Summary
ここで、ナイーブ cd4 陽性 T 細胞、THGM の分化の分離を含む、ナイーブ cd4 陽性 T 細胞からマウスの granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T (THGM) ヘルパー細胞を区別するためにプロトコルを提案し、THGM の分化した細胞の解析。このメソッドは、規制の研究と THGM 細胞の機能に適用できます。
Abstract
顆粒球マクロファージ ・ コロニー刺激因子 (GM-CSF)-(THGM) ヘルパー T 細胞の生産は主にインターフェロン (IFN) γ やインターロイキン (IL)-17 を伴わず GM-CSF を分泌して認められる新たに同定された T のヘルパー細胞サブセット自己免疫 neuroinflammation で重要な役割を果たします。脾細胞の単一細胞懸濁液からナイーブ cd4 陽性 T 細胞および THGM セル生成ナイーブ cd4 陽性 T 細胞からの分離の方法は、T 細胞性免疫や自己免疫疾患の研究に有用な技術でしょう。ここで IL-7 によって促進される THGM セルにマウス ナイーブ cd4 陽性 T 細胞を区別する方法をについて説明します。細胞内サイトカイン染色、フローサイトメトリー、量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) の組み合わせを含む、さまざまなテクニックを用いたサイトカイン発現の解析によって評価された分化の結果、酵素抗体法 (ELISA)。THGM 分化プロトコルをここで前述の使用細胞の約 55% はインターフェロンや IL 17 の最小表現と GM-CSF を表現しました。THGM 細胞に GM-CSF の優勢な式は、GM-CSF、インターフェロン、IL-17 mRNA とタンパク質レベルでの発現解析によってさらに確認されました。したがって、このメソッドは T にナイーブ cd4 陽性 T 細胞を区別するために使用できるHGM 細胞の in vitro、THGM 細胞生物学の研究に有用となります。
Introduction
ヘルパー (TH) cd4 T 細胞、微生物病原体に対する生体防御、癌サーベイランスおよび自己免疫1,2,3重要な役割を持つ免疫システムに不可欠なコンポーネントです。T 細胞受容体 (TCR) 活性化 THTH2 1 ナイーブ cd4 陽性 T 細胞が分化することができます、異なるサイトカイン ミリュー2,4,の影響の下で T (Treg) 細胞を TH 17、または規制5します。 最近、GM-CSF を主に生産、新しい THセルのサブセットを特定され、THGM6の名前。THGM 細胞の分化は、信号変換器の活性化と転写 5 (STAT5) の活性化を介して IL-7 によって駆動されます。これらの細胞は他の T のHの低発現しながら GM-CSF の大量を表現-署名サイトカイン肝腎と IL-176などを携帯します。GM-CSF cd 4 + T 細胞を介した neuroinflammation7,8の開発に重要な役割を果たすことがわかった。肝腎- または IL-17-を表現する自己反応性 T 細胞と比較して、GM CSF 表現 T 細胞、野生型に転送 (WT) マウス以前の発症および重症度高いです。また、 Csf2-/- T 細胞は WT の受信者に転送される利用後実験的自己免疫性脳脊髄炎 (EAE) を誘導するために失敗しました肝腎や IL 17A 欠けて T 細胞 EAE7を仲介する能力を保持するのに対し。また、中和抗体を用いた GM-CSF の封鎖は EAE 病重症度8を改善しました。さらに、マウスの T 細胞に STAT5 の欠乏は、EAE 開発6に減少 THGM 世代と、それゆえ、マウスの抵抗を起因しました。これらの調査結果は、自己免疫性アミロイド疾患における GM CSF 表現 TH細胞の重要性を強調します。したがって、ナイーブ cd4 陽性 T 細胞から GM CSF 表現 TH細胞を区別する方法を確立する自己免疫 neuroinflammation と T 細胞を介した免疫反応の機序の解明に重要となります。しかし、プロトコルを効率的にセルを生成する THGM マウス ナイーブ cd4 が確立されていないから。
ナイーブ cd4 陽性 T 細胞からマウスの THGM 細胞を区別する方法をご紹介します。このプロトコルはマウスから脾臓の抽出、TH細胞蛍光活性化セル (FACS) を並べ替え、CD4 の正の選択単一細胞懸濁液の準備などを含む全体の手順を記述します。微分法と解析。差別化されたヘルパー T 細胞は、細胞内サイトカインの mRNA レベルでのサイトカインの発現を決定する定量的リアルタイム PCR による単一細胞レベルでのサイトカインの発現をフローサイトメトリーと組み合わせて染色によって分析されるとタンパク質レベルでのサイトカインの発現を評価するために ELISA によるこのメソッドは、惹起、GM-CSF が病因に重要な役割を果たしているなど、様々 な条件の下で THGM 細胞生物学の研究に適用できます。
