Summary
在这里, 我们提出了一种区分小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子产生的 t 型CD4+ t 细胞, 包括天真的 CD4+ t 细胞的分离, th基因的分化和差异性 TH基因细胞的分析。该方法可用于转基因细胞的调节和功能研究.
Abstract
粒-巨噬细胞集落刺激因子 (gm-csf) 生产的 t 帮助器 (tHGM) 细胞是一个新发现的 t 辅助细胞子集, 主要分泌的 GM-脑脊液不产生干扰素 (干扰素) γ或白细胞介素 (IL)-17, 并发现在自身免疫性 neuroinflammation 中起重要作用。从单纯的 CD4+ t 细胞中分离出单纯的脾和 tH基因 CD4+ t 细胞, 是研究 t 细胞介导免疫和自身免疫性疾病的有效方法。这里我们描述了一种方法, 将小鼠天真 CD4+ t 细胞与 IL-7 促进的 tH基因细胞区分开来。用不同的方法分析细胞因子的表达, 包括细胞内细胞因子染色结合流式细胞术、定量实时聚合酶链反应 (PCR), 对分化结果进行评估, 并酶联免疫吸附测定法 (ELISA)。根据这里所描述的 THgm 分化协议, 大约55% 的细胞表达了 IFNα或 IL-17 的最小表达。通过对基因型脑脊液、IFNα和 IL-17在 mRNA 和蛋白质水平上表达的分析, 进一步证实了转基因脑脊液的主要表达。因此, 该方法可用于体外诱导单纯 CD4+ t 细胞与 th基因细胞的分离, 对转基因细胞生物学研究有一定的参考价值。
Introduction
CD4+ (tH) 细胞是免疫系统的重要组成部分, 在宿主防御微生物病原体、癌症监测和自身免疫性1、2、3中具有重要作用。在 t 细胞受体 (TCR) 激活, 天真的 CD4+ t 细胞可以被区分为t h1,t h2, th 17, 或调节 t (Treg) 细胞在不同的细胞因子环境传道2,4,5. 最近, 发现了一种主要生产 gm-CSF 的 th细胞的新子集, 并命名为 gm6。IL-7 通过激活信号传感器和转录激活剂 5 (STAT5) 来驱动 THGM 细胞的分化。这些细胞表达了大量的 GM-脑脊液, 同时低表达其他 TH细胞特征因子, 如 IFNγ和 IL-176。在 CD4+ T 细胞介导的 neuroinflammation7、8的发展中, 基因型脑脊液被发现发挥了关键作用。与 IFNγ或 IL-17-expressing 自身反应性 t 细胞相比, 转基因脑脊液表达 t 细胞转移到野生型 (小鼠) 导致早期疾病发作和更高的疾病严重性。此外, Csf2细胞没有诱导实验性自身免疫脑脊髓炎 (EAE) 后被过继转输转移到脑细胞受体, 而缺乏 IFNγ或 IL-17A 的 T 淋巴细胞保留了调解 EAE7的能力。此外, 使用中和抗体对 GM-CSF 的封锁改善了 EAE 疾病严重程度8。此外, 小鼠 t 细胞中 STAT5 的缺失导致了转基因一代的减少, 因此, 在小鼠对 EAE 发展6的抵抗力。这些发现强调了 GM-脑脊液表达 TH细胞在自身免疫性 neuroinflammatory 疾病中的重要性。因此, 建立一种从天真的 CD4+ t 细胞中鉴别 GM-脑脊液表达 tH细胞的方法, 对于研究自身免疫 neuroinflammation 和 T 细胞介导的免疫应答的发病机制具有重要意义。然而, 从小鼠天真的 CD4+ 有效地产生 TH基因电池的协议尚未建立。
