Summary
यहां, हम murine granulocyte अंतर करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद-मैक्रोफेज-कॉलोनी उत्तेजक-कारक उत्पादन टी हेल्पर (टीएचजीएम) भोली CD4 + टी कोशिकाओं से, भोली CD4 के अलगाव सहित + टी कोशिकाओं, टीएचजीएम के भेदभाव, और विभेदित टीएचजीएम कोशिकाओं का विश्लेषण । इस विधि के विनियमन और टीएचजीएम कोशिकाओं के समारोह के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है ।
Abstract
granulocyte-मैक्रोफेज-कॉलोनी-उत्तेजक फैक्टर (जीएम-सीएसएफ)-उत्पादन टी हेल्पर (टीएचजीएम) सेल एक नई पहचान टी सहायक सेल सबसेट है कि मुख्य रूप से इंटरफेरॉन (IFN) γ या interleukin (IL) के उत्पादन के बिना जीएम-सीएसएफ स्रावित-17 और पाया जाता है स्व-प्रतिरक्षित neuroinflammation में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं । splenocytes और टीएचजीएम सेल पीढ़ी के भोली CD4 + टी कोशिकाओं से एक एकल सेल निलंबन से भोली CD4 + टी कोशिकाओं के अलगाव की एक विधि टी कोशिका मध्यस्थता प्रतिरक्षा और स्व-प्रतिरक्षित रोगों के अध्ययन में एक उपयोगी तकनीक होगी । यहां हम एक विधि का वर्णन है कि माउस भोली CD4 + टीएचजीएम कोशिकाओं आईएल-7 द्वारा पदोंनत में अंतर । भेदभाव के परिणाम साइटोकिंस अभिव्यक्ति के विश्लेषण के द्वारा मूल्यांकन किया गया था, intracellular cytokine प्रवाह cytometry, एक मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) के साथ संयुक्त धुंधला सहित विभिंन तकनीकों का उपयोग, और एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) । यहां वर्णित के रूप में टीएचजीएम भेदभाव प्रोटोकॉल का उपयोग कर, कोशिकाओं के बारे में ५५% IFNα या IL-17 की एक ंयूनतम अभिव्यक्ति के साथ जीएम सीएसएफ व्यक्त की । टीएचजीएम कोशिकाओं द्वारा जीएम-सीएसएफ की प्रमुख अभिव्यक्ति और mRNA और प्रोटीन के स्तर पर जीएम-सीएसएफ, IFNα, और आईएल-17 की अभिव्यक्ति के विश्लेषण के द्वारा पुष्टि की गई थी । इस प्रकार, इस विधि टी एच जीएम कोशिकाओं को भोली CD4 + टी कोशिकाओं में अंतरकरने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता इन विट्रो, जो टीएचजीएम सेल जीवविज्ञान के अध्ययन में उपयोगी हो जाएगा ।
Introduction
CD4 + टी हेल्पर (टीएच) कोशिकाओं प्रतिरक्षा प्रणाली के आवश्यक घटक हैं, माइक्रोबियल रोगजनकों के खिलाफ मेजबान रक्षा में महत्वपूर्ण भूमिका होने, कैंसर निगरानी में, और प्रतिरक्षा में1,2,3। टी सेल रिसेप्टर (TCR) सक्रियण पर, भोली CD4 + टी कोशिकाओं अलग cytokine milieus2,4के प्रभाव में टी एच 1, टीएच2, टीएच 17, या विनियामक टी (Treg) कोशिकाओं में अंतर किया जा सकता है, 5. हाल ही में, टीएच कोशिकाओं का एक नया सबसेट, जो मुख्य रूप से जीएम-सीएसएफ पैदा करता है, की पहचान की और टीएचजीएम6नाम दिया गया था । टीएचजीएम कोशिकाओं के भेदभाव IL-7 द्वारा एक संकेत transducer और प्रतिलेखन 5 (STAT5) के एक उत्प्रेरक के सक्रियकरण के माध्यम से संचालित है । इन कोशिकाओं को एक बड़ी मात्रा में जीएम-सीएसएफ का इजहार करते हुए अन्य टीएचसेल सिग्नेचर साइटोकिंस जैसे IFNγ और आईएल-176की कम अभिव्यक्ति रही. जीएम-सीएसएफ को CD4 + टी सेल-मध्यस्थता neuroinflammation7,8के विकास में अहम भूमिका निभाने के लिए मिला था । IFNγ-या IL-17-व्यक्त की तुलना में प्रतिक्रियात्मक टी कोशिकाओं, जीएम-सीएसएफ-एक्सप्रेस टी कोशिकाओं जंगली प्रकार (WT) को हस्तांतरित चूहों एक पूर्व रोग शुरुआत और उच्च रोग गंभीरता का कारण बना । इसके अलावा, Csf2-/टी कोशिकाओं को प्रयोगात्मक स्व-प्रतिरक्षित encephalomyelitis (EAE) WT प्राप्तकर्ताओं को हस्तांतरित adoptively होने के बाद प्रेरित करने में विफल रहा है, जबकि टी कोशिकाओं IFNγ या IL-17A की कमी EAE7मध्यस्थता करने की क्षमता बनाए रखा । इसके अलावा, जीएम-सीएसएफ बेअसर एंटीबॉडी उन्नत EAE रोग गंभीरता8का उपयोग कर के एक नाकाबंदी । इसके अलावा, चूहों में टी कोशिकाओं में STAT5 की कमी एक कम टीएचजीएम पीढ़ी के परिणामस्वरूप और, इसलिए, चूहों