Summary
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול להבדיל מאתר granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T helper (THGM) תאים מתאי CD4 + T נאיביים, כולל בידוד תאי CD4 + T נאיבי, הבידול של THGM, ו- ניתוח של תאים THGM. בשיטה זו ניתן ליישם לימודי ההוראה ותפקוד תאי THGM.
Abstract
הגורם גרנולוציט-מקרופאג-המושבה-מגרה (GM-CSF)-ייצור תא T מסייע (THGM) היא תת-קבוצה תא מסייע T שזוהה בעיקר מפריש GM-CSF מבלי לייצר אינטרפרון (IFN) וγ או אינטרלוקין (IL)-17, נמצא לשחק תפקיד חיוני neuroinflammation אוטואימונית. שיטה של בידוד של תמים CD4 + T תאים מתא בודד השעיה של splenocytes ויצירת תא THGM מתאי CD4 + T נאיביים יהיה טכניקה שימושית במחקר של חסינות T תאית ומחלות אוטואימוניות. כאן נתאר שיטת מבדיל בין בעכבר נאיבי CD4 + T תאים לתאי THGM קידום על ידי IL-7. התוצאה של הבידול הוערכה על ידי הניתוח של הביטוי ציטוקינים באמצעות טכניקות שונות, כולל ציטוקין תאיים מכתים משולב עם cytometry זרימה, כמותיים בזמן אמת תגובת שרשרת פולימראזית (PCR), ו מבחני מקושרים-אנזים immunosorbent (אליסה). כ-55% של התאים באמצעות פרוטוקול בידול THGM כפי שמתואר כאן, הביע GM-CSF עם ביטוי מינימלי של IFNα או IL-17. הביטוי העיקרי של GM-CSF על-ידי תאי THGM אושר עוד יותר על ידי הניתוח של הביטוי של GM-CSF, IFNα ו- IL-17 ברמות ה-mRNA וגם חלבון. לכן, בשיטה זו ניתן להשתמש כדי להבדיל תמים CD4 + T תאים THGM תאי במבחנה, אשר יהיה שימושי במחקר של ביולוגיה של התא THGM.
Introduction
תאי CD4 + T helper (TH) הם מרכיבים חיוניים של המערכת החיסונית, יש תפקיד מכריע ההגנה מארח נגד חיידקים פתוגנים, מעקב סרטן, מחלת חיסון עצמי1,2,3. בעת הפעלת קולטן (TCR) תא T, תאי CD4 + T נאיבי יכול להיות מובחן TH1, TH2, TH 17, כתוצאה מתקנות או תאי T (Treg) תחת ההשפעה של ציטוקינים שונים milieus2,4, 5. לאחרונה, ערכה חדשה של תאי TH , המייצרת בעיקר GM-CSF, היה מזוהה, בשם THGM6. הבידול בתאי THGM מונעת על ידי IL-7 באמצעות הפעלת אות מתמר activator של שעתוק 5 (STAT5). תאים אלה אקספרס כמות גדולה של GM-CSF תוך ביטוי נמוך של אחרים TH-תא החתימה ציטוקינים כגון IFNγ ו- IL-176. GM-CSF נמצאה לשחק תפקיד קריטי בהתפתחות של CD4 + T תאית neuroinflammation7,8. בהשוואה ל IFNγ - או איל-17-לבטא autoreactive T תאים, GM-CSF-הבעת ' T תאים שהועברו אל פראי-סוג עכברים (WT) גרם של תחילת המחלה מוקדם יותר וחומרת המחלה גבוהה יותר. בנוסף, תאי T Csf2- / - נכשלה לזירוז ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה (EAE) לאחר להיות הועבר adoptively לנמענים WT, ואילו תאי T IFNγ או איל-17A שמר את היכולת לתווך EAE7. יתר על כן, מצור של GM-CSF באמצעות נוגדנים נטרול יושבחו חומרת המחלה EAE8. יתר על כן, מחסור של STAT5 בתאי T בעכברים הביא דור THGM מופחתת ו, לכן, ב התנגדות של העכברים EAE פיתוח6. ממצאים אלו מדגישים את החשיבות של תאי T GM-CSF-הבעת 'H neuroinflammatory חיסון למחלה. לפיכך, קביעת שיטה להבדיל בין תאי T GM-CSF-הבעת 'H מתאי CD4 + T נאיביים יהיה חשוב בחקר בפתוגנזה של neuroinflammation אוטואימונית ותגובות החיסון T תאית. עם זאת, פרוטוקול זה ביעילות מייצר תאי THGM מ מאתר תמים ש-cd4 + לא הוכח.