在这里, 我们提出了一种方法, 区分小鼠 tHGM 细胞从天真的 CD4+ t 细胞。该协议描述了整个过程, 包括从小鼠中提取脾脏、单细胞悬浮液的制备、CD4 阳性选择、荧光活化细胞分选和 TH细胞。分化和分析。用细胞内细胞因子染色结合流式细胞仪对分化的 T 辅助细胞进行分析, 以确定单细胞水平的细胞因子表达, 采用定量实时 PCR 方法测定 mRNA 水平的细胞因子表达, 并通过 ELISA 对蛋白质水平的细胞因子表达进行评估。该方法可应用于 EAE 等不同条件下的转基因细胞生物学研究中, 其在发病机制中起着重要作用。
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Protocol
所有在本议定书中使用的老鼠都是在 C57BL/6 的遗传背景下, 并被安置在新加坡国立大学特定的无病原体条件下。所有实验都使用新加坡国立大学机构动物保育和使用委员会批准的协议进行。
1. 试剂和材料制备
- 制备500毫升磷酸盐缓冲盐水 (PBS), 含2% 胎牛血清 (血清) 和1毫米乙二胺四乙酸 (EDTA)。
注意: 在整个过程中保持缓冲区在冰的最佳效果。 - 准备50毫升完整的 RPMI 培养基, 含有 RPMI 1640, 10% 的血清和1% 青霉素-链霉素。使用包含50µM β巯基乙醇的完整 RPMI 培养基进行 THGM 细胞分化。在通风罩中加入β巯基乙醇。
- 通过将 anti-CD3e 浓缩的库存稀释到 PBS 中的3微克/毫升, 制备7.5 毫升的 anti-CD3e 抗体混合物。涂层48井板材通过增加 150 ul 抗体混合物对每个井和孵化板材在37°c 至少 1 h, 或者在4°c 隔夜。
- 消毒一双剪刀和镊子, 并保持他们在70% 的乙醇夹层解剖。
2. 小鼠脾的制备
- 弄死老鼠 (6–8周老) 使用一个制度上批准的 CO2窒息或颈椎脱位。用70% 乙醇喷雾鼠标, 并将其装在其背面的聚苯乙烯块上。将鼠标转移到生物安全柜, 以执行以下步骤。
- 用一把钳子握住皮肤, 用一把剪刀将左侧肋骨下面的皮肤切开4厘米。打开腹膜囊露出脾脏, 用无菌钳提取脾脏。
- 在50毫升管上放置一个70微米的细胞过滤器, 用2毫升的缓冲器将其预湿。将脾放在细胞过滤器上 (2–3脾一个细胞滤网), 并浸渍使用5毫升注射器柱塞的末端。
- 将过滤器和管多次冲洗成细胞隔离缓冲器, 直到所有细胞都冲入管内。丢弃细胞过滤器和离心细胞在 350 x g 5 分钟在4摄氏度。放弃上清。
- 并用重悬5毫升冷 (4 °c) 氯化铵-钾 (ACK) 株溶藻缓冲器 (150 毫米 NH4氯) 的细胞颗粒; 10 毫米 KHCO3, 0.1 毫米 Na2EDTA; pH 7.2–7.4), 并将其轻轻地混合为2分钟. 添加10毫升完整的 RPMI 介质以中和应答缓冲, 并立即离心细胞在 350 x g 5 分钟在4摄氏度。离心后要丢弃上清液。
3. 用磁性 CD4 微珠和细胞分离柱分离 CD4+ T 细胞
- 并用重悬细胞颗粒在5毫升细胞隔离缓冲。用预分离过滤器 (30 微米) 将细胞悬浮物过滤成新的15毫升管以去除任何碎片。
- 采取 10 ul 的细胞悬浮, 并作出10x 稀释通过增加 90 ul 的缓冲。取 10 ul 的稀释细胞悬浮, 并混合它与 10 ul 的台盼蓝的细胞计数。计数 hemocytometer 中的细胞以确定存活细胞的产量。
- 离心细胞在 350 x g 5 分钟在4°c 和放弃上清。
- 并用重悬细胞在 90 ul 的缓冲每 107细胞。添加 10 ul 磁性 CD4 微珠每 107细胞。在4摄氏度孵化细胞15分钟。为获得最佳效果, 在孵化过程中, 每5分钟轻轻混合一次细胞悬浮。
- 当细胞孵化时, 在磁性支架上放置一个分离柱。用2毫升的缓冲器预湿柱。
- 在细胞/珠孵化结束时, 用5毫升的缓冲液冲洗细胞, 在4摄氏度时将其离心在 350 x g处5分钟。放弃上清。
