本的活动, 如步行, 爬楼梯和坐。丢失的 rom 被称为关节收缩, 导致发病率上升。由于很难扭转已建立的膝关节收缩, 早期发现是重要的, 因此, 知道他们的发展的危险因素是必不可少的。由于大鼠膝关节解剖与人膝关节解剖相似, 大鼠能够承受弯曲时膝关节固定的长时间, 以及机械数据可以, 大鼠可以用这种模型研究干预的效果。与膝关节组织的组织学和生化分析有关。
我们使用自动关节仪, 演示了一种经过验证的、精确的、可重复的、与用户无关的方法来测量大鼠膝关节在特定扭矩下的扩展 rom。该关节仪可用于确定干预对大鼠膝关节 rom 的影响。
Introduction
关节有全范围的运动 (rom) 对健康和幸福至关重要1。在联合被动 rom 的损失叫收缩 2。关节收缩可能产生于多种情况, 包括长期卧床休息, 瘫痪, 关节置换术, 烧伤, 感染, 和神经疾病1,3,4,5。膝盖收缩可能会致残, 因为它会加速关节退化, 增加跌倒的风险, 并对一个人执行步行、坐着和爬楼梯等基本功能任务的能力产生不利影响.7。
一旦建立, 膝关节收缩是很难治疗, 因此, 确定哪些患者是在发展这种条件的最高风险是必不可少的预防和避免收缩相关的发病率8。实验被设计评估 1) 导致或影响膝关节收缩的情况, 2) 收缩的严重程度, 3) 他们的世俗进展, 4) 参与收缩的组织, (5) 他们的可逆性并且 (6) 有用性对膝关节 rom 的各种预防和治疗干预。对于所有这些实验, 有效的、客观的、精确的和可重复的 rom 测量方法至关重要。其他辅助措施 (能量消耗、组织形态测量、基因表达和蛋白质含量) 是了解关节收缩病理生理的有用标志, 但机械限制是限制患者并导致残疾的原因。在这一研究领域的一些挑战包括异质方法, 通过实验测试膝关节 rom, 以及缺乏定量数据9。使用各种不同的实验方法会产生从实验室到实验室都无法比较的结果。这引起了关于导致关节收缩的条件 (如固定或关节置换术) 的争议.因此, 需要一种在干预后进行实验测量关节 rom 的自动化方法。
在这里, 我们描述了一个用户独立, 有效, 精确和可重复的协议, 用于评估大鼠膝关节 rom 使用定制的关节计连接到数码相机, 以精确测量膝关节 rom 的扩展。我们测试了不同时期的固定对膝关节 rom 的影响。然后, 我们描述了使用固定的骨地标在预先指定的扭矩下测量生成的数字图像上的 rom 的方法。总体而言, 这些方法能可靠地测量大鼠膝关节 rom, 并提供定量数据。
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Protocol
所使用的大鼠膝盖固定模型已获得渥太华大学动物护理和兽医服务机构以及当地伦理委员会的批准。
1. 动物准备
- 在预定的固定时间结束时, 通过给老鼠排放二氧化碳来安乐死。
注: 在这里, 我们使用了一个固定模型与板和2个螺丝 (一个插入在股骨近端, 另一个在胫骨远端), 避免违反任何膝关节结构, 并保持膝盖弯曲的位置 135°, 如前面所述6.在一段时间内, 这会产生膝关节屈曲收缩 11. - 覆盖表面和周围的区域, 使证人花式计将放置在吸水, 防水保护垫。在完成实验时, 请戴上手套、实验室外套和护目镜。
- 使用手术刀, 分割皮肤, 露出板和螺丝 (参见步骤1.1 后面的说明);在股骨近端插入更多的近端螺钉, 并在胫骨远端插入更多的远端螺钉。触诊以找到螺钉。一旦可以接触到螺钉头, 请使用螺丝刀取出螺钉。
注: 在固定化期间, 螺钉的头部可能会被软组织覆盖。如果发生这种情况, 使用手术刀轻轻地取出组织, 并揭开螺钉头。 - 卸下螺钉后, 请手动取出板或使用解剖套件中的钳子。
- 使用剪刀和钳子, 脱牙下肢, 以去除皮肤从底层筋膜。
2. 汽车驱动的关节计上的动物定位
注: 所有测试应在室温下进行。在这里, 关节计是由一个标准的北美 120 v 输入供电。适配器输出为 12 v 和 500 ma。
- 将要测试的动物放在侧面, 实验腿 (要测试的腿) 朝上 (图 2)。
- 将股骨固定在集成到关节仪安装阶段的凹槽金属夹具中。用精密螺丝刀打孔穿过肌肉, 将夹子远端放置在更大的转子上, 并固定股骨。调整股骨外侧尖锐湿疣在关节器的旋转中心 (图 1, 2)。
- 将可移动的手臂放置在腿后面的两个立柱上, 只是优于跟骨骨, 一旦电动机启动, 就会将膝盖推入被动伸展。
- 用六角键拧紧股骨夹在其底部, 直到固定。
- 使用螺丝刀确保相机正确安装在关节仪表上, 并处于手动对焦。把相机的焦点放在股骨尖锐湿疣上。
- 根据所测试的膝盖 rom 的方向和大鼠的位置, 选择关节仪上的方向设置 (顺时针或逆时针)。
- 同时按下 "电源" 和"启动"按钮, 激活冲光仪电机。
注: 同时按下电源和启动按钮的必要性是设备的一个安全功能, 可防止意外激活。- 观察到, 关节计电机将以 6.6 rpm 的速度移动, 然后在达到第一个预设扭矩时停止 2.1 s。
- 注: 当达到第一个扭矩时, 相应的 led 将亮起, 数码相机将自动拍摄膝盖的照片。
注: 一旦拍摄的图片, 关节计将继续到下一个, 更高的预设扭矩。一旦四个扭矩被应用, 关节计将停止。一旦大鼠被放置在关节计上并开始测试, 单膝检测的总时间约为 18.8秒, 根据关节收缩的情况, 时间可能略有不同。所拍摄的图像用于测量每个扭矩的延伸。
3. 使用电机驱动的关节计捕捉膝关节伸长角
注: 一旦电机停止在每个应用的扭矩, 数码相机被触发拍照。相机位于框架上, 使其直接位于正在测试的膝关节上方, 并聚焦在股骨尖锐湿疣上。
- 继续用同一动物的相同膝盖进行测试, 但在不同的情况下,例如,在对后经关节肌肉进行切开术以隔离宫缩的关节源 (非肌肉) 成分后, 或与膝盖另一种动物。
- 完成切开术后, 解剖膝盖关节近端的肌肉, 以确保胶囊不被切割。
注: 这是最容易完成肌切开术时, 腿是在延长, 在应用扭矩设置 4 (17.53 n 厘米)。然后, 重复步骤2.1 到3.1。
- 完成切开术后, 解剖膝盖关节近端的肌肉, 以确保胶囊不被切割。
- 一旦两条腿在所有条件下 (例如,在切开术前后) 都进行了测试, 按照机构协议处置动物尸体和所有生物危险材料, 并清洁记录仪。
4. 膝关节 rom 测量分析
- 使用 imagej 分析 rom。
注: 这里使用了版本1.45。 - 打开包含安装在大鼠关节计上的相机拍摄的数字图像的文件。
注: 进行分析的人应该对动物的实验分组视而不见 (例如,固定与控制)。 - 从主工具栏中选择"角度" 工具, 并通过从股骨夹的中间绘制股骨线到外侧尖锐湿疣 (与股骨干线对齐,图 2) 和从外侧绘制胫骨线, 追踪股骨带角股骨尖锐湿疣到外侧锁骨 (图 2)。
注: 股骨胫骨角度对应于在每个预设扭矩下达到的膝盖伸长的最大角度。 - 通过单击"分析" 使用测量工具测量以显示上面绘制的2条线产生的计算角度。使用0°的约定表示完全扩展。
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Representative Results
总结了不同不动期确定的膝关节伸长量, 以增加不动的持续时间, 并表明在固定时间增加后, 会产生更严重的收缩。使用 imagej 的代表性结果如图 3所示。
能够以有效、精确和可重复的、独立于用户的方式测量大鼠膝盖的最大延伸, 从而减少数据中的偏差。在所提供的例子中, 我们评估了7只大鼠在固定4周后的最大膝关节伸长, 并将固定化 (实验) 肢体与非固定化对侧肢体进行了比较。选择固定的肢体从一只老鼠交替到另一只 (例如,大鼠1的右膝固定, 老鼠2左)。测量角度的调查员被蒙住了眼睛, 在测量过程中固定住了哪一边。结果如图 3所示。对于固定化的膝关节, 与对侧相比, 最大伸长的能力降低。关节肌肉的划分消除了屈曲收缩的肌原成分。切开术后, 实验和对侧膝关节的最大延伸能力增加;然而, 实验膝关节继续表现为屈曲收缩 (图 3)。
图 1:鼠膝盖关节仪。(a) 整个仪器 (b) 动物在关节计 (c) 电子显示器和夹紧中的动物代表图像。(d) 电子显示器的放大图像。数字表明所施加的各种扭矩: 扭矩 1 = 2.53 n 厘米, 扭矩 2 = 7.53 n 厘米, 扭矩 3 = 12.53 n 厘米, 扭矩 4 = 17.53 n 厘米. (e) 放大的股夹和胫骨推拿装置的图像。股骨夹具固定在舞台上。胫骨移动臂有2个直立的姿势, 固定远端下肢, 并将膝盖移动到伸展。箭头和雪佛龙分别表示股骨夹和可移动臂。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2:用于评估的是关节仪和实验性大鼠.(a) 后肢的膝关节伸长是使用从股骨外侧尖锐湿疣到外侧锁骨的胫骨线和从外侧尖锐湿疣到股骨夹块中部的股骨线测量的。箭头和雪佛龙分别表示股骨夹和可移动臂。(b) 股骨尖锐湿疣的高放大倍率图像和 (c) 外侧小腿的高放大倍率。
图 3: 固定化和对侧大鼠膝关节运动范围16周固定后.对于两个膝盖, 在测试了所有关节结构完整的膝盖伸长后, 对跨关节肌肉进行了切开术, 以确定 rom 上的关节素限制. 数据显示为完全伸展的平均程度 (使用约定 0° = 完全扩展), 误差条表示标准偏差。* 表示 p & lt; 0.01 使用独立样本 t 检验。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
开发了大鼠膝关节关节仪, 可重现、可靠地确定干预后大鼠膝关节的最大伸长率。该装置的优点包括在膝关节上持续产生扭矩, 手臂长度和延长力保持不变。另一个优势包括能够将扭矩设置在允许在同一关节上重复测试的水平, 以评估不同关节结构对膝关节 om 的影响, 如肌肉、胶囊或韧带。例如, 在对完全完整的关节进行测试后, 可以分割后关节膝关节肌肉, 重复使用关节造影仪测试, 以确定关节源性对伸展性限制 11的贡献。
用于优化测量精度和精度的关节计的特定机械特性包括沟槽夹具, 该夹具旨在防止股骨在测试过程中旋转 (图 1)。远端两个金属立柱向后接合腿部, 按顺时针方向将膝盖推入伸展, 并在测试过程中最大限度地降低股骨胫骨后脱位的风险 (图 1)。柱的高度和上直立连接的前悬垂确保胫骨不会从柱上滑落。直立柱的能力, 旋转和保持他们的位置胫骨只是近端的跟骨, 以确保恒定的扭矩。按顺序测试四个扭矩: 2.53 n 厘米、7.53 n 厘米、12.53 n 厘米和 17.53 n 厘米。最高扭矩水平被确定为导致正常 (未操作) 大鼠膝关节囊囊衰竭的力的量 (即,延伸超过 0°) 后, 所有的跨关节肌肉分裂。最低扭矩是正常大鼠膝关节的角度运动阻力点, 其阻力值略高于可测量量。中间的两个扭矩被设置为大约中间之间的最高和最低扭矩。
介绍了在特定扭矩下测量关节 rom 的其他方法, 包括12、13、14、15、16大鼠模型。与这些其他系统相比, 我们的型号的一些优势包括方便的尺寸, 允许设备的台式放置, 而不需要特殊的设施。其他模型也可能需要对正在研究的肢体进行分离, 而这里提出的模型则不需要。机械地, 柱的电弧路径应用延伸力的远端腿, 随着膝盖的角度进展, 从而保持一个一致的角度的力量应用。关节仪的阶段允许将整个大鼠放置在测量工具上, 允许测试所有可能导致丢失 rom 的原位关节结构, 而不会破坏关节解剖。虽然我们实验室的伦理协议排除了对活体动物的测试, 但这在理论上是可能的, 有适当的镇痛和测试后的牺牲协议。
关节仪确实存在一些缺点。该装置的尺寸为成年大鼠膝盖, 以确保可移动的手臂保持长度, 以确保它不会从腿上滑落, 腿也不会从手臂上滑落。年轻的老鼠, 或较小和较大的物种将受益于适当大小的成分。此外, 还需要对最佳力矩臂和力矩 (扭矩) 进行重新编程。例如, 如果使用了较大或较小的动物, 则可能需要调整力矩臂的长度和/或用于达到最佳扭矩的力的大小。关节仪的其他部分也可能需要根据动物的大小调整大小。虽然关节仪的运动是用户独立的, 但使用 imagej 的联合测量可能会受到人为错误的影响。然而, 我们发现, 使用这里提出的方法, 有较高的内拉和间度的可靠性, 内部相关系数分别为0.987 和0.987。由于在测试过程中, 最高扭矩通常会损坏关节结构, 因此很难确定关节计时器的有效间架具可靠性。为了避免可能与让多个调查员执行协议的这一部分相关的测量误差, 我们建议让相同的调查员在研究期间将老鼠固定在关节计上, 以便任何偏差在实验和控制膝盖。由于腿筋交叉膝关节和髋关节, 骨盆逆行可能发生在测试扭矩1和2之前的肌切开术。这可能有助于增加膝盖伸长的实验和控制膝盖在这些扭矩。最后, 结果可能与实际 rom 不同, 因为该协议是为测试安乐死而不是活体动物而开发的.
虽然我们描述了使用一个装置来评估不动对大鼠膝关节的影响, 也可以研究其他条件下影响关节 rom。有许多例子, 其中一些包括创伤的影响, 增加肌肉张力继发到中枢神经系统侮辱, 或与神经肌肉疾病相关的基因修改。此外, 还可以使用该设备评估相应的干预措施, 如干细胞应用于膝关节、神经肌肉连接阻滞或基因治疗, 以帮助发现新的治疗方案。
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Disclosures
作者没有要申报的披露或利益冲突。
Acknowledgments
作者要感谢 joao tomas 在该设备方面提供的技术援助, 并感谢 khaoula louati 在开发图像分析方法方面提供的协助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arthrometer | The Ottawa Hospital Rehabilitation Centre - Rehabilitation Engineering | N/A | |
| Camera | Canon | EOS-500D | Commonly known as EOS Rebel T1i |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.45s | |
| Absotbent Underpads | VWR | 820202-845 | |
| Dissection Kit | Fisher | 08-855 | Kit Includes: Forceps: medium points, nickel-plated Scissors: 1.5 in. (40 mm) blades, stainless steel Dissecting knife handle: nickel-plated Knife blades: stainless steel, pack of 3 Dropping pipet: glass Bent dissecting needle: stainless steel with plastic handle Straight dissecting needle: stainless steel with plastic handle Vinylite Ruler 6 in. (15 cm) |
| Precision Screw Driver | Mastercraft | 057-3505-8 | |
| Scalpel Blades - #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Screwdriver | Stanley | 057-3558-2 | |
| Hex Keys | Mastercraft | 058-9684-2 | |
| Universal AC to DC powder adapter | RCA | 108004951 |
References
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