כאן אנו מציגים שיטה מבדיל בין תאי THGM מאתר מתאי CD4 + T נאיביים. פרוטוקול זה מתאר את כל התהליך, כולל החילוץ של הטחול מהעכבר, ההכנה של השעיה מתא בודד, הבחירה חיובי CD4, תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) לתא TH בידול וניתוח. התאים helper T הבדיל מנותחים על-ידי ציטוקינים תאיים מכתים משולב עם cytometry זרימה כדי לקבוע את הביטוי ציטוקין ברמה תא יחיד, מאת-אמת ה-PCR כמותי כדי לקבוע את הביטוי ציטוקין ברמת mRNA, ו מאת אליסה כדי להעריך את הביטוי ציטוקין ברמת חלבון. בשיטה זו ניתן להחיל מחקרים של ביולוגיה של התא THGM בתנאים שונים, כגון EAE, איפה GM-CSF ממלא תפקיד חשוב בפתוגנזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל העכברים המשמשים פרוטוקול זה היו על רקע גנטי C57BL/6, תחת תנאים מסוימים ללא הפתוגן באוניברסיטה הלאומית של סינגפור. כל הניסויים בוצעו באמצעות פרוטוקולים אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים שימוש הוועדה באוניברסיטה הלאומית של סינגפור.
1. מגיב והכנת חומרים
- הכנת 500 מ"ל תמיסת באגירה פוספט (PBS) המכיל 2% סרום שור עוברית (FBS) וחומצה ethylenediaminetetraacetic 1 מ מ (EDTA).
הערה: לשמור על המאגר על קרח לאורך כל התהליך לקבלת תוצאות אופטימליות. - להכין 50 מ של המדיה RPMI מלאה המכילה פניצילין-סטרפטומיצין RPMI 1640, 10% FBS ו- 1%. השתמש המדיה RPMI מלאה המכילה 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol עבור הבידול תא THGM. הוסף את β-mercaptoethanol בשכונה fume.
- הכן 7.5 mL של תערובת נוגדן anti-CD3e על ידי דילול מניות anti-CD3e מרוכז μg/mL 3 ב- PBS. מעיל 48-ובכן הצלחות על-ידי הוספת μL 150 של תערובת נוגדן מכל קידוח, דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה, או ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- לעקר את זוג מלקחיים ומספריים ולשמור אותם 70% אתנול בין והניתוחים.
2. הכנת מאתר Splenocytes
- המתת חסד העכבר (של בן 6-8 שבועות) באמצעות אישור כמוסד CO2 חנק או נקע בצוואר הרחם. לרסס את העכבר עם 70% אתנול והר זה על בלוק פוליסטירן על גבו. העבר את העכבר בטיחות ביולוגית בארון כדי להמשיך השלבים הבאים.
- להחזיק העור באמצעות זוג מלקחיים, לחתוך את העור מתחת כלוב הצלעות בצד שמאל כ 4 ס מ, בעזרת זוג מספריים. פתח את השק הצפק. לחשוף את הטחול ולהשתמש מלקחיים סטרילי כדי לחלץ את הטחול.
- מניחים מסננת תא 70 μm על שפופרת 50 מ ל, טרום רטוב זה עם 2 מ של המאגר. מניחים את טחולים על מסננת התא (2-3 טחולים עבור תא אחד מסננת), macerate אותם באמצעות סוף פומפה מזרק 5 מ.