- 并用重悬1毫升的缓冲细胞, 将样品装入细胞分离柱中, 让它流过。使用15毫升离心管收集 CD4 细胞分数。添加1毫升的缓冲液, 在干燥之前将其冲洗干净。重复洗涤步骤2x。
- 从磁支架中取出单元分离柱, 将其放在新的15毫升离心管上。将2毫升的细胞隔离缓冲器添加到细胞分离柱上, 并将柱塞牢固地应用于将细胞从柱上强行取出。
- 离心率为 350 x克5 分钟, 在4摄氏度, 以获得 CD4+ 细胞。放弃上清。
4. 荧光活化细胞分选和 THCD4+ 纯化天真的 CD4+CD25-CD44螺CD62Lhi)
- 并用重悬在500µL 缓冲液中获得 CD4+ 细胞颗粒。将细胞与含有 CD4-PerCp (2.8 µg/毫升)、CD44-APC (2.4 µg/毫升)、CD25-PE (2 µg/毫升) 和 CD62L-FITC (10 µg/毫升) 的荧光共轭抗体混合物 (表 1) 混合。在冰上孵化细胞以 20–30 min, 同时保护它们不受光照。
注意: 抗体的浓度在实验室中进行了优化。所列出的抗体的数量是来自于小鼠的细胞。 - 孵化后, 用5毫升的缓冲液冲洗细胞, 将细胞在 350 x g处进行离心处理, 在4摄氏度时进行5分钟。
- 丢弃上清液, 并用重悬500µL 的细胞。使用尼龙网格再次过滤单元格。
- 将细胞悬浮液转移到用于细胞分类的转流管。涂型了500µL 缓冲器的采集器管。
- 通过 CD4 的分类,获得 CD25CD44 CD62Lhi种群 (天真 CD4+ T 细胞)。门在 CD4+CD25-首先, 然后选择 CD44 CD62Lhi细胞从这个人群。
- 将天真的 CD4和 T 细胞分数收集成一个新的15毫升离心管。离心细胞在 350 x g 5 分钟在4°c 和放弃上清。
- 并用重悬在含有50µM β巯基乙醇的完整 RPMI 培养基中, CD4+ 的浓度为 106细胞/毫升的天真的 T 细胞。
- 在48井板中吸入用于预涂的 anti-CD3e 抗体。种子 25万 (250 µL) 细胞在每个井与 IL-7 (2 ng/毫升), anti-CD28 (1 µg/毫升), 和反 IFNγ (10 µg/毫升) (表 1)。
注意: 细胞因子和抗体的浓度在实验室中被优化为 THGM 细胞分化。 - 孵化细胞在37°c 与 5% CO2 3 天。在孵化过程中不要改变培养基。
5. 小鼠 T 型转基因细胞体外生成的分析
- 用显微镜检查细胞分化后 3 d 的分化。收获细胞和离心他们在 350 x g 5 分钟在4摄氏度。用完整的 RPMI 介质冲洗细胞2x。
注意: 分化细胞的大小比天真的 CD4+ T 细胞大。 - 并用重悬1毫升完整的 RPMI 培养基中的细胞。采取 10 ul 的细胞悬浮和混合它与 10 ul 的台盼蓝, 以确定的细胞数与 hemocytometer。将分化的细胞分成三药剂进行 restimulation 和分析。
注: 细胞内细胞因子染色和 ELISA 检测需要≥0.5 百万细胞, qPCR 分析需要≥100万细胞。 -
为细胞内细胞因子染色, restimulate 细胞与佛波 12-酯 13-醋酸盐 (100 ng/毫升) 和 ionomycin (1 微克/毫升) 存在蛋白质转运抑制剂 (1 µL/毫升) 为第4-6 h。
- 用 anti-CD4 抗体 (PerCP 共轭, 0.2 毫克/毫升, 1:100 稀释; 或 FITC 共轭, 0.5 毫克/毫升, 1:100 稀释), 以30分钟的方法收割细胞并染色。
- 用 200 ul 固定缓冲细胞固定20–60分钟。固定后, 用1毫升的通透缓冲液冲洗细胞2x。