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Protocol
このプロトコルで使用されるすべてのマウス C57BL/6 遺伝的背景、シンガポール国立大学で特定の病原体フリーの条件の下に収容します。動物介護制度とシンガポール国立大学の利用委員会によって承認されたプロトコルを使用してすべての実験を行った。
1. 試薬および材料の準備
- リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 2% ウシ胎児血清 (FBS) と 1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を含む 500 mL を準備します。
注: は、最適な結果を得るのための全体の手順の中で氷の上バッファーを保持します。 - RPMI 1640、10 %fbs、および 1% のペニシリン-ストレプトマイシンを含む完全な RPMI メディアの 50 mL を準備します。50 μ M β-メルカプトエタノール THGM 細胞分化を含む完全な RPMI メディアを使用します。ヒューム フードの β-メルカプトエタノールを追加します。
- 抗 CD3e 抗体の混合物の 7.5 mL を準備するには、3 μ g/ml PBS に反 CD3e 集中して株式を希釈します。コート 48 ウェル プレートの各ウェルに抗体の混合物の 150 μ L の追加によって、少なくとも 1 時間、37 ° C、4 ° C のプレートを一晩インキュベートします。
- ハサミとピンセットのペアを殺菌し、解剖間 70% エタノールでそれらを保ちます。
2. 脾細胞の調製
- (6-8 週齢) のマウスを安楽死させる制度が承認した CO2窒息または頚部転位を使用します。マウスを 70% エタノール スプレーし、その裏にポリスチレン ブロックでそれをマウントします。マウスを次の手順を続行するキャビネットの生物学的安全に転送します。
- ピンセットのペアを使用して肌を押し、はさみのペアを使用して、約 4 cm の左側に胸郭の下の皮膚をカットします。脾臓を公開、脾臓を抽出し滅菌鉗子を使用して腹膜嚢を開きます。
- 50 mL のチューブに 70 μ m の細胞ストレーナーを配置し、2 mL のバッファーぬれる前。セル ストレーナー (1 つのセルのストレーナーの脾臓 2-3) に脾臓を配置し、5 mL シリンジのプランジャーのエンドを使用してそれらを漬け込みます。
- チューブにすべてのセルがフラッシュされるまで、ストレーナーとチューブ 1-2 mL の細胞分離バッファーを数回をすすいでください。セル ストレーナーを破棄し、4 ° C で 5 分間 350 x gで細胞を遠心分離上清を捨てます。
- 風邪 (4 ° C) アンモニウム塩化物-カリウム (ACK) 溶解バッファー (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM ナ2EDTA; pH 7.2-7.4) の 5 mL の細胞ペレットを再懸濁し、優しく ACK を中和するために完全な RPMI メディアの 2 分を追加 10 mL でそれらをミックスバッファーに格納し、すぐに 4 ° C で 5 分間 350 x gで細胞を遠心遠心分離後、上清を破棄します。
3. 分離の cd4 陽性 T 細胞の CD4 磁気ビーズと細胞分離カラムを使用して
- 5 mL の細胞分離バッファーで細胞ペレットを再懸濁します。任意の残骸を削除する新しい 15 mL チューブに事前色分解フィルター (30 μ m) を用いた細胞懸濁液をフィルター処理します。
- 細胞懸濁液の 10 μ L を取り、バッファーの 90 μ L の追加によって 10 倍希釈を行います。希薄化後の細胞懸濁液の 10 μ L を取るし、トリパン ブルーのセルをカウントするための 10 μ L を混ぜます。生菌の収量を決定する検定のセルをカウントします。
- 4 ° C で 5 分間 350 x gで細胞を遠心分離し、上澄みを廃棄します。
- 10 の7セルごとのバッファーの 90 μ L で細胞を再懸濁します。10 の7セルごと CD4 マイクロ磁気ビーズの 10 μ L を追加します。4 ° C で 15 分間細胞をインキュベートします。最適な結果を得るには、インキュベーション中に 5 分に優しく細胞懸濁液を混ぜます。