- יש לשטוף את מסננת ואת התחתית מספר פעמים עם 1-2 מ ל תא בידוד מאגר עד כל התאים הם סמוקים לתוך הצינור. למחוק את מסננת תא, centrifuge את התאים ב x 350 גרם במשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
- Resuspend בגדר תא עם 5 מ של קרים (4 ° C) אמוניום כלוריד-אשלגן (ACK) lysing מאגר (NH 150 מ מ4קלרנית, KHCO 10 מ מ3, 0.1 מ מ נה2EDTA; pH 7.2-7.4) ומערבבים אותם בעדינות על 2 דק להוסיף 10 מ של מדיה RPMI מלאה כדי לנטרל את ג'ק מאגר, מיד centrifuge את התאים ב x 350 גרם במשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע לאחר צנטריפוגה.
3. בידוד של CD4 + T תאים באמצעות גרגרי CD4 מגנטי ועמודה ההפרדה תא
- Resuspend בגדר תא ב 5 מ של תא בידוד מאגר. לסנן את המתלים התא באמצעות מסנן הכנה להפרדות צבע (30 μm) לתוך צינור 15-mL החדש כדי להסיר את כל הלכלוך.
- לקחת 10 μL של התליה תא ולעשות לדילול 10 x על-ידי הוספת μL 90 המאגר. קח 10 μL של התליה תא מדולל, ערבב את זה עם 10 μL של trypan blue לספירת תאים. לספור התאים hemocytometer כדי לקבוע את התשואה של התאים קיימא.
- Centrifuge התאים ב x 350 גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C וזורקים את תגובת שיקוע.
- Resuspend תאי μL 90 מאגר לכל 107 תאים. להוסיף 10 μL של גרגרי CD4 מגנטי לכל 107 תאים. דגירה התאים למשך 15 דקות ב 4 º C. לקבלת תוצאות מיטביות, מערבבים התליה תא בעדינות כל 5 דקות בזמן הדגירה.
- בעוד התאים הם המקננת, במקום עמודה ההפרדה על הדוכן מגנטי. טרום רטוב את העמודה עם 2 מ של המאגר.
- בסוף הדגירה תא/חרוז, לשטוף את התאים עם 5 מ של המאגר, centrifuge אותם ב 350 x גרם במשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
- Resuspend תאי 1 מ"ל של המאגר, לטעון את הדגימה לתוך העמודה ההפרדה תא, תני לזה לזרום דרך. להשתמש שפופרת צנטרפוגה 15-mL כדי לאסוף את השבר תאי CD4. להוסיף 1 מ"ל של מאגר לשטוף המאגר לפני זה יבש. חזור על השלב כביסה 2 x.
- הסר את העמודה ההפרדה תא הדוכן מגנטי ומניחים אותו על שפופרת צנטרפוגה 15 mL החדש. להוסיף 2 מ"ל תא בידוד מאגר העמודה ההפרדה תא ולהחיל על הבוכנה בחוזקה כדי לאלץ את התאים מחוץ העמודה.
- Centrifuge את השבר ב x 350 גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C כדי להשיג תאי CD4 +. למחוק את תגובת שיקוע.
4. טיהור של תאי T CD4 + נאיבי (CD4+CD25–CD44הלאוCD62Lשלום) על ידי בידול THGM ומיון תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית
- Resuspend שהושג CD4 + תא בגדר ב 500 µL של המאגר. מערבבים את התאים עם תערובת נוגדנים מצומדת פלורסנט המכילה CD4-PerCp (2.8 µg/mL), CD44-APC (2.4 µg/mL), CD25-PE (2 µg/mL), ו- CD62L-FITC (10 µg/mL) (טבלה 1). דגירה התאים על קרח למשך 20-30 דקות, ולהגן עליהם מפני אור.
הערה: ריכוזי הנוגדנים אופטימציה בעבר במעבדה. המספר של נוגדנים הרשומים הוא עבור תאים של 1 – 2 עכברים. - לאחר הדגירה, לשטוף את התאים עם 5 מ של המאגר, centrifuge את התאים ב x 350 גרם במשך 5 דקות ב 4 º C.
- למחוק את תגובת שיקוע, resuspend תאי µL 500 המאגר. לסנן את התאים שוב באמצעות רשת ניילון.