- 对 GM 脑脊液 (PE 共轭, 0.2 毫克/毫升, 1:100 稀释), IL-17A (FITC 共轭, 0.5 毫克/毫升, 1:100 稀释) 抗体进行细胞内染色;apc 共轭, 0.2 毫克/毫升, 1:100 稀释), IL-4 (apc 共轭, 0.2 毫克/毫升, 1:100 稀释), 和 IFNγ (apc 共轭, 0.2 毫克/毫升, 1:100 稀释;PE 共轭, 0.2 毫克/毫升, 1:100 稀释) 在黑暗中30分钟。
- qPCR 分析分化细胞的细胞因子基因表达, 激活细胞与板块绑定 anti-CD3e (3 微克/毫升) (预涂的板块, 如步骤1.3 所述)。在刺激后3小时, 利用苯酚 RNA 萃取试剂, 采集细胞以分离总 RNA, 为 qPCR 制备 cDNA。用于 qPCR 的引物和程序分别列在表 2和3中。
- 为分析分化细胞的细胞因子蛋白分泌, restimulate 细胞与板块约束 anti-CD3e (3 微克/毫升) 为 24 h (预涂的板块, 如步骤1.3 所述)。收获细胞培养上清 IL-17 和 GM-脑脊液 ELISA, 以确定其浓度。
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Representative Results
从两个8周大的雄性 C57BL/6 小鼠中分离出的朴素 CD4+ T 细胞分为三部分。在描述的协议之后, 细胞的一部分被区分成 THGM 细胞。另一部分是在 thgm 条件下培养的 anti-IL-4 抗体 (10 µg/毫升), 以测试 IL-4 封锁的影响, 在分化的 thgm。最后一部分是培养在 TH17 分化条件 (3 µg/毫升 anti-CD3e, 1 µg/毫升 anti-CD28, 10 ng/毫升 TGFβ, 30 ng/毫升 IL-6, 10 µg/毫升反 IFNγ, 10 µg/毫升 anti-IL-4)。经过3天的分化后, 细胞被收获和 restimulated, 通过细胞内细胞因子染色、qPCR 和酶联免疫吸附因子的表达进行分析。细胞内细胞因子染色和外磁场分析结果表明, 55% 的培养细胞在 TH基因的分化条件下是 gm-脑脊液表达细胞 (图 1A), 而只有约2% 的细胞区别在 TH17 情况下表达了 GM 脑脊液。此外, 与产生 8.17% IL-17-producing 细胞的 th17 分化条件相比, thGM 分化条件只导致约1% 的 IL-17-expressing 细胞。在两种分化条件下测试, 只有一小部分细胞表达 IFNγ (< 1%)。此外, 很少有 IL-4-expressing t 细胞 (< 1%) 被发现在 thGM 或 th17 文化 (图 1B)。这些结果表明, 利用所描述的 tHgm 细胞分化条件, 我们成功地产生了 t 帮助细胞主要表达的 gm-脑脊液。
qPCRs 和 ELISA 检测结果进一步证实了 THgm 细胞的成功分化, 研究了基因型脑脊液和 IL-17 在分化细胞中 RNA 和蛋白质水平的表达。生成的 thGM 细胞具有明显较高的Csf2表达, 但Il17比 Th17 细胞更低的表达 (图 2A)。如图 2B所示, 在上清液和 th17 细胞的培养中发现了gm-脑脊液蛋白。然而, 转基因-脑脊液浓度在 thgm 文化上清是大约三个在 th17 细胞。此外, IL-17 (图 2B)、IFNγ和 IL-4 的蛋白质在 THGM 细胞培养上清液中是无法检测到的。由于 RORγt 已被确定为 th17 细胞的主转录因子, 而 STAT3 和 STAT5 在 th17 和 th基因细胞的发展中已经被证明是非常重要的, 我们检查他们的 mRNA表达在 thGM 和 th17 细胞。发现 thGM 细胞的Rorc表达明显低于 th17 细胞 (图 3). 有趣的是, thGM 细胞与 th17 细胞相比, Stat3基因的表达略低 (但不显著)。这些结果表明, 虽然 thGM 和 th17 的分化受不同的转录因子的制约, 他们可能会分享一些共同的特点。