के एक प्रतिरोध में EAE विकास6. ये निष्कर्ष जीएम-सीएसएफ-व्यक्त टीएच कोशिकाओं के महत्व को स्व-प्रतिरक्षित neuroinflammatory रोग में रेखांकित करते हैं । इस प्रकार, जीएम-सीएसएफ-व्यक्त टीएच कोशिकाओं में अंतर करने के लिए एक विधि की स्थापना भोली CD4 + टी कोशिकाओं से स्व-प्रतिरक्षित neuroinflammation और टी कोशिका की मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के रोगजनन के अध्ययन में महत्वपूर्ण होगा. हालांकि, एक प्रोटोकॉल है कि कुशलतापूर्वक murine भोली CD4 से टीएचजीएम कोशिकाओं उत्पंन + स्थापित नहीं किया गया है ।
यहां हम एक विधि है कि murine टीएचजीएम कोशिकाओं भोली CD4 + टी कोशिकाओं से अलग प्रस्तुत करते हैं । इस प्रोटोकॉल का वर्णन पूरी कार्यविधि, माउस से तिल्ली की निकासी सहित, एक एकल-सेल निलंबन की तैयारी, CD4 सकारात्मक चयन, प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष छँटाई (FACS), और टीएच सेल विभेद और विश्लेषण । विभेदित टी सहायक कोशिकाओं intracellular cytokine प्रवाह cytometry के साथ संयुक्त एक-कोशिका स्तर पर cytokine अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए, एक मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर द्वारा cytokine स्तर पर mRNA अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए, और विश्लेषण कर रहे है एलिसा द्वारा प्रोटीन के स्तर पर cytokine अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए । इस विधि EAE, जहां जीएम सीएसएफ रोगजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है जैसे विभिन्न स्थितियों के तहत टीएचजीएम सेल जीवविज्ञान के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है ।
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Protocol
इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त सभी चूहों C57BL/6 आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर थे और सिंगापुर के राष्ट्रीय विश्वविद्यालय में विशिष्ट रोगजनक-मुक्त शर्तों के तहत स्थित है । सभी प्रयोगों के संस्थागत पशु देखभाल और राष्ट्रीय सिंगापुर विश्वविद्यालय के उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया ।
1. रिएजेंट और सामग्री की तैयारी
- 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) युक्त फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के ५०० मिलीलीटर तैयार करें ।
नोट: पूरे प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर बफर इष्टतम परिणामों के लिए रखें । - RPMI १६४०, 10% FBS, और 1% पेनिसिलिन-streptomycin युक्त पूरा RPMI मीडिया के ५० मिलीलीटर तैयार करें । का प्रयोग करें पूर्ण RPMI मीडिया युक्त ५० µ m β-mercaptoethanol टीएचजीएम सेल विभेदन के लिए. एक धुएं डाकू में β-mercaptoethanol जोड़ें ।
- एक एंटी-CD3e एंटीबॉडी मिश्रण के ७.५ मिलीलीटर को कमजोर एंटी-CD3e केंद्रित स्टॉक से 3 μg/ कोट ४८-अच्छी तरह से प्लेटें एक अच्छी तरह से एंटीबॉडी मिश्रण के १५० μL जोड़ने और ३७ ° c पर थाली कम 1 घंटे के लिए, या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के लिए ।
- कैंची और संदंश की एक जोड़ी निष्फल और उंहें विच्छेदन के बीच ७०% इथेनॉल में रहते हैं ।
2. Murine Splenocytes की तैयारी
- Euthanize माउस (6-8 सप्ताह पुराना) का उपयोग कर एक संस्थागत-सह2 asphyxiation या गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन को मंजूरी दे दी । ७०% इथेनॉल के साथ माउस स्प्रे और इसकी पीठ पर एक polystyrene ब्लॉक पर माउंट । निंनलिखित चरणों के साथ आगे बढ़ने के लिए एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के लिए माउस स्थानांतरण ।
- संदंश की एक जोड़ी का उपयोग कर त्वचा पकड़ो और के बारे में 4 सेमी के लिए बाईं ओर रिब पिंजरे के नीचे त्वचा में कटौती, कैंची की एक जोड़ी का उपयोग कर । पेरिटोनियल थैली को खोलने के लिए तिल्ली का पर्दाफाश और बाँझ संदंश का उपयोग करने के लिए तिल्ली निकालने.