- העברה התליה תא צינור FACS למיון התא. Precoat הצינורות FACS אוסף עם 500 µL של המאגר.
- להשיג CD4+CD25–CD44הלאוCD62Lשלום האוכלוסייה (של תמים CD4+ T תאים) על-ידי מיון FACS. שער-CD4+CD25– הראשונה ולאחר מכן בחר CD44הלאוCD62Lשלום תאים של אוכלוסייה זו.
- לאסוף נאיבי CD4+ T תא שברים לתוך שפופרת צנטרפוגה 15-mL החדש. Centrifuge התאים ב x 350 גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C וזורקים את תגובת שיקוע.
- Resuspend תאי CD4 + T נאיביים-ריכוז של 106 תאים למ"ל בתקשורת RPMI מלאה המכילה 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol.
- האחות נוגדנים anti-CD3e משמש precoating בצלחת 48-. טוב. זרע 0.25 מיליון תאים (250 µL) כל היטב עם איל-7 (2 ng/mL), אנטי-CD28 (1 µg/mL), אנטי-IFNγ (10 µg/mL) (טבלה 1).
הערה: ריכוזי ציטוקין נוגדנים אופטימציה בעבר במעבדה על הבחנה תא THGM. - תקופת דגירה התאים ב 37 ° C עם 5% CO2 של 3 ימים. אל תשנה את המדיום בתקופת הדגירה.
5. ניתוח של העכבר THGM התאים שנוצר במבחנה
- באמצעות מיקרוסקופ, בדוק את הבידול תא בתלת-ממד לאחר הבידול. לקצור את התאים, centrifuge אותם ב 350 x גרם במשך 5 דקות ב 4 º C. לשטוף את התאים 2 x עם מדיה RPMI מלאה.
הערה: תאים הם גדולה יותר תאי CD4 + T נאיביים. - Resuspend תאי 1 מ"ל של מדיה RPMI מלאה. לקחת 10 μL של השעיה תא ולערבב היטב עם μL 10 של trypan כחול כדי לקבוע את המספר הנייד עם hemocytometer. לחלק תאים שיקויים שלושה לרסטימולציה, ניתוח.
הערה: ציטוקין תאיים מכתים, אליסה מבחני לדרוש ≥0.5 מיליון תאים, ומחייב ניתוח qPCR ≥ 1 מיליון תאים. -
עבור ציטוקין תאיים מכתים, restimulate את התאים עם 13 12-פעילים phorbol-אצטט (PMA) (100 ng/mL), ionomycin (1 μg/mL) בנוכחות מעכב תחבורה חלבון (1 µL/mL) עבור 4-6 שעות.
- לקצור את התאים ואת תכתים אותם עם נוגדן anti-CD4 (PerCP-מצומדת, 0.2 מ"ג/מ"ל, דילול בטחונות; או מצומדת FITC, 0.5 מ"ג/מ"ל, דילול מטריים) למשך 30 דקות.
- לתקן את התאים μL 200 קיבוע מאגר למשך 20-60 דקות. לאחר הקיבעון, לשטוף את התאים 2 x 1 מ ל permeabilization מאגר.
- לבצע צביעת תאיים עם נוגדנים נגד GM-CSF (PE-מצומדת, 0.2 מ"ג/מ"ל, דילול מטריים), IL-17A (FITC-מצומדת, 0.5 מ"ג/מ"ל, דילול בטחונות; APC-conjugated, 0.2 מ"ג/מ"ל, דילול מטריים), IL-4 (APC-מצומדת, 0.2 מ"ג/מ"ל, דילול מטריים), ו- IFNγ (APC-מצומדת, 0.2 מ"ג/מ"ל, דילול בטחונות; PE-conjugated, 0.2 מ"ג/מ"ל, דילול מטריים) במשך 30 דקות בחושך.
- עבור ניתוח qPCR של ציטוקין בביטוי הגן על ידי תאים, להפעיל את התאים עם צלחת מכורך אנטי-CD3e (3 μg/mL) (precoating את הצלחת כפי שמתואר בשלב 1.3). ב-3 שעות לאחר הגירוי, לקצור את התאים כדי לבודד הכולל RNA באמצעות פנול RNA החילוץ ריאגנט להתכונן cDNA qPCR. צבעי יסוד ואת תוכנית המשמש את qPCR מוצגים לוחות 2 ו- 3, בהתאמה.
- לניתוח של הפרשת חלבונים ציטוקינים על ידי תאים, restimulate את התאים עם צלחת מכורך אנטי-CD3e (3 μg/mL) במשך 24 שעות ביממה (precoating את הצלחת כפי שמתואר בשלב 1.3). הקציר התרבות תא supernatant IL-17 ו- GM-CSF אליסה לקביעת ריכוזים שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תאי CD4 + T נאיבי מבודד שני בן שבוע 8 זכר C57BL/6 עכברים חולקו לשלושה חלקים. חלק אחד של התאים היה הבדיל לתאי THGM בעקבות הפרוטוקול המתואר. בחלק אחר היה תרבותי בתנאי THGM בנוכחות נוגדן anti-IL-4 (10 µg/mL) כדי לבחון את השפעת המצור IL-4 הבידול של THGM. החלק האחרון היה תרבותי בתנאי בידול 17 TH(3 µg/mL anti-CD3e נגד µg/mL 1-CD28..., 10 ננוגרם למ"ל TGFβ, 30 ננוגרם למ"ל IL-6, 10 µg/mL anti-IFNγ, µg 10/mL אנטי-IL-4). אחרי 3 ימים של בידול, התאים היו קוצרים, לרסטימולציה לנתח את הביטוי ציטוקין על ידי ציטוקינים תאיים מכתים, qPCR אליסה. תוצאות ציטוקין תאיים מכתים וניתוח FACS הדגימו כי כ-55% של תאים תרבותי תחת התנאי בידול THGM היו תאים GM-CSF-הבעת ' (איור 1 א'), ואילו רק כ- 2% של התאים הבדיל את THתחת תנאי 17 הביע GM-CSF. בנוסף, לעומת מצב בידול 17 THאשר נוצר והתאים המייצרים 17 IL 8.17%, התנאי בידול THGM רק הביא כ- 1% של תאים IL-17-הבעת '. תחת התנאים בידול שני שנבדקו, רק חלק קטן של תאי ביטא IFNγ (< 1%). יתר על כן, מספר תאי T IL-4-הבעת ' (< 1%) נראו בתרבות THGM או TH17 (איור 1B). התוצאות הראו כי שימוש התנאי בידול המתואר של תא THGM, יש לנו בהצלחה שנוצר בתאי T helper המבטאים בעיקר GM-CSF.
הבידול מוצלחת של תאי THGM אושר עוד יותר ע י תוצאות qPCRs, אליסה מבחני לבחון את הביטוי של GM-CSF, IL-17 ברמות ה-RNA וחלבון בתאים הבדיל. תאי THGM שנוצר היה ביטוי גבוה משמעותית של Csf2 אבל ביטוי נמוך יותר של Il17 בהשוואה TH17 תאים (איור 2 א). כפי שמוצג באיור 2B, חלבון GM-CSF זוהה supernatants התרבות של תאים 17 THGM ו- TH. למרות זאת, הריכוז GM-CSF בתרבות THGM supernatant היה על פי שלושה מזה של TH17 תאים. בנוסף, חלבונים של IL-17 (איור 2B), IFNγ ו- IL-4 היו לגילוי בתרבות תא THGM supernatant. כיוון RORγt זוהתה כגורם שעתוק מאסטר של TH17 תאים, תוך כדי STAT3, STAT5 הוכחו יש חשיבות רבה בפיתוח של TH17 ותאי THGM, בהתאמה, בדקנו את ה-mRNA שלהם ביטוי בתאים 17 THGM ו- TH. נמצא כי תאי THGM היה ביטוי נמוך משמעותית של Rorc וביטוי Stat5 גבוה יותר מאשר TH17 תאים (איור 3). מעניין, תאי THGM היה ביטוי מעט נמוך יותר (אך לא משמעותית) Stat3 של הגן לעומת THתאים 17. תוצאות אלו עולה כי למרות THGM ו- TH17 בידול נשלטים על ידי גורמים שונים תעתיק, הם עשויים לשתף כמה תכונות משותפות.
איור 1: THGM תאים בעיקר אקספרס GM-CSF. תאים 17 THGM ו- THנבצרו ביום השלישי לאחר הבידול. (A) עבור 5 שעות, התאים היו לרסטימולציה עם PMA ו ionomycin בנוכחות מעכב תחבורה חלבון. הביטוי של GM-CSF, IL-17, IFNγ נותחה על ידי ציטוקינים תאיים מכתים ואחריו cytometry זרימה. הביטוי (B) IL-4 ו- IFNγ על ידי TH17 או תאי THGM נותחו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: ביטוי של IL-17, IFNγ ו- GM-CSF ב TH17 ותאי THGM- התאים 17 THGM ו- THהיו קוצרים, לרסטימולציה עם צלחת מכורך anti-CD3e, 3 ימים לאחר הבידול. (א) תאים נבצרו לבודד RNA להכנה cDNA, 3 שעות לאחר הגירוי. הביטויים של Ifng, Il-17, Csf2 נקבעו על ידי PCR כמותי בזמן אמת (qPCR). (B) התרבות supernatant היה נקצרו 24 שעות לאחר הגירוי, כדי לקבוע את הריכוז של GM-CSF בתאי THGM, או תאים IL-17 ב- TH17, מאת אליסה. (* * p < 0.01, * * * p < 0.001.) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: Rorc, Stat3, ו Stat5 ביטוי גנים ב TH17 ותאי THGM- תאים 17 הבדיל GMHT ו- THנקטפו, restimulated עם צלחת מכורך anti-CD3e עבור 3 ה RNA הכולל היה מבודד כדי להכין cDNA. הביטויים Rorc, Stat3, Stat5 נקבעו על ידי qPCR. (* p < 0.05, * * p < 0.01; NS = לא משמעותי.) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| שם | ריכוז מניות | ריכוז בעבודה | דילול | נפח 500 μL מכתים מאגר |
| CD4-PerCp | 0.2 מ"ג/מ"ל | 2.8 μg/mL | 1:71 | 7 ΜL |
| CD44-APC | 0.2 מ"ג/מ"ל | 2.4 μg/mL | 1:83 | 6 ΜL |
| CD25-PE | 0.2 מ"ג/מ"ל | 2 μg/mL | בטחונות | 5 ΜL |
| CD62L-FITC | 0.5 מ"ג/מ"ל | 10 μg/mL | 1:50 | 10 ΜL |
| GM-CSF-PE | 0.2 מ"ג/מ"ל | 2 μg/mL | בטחונות | |
| IL-17A-FITC | 0.5 מ"ג/מ"ל | 5 μg/mL | בטחונות | |
| IL-17A-APC | 0.2 מ"ג/מ"ל | 2 μg/mL | בטחונות | |
| IFNΓ-APC | 0.2 מ"ג/מ"ל | 2 μg/mL | בטחונות | |
| IFNΓ-PE | 0.2 מ"ג/מ"ל | 2 μg/mL | בטחונות | |
| IL-4-APC | 0.2 מ"ג/מ"ל | 2 μg/mL | בטחונות | |
| CD4-FITC | 0.5 מ"ג/מ"ל | 5 μg/mL | בטחונות | |
| IL-7 | 20 μg/mL | 2 ng/mL | 1:10000 | |
| אנטי-CD28 | 0.5 מ"ג/מ"ל | 1 μg/mL | שבערך | |
| אנטי-IFNγ | 1 מ"ג/מ"ל | 10 μg/mL | בטחונות |
טבלה 1: השתמשו ציטוקינים, נוגדנים.