- 一方、細胞の培養は、マグネット スタンドに分離カラムを配置します。中古ウェット 2 mL のバッファーの列。
- セル/ビーズ インキュベーションの最後には、5 mL のバッファーを持つ細胞を洗浄し、4 ° C で 5 分間 350 × gで遠心分離機のこと上清を捨てます。
- バッファーの 1 mL の細胞を再懸濁します、細胞分離カラムにサンプルをロードし、それを通過します。15 mL 遠心管を使用して、CD4 細胞画分を収集します。1 mL の乾燥する前にタンクを洗浄するバッファーを追加します。2 倍洗浄手順を繰り返します。
- マグネット スタンドから細胞分離カラムを削除し、新しい 15 mL 遠心管の上に置きます。細胞分離カラムに 2 mL の細胞分離バッファーを追加し、列のセルを強制的にしっかりとプランジャーを適用します。
- Cd4 陽性細胞を取得する 4 ° C で 5 分間 350 x gで分数を遠心します。上清を捨てます。
4. ナイーブ cd4 陽性 T 細胞の浄化 (CD4+CD25-CD44loCD62Lこんにちは) 蛍光活性化細胞選別と THGM 分化によって
- 500 μ L のバッファーで得られた cd4 細胞ペレットを再懸濁します。セルを混ぜて CD4 PerCp を含んでいる蛍光色素標識された抗体の混合物 (2.8 μ g/mL)、CD44 APC (2.4 μ g/ミリリットル), CD25 PE (2 μ G/ml) と CD62L FITC (10 μ G/ml) (表 1)。光から保護しつつ、20-30 分間氷の上のセルを孵化させなさい。
注: 抗体の濃度は、実験室で以前最適化しました。記載されている抗体の数は 1-2 マウス細胞です。 - 、孵化後 5 mL のバッファーを持つ細胞を洗浄し、4 ° C で 5 分間 350 x gで細胞を遠心分離
- 上澄みを廃棄し、バッファーを 500 μ l 添加の細胞を再懸濁します。ナイロン メッシュを使用して再度セルをフィルター処理します。
- 細胞選別の FACS チューブに細胞懸濁液を転送します。バッファーの 500 μ L でコレクション FACS チューブをプレコートします。
- 取得、CD4+CD25-CD44loCD62Lこんにちは人口 (ナイーブ cd4 陽性の+ T 細胞) FACS を並べ替えて。CD4 のゲート+CD25-最初のそして [CD44loCD62Lこんにちは細胞この人口から。
- ナイーブ cd4 陽性を収集+ T 細胞分画の新しい 15 mL 遠心管に。4 ° C で 5 分間 350 x gで細胞を遠心分離し、上澄みを廃棄します。
- 50 μ M β-メルカプトエタノールを含む完全な RPMI メディアで 10 の6セル/mL の濃度でナイーブ cd4 陽性 T 細胞を再懸濁します。
- プレコートボルトメック 48 ウェル プレートで使用される抗 CD3e 抗体を吸い出しなさい。IL-7 の各ウェルの種子 25 万 (250 μ L) セル (2 ng/mL)、抗 CD28 (1 μ G/ml) と抗肝腎 (10 μ G/ml) (表 1)。
注: サイトカインと抗体の濃度を以前 THGM 細胞分化の演習に最適化しました。 - 3 日間 5% CO2と 37 ° C でセルを孵化させなさい。孵化の間に媒体を変更しないでください。
5. マウス THGM 細胞解析体外生成
- 分化した細胞分化 3 d 顕微鏡を使用して、チェックしてください。セルを収穫し、4 ° C で 5 分間 350 × gで遠心分離機のこと2 セルを洗浄して完全な RPMI メディアで x。
注: 分化した細胞は、ナイーブ cd4 陽性 T 細胞よりもサイズが大きい。 - 完全な RPMI メディアの 1 mL の細胞を再懸濁します。細胞懸濁液の 10 μ L を取るし、トリパン ブルー診断とセルの数を決定するの 10 μ L とよく混ぜます。メモリセル再刺激と分析のための 3 つのポーションに分化した細胞を分割します。
注: 細胞内サイトカイン染色、ELISA アッセイが必要 ≥0.5 百万セルと qPCR 分析 ≥ 100 万セルが必要です。 -
細胞内サイトカイン染色、ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) の細胞を再び刺激 (100 ng/mL) とタンパク質輸送阻害剤 (1 μ L/mL) 4-6 h の存在下でイオノマイシン (1 μ g/mL)。
- セルを収穫し、それらを抗 CD4 抗体で染色 (PerCP 標識、0.2 mg/mL、1: 100 希釈; または FITC 結合 0.5 mg/mL、1: 100 希釈) 30 分間。