图 1: THgm 细胞主要表达了转基因脑脊液.转基因和 th17 细胞在3天的分化后收获。(A) 5 小时, 在蛋白转运抑制剂的存在下, 细胞与 restimulated 和 ionomycin。采用细胞内细胞因子染色和流式细胞术对 IL-17、IFNγ的表达进行分析。(B) 分析了 th17 或 thGM 细胞的 IL-4 和 IFNγ表达。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: IL-17、IFNγ和 gm-脑脊液在 th17 和 thgm 细胞中的表达.在分化后3天, restimulated 和 th17 细胞被收获并与板块束缚的 anti-CD3e。(A) 在刺激后3小时, 采集细胞以分离 RNA 进行 cDNA 制备。Ifng、 Il-17和Csf2的表达由定量实时 PCR (qPCR) 确定。(B) 在刺激后24小时收获培养液, 用 ELISA 法测定 th型 gm 细胞中的 gm-脑脊液浓度, 或 IL-17 17 细胞中的 t。(** p < 0.01, ** p < 0.001。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: Rorc、Stat3和Stat5基因在 th17 和 thGM 细胞中的表达.用 anti-CD3e 17 细胞进行了分化的 th型 GM 和 th的 restimulated, 并以3小时的总 RNA 分离制备 cDNA。Rorc、 Stat3和Stat5表达由 qPCR 决定。( p < 0.05, ** p < 0.01;NS = 不重要。请单击此处查看此图的较大版本.
| 名字 | 库存浓度 | 工作浓度 | 稀释 | 容量在 500 ul 染色缓冲器 |
| CD4-PerCp | 0.2 毫克/毫升 | 2.8 微克/毫升 | 1:71 | 7 ul |
| CD44-APC | 0.2 毫克/毫升 | 2.4 微克/毫升 | 1:83 | 6 ul |
| CD25-PE | 0.2 毫克/毫升 | 2微克/毫升 | 1:100 | 5 ul |
| CD62L-FITC | 0.5 毫克/毫升 | 10微克/毫升 | 1:50 | 10 ul |
| 通用-CSF-PE | 0.2 毫克/毫升 | 2微克/毫升 | 1:100 | |
| IL-17A-FITC | 0.5 毫克/毫升 | 5微克/毫升 | 1:100 | |
| IL-17A-APC | 0.2 毫克/毫升 | 2微克/毫升 | 1:100 | |
| IFNγ-APC | 0.2 毫克/毫升 | 2微克/毫升 | 1:100 | |
| IFNγ-PE | 0.2 毫克/毫升 | 2微克/毫升 | 1:100 | |
| IL-4-APC | 0.2 毫克/毫升 | 2微克/毫升 | 1:100 | |
| CD4-FITC | 0.5 毫克/毫升 | 5微克/毫升 | 1:100 | |
| IL-7 | 20微克/毫升 | 2 ng/毫升 | 1:10000 | |
| Anti-CD28 | 0.5 毫克/毫升 | 1微克/毫升 | 1:500 | |
| 抗 IFNγ | 1毫克/毫升 | 10微克/毫升 | 1:100 |
表 1: 使用的细胞因子和抗体。
| 底漆 | 序列 | |
| Ifng向前 | 5 '-TCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAA-3 ' | |