| פריימר | רצף | |
| Ifng קדימה | 5'-TCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAA-3' | |
| Ifng הפוך | 5'-TGGCTCTGCAGGATTTTCATG-3' | |
| Il-17 קדימה | 5'-CTCCAGAAGGCCCTCAGACTAC-3' | |
| Il-17 הפוך | 5'-AGCTTTCCCTCCGCATTGACACAG-3' | |
| Csf2 קדימה | 5'-TTTACTTTTCCTGGGCATTG-3' | |
| Csf2 הפוך | 5'-TAGCTGGCTGTCATGTTCAA-3' | |
| Rorc קדימה | 5'-TTTGGAACTGGCTTTCCATC-3' | |
| Rorc הפוך | 5'-AAGATCTGCAGCTTTTCCACA-3' | |
| Stat3 קדימה | 5'-TGGCCCTTTGGAATGAAGGGTACA-3' | |
| Stat3 הפוך | 5'-CACTGATGTCCTTTTCCACCCAAGT-3' | |
| Stat5 קדימה | 5'-TGCCCGGCTGGAACTACACCTT-3' | |
| Stat5 הפוך | 5'-ATGCCCCCGATTTCCGAGTCAC-3' | |
טבלה 2: צבעי יסוד qPCR.
| שלב | Temp. (° C) | זמן | אני חוזר | |
| 1 | 95 | 2 דקות | ||
| 2 | 95 | 3 s | ||
| 3 | 60 | 30 s | שלב 2 ו- 3, 39 פעמים | לקרוא את הצלחת |
| 4 | 65-95 | 5 s | בשלב 4, 30 פעמים, + 0.5 ° C כל חוזר | לקרוא את הצלחת |
טבלה 3: תוכנית ה-PCR כדי להעריך ביטוי גנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנחנו תיאר פרוטוקול בידול THGM במבחנה מתאי תמים CD4 + עכבר, ואחריו ניתוח של התאים הבדיל כדי לאמת את השיטה. ראוי לציין, הן הטחול ובלוטות הלימפה יכול לשמש עבור תמים CD4 + תא T טיהור ובידול THGM. הביטוי ציטוקין נקבעים על-ידי ציטוקינים תאיים מכתים בשילוב עם cytometry זרימה הראה כי כ-55% של התאים היו המושרה להיות GM-CSF-הבעת ' התאים בתנאי THGM (איור 1 א'). בהשוואה לתאי THבידול 17 בתנאי, התאים הבדיל בתנאי THGM הכלולים לרמת הרקע אוכלוסיה IL-17-הבעת '; אולם, בביטוי הגן il17 הוא לא יכול לזהות את qPCR (איור 2 א).
מעניין, למרות התוספת של נוגדן נטרול IFNγ, גילינו רמה נמוכה של Ifng ה-mRNA הביטוי TH17 והן תאי THGM, פחות מ 1% של תאי THGM היו תאים לבטא IFNγ. (מספרים 1 - 2). ניתן עקב כמות נוגדנים בנטרול IFNγ לא מספיק להשתמש. מצב THGM, או זיהום אפשרי של תאים חיסוניים מולדת (זה כמעט בלתי אפשרי להשיג 100% טהור תמים CD4 + T תאים) סיפק כמות עקבות של IL-12 לדור 1 תא THאפשרי. זה גם אפשרי כי התנאי THGM השתמשנו לא היה מסוגל לכבות לחלוטין שעתוק של Ifng. נתייחס בעיה זו בעתיד. למרות זאת, IFNγ חלבון לא זוהה supernatants התרבות של THGM או TH17 מאת אליסה.
בפרוטוקול המובאת כאן, שאנחנו משתמשים. רק נוגדן חסימה IFNγ יחד עם איל-7 על הבידול THGM. אחרי 3 ימים של בידול בתנאים האלה, יותר מ 50% של תאי ביטא GM-CSF, אבל לא איל-17, IL-4, או IFNγ (איור 1). בנוסף, הביטוי של Rorc, הגן זה מקודד RORγt, אשר הוא קריטי עבור בידול Th179, הייתה נמוכה יותר בצורה משמעותית בתאי THGM לעומת זאת TH17 תאים (איור 3). פרוטוקול זה היא, אפוא, שיטה יעילה יותר לדור של תאי T GM-CSF-מביע יותר אחר דיווח בעבר10. התוצאות שלנו הראה גם כי בנוסף טוהר תמים T תאים, IL-7 איתות, למניעת הבידול תא T לבטא IFNγ הוא מפתח לדור THGM.
הביטוי הדומיננטית של התאים GM-CSF נוצר באמצעות פרוטוקול המתואר הפגינו את הבידול מוצלחת של THGM. ברצוננו לציין כי האיכות של ציטוקינים, נוגדנים מחברות שונות או אפילו של קבוצות שונות של אותה חברה עשוי להיות שונה. לכן, אנו ממליצים כי המספר של ציטוקינים ו נוגדנים בשימוש T helper תאית התמיינות צריך להיבדק על מנת לברר את המצב האופטימלי.
לסיכום, תאי THGM נוצרו באמצעות פרוטוקול זה אקספרס רמה מינימלית של IL-17, IL-4, או IFNγ. אנו בטוחים כי פרוטוקול זה פועל היטב על מנת לייצר GM-CSF-הבעת ' THGM תאים בתוך חוץ גופית. בשיטה זו ניתן להשתמש כדי המשך מחקר הביולוגיה של תאי THGM בתנאים שונים כגון neuroinflammation אוטואימונית, כולל ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה (EAE) בעכברים ובבני אדם טרשת נפוצה, שם GM-CSF משחקת תפקיד חשוב בפתוגנזה11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענקים באוניברסיטה הלאומית לבריאות מערכת של סינגפור (T1-2014 Oct-12 ו T1-2015 Sep-10).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Biowest | L0500-500 | |
| FBS Heat Inactivated | Capricorn | FBS-HI-12A | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10 | Diluted to 1x PBS in sterile water |
| EDTA | 1st Base | BUF-1053-100ml-pH8.0 | |
| 10x ACK buffer | Biolegend | 420301 | diluted in sterile water |
| Cell strainer | SPL Life Sciences | 93070 | |
| CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T | |
| Centrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5810R | |
| Sony SY3200 cell sorter | Sony | Sony SY3200 cell sorter | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 210261 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| FACS tube | Corning | 352054 | |
| 24 well cell culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 | eBioscience | 46-0041-82 | |
| PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) | eBioscience | 12-0251-82 | |
| anti-human/mouse CD44 APC | eBioscience | 17-0441-82 | |
| anti-mouse CD62L FITC | eBioscience | 11-0621-85 | |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | 640010 | |
| Hyclone Trypan Blue Solution | GE healthcare Life Sciences | SV30084.01 | |
| microscope | Nikon | Nikon Elipse TS100 | |
| Purified anti-mouse CD3e antibody | Biolegend | 100314 | |
| Purified hamster anti-mouse CD28 | BD Biosciences | 553295 | |
| Purified Rat anti-mouse IFNγ | eBioscience | 16-7312-85 | |
| Purified anti-mouse IL-4 Antibody | Biolegend | 504102 | |
| Recombinant Mouse IL-7 Protein | R&D system | 407-ML | |
| recombinant human TGF-beta | R&D system | 240-B-010 | |
| PMA | Merck Millipore | 19-144 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| GolgiPlug protein transport inhibitor | BD Biosciences | 51-2301KZ | |
| Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| anti-mouse GM-CSF PE | eBioscience | 12-7331-82 | |
| FITC anti-mouse IL-17A | Biolegend | 506908 | |
| APC anti-mouse IFN-gamma | Biolegend | 505810 | |
| GO Taq qPCR master mix | Promega | A6002 | |
| mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! | invitrogen | 88-7334-88 | |
| Mouse IL-17A Uncouted ELISA | invitrogen | 88-7371-22 |
References
- Zhu, J., Paul, W. E. CD4 T cells: fates, functions, and faults. Blood. 112, 1557-1569 (2008).
- Kara, E. E., et al. Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity. PLoS Pathogens. 10, e1003905 (2014).
- Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. Tumor Immunology meets...Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells. Oncoimmunology. 6, e1356149 (2017).
- Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).
- Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).
- Sheng, W., et al. STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation. Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).
- Codarri, L., et al. RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation. Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).
- El-Behi, M., et al. The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF. Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126, 1121-1133 (2006).
- Zhang, J., et al. A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF. Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).
- Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage. Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).