- एक ५० मिलीलीटर ट्यूब और पूर्व यह बफर के 2 मिलीलीटर के साथ गीला पर एक ७० माइक्रोन सेल छलनी प्लेस । तिल्ली के सेल छलनी पर रखें (एक सेल छलनी के लिए 2-3 तिल्ली) और macerate उन्हें एक 5 मिलीलीटर सिरिंज गोताख़ोर के अंत का उपयोग कर.
- छलनी और ट्यूब 1 के साथ कई बार कुल्ला-2 सेल अलगाव बफर के मिलीलीटर जब तक सभी कोशिकाओं को ट्यूब में फ्लश कर रहे हैं । सेल छलनी त्यागें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ३५० x g पर कोशिकाओं को केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें ।
- ठंड के 5 मिलीलीटर (4 डिग्री सेल्सियस) अमोनियम-क्लोराइड-पोटेशियम (ले) lysing बफर (१५० मिमी एनएच4सीएल, के साथ सेल गोली resuspend 10 मिमी KHCO3, ०.१ मिमी न2EDTA; पीएच 7.2-7.4) और धीरे से उन्हें 2 मिनट के लिए मिश्रण. पूरा RPMI मीडिया के 10 मिलीलीटर जोड़ें पृष्ठ बेअसर बफर और तुरंत 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ३५० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक । केंद्रापसारक के बाद supernatant त्यागें ।
3. CD4 का अलगाव + टी कोशिकाओं चुंबकीय CD4 Microbeads और एक कोशिका जुदाई कॉलम का उपयोग
- सेल अलगाव बफर के 5 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend । किसी भी मलबे को हटाने के लिए एक नई 15 मिलीलीटर ट्यूब में एक पूर्व जुदाई फिल्टर (30 माइक्रोन) का उपयोग कर सेल निलंबन फ़िल्टर ।
- सेल सस्पेंशन के 10 μL लें और ९० μL को जोड़कर एक 10x कमजोर पड़ने का बफर बनाएं । पतला सेल सस्पेंशन की 10 μL लें और इसे सेल काउंटिंग के लिए trypan ब्लू के 10 μL के साथ मिलाएं । व्यवहार्य कोशिकाओं की उपज निर्धारित करने के लिए एक hemocytometer में कोशिकाओं की गणना ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ३५० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
- 107 कक्षों प्रति बफ़र के ९० μL में कक्षों को पुनर्स्थगित । 107 कोशिकाओं प्रति चुंबकीय CD4 microbeads के 10 μL जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं की मशीन । इष्टतम परिणामों के लिए, सेल निलंबन धीरे हर 5 मिनट की मशीन के दौरान मिश्रण ।
- जबकि कोशिकाओं गर्मी कर रहे हैं, चुंबकीय स्टैंड पर एक जुदाई कॉलम जगह है । पूर्व बफर के 2 मिलीलीटर के साथ कॉलम गीला ।
- सेल/मनका मशीन के अंत में, बफर के 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो और उंहें ३५० x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें ।
- बफ़र के 1 मिलीलीटर में कक्षों को पुनर्स्थगित करें, नमूना को कक्ष पृथक्करण स्तंभ में लोड करें, और इसे के माध्यम से प्रवाहित करने दें । CD4-सेल अंश एकत्र करने के लिए एक 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब का प्रयोग करें । जलाशय को धोने के लिए बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ने से पहले यह सूखा है । दोहराएं धुलाई चरण 2x ।
- चुंबकीय स्टैंड से सेल जुदाई कॉलम निकालें और यह एक नया 15 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब पर जगह है । कक्ष पृथक्करण स्तंभ के लिए कक्ष आइसोलेशन बफ़र की 2 मिलीलीटर जोड़ें और कक्षों को स्तंभ से बाहर बलपूर्वक करने के लिए गोताख़ोर को मजबूती से लागू करें ।
- CD4 + कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ३५० x g पर अंश केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें ।
4. नादान CD4 + टी कोशिकाओं का शुद्धिकरण (CD4+CD25-CD44loCD62Lhi) by प्रतिदीप्ति-आपन कोशिका छंटाई और टीएचजीएम विभेदन
- प्राप्त CD4 + सेल गोली resuspend ५०० µ में बफर के एल । CD4-PerCp (२.८ µ जी/एमएल), CD44-APC (२.४ µ जी/एमएल), CD25-पीई (2 µ जी/एमएल), और CD62L-FITC (10 µ जी/एमएल) युक्त एक फ्लोरोसेंट-संयुग्मित एंटीबॉडी मिश्रण के साथ कोशिकाओं मिश्रण (तालिका 1) । 20 के लिए बर्फ पर कोशिकाओं की मशीन-30 मिनट, जबकि उंहें प्रकाश से बचाने के ।
नोट: एंटीबॉडी की सांद्रता पहले प्रयोगशाला में अनुकूलित किया गया । सूचीबद्ध एंटीबॉडी की संख्या 1 से कोशिकाओं के लिए है-2 चूहों. - मशीन के बाद, बफर के 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोने और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ३५० x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक ।
- supernatant छोड़ें और ५०० µ l में कक्षों को फिर से निलंबित करें बफ़र की । एक नायलॉन मेष का उपयोग कर फिर से कोशिकाओं को फ़िल्टर ।
- सेल छंटाई के लिए एक FACS ट्यूब के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण । कोट ५०० µ के साथ संग्रह FACS ट्यूबों बफर के एल ।
- CD4 छँटाई द्वारा एक CD4+CD25-CD44loCD62Lहाय जनसंख्या (भोली FACS+ टी कोशिकाओं) प्राप्त करें । CD4 पर गेट+CD25- पहले, और फिर इस आबादी से CD44loCD62Lहाय कोशिकाओं का चयन करें ।
- एक नया 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में भोली CD4+ टी सेल भागों लीजिए । 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ३५० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
- 106 कोशिकाओं की एकाग्रता में भोली CD4 + टी कोशिकाओं resuspend/५० µ m β-mercaptoethanol युक्त पूर्ण RPMI मीडिया में ।
- महाप्राण विरोधी CD3e एंटीबॉडी ४८-अच्छी तरह से थाली में कोटिंग के लिए इस्तेमाल किया । बीज २५०,००० (२५० µ l) प्रत्येक कुआं में आईएल-7 (2 एनजी/एमएल), एंटी-CD28 (1 µ g/एमएल), और एंटी IFNγ (10 µ g/एमएल) (तालिका 1) के साथ कोशिकाओं ।
नोट: cytokine और एंटीबॉडी की सांद्रता पहले प्रयोगशाला में एक टीएचजीएम सेल भेदभाव के लिए अनुकूलित किया गया । - 3 दिनों के लिए 5% CO2 के साथ ३७ ° c पर कोशिकाओं को मशीन । इस मशीन के दौरान माध्यम बदल नहीं है ।
5. माउस टीएचजीएम कोशिकाओं का विश्लेषण इन विट्रो में उत्पन्न
- एक खुर्दबीन का प्रयोग, अंतर के बाद सेल भेदभाव 3 डी की जांच करें । फसल कोशिकाओं और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ३५० x g पर केंद्रापसारक । पूरी RPMI मीडिया के साथ 2x कोशिकाओं धो लो ।
नोट: विभेदित कोशिकाओं भोली CD4 + टी कोशिकाओं से आकार में बड़ा कर रहे हैं । - पूरा RPMI मीडिया के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend । सेल सस्पेंशन के 10 μL लें और hemocytometer के साथ सेल नंबर निर्धारित करने के लिए trypan ब्लू के 10 μL के साथ अच्छी तरह मिक्स करें । एक उत्तेजना और विश्लेषण के लिए तीन औषधि में विभेदित कोशिकाओं विभाजित ।
नोट: Intracellular cytokine धुंधला और एलिसा परख ≥ ५००,००० कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, और qPCR विश्लेषण ≥ १,०००,००० कोशिकाओं की आवश्यकता है । -
intracellular cytokine दाग के लिए, phorbol के साथ कोशिकाओं को पुनः उत्तेजित 12-myristate 13-एसीटेट (पमा) (१०० एनजी/एमएल) और ionomycin (1 μg/एमएल) की उपस्थिति में एक प्रोटीन परिवहन अवरोध करनेवाला (1 µ एल/एमएल) के लिए 4 – 6 एच ।
- फसल कोशिकाओं और उंहें विरोधी CD4 एंटीबॉडी (PerCP-संयुग्मित, ०.२ मिलीग्राम/एमएल, 1:100 कमजोर पड़ने के साथ दाग; या FITC-संयुग्मित, ०.५ मिलीग्राम/एमएल, 1:100 कमजोर पड़ने) के लिए 30 मिनट ।
- 20 – 60 मिनट के लिए निर्धारण बफर के २०० μL के साथ कोशिकाओं को ठीक करें । निर्धारण के बाद, permeabilization बफर के 1 मिलीलीटर के साथ 2x कोशिकाओं धो ।
- जीएम सीएसएफ के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ intracellular धुंधला प्रदर्शन (पीई-संयुग्मित, ०.२ मिलीग्राम/एमएल, 1:100 कमजोर पड़ने), IL-17A (FITC-संयुग्मित, ०.५ मिलीग्राम/एमएल, 1:100 कमजोर पड़ने; apc-संयुग्मित, ०.२ मिलीग्राम/एमएल, 1:100 कमजोर पड़ने), आईएल-4 (apc-संयुग्मित, ०.२ मिलीग्राम/एमएल, 1:100 कमजोर पड़ने), और IFNγ (apc-संयुग्मित, ०.२ मिलीग्राम/एमएल, 1:100 कमजोर पड़ने; संयुग्मित, ०.२ मिलीग्राम/एमएल, 1:100 कमजोर पड़ने) अंधेरे में 30 मिनट के लिए ।
- विभेदित कोशिकाओं द्वारा cytokine जीन अभिव्यक्ति के एक qPCR विश्लेषण के लिए, प्लेट के साथ कोशिकाओं को सक्रिय करें-बाउंड एंटी-CD3e (3 μg/एमएल) (चरण १.३ में वर्णित के रूप में थाली कोटिंग) । उत्तेजना के बाद 3 एच में, qPCR के लिए सीडीएनए तैयार करने के लिए एक phenol आरएनए निष्कर्षण रिएजेंट का उपयोग कर कुल आरएनए को अलग करने के लिए कोशिकाओं फसल । प्राइमरों और qPCR के लिए इस्तेमाल किया कार्यक्रम तालिकाओं में सूचीबद्ध है 2 और 3, क्रमशः ।
- विभेदित कोशिकाओं द्वारा cytokine प्रोटीन स्राव के विश्लेषण के लिए, प्लेट के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित विरोधी CD3e (3 μg/एमएल) 24 घंटे के लिए (१.३ कदम में वर्णित के रूप में प्लेट कोटिंग) । उनकी सांद्रता निर्धारित करने के लिए सेल कल्चर supernatant आईएल-17 और जीएम-सीएसएफ एलिसा के लिए फसल ।
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Representative Results
नादान CD4 + टी कोशिकाओं से पृथक दो 8-सप्ताहीय पुरुष C57BL/6 चूहों तीन भागों में विभाजित किया गया था. कोशिकाओं के एक भाग टीएचजीएम कोशिकाओं में अंतर प्रोटोकॉल वर्णित निंनलिखित था । एक अंय भाग विरोधी की उपस्थिति में टीएचजीएम हालत-IL-4 एंटीबॉडी (10 µ g/एमएल) टीएचजीएम के भेदभाव में एक il-4 नाकाबंदी के प्रभाव का परीक्षण के तहत संस्कृति थी । पिछले भाग एक टीएच17 भेदभाव हालत (3 µ जी/एमएल विरोधी CD3e के तहत संस्कृति था, 1 µ g/एमएल एंटी CD28, 10 एनजी/एमएल TGFβ, 30 एनजी/एमएल आईएल-6, 10 µ जी/एमएल एंटी IFNγ, और 10 µ जी/एमएल एंटी आईएल-4) । भेदभाव के 3 दिनों के बाद, कोशिकाओं को काटा और restimulat cytokine धुंधला, qPCR, और एलिसा द्वारा cytokine अभिव्यक्ति का विश्लेषण उत्तेजित थे । intracellular cytokine धुंधला और FACS विश्लेषण से परिणाम दिखा दिया है कि लगभग ५५% कोशिकाओं के टीएचजीएम विभेदन हालत के तहत संस्कृति के जीएम थे-सीएसएफ-व्यक्त कोशिकाओं (आंकड़ा 1a), जबकि केवल कोशिकाओं के बारे में 2% टीएच17 शर्त के तहत विभेदित जीएम-सीएसएफ व्यक्त किया । इसके अलावा, टीएच17 भेदभाव हालत जो ८.१७% il-17 उत्पादन कोशिकाओं, टीएचजीएम विभेदन हालत केवल IL-17-एक्सप्रेस कोशिकाओं के बारे में 1% के परिणामस्वरूप की तुलना में । परीक्षण किए गए दो भिंनता शर्तों के अंतर्गत, IFNγ व्यक्त की गई कक्षों का केवल एक छोटा अंश (< 1%) । इसके अलावा, कुछ IL-4-एक्सप्रेस टी कोशिकाओं (< 1%) टीएचजीएम या टीएच17 संस्कृति (चित्रा 1b) में देखा गया । इन परिणामों से पता चला कि वर्णित टीएचजीएम सेल भेदभाव हालत का उपयोग कर, हम सफलतापूर्वक टी सहायक कोशिकाओं है कि मुख्य रूप से एक्सप्रेस जीएम-सीएसएफ उत्पंन किया है ।
टीएचजीएम कोशिकाओं के सफल अंतर आगे qPCRs और एलिसा परख से परिणामों के द्वारा की पुष्टि की थी जीएम के अभिव्यक्ति की जांच-सीएसएफ और आईएल-17 दोनों आरएनए और विभेदित कोशिकाओं में प्रोटीन के स्तर पर । उत्पन्न टीएचजीएम कोशिकाओं Csf2 की एक काफी अधिक अभिव्यक्ति थी लेकिन टीएच17 कोशिकाओं (चित्रा 2a) की तुलना में Il17 की एक बहुत कम अभिव्यक्ति. चित्रा 3 बीमें दिखाया गया है, जीएम सीएसएफ प्रोटीन संस्कृति supernatants में दोनों टीएचजीएम और टीएच17 कोशिकाओं से पता चला था । फिर भी, टीएचजीएम संस्कृति supernatant में जीएम सीएसएफ एकाग्रता टीएच17 कोशिकाओं में उस के बारे में तिगुना था । इसके अलावा टीएचजीएम सेल कल्चरल supernatant में आईएल-17 (फिगर 2 बी), IFNγ, और आईएल-4 के प्रोटीन्स undetect थे । चूंकि RORγt टीएच17 कोशिकाओं के मास्टर प्रतिलेखन कारक के रूप में पहचान की गई है, जबकि STAT3 और STAT5 टी एच 17 और टीएचजीएम कोशिकाओं के विकास मेंएक बड़ा महत्व है दिखाया गया है, क्रमशः, हम उनके mRNA की जांच टीएचजीएम और टीएच17 कोशिकाओं में अभिव्यक्ति. यह पाया गया कि टीएचजीएम कोशिकाओं Rorc की एक काफी कम अभिव्यक्ति और टीएच17 कोशिकाओं (चित्रा 3) की तुलना में एक उच्च Stat5 अभिव्यक्ति था । दिलचस्प है, टीएचजीएम कोशिकाओं था एक थोड़ा कम (लेकिन महत्वपूर्ण नहीं) Stat3 जीन की अभिव्यक्ति टीएच17 कोशिकाओं की तुलना में । इन परिणामों से संकेत मिलता है कि हालांकि टीएचजीएम और टीएच17 भेदभाव अलग transcriptional कारकों से नियंत्रित कर रहे हैं, वे कुछ आम सुविधाओं को साझा कर सकते हैं ।
चित्रा 1: टीएचजीएम कोशिकाओं मुख्य रूप से एक्सप्रेस जीएम-सीएसएफ । टीएचजीएम और टीएच17 कोशिकाओं को भेदभाव के बाद 3 दिन पर काटा गया । (क) 5 ज के लिए, कोशिकाओं को एक प्रोटीन परिवहन अवरोधक की उपस्थिति में पमा और ionomycin के साथ फिर से उत्तेजित किया गया । जीएम सीएसएफ, आईएल-17, और IFNγ की अभिव्यक्ति intracellular cytokine प्रवाह cytometry द्वारा पीछा दाग द्वारा विश्लेषण किया गया था । (ख) टीएच१७ या टीएचजीएम कोशिकाओं द्वारा आईएल-४ और IFNγ अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया गया. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: टीएच17 और टीएचजीएम कोशिकाओं में आईएल-17, IFNγ, और जीएम-सीएसएफ की अभिव्यक्ति । टीएचजीएम और टीएच17 कोशिकाओं को काटा और प्लेट बंधे विरोधी CD3e, 3 दिनों के बाद भेदभाव के साथ उत्तेजित हो गए थे । (एक) कोशिकाओं को सीडीएनए तैयारी, उत्तेजना के बाद 3 ज के लिए आरएनए अलग काटा गया । Ifng, आईएल-17, और Csf2 के भाव एक मात्रात्मक रीयल-टाइम पीसीआर (qPCR) द्वारा निर्धारित किए गए थे । (ख) संस्कृति supernatant को उत्तेजना के बाद 24 ज में काटा गया था, टीएचजीएम कोशिकाओं में जीएम-सीएसएफ की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए, या टीएच17 कोशिकाओं में आईएल-17, एलिसा द्वारा । (* * p < 0.01, * * * p < 0.001.) कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: Rorc, Stat3, और टीएच17 और टीएचजीएम कोशिकाओं में Stat5 जीन अभिव्यक्ति । विभेदित टीएचजीएम और टीएच17 कोशिकाओं को काटा गया था और प्लेट के साथ उत्तेजित विरोधी-CD3e 3 एच के लिए बाध्य कुल आरएनए सीडीएनए तैयार करने के लिए अलग-थलग था । Rorc, Stat3, और Stat5 भाव qPCR द्वारा निर्धारित किए गए थे. (* p < 0.05, * * p < 0.01; एनएस = महत्वपूर्ण नहीं है.) कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| नाम | शेयर एकाग्रता | कार्य एकाग्रता | पतलापन | ५०० μL धुंधला बफर में मात्रा |
| CD4-PerCp | ०.२ मिलीग्राम/एमएल | २.८ μg/एमएल | 1:71 | 7 μL |
| CD44-APC | ०.२ मिलीग्राम/एमएल | २.४ μg/एमएल | 1:83 | 6 μL |
| CD25-पे | ०.२ मिलीग्राम/एमएल | 2 μg/एमएल | 1:100 | 5 μL |
| CD62L-FITC | ०.५ मिलीग्राम/एमएल | 10 μg/एमएल | 1:50 | 10 μL |
| जीएम-सीएसएफ-पीई | ०.२ मिलीग्राम/एमएल | 2 μg/एमएल | 1:100 | |
| IL-17A-FITC | ०.५ मिलीग्राम/एमएल | 5 μg/एमएल | 1:100 | |
| IL-17A-APC | ०.२ मिलीग्राम/एमएल | 2 μg/एमएल | 1:100 | |
| IFNγ-APC | ०.२ मिलीग्राम/एमएल | 2 μg/एमएल | 1:100 | |
| IFNγ-पे | ०.२ मिलीग्राम/एमएल | 2 μg/एमएल | 1:100 | |
| IL-4-APC | ०.२ मिलीग्राम/एमएल | 2 μg/एमएल | 1:100 | |
| CD4-FITC | ०.५ मिलीग्राम/एमएल | 5 μg/एमएल | 1:100 | |
| आईएल-7 | 20 μg/एमएल | 2 एनजी/ | 1:10000 | |
| एंटी CD28 | ०.५ मिलीग्राम/एमएल | 1 μg/एमएल | 1:500 | |
| एंटी IFNγ | 1 मिलीग्राम/एमएल | 10 μg/एमएल | 1:100 |
तालिका 1: प्रयुक्त साइटोकिंस और एंटीबॉडी ।
| प्राइमर | अनुक्रम | |
| Ifng आगे | 5 '-TCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAA-3 ' | |
| Ifng रिवर्स | 5 '-TGGCTCTGCAGGATTTTCATG-3 ' | |
| आईएल-17 आगे | 5 '-CTCCAGAAGGCCCTCAGACTAC-3 ' | |
| आईएल-17 रिवर्स | 5 '-AGCTTTCCCTCCGCATTGACACAG-3 ' | |
| Csf2 आगे | 5 '-TTTACTTTTCCTGGGCATTG-3 ' | |
| Csf2 रिवर्स | 5 '-TAGCTGGCTGTCATGTTCAA-3 ' | |
| Rorc आगे | 5 '-TTTGGAACTGGCTTTCCATC-3 ' | |
| Rorc रिवर्स | 5 '-AAGATCTGCAGCTTTTCCACA-3 ' | |
| Stat3 आगे | 5 '-TGGCCCTTTGGAATGAAGGGTACA-3 ' | |
| Stat3 रिवर्स | 5 '-CACTGATGTCCTTTTCCACCCAAGT-3 ' | |
| Stat5 आगे | 5 '-TGCCCGGCTGGAACTACACCTT-3 ' | |
| Stat5 रिवर्स | 5 '-ATGCCCCCGATTTCCGAGTCAC-3 ' | |
तालिका 2: qPCR के लिए प्राइमर ।
| चरण | Temp. (° c) | समय | दोहराएँ | |
| 1 | ९५ | 2 min | ||
| 2 | ९५ | 3 एस | ||
| 3 | ६० | 30 एस | चरण 2 और 3, ३९ बार | पढ़ें थाली |
| 4 | ६५ – ९५ | 5 एस | चरण 4, 30 बार, + 0.5 ° c प्रत्येक दोहराने | पढ़ें थाली |
तालिका 3: पीसीआर कार्यक्रम जीन अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए ।
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Discussion
यहां हम एक प्रोटोकॉल वर्णित इन विट्रो टीएचजीएम भेदभाव से माउस भोली CD4 + कोशिकाओं, विभेदित कोशिकाओं के विश्लेषण के बाद विधि को मांय करने के लिए । नोट की, दोनों तिल्ली और लिम्फ नोड्स भोली CD4 + टी सेल शुद्धि और टीएचजीएम विभेदन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । intracellular cytokine प्रवाह cytometry के साथ संयुक्त धुंधला द्वारा निर्धारित cytokine अभिव्यक्ति से पता चला है कि कोशिकाओं के बारे में ५५% टीएचजीएम हालत (आंकड़ा 1a) के तहत जीएम-सीएसएफ-व्यक्त कोशिकाओं बनने के लिए प्रेरित किया गया । टीएच17 भेदभाव हालत के तहत कोशिकाओं की तुलना में, कोशिकाओं है कि टीएचजीएम हालत के तहत विभेदित एक आईएल-17-व्यक्त की आबादी का एक पृष्ठभूमि स्तर निहित; हालांकि, il17 जीन अभिव्यक्ति qPCR (चित्रा 2a) द्वारा undetect है ।
दिलचस्प है, एक IFNγ बेअसर एंटीबॉडी के अलावा के बावजूद, हम दोनों टीएच17 और टी एच जीएम कोशिकाओं में Ifng mRNA अभिव्यक्ति के एक निंन स्तर कापता चला है, और टीएचजीएम कोशिकाओं के कम से 1% IFNγ-व्यक्त कर रहे थे कोशिकाओं । (आंकड़े 1 - 2) । यह IFNγ के अपर्याप्त राशि के कारण हो सकता है-बेअसर एंटीबॉडी टीएचजीएम हालत में इस्तेमाल किया, या सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं के एक संभावित संदूषण के लिए (यह लगभग १००% शुद्ध भोली CD4 + टी कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए असंभव है) कि एक ट्रेस राशि प्रदान की आईएल-12 संभव टीएच1 सेल पीढ़ी के लिए । यह भी संभव है कि टीएचजीएम हालत हम इस्तेमाल करने में सक्षम पूरी तरह से Ifngकी प्रतिलेखन बंद नहीं था । हम भविष्य में इस मुद्दे को संबोधित करेंगे । फिर भी एलिसा द्वारा टीएचजीएम या टीएच17 के कल्चरल supernatants में IFNγ प्रोटीन का पता नहीं लगाया गया ।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, हम केवल एक IFNγ-ब्लॉक एंटीबॉडी टीएचजीएम भेदभाव के लिए IL-7 के साथ एक साथ इस्तेमाल किया । इस हालत के तहत भेदभाव के 3 दिनों के बाद, अधिक से अधिक ५०% कोशिकाओं के जीएम-सीएसएफ व्यक्त किया है, लेकिन नहीं il-17, il-4, या IFNγ (चित्रा 1) । इसके अलावा, Rorcकी अभिव्यक्ति, जीन है कि सांकेतिक शब्दों में बदलना RORγt है, जो Th17 भेदभाव9के लिए महत्वपूर्ण है, टी एच 17 कोशिकाओं (चित्रा 3) में है कि तुलना में thजीएम कोशिकाओं में काफी कम था । इस प्रोटोकॉल है, इसलिए, जीएम-सीएसएफ-एक्सप्रेस टी कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए एक और अधिक कुशल विधि से एक और पहले10रिपोर्ट । हमारे परिणामों को भी प्रदर्शित किया है कि, भोली टी कोशिकाओं और IL-7 संकेत की शुद्धता के अलावा, IFNγ टी कोशिका भेदभाव की रोकथाम टीएचजीएम पीढ़ी के लिए एक महत्वपूर्ण है ।
जीएम-सीएसएफ कोशिकाओं है कि वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर उत्पंन किया गया की प्रमुख अभिव्यक्ति टीएचजीएम के सफल विभेद प्रदर्शन । हम इस बात को कहना चाहेंगे कि साइटोकिंस और एंटीबॉडी की विभिन्न कंपनियों से या एक ही कंपनी से अलग बैचों की गुणवत्ता भी वैसी नहीं हो सकती. इसलिए, हम अनुशंसा करते है कि साइटोकिंस और एंटीबॉडी टी सहायक सेल भेदभाव में इस्तेमाल की संख्या का परीक्षण किया जाना चाहिए ताकि बाहर इष्टतम हालत का पता लगाने के लिए ।
संक्षेप में, टीएचजीएम कोशिकाओं है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर उत्पंन किया गया il-17, il-4, या IFNγ के एक ंयूनतम स्तर एक्सप्रेस । हम इस प्रोटोकॉल जीएम-सीएसएफ-एक्सप्रेस टीएचजीएम कोशिकाओं में इन विट्रो मेंपैदा करने में अच्छी तरह से काम करता है कि विश्वास कर रहे हैं । इस विधि को आगे के लिए विभिंन स्थितियों में टीएचजीएम कोशिकाओं के जीवविज्ञान जैसे स्व-प्रतिरक्षित neuroinflammation के रूप में अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, चूहