Summary
Syftet med protokollet är att mäta förlängning rörelseomfång i råtta knäet. Effekterna av olika sjukdomar som ökar styvheten i knäleden och effektiviteten av behandlingar kan kvantifieras.
Abstract
Normala knä rörelseomfång (ROM) är kritisk till välbefinnande och gör att man kan utföra grundläggande aktiviteter såsom promenader, gå i trappor och sittande. Förlorade ROM kallas en ledkontrakturen och resulterar i ökad sjuklighet. På grund av svårigheten att vända etablerade knä kontrakturer, tidig upptäckt är viktigt, och därför veta riskfaktorer för deras utveckling är viktigt. Råttan representerar en bra modell som effekten av en intervention kan studeras på grund av likheten av råtta knäet anatomi till människor, råttans förmåga att tolerera långa räntebindningstider knä immobilisering i flexion, och eftersom mekaniska data kan korrelerade med histologisk och biokemisk analys av knä vävnad.
Använda en automatiserad arthrometer, visar vi en validerad, exakt, reproducerbara, användare-oberoende metod att mäta tillägget ROM av råtta knäleden på specifika vridmoment. Denna arthrometer kan användas för att avgöra effekterna av interventioner på knä gemensamma ROM hos råtta.
Introduction
Att ha full rörelseomfång (ROM) i lederna är avgörande för hälsa och välbefinnande1. En förlust i gemensamma passiv ROM kallas en kontraktur2. Gemensamma kontrakturer kan uppkomma flera villkor, inbegripet långvarig bedrest, förlamning, gemensamma Proteskirurgi, brännskador, infektion och neurologiska villkor1,3,4,5. En kontraktur i knäet kan inaktivera eftersom det påskyndar gemensamma degeneration, ökar risken för fall och negativt påverkar en persons förmåga att utföra grundläggande funktionella uppgifter inklusive promenader, sitta och klättra trappor6, 7.
När etablerad, kontrakturer i knäet är svåra att behandla, och därför fastställa vilka patienter löper störst risk att utveckla detta tillstånd är viktigt för förebyggande och undvikande av kontraktur-associerade sjuklighet8. Experiment är utformad för att utvärdera 1) villkor orsakar eller påverka knä gemensamma kontrakturer, 2) graden av kontrakturer, 3) deras temporal progression, 4) vävnaderna som är inblandade i kontrakturen, 5) deras reversibilitet samt 6) nyttan olika förebyggande och botande ingripandena på knä gemensamma ROM. För alla dessa experiment är en giltig, objektiva, exakt och reproducerbar metod för mätning av ROM kritisk. Andra kompletterande åtgärder (energiförbrukning, histomorphometry, gen uttryck och protein innehåll) är användbara markörer att förstå patofysiologin av gemensamma kontrakturer, men den mekaniska begränsningen är vad begränsar patienten och leder till funktionshinder. Några av utmaningarna inom detta forskningsområde innefattar heterogena metoder som knä ROM kan testas experimentellt, samt brist på kvantitativa data9. Användning av en mängd olika experimentella metoder leder till resultat som inte är jämförbara från laboratorium till laboratorium. Detta har lett till kontroverser angående de villkor (såsom immobilisering eller gemensamma Proteskirurgi) som orsakar gemensamma kontrakturer10. En automatiserad metod experimentellt mäta gemensamma ROM efter en intervention behövs därför.
Här beskriver vi ett användare-oberoende, giltig, exakt och reproducerbar protokoll för att utvärdera råtta knä ROM med hjälp av en specialbyggd arthrometer kopplad till en digital kamera att exakt mäta knä ROM i förlängning. Vi testat effekten av olika perioder av immobilisering på knä ROM. Sedan beskriver vi metoderna för att mäta ROM på förspecificerade vridmoment på digital bilderna med hjälp av fasta beniga landmärken. Sammantaget dessa metoder på ett tillförlitligt sätt mäta råtta knä ROM och tillhandahålla kvantitativa data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Rat knä immobilisering modellen används har godkänts av University of Ottawa Animal Care och veterinärmyndighetens och den lokala etiska kommittén.
1. animaliskt förberedelse
- I slutet av perioden förutbestämda immobilisering, avliva råttorna genom administrering av koldioxid.
Obs: Använde här vi en immobilisering modell med en platta och 2 skruvar (en sitter i proximala lårbenet och den andra i distala tibia), som undviker brott mot någon knä gemensamma strukturer, och upprätthåller en knä-böjd position av 135° som beskrivs tidigare6 . Över en tidsperiod ger detta en knä flexion kontraktur11. - Täck området både på och runt ytan som arthrometer kommer att placeras vid med absorberande, vattentät skydd kuddar. Bär handskar, laboratorierock och skyddsglasögon, medan du slutför experimentet.