| Ifng反向 | 5 '-TGGCTCTGCAGGATTTTCATG-3 ' | |
| Il-17向前 | 5 '-CTCCAGAAGGCCCTCAGACTAC-3 ' | |
| Il-17反向 | 5 '-AGCTTTCCCTCCGCATTGACACAG-3 ' | |
| Csf2向前 | 5 '-TTTACTTTTCCTGGGCATTG-3 ' | |
| Csf2反向 | 5 '-TAGCTGGCTGTCATGTTCAA-3 ' | |
| Rorc向前 | 5 '-TTTGGAACTGGCTTTCCATC-3 ' | |
| Rorc反向 | 5 '-AAGATCTGCAGCTTTTCCACA-3 ' | |
| Stat3向前 | 5 '-TGGCCCTTTGGAATGAAGGGTACA-3 ' | |
| Stat3反向 | 5 '-CACTGATGTCCTTTTCCACCCAAGT-3 ' | |
| Stat5向前 | 5 '-TGCCCGGCTGGAACTACACCTT-3 ' | |
| Stat5反向 | 5 '-ATGCCCCCGATTTCCGAGTCAC-3 ' | |
表 2: qPCR 底漆。
| 步 | 临时。°C | 时间 | 重复 | |
| 1 | 95 | 2分钟 | ||
| 2 | 95 | 1 1 | ||
| 3 | 60 | 三十年代 | 步骤2和 3, 39 次 | 阅读板 |
| 4 | 65–95 | 5 s | 步骤 4, 30 次, + 0.5°C 每次重复 | 阅读板 |
表 3: PCR 方案评估基因表达。
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Discussion
在这里我们描述了一个从小鼠天真的 CD4+ 细胞的体外TH基因分化的协议, 其次是对分化细胞的分析, 以验证该方法。注意, 脾脏和淋巴结均可用于幼稚的 CD4+ t 细胞纯化和 tH基因的分化。细胞内细胞因子染色与流式细胞术相结合的细胞因子表达表明, 在 gm (图 1A) 下, 约有55% 的神经细胞被诱导成为 gm-脑脊液表达细胞。与 th17 分化条件下的细胞相比, 在 thGM 条件下分化的细胞含有 IL-17-expressing 种群的背景水平;然而, il17基因的表达是不可检测的 qPCR (图 2A)。
有趣的是, 尽管添加了 IFNγ中和抗体, 我们发现在 th17 和 thgm 细胞中的Ifng mRNA 表达水平较低, 而不到1% 的 thgm 细胞 IFNγ表达细胞。(图 1 - 2)。这可能是由于在 THGM 条件中使用的 IFNγ中和抗体量不足, 或可能对先天免疫细胞造成的污染 (几乎不可能获得100% 纯天真的 CD4+ T 细胞), 提供了微量的 IL-12为可能的 TH1 细胞世代。也有可能, 我们使用的 THGM 条件无法完全关闭Ifng的转录。我们将在今后讨论这个问题。然而, IFNγ蛋白在上清液和 th17 的培养中没有发现。
在这里提出的协议, 我们只使用了 IFNγ阻断抗体和 IL-7 的 THGM 分化。经过3天的分化, 在这种情况下, 超过50% 的细胞表达了 GM-CSF, 但不是 IL-17, IL-4, 或 IFNγ (图 1)。此外, Rorc的表达, 编码 RORγt 的基因, 这是关键的 Th17 分化9, 在 thGM 细胞相比, th17 细胞 (图 3) 明显低。因此, 这项议定书是一种更有效的方法来生成 GM-脑脊液表达 T 细胞比另一报告以前10。实验结果还表明, 除了单纯的 t 细胞和 IL-7 信号的纯度外, 防止 IFNγ表达 t 细胞分化是转基因基因生成的关键.