- 20-60 分固定バッファーの 200 μ L にセルを修正します。固定後、洗浄セル 2 透過バッファーの 1 ml x。
- IL 17A (FITC 結合 0.5 mg/mL、1: 100 希釈; GM-CSF (PE 共役 0.2 mg/mL、1: 100 希釈) に対する抗体と細胞内染色を実行します。APC-conjugated、0.2 mg/mL、1: 100 希釈)、IL-4 (APC 共役 0.2 mg/mL、1: 100 希釈)、および肝腎 (APC 共役 0.2 mg/mL、1: 100 希釈。PE-conjugated、0.2 mg/mL、1: 100 希釈) 暗闇の中で 30 分間。
- 、分化した細胞がサイトカイン遺伝子発現の qPCR の分析 (プレコート板手順 1.3 で説明した) プレート連結アンチ CD3e (3 μ g/mL) が付いているセルをアクティブにします。刺激後 3 h で、qPCR の cDNA を準備するフェノール RNA 抽出試薬を使用して総 RNA を分離する細胞を収穫します。プライマーと、qPCR 用プログラムは、それぞれ表 2 3に表示されます。
- 分化した細胞によって分泌蛋白質の分析のため 24 h (プレコート板 1.3 のステップで説明したよう) のプレート連結アンチ CD3e (3 μ g/mL) で細胞を再び刺激します。IL-17 と GM-CSF ELISA の濃度を決定するための培養上清中の細胞培養を収穫します。
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Representative Results
2 つの 8 週齢雄 c57bl/6 マウスから分離したナイーブ cd4 陽性 T 細胞は、3 つの部分に分けられました。セルの 1 つの部分だった説明されたプロトコルを次 THGM 細胞へと分化します。別の部分を THGM の分化における IL 4 封鎖の影響をテストする抗 IL 4 抗体 (10 μ G/ml) の存在下で THGM 条件下で培養しました。最後の部分を (3 μ g/mL 抗 CD3e 1 μ g/mL 抗 CD28 10 ng/mL TGFβ、30 ng/mL IL 6、10 μ G/ml アンチ-肝腎、10 μ g/mL 抗 IL-4) TH17 分化条件下で培養しました。分化の 3 日後、細胞収穫, 細胞内サイトカイン染色、qPCR、ELISA、よみがえってサイトカイン発現を分析する.細胞内サイトカイン染色および FACS 解析の結果を示した THGM 分化条件下で培養された細胞の約 55% が GM CSF 発現細胞 (図 1 a) に対し約 2% の細胞17 条件表現、GM-CSF THの下で区別されます。さらに、8.17% IL 17 産生細胞を生成する TH17 分化条件と比較して、THGM 分化状態をもたらしただけ IL 17 発現細胞の約 1%。テスト 2 分化の条件下で細胞の小さい一部分だけは肝腎を表現 (< 1%)。さらに、いくつかの IL-4 表現する T 細胞 (< 1%) THGM または TH17 文化 (図 1 b) に見られました。これらの結果は、こと説明 THGM 細胞分化状態を使用して、正常に生成した GM-CSF を主に表現する T のヘルパー細胞を示した。
THGM 細胞の正常な分化は、qPCRs からの結果によって確認されたさらに、GM-CSF と IL-17 分化細胞の RNA とタンパク質レベルでの発現を調べる ELISA の試金。生成された THGM セルCsf2の有意に高い発現がIl17のはるかに低い式に比べて TH17 細胞 (図 2 a)。図 2 bに示すように、THGM と TH17 細胞から培養上清中 GM CSF 蛋白質が検出されました。それにもかかわらず、THGM 培養上清中の GM-CSF 濃度については TH17 で三重のセル。さらに、イリノイ-17 (図 2 b)、肝腎、IL 4 の蛋白質は THGM 細胞培養上清中に検出されなかった。以来、RORγt は TH17 のマスター転写因子として同定されている細胞、STAT3、STAT5 がそれぞれ TH17 やHGM の T 細胞の開発に大きい重要性を持っている示されている、その mRNA を調べたTHGM と TH17 細胞で発現。THGM セルRorc発現が有意に低いと TH17 より高いStat5表現があったことが分られた細胞 (図 3)。興味深いことに、THGM セルが若干低い (しかし重要ではない) 式Stat3遺伝子に比べて TH17 細胞。これらの結果は示唆が THGM と TH17 分化は、異なる転写因子によって支配される、いくつかの共通の機能を共有することがあります。
図 1: THGM 細胞主に特急 GM-CSF 。THGM と TH17 細胞の分化後 3 日目に収穫されました。(A) 5 h のセルは PMA とタンパク質輸送阻害剤の存在下でイオノマイシンよみがえっていた。GM-CSF, イリノイ-17 と肝腎の発現は細胞内サイトカイン染色 cytometry 流れ続いてによって分析されました。TH17 または THGM 細胞 (B)、IL-4 と肝腎の発現解析を行った。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: IL 17、肝腎、および TH17 と THGM 細胞に GM-CSF 発現。THGM と TH17 細胞は収穫され、よみがえってプレート バインド対策-CD3e と分化後 3 日。(A) セルを cDNA 作製、刺激後 3 h の RNA を隔離する収穫されました。量的なリアルタイム PCR (qPCR) によりIfng、 Il 17、およびCsf2の式を求めた。(B) 培養上清は THGM 細胞に GM-CSF の濃度を決定するため、刺激後 24 h で収穫されたまたは IL-17 tH17 細胞、elisa 法による。(* * p < 0.01 * * * p < 0.001)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: TH17 と THGM セルRorc、Stat3 の Stat5発現。分化 THGM と TH17 細胞を採取、3 h のプレート連結反 CD3e と restimulated の総 RNA cDNA を準備する分離されました。QPCR によりRorc Stat3、 Stat5の式を求めた。(* p < 0.05 * * p < 0.01;NS = 重要ではない)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 名 | ストック濃度 | 使用濃度 | 希釈 | ボリューム 500 μ L バッファーを染色 |
| CD4 PerCp | 0.2 mg/mL | 2.8 μ g/mL | 1:71 | 7 Μ L |
| CD44 APC | 0.2 mg/mL | 2.4 μ g/mL | 1:83 | 6 Μ L |
| CD25 PE | 0.2 mg/mL | 2 μ g/mL | 1: 100 | 5 Μ L |
| CD62L FITC | 0.5 mg/mL | 10 μ g/mL | 1:50 | 10 Μ L |
| GM CSF PE | 0.2 mg/mL | 2 μ g/mL | 1: 100 | |
| IL 17A FITC | 0.5 mg/mL | 5 μ g/mL | 1: 100 | |
| IL 17A APC | 0.2 mg/mL | 2 μ g/mL | 1: 100 | |
| 肝腎 APC | 0.2 mg/mL | 2 μ g/mL | 1: 100 | |
| 肝腎 PE | 0.2 mg/mL | 2 μ g/mL | 1: 100 | |
| IL 4 APC | 0.2 mg/mL | 2 μ g/mL | 1: 100 | |
| CD4 FITC | 0.5 mg/mL | 5 μ g/mL | 1: 100 | |
| IL-7 | 20 μ g/mL | 2 ng/mL | 1:10000 | |
| 抗 CD28 | 0.5 mg/mL | 1 μ g/mL | 1: 500 | |
| 抗肝腎 | 1 mg/mL | 10 μ g/mL | 1: 100 |
表 1:、サイトカインや抗体が使用されます。
| プライマー | シーケンス | |
| Ifngフォワード | 5'-TCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAA-3' | |
| Ifng逆 | 5'-TGGCTCTGCAGGATTTTCATG-3' | |
| Il 17フォワード | 5'-CTCCAGAAGGCCCTCAGACTAC-3' | |
| Il 17逆 | 5'-AGCTTTCCCTCCGCATTGACACAG-3' | |
| Csf2フォワード | 5'-TTTACTTTTCCTGGGCATTG-3' | |
| Csf2逆 | 5'-TAGCTGGCTGTCATGTTCAA-3' | |
| Rorcフォワード | 5'-TTTGGAACTGGCTTTCCATC-3' | |
| Rorc逆 | 5'-AAGATCTGCAGCTTTTCCACA-3' | |
| Stat3フォワード | 5'-TGGCCCTTTGGAATGAAGGGTACA-3' | |
| Stat3逆 | 5'-CACTGATGTCCTTTTCCACCCAAGT-3' | |
| Stat5フォワード | 5'-TGCCCGGCTGGAACTACACCTT-3' | |
| Stat5逆 | 5'-ATGCCCCCGATTTCCGAGTCAC-3' | |
表 2: qPCR 用プライマー。
| ステップ | Temp。(° C) | 時間 | 繰り返します | |
| 1 | 95 | 2 分 | ||
| 2 | 95 | 3 s | ||
| 3 | 60 | 30 s | ステップ 2 と 3、39 回 | 板を読む |
| 4 | 65-95 | 5 s | ステップ 4、30 回 + 各 0.5 の ° C を繰り返します | 板を読む |
表 3: PCR プログラム遺伝子発現を評価します。
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Discussion
ここで我々 は、体外THGM から分化メソッドを検証する分化した細胞の解析に続いてマウス ナイーブ cd4 細胞のプロトコルを記述しました。注記のうち、脾臓およびリンパ節はナイーブ cd4 T 細胞の浄化と THGM 分化に使えます。THGM 条件 (図 1 a) GM CSF 発現細胞になる細胞内サイトカイン染色細胞の約 55%, フローサイトメトリーと組み合わせて定めたサイトカイン発現が誘導された.TH17 分化条件下の細胞と比較して、THGM 条件下で分化した細胞は IL 17 表現する母集団のレベルのバック グラウンドを含まれています。しかし、 il17遺伝子発現は qPCR (図 2 a) によって検出不可能ではありません。
興味深いことに、にもかかわらず、肝腎中和抗体添加、 Ifng mRNA の発現の低レベルを検出した TH17 と THGM 細胞と THGM セルの 1% 未満が肝腎発現細胞。(図 1 - 2)。これは、肝腎中和抗体の不十分な量のためにまたは使用できる THGM 状態で il-12 の微量を提供される生得の免疫細胞 (ほぼ 100% 純粋なナイーブ cd4 陽性 T 細胞を得ることが可能ではない) の可能な汚染を可能な TH1 細胞世代。それを用いて THGM 条件が完全にIfngの転写を遮断するできなかったこともあります。我々 は将来的にこの問題を解決します。しかし、肝腎のタンパク質は、elisa 法による THGM または TH17 の培養上清中検出されませんでした。
ここで提示されたプロトコルにのみ THGM 分化の IL-7 と共に肝腎ブロッキング抗体を使用しました。この条件下での 3 日間後、細胞の 50% 以上表現 GM-CSF、しかしないイリノイ 17、IL-4、または肝腎 (図 1)。さらに、 Rorc発現、遺伝子には RORγt、th17 細胞分化9にとって重要です、17 細胞 (図 3) と比較して THTHGM 細胞で低下をエンコードします。このプロトコルは、したがって、別報告10では以前よりも GM CSF 表現する T 細胞の生成のためのより効率的な方法です。、ナイーブ T 細胞の IL-7 の信号純度、に加えては肝腎を表現する T 細胞の分化の防止がキーを THGM 世代はまた示した。
記述のプロトコルを使用して生成された GM-CSF 細胞の優勢な式は、THGM の正常な分化を示した。サイトカインの品質を指摘したいと思います、別の会社から、あるいは同じ会社から別のバッチの抗体は同じにできない場合があります。したがって、サイトカインや抗体のヘルパー T 細胞分化の数する必要があります最適な条件を調べるためにテストすることをお勧めします。
要約すると、このプロトコルを使用して生成された THGM 細胞は IL-17 の最小限レベルを表現 IL-4、または肝腎。このプロトコルは T の GM CSF 表現を生成する際によく働くことと確信しておりますHGM 細胞で培養。この方法使えますさらに実験的自己免疫性脳脊髄炎 (EAE) を含む、自己免疫 neuroinflammation など様々 な条件で THGM 細胞の生物学を勉強するマウスおよびひと多発性硬化症、GM-CSF が果たしている、11の病因に重要な役割。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
本研究は、シンガポール国立大学健康システム (T1 ~ 2014 年 10 月 12、T1-2015 年 9 月-10) からの助成金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Biowest | L0500-500 | |
| FBS Heat Inactivated | Capricorn | FBS-HI-12A | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10 | Diluted to 1x PBS in sterile water |
| EDTA | 1st Base | BUF-1053-100ml-pH8.0 | |
| 10x ACK buffer | Biolegend | 420301 | diluted in sterile water |
| Cell strainer | SPL Life Sciences | 93070 | |
| CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T | |
| Centrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5810R | |
| Sony SY3200 cell sorter | Sony | Sony SY3200 cell sorter | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 210261 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| FACS tube | Corning | 352054 | |
| 24 well cell culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 | eBioscience | 46-0041-82 | |
| PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) | eBioscience | 12-0251-82 | |
| anti-human/mouse CD44 APC | eBioscience | 17-0441-82 | |
| anti-mouse CD62L FITC | eBioscience | 11-0621-85 | |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | 640010 | |
| Hyclone Trypan Blue Solution | GE healthcare Life Sciences | SV30084.01 | |
| microscope | Nikon | Nikon Elipse TS100 | |
| Purified anti-mouse CD3e antibody | Biolegend | 100314 | |
| Purified hamster anti-mouse CD28 | BD Biosciences | 553295 | |
| Purified Rat anti-mouse IFNγ | eBioscience | 16-7312-85 | |
| Purified anti-mouse IL-4 Antibody | Biolegend | 504102 | |
| Recombinant Mouse IL-7 Protein | R&D system | 407-ML | |
| recombinant human TGF-beta | R&D system | 240-B-010 | |
| PMA | Merck Millipore | 19-144 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| GolgiPlug protein transport inhibitor | BD Biosciences | 51-2301KZ | |
| Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| anti-mouse GM-CSF PE | eBioscience | 12-7331-82 | |
| FITC anti-mouse IL-17A | Biolegend | 506908 | |
| APC anti-mouse IFN-gamma | Biolegend | 505810 | |
| GO Taq qPCR master mix | Promega | A6002 | |
| mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! | invitrogen | 88-7334-88 | |
| Mouse IL-17A Uncouted ELISA | invitrogen | 88-7371-22 |
References
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