- Med en skalpell, dela upp huden för att exponera plattan och skruvar (se noten följande steg 1.1). Infoga mer proximala skruven i proximala lårbenet och infoga mer distala skruven i distala tibia. Palpera för att lokalisera skruvarna. När över skruvhuvudena är tillgängliga, ta bort skruven med en skruvmejsel.
Obs: Under immobilisering, cheferna för skruvarna kan bli täckt av mjuk vävnad. Om detta inträffar, Använd skalpell att försiktigt ta bort vävnaden och avslöja över skruvhuvudena. - När skruvarna tas bort, ta bort plattan manuellt eller med hjälp av tången från en dissektion kit.
- Med sax och pincett, deglove nedre extremiteten för att ta bort huden från underliggande fascia.
2. djur som positionering på den motordrivna Arthrometer
Obs: All testning bör utföras vid rumstemperatur. Här drivs arthrometer av en standard nordamerikanska 120 V inspänning. Adapter utdata är 12 V och 500 mA.
- Placera djuret att testas på sin sida med experimentella benet (benet ska testas) uppåt (figur 2).
- Säkra lårbenet i räfflade metall klämman som är integrerade i montering scenen av arthrometer. Stansa hål genom muskeln med en precision skruvmejsel att placera klämman distalt ju större trochanter och säkra lårbenet. Justera den laterala femorala condylen över centrum av rotation av arthrometer (figur 1, 2).
- Ställning som rörliga arm med två upprätt inlägg bakom benet, bara överlägsen calcaneus, att driva knäet i passiv förlängning en gång elmotorn aktiveras.
- Dra åt lårbenet klämman vid sin bas med hjälp av en sexkantsnyckel tills det säkras.
- Se till att kameran är korrekt monterad på den arthrometer med en skruvmejsel och är på Manuell fokus. Fokusera kameran på den femorala condylen.
- Välj inställningen riktning på arthrometer (medurs eller moturs) beroende på riktningen av knäet ROM testas och positionen för råtta.
- Aktivera arthrometer motorn genom att samtidigt trycka knappen Power och Starta .
Obs: Nödvändigheten av att trycka på power och start knappen samtidigt är en säkerhetsfunktion för enheten, vilket förhindrar oavsiktlig aktivering.- Observera att arthrometer motorn kommer att flytta med en hastighet av 6,6 RPM och sedan sluta för 2.1 s när den når det första förinställda vridmomentet.
- Obs: att när första vridmomentet uppnås motsvarande LED tänds och den digitala kameran tar en bild av knäet automatiskt.
Obs: När bilden tas, arthrometer kommer att fortsätta till nästa, högre förinställda vridmoment. När de fyra vridmoment har tillämpats, kommer att arthrometer sluta. När råttan är placerad på arthrometer och testning inleds, är den totala tiden för att testa ett knä ca 18,8 s. gånger kan variera något beroende på ledkontrakturen tillstånd. Bilder tagna används för att mäta en förlängning på varje moment.
3. att fånga vinkeln på knä Extension använder den motordrivna Arthrometer
Obs: När motorn har stannat vid varje tillämpad vridmoment, utlöses en digital kamera för att ta en bild. Kameran är placerad på ramen så att det är direkt ovanför knäleden testas och fokuserade på den femorala condylen.
- Fortsätta att testa med samma knä från samma djur men i en annan situation, t.ex. efter en myotomy bakre transarticular muskler utförs för att isolera komponenten arthrogenic (icke-muskulära) av en kontraktur, eller med ett knä från ett annat djur.
- När du fyller den myotomy, dissekera muskeln nog proximalt knäleden att se till att kapseln inte klipps.
Obs: Det är enklast att slutföra den myotomy när benet är i tillägg, efter applicering av vridmoment inställning 4 (17.53 N-cm). Upprepa sedan steg 2.1 genom 3.1.
- När du fyller den myotomy, dissekera muskeln nog proximalt knäleden att se till att kapseln inte klipps.
- När båda benen har testats under alla förhållanden (t.ex. före och efter myotomy), kassera djurkropp och allt biologiskt material följande institutionella protokoll och rengör arthrometer.
4. knä ROM mätning analys
- Analysera ROM använder ImageJ.
Obs: Här version 1.45s användes. - Öppna filen som innehåller digitala bilden från kameran monterad på en råtta arthrometer.
Obs: Den person som utför analysen bör förblindas till experimentella gruppering av djuret (t.ex. orörlig kontra kontroll). - Välj vinkel verktyg från huvudverktygsfältet och spåra femorotibial vinkel genom att dra en femoral linje från mitten av lårbenet klämman till den laterala condyle (i linje med den femorala diaphysis, figur 2) och en tibial linje från lateralen femorala condyle till den laterala fotknölen (figur 2).
Obs: Femoro-tibial vinkel motsvarar maximal vinkel knä Extension nåddes vid varje förinställda vridmoment. - Använda mätverktyget genom att klicka analysera | Åtgärd att visa den beräkna vinkel som produceras av de 2 linjer dragna ovan. Använd konventionen av 0° betyder full utbyggnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mängden knä förlängning fastställas för olika perioder av orörlighet sammanfattas för att öka varaktighet av orörlighet och visa att mer allvarliga kontrakturer producerades efter ökande längder immobilisering. Representativa resultat använder ImageJ visas i figur 3.
Möjligheten att mäta maximal förlängning av råtta knän i ett giltigt, exakt och reproducerbar, användare-oberoende sätt som minskar bias i data. I exemplet förutsatt, vi utvärderat den maximala knä förlängning efter 16 veckors immobilisering för 7 råttor, jämföra den immobiliserade (experimentell) lem att icke-orörlig kontralaterala extremiteten. Lemmen valt för immobilisering växlat från en råtta till nästa (t.ex. 1 råtta hade höger knä orörlig, rat 2 till vänster). Prövaren mäta vinklarna var blind som sida var orörlig under mätningarna. Resultaten presenteras i figur 3. För immobiliserade knäet reducerades möjligheten för maximal förlängning jämfört med den kontralaterala. Uppdelningen av transarticular muskler eliminerar myogenic komponenten av flexionskontraktur. Efter myotomy, maximal förlängning kapacitet för experimentella och kontralaterala knäet ökade; experimentell knäet fortsatte dock att demonstrera en flexionskontraktur (figur 3).
Figur 1 : Rat knä arthrometer. (A) hela apparaten (B) representativ bild av djur inom arthrometer (C) elektronik display och klämmor för arthrometer. (D) förstorad bild av elektronik display. Siffrorna anger de olika vridmoment tillämpas: vridmoment 1 = 2,53 N-cm, vridmoment 2 = 7,53 N-cm, vridmoment 3 = 12,53 N-cm, vridmoment 4 = 17,53 N-cm. (E) förstorad bild av femorala klämman och tibial driftigt apparater. Den femorala klämman fast till scenen. Tibial rörliga armen har 2 upprätt inlägg som fixa distala nedre extremiteten och flytta knät till förlängning. Pilspets och chevron anger lårbenet klämman och den rörliga armen, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Arthrometer och experimentell råtta för utvärdering. (A) knä förlängning av bakre lemmen mäts med den tibial linje från den laterala femorala condylen till den laterala fotknölen och den femorala linje från den laterala condylen till mitten av lårbenet klämman. Pilspets och chevron anger lårbenet klämman och den rörliga armen, respektive. (B) hög förstoring bilder av femorala condyle och (C) hög förstoring av laterala fotknölen.
Figur 3 : Immobiliserade och kontralaterala råtta knä rörelseomfång efter 16 veckors immobilisering. För båda knäna, efter att ha testat knä förlängning med alla articular strukturer intakta (n = 7), en myotomy trans-artikulära muskler utfördes för att bestämma om arthrogenic begränsning av ROM. Data presenteras som genomsnittlig grader från full utbyggnad (med hjälp av den konventionen 0 ° = full utbyggnad) med felstaplar representera standardavvikelse. * representerar p < 0,01 i oberoende-samples T-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den råtta knä arthrometer utvecklades för att reproducibly och tillförlitligt avgöra maximal förlängning av råtta knät efter en intervention. Fördelarna med denna enhet är konsekvent generering av vridmoment över knäleden med en konstant arm längd och förlängning kraft. En annan fördel inkluderar möjligheten att ange vridmomentet på en nivå som tillåter upprepade tester på samma gemensamma att utvärdera påverkan av olika articular strukturer på knä ROM, såsom muskel, kapsel eller ligament. Exempelvis efter testning av den helt intakt gemensamt, bakre transarticular knä muskler kunde delas och arthrometer testning upprepade för att fastställa arthrogenic bidrag till förlängning begränsning11.
Specifika erbjuder mekaniska arthrometer som optimerar mätning noggrannhet och precision den räfflade klämma, som syftar till att förhindra rotation av lårbenet under testning (figur 1). De distala två metalliska upprätt inlägg engagera benet baktill, att trycka in knäet i extension i medurs riktning och minimera risken för bakre luxation av skenbenet på lårbenet under testning (figur 1). Höjden av inlägg och främre överhäng av länken övre upprätt säkerställa att skenbenet inte glider av inlägg. Förmågan hos de upprätt inlägg att rotera och behålla sin ställning på skenbenet strax proximalt till calcaneus säkerställer konstant vridmoment. Fyra moment är testade i sekvens: 2.53 N-cm, 7,53 N-cm, 12,53 N-cm och 17.53 N-cm. Högsta vridmoment fastställdes vara mängden kraft som ledde till kapsulära misslyckande i normal (unoperated) råtta knäleder (dvs förlängning som överträffar 0 °) efter uppdelningen av alla transarticular muskler. Det lägsta vridmomentet var punkten av resistens mot vinkelrörelser precis ovanför mätbara mängder på normala råtta knäleder. Den mellersta två vridmoment sattes vara ungefär halvvägs mellan den högsta och lägsta vridmoment.
Andra metoder för att mäta gemensamma ROM på specifika vridmoment har beskrivits för både råtta och andra djur modeller12,13,14,15,16. Några av fördelarna med vår modell över dessa andra system inkluderar en bekväm storlek som gör att bänkmonterade placering av enheten utan behov av särskilda faciliteter. Andra modeller kan också behöva amputera av lemmen studeras medan den modell som presenteras här inte. Mekaniskt, gäller överslag vägen av inlägget förlängning kraft distala benet, efter den kantiga progressionen av knäet, därmed upprätthålla en konsekvent vinkel av kraft program. Scenen av arthrometer tillåter placering av hela råttan på mätverktyget, möjliggör testning av alla i situ articular strukturer som kan bidra till förlorade ROM utan att bryta mot anatomi. Medan etik protokollet för vårt labb utesluter tester på levande djur, skulle detta vara teoretiskt möjligt med lämpliga analgesi och efter provningen att offra protokoll.
Arthrometer utgör vissa nackdelar. Enheten var storlek till vuxen råtta knäet att säkerställa att den rörliga armen var vid en längd så det inte skulle glida av benet och benet inte skulle halka av armen. Yngre råttor, eller mindre och större arter gynnas av passande storlek komponenter. Dessutom en omprogrammering av den optimala ögonblicket arm och kraft (vridmoment) skulle krävas. Om, till exempel en större eller mindre djur användes, kan det vara nödvändigt att justera längden på den stund arm eller mängden kraft som tillämpas för att nå optimalt vridmoment. Andra delar av arthrometer kan också behöva ändras, beroende på storleken på djuret. Medan arthrometer rörelser är användare-oberoende, kan gemensamma mätning använder ImageJ bli föremål för mänskliga fel. Vi har dock funnit att, använda de metoder som presenteras här, finns hög intra-rater och Inter rater tillförlitlighet med intraklass korrelationskoefficienterna 0,987 och 0,903, respektive. Eftersom det högsta vridmomentet skadar ofta articular strukturer under testningen, är en giltig mellan rater tillförlitlighet för djurens placering och aktivering av arthrometer svårt att avgöra. För att undvika mätfel som kan vara förknippade med att ha mer än en utredare utföra denna del av protokollet, rekommenderar vi att ha samma prövaren säkra råttorna till arthrometer för varaktigheten av en studie så att någon bias är konsekvent mellan experimentell och styra knän. Eftersom hamstrings passerar både knä- och höftleder, uppstå retroversion av bäckenet under provning på moment 1 och 2 före myotomy. Detta kan bidra till ökningar i knä extension för både experimentell och kontroll knän på dessa vridmoment. Slutligen, resultaten kan variera från sanna i vivo ROM som protokollet utvecklades för att testa euthanized snarare än levande djur.
Medan vi beskrivit användning av en enhet för att utvärdera effekterna av orörlighet på råtta knäleden, kunde andra sjukdomstillstånd i gemensamma ROM också studeras. I området i närheten finns det många exempel, av vilka några effekter av trauma, ökad muskeltonus som sekundärt till centrala nervsystemet förolämpning eller genetiska modifieringar avseende neuromuskulär sjukdom. Respektive insatser såsom stamceller ansökan till knäleden, neuromuskulära förbindelsen blockad eller gen terapi behandlingar som hjälper Upptäck nya behandlingsalternativ kunde också bedömas med hjälp av enheten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga upplysningar eller intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Joao Tomas för hans tekniskt bistånd med enheten och Khaoula Louati för hjälp med att utveckla analysmetoderna som bild.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arthrometer | The Ottawa Hospital Rehabilitation Centre - Rehabilitation Engineering | N/A | |
| Camera | Canon | EOS-500D | Commonly known as EOS Rebel T1i |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.45s | |
| Absotbent Underpads | VWR | 820202-845 | |
| Dissection Kit | Fisher | 08-855 | Kit Includes: Forceps: medium points, nickel-plated Scissors: 1.5 in. (40 mm) blades, stainless steel Dissecting knife handle: nickel-plated Knife blades: stainless steel, pack of 3 Dropping pipet: glass Bent dissecting needle: stainless steel with plastic handle Straight dissecting needle: stainless steel with plastic handle Vinylite Ruler 6 in. (15 cm) |
| Precision Screw Driver | Mastercraft | 057-3505-8 | |
| Scalpel Blades - #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Screwdriver | Stanley | 057-3558-2 | |
| Hex Keys | Mastercraft | 058-9684-2 | |
| Universal AC to DC powder adapter | RCA | 108004951 |
References
- Clavet, H., Hébert, P. C., Fergusson, D., Doucette, S., Trudel, G. Joint contracture following prolonged stay in the intensive care unit. Canadian Medical Association Journal. 178 (6), 691-697 (2008).
- Campbell, T. M., Dudek, N., Trudel, G. Essentials of Physical Medicine and Rehabilitation: musculoskeletal disorders, pain, and rehabilitation. Silver, J. K., Frontera, W. R., Rizzo, T. D. , Saunders. Ch. 126 (2015).
- Dehail, P., et al. Acquired deforming hypertonia and contractures in elderly subjects: definition and prevalence in geriatric institutions (ADH survey). Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 57 (3), 11-23 (2014).
- Korp, K., Richard, R., Hawkins, D. Refining the idiom "functional range of motion" related to burn recovery. Journal of Burn Care and Research. 36 (3), 136-145 (2015).
- Elliott, L., Walker, L. Rehabilitation interventions for vegetative and minimally conscious patients. Neuropsychological Rehabilitation. 15 (3-4), 480-493 (2005).
- Campbell, T. M., Reilly, K., Laneuville, O., Uhthoff, H., Trudel, G. Bone replaces articular cartilage in the rat knee joint after prolonged immobilization. Bone. 106, 42-51 (2017).
- Trudel, G., et al. Mechanical alterations of rabbit Achilles' tendon after immobilization correlate with bone mineral density but not with magnetic resonance or ultrasound imaging. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 88 (12), 1720-1726 (2007).
- Harvey, L. A., et al. Stretch for the treatment and prevention of contractures. Cochrane Database of Systematic Reviews. 1, Cd007455 (2017).
- Trudel, G., Himori, K., Uhthoff, H. K. Contrasting alterations of apposed and unapposed articular cartilage during joint contracture formation. Archives of Physical Medicine Rehabilitation. 86 (1), 90-97 (2005).
- Trudel, G., Uhthoff, H. K., Goudreau, L., Laneuville, O. Quantitative analysis of the reversibility of knee flexion contractures with time: an experimental study using the rat model. BMC Musculoskeletal Disorders. 15, 338 (2014).
- Trudel, G., Uhthoff, H. K. Contractures secondary to immobility: is the restriction articular or muscular? An experimental longitudinal study in the rat knee. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 81 (1), 6-13 (2000).
- Chimoto, E., Hagiwara, Y., Ando, A., Itoi, E. Progression of an arthrogenic motion restriction after immobilization in a rat experimental knee model. Upsala Journal of Medical Sciences. 112 (3), 347-355 (2007).
- Ando, A., et al. Remobilization does not restore immobilization-induced adhesion of capsule and restricted joint motion in rat knee joints. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 227 (1), 13-22 (2012).
- Abdel, M. P., et al. Effects of joint contracture on the contralateral unoperated limb in a rabbit knee contracture model: a biomechanical and genetic study. Journal of Orthopaedic Research. 30 (10), 1581-1585 (2012).
- Hildebrand, K. A., Sutherland, C., Zhang, M. Rabbit knee model of post-traumatic joint contractures: the long-term natural history of motion loss and myofibroblasts. Journal of Orthopaedic Research . 22 (2), 313-320 (2004).
- Klein, L., Player, J. S., Heiple, K. G., Bahniuk, E., Goldberg, V. M. Isotopic evidence for resorption of soft tissues and bone in immobilized dogs. Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 64 (2), 225-230 (1982).