使用所述的协议生成的 gm-脑脊液细胞的主要表达显示了转基因 T 的成功分化.我们想指出的是, 来自不同公司, 甚至来自同一公司的不同批次的细胞因子和抗体的质量可能不一样。因此, 我们建议对 T 辅助细胞分化中使用的细胞因子和抗体的数量进行测试, 以找出最佳的条件。
总之, 使用此协议生成的 THGM 单元表示 IL-17、IL-4 或 IFNγ的最小水平。我们相信, 该协议能很好地在体外生成 gm-CSF 表达 TH基因细胞。该方法可用于在自身免疫性 neuroinflammation (EAE) 小鼠和人多发性硬化等各种条件下进一步研究 THgm 细胞的生物学特性, 其中重要角色在发病机制11。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到新加坡国立大学卫生系统 (T1-2014 Oct-12 和 T1-2015 Sep-10) 赠款的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Biowest | L0500-500 | |
| FBS Heat Inactivated | Capricorn | FBS-HI-12A | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10 | Diluted to 1x PBS in sterile water |
| EDTA | 1st Base | BUF-1053-100ml-pH8.0 | |
| 10x ACK buffer | Biolegend | 420301 | diluted in sterile water |
| Cell strainer | SPL Life Sciences | 93070 | |
| CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T | |
| Centrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5810R | |
| Sony SY3200 cell sorter | Sony | Sony SY3200 cell sorter | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 210261 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| FACS tube | Corning | 352054 | |
| 24 well cell culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 | eBioscience | 46-0041-82 | |
| PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) | eBioscience | 12-0251-82 | |
| anti-human/mouse CD44 APC | eBioscience | 17-0441-82 | |
| anti-mouse CD62L FITC | eBioscience | 11-0621-85 | |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | 640010 | |
| Hyclone Trypan Blue Solution | GE healthcare Life Sciences | SV30084.01 | |
| microscope | Nikon | Nikon Elipse TS100 | |
| Purified anti-mouse CD3e antibody | Biolegend | 100314 | |
| Purified hamster anti-mouse CD28 | BD Biosciences | 553295 | |
| Purified Rat anti-mouse IFNγ | eBioscience | 16-7312-85 | |
| Purified anti-mouse IL-4 Antibody | Biolegend | 504102 | |
| Recombinant Mouse IL-7 Protein | R&D system | 407-ML | |
| recombinant human TGF-beta | R&D system | 240-B-010 | |
| PMA | Merck Millipore | 19-144 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| GolgiPlug protein transport inhibitor | BD Biosciences | 51-2301KZ | |
| Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| anti-mouse GM-CSF PE | eBioscience | 12-7331-82 | |
| FITC anti-mouse IL-17A | Biolegend | 506908 | |
| APC anti-mouse IFN-gamma | Biolegend | 505810 | |
| GO Taq qPCR master mix | Promega | A6002 | |
| mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! | invitrogen | 88-7334-88 | |
| Mouse IL-17A Uncouted ELISA | invitrogen | 88-7371-22 |
References
- Zhu, J., Paul, W. E. CD4 T cells: fates, functions, and faults. Blood. 112, 1557-1569 (2008).
- Kara, E. E., et al. Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity. PLoS Pathogens. 10, e1003905 (2014).
- Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. Tumor Immunology meets...Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells. Oncoimmunology. 6, e1356149 (2017).
- Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).
- Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).
- Sheng, W., et al. STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation. Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).
- Codarri, L., et al. RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation. Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).
- El-Behi, M., et al. The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF. Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126, 1121-1133 (2006).
- Zhang, J., et al. A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF. Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).
- Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage. Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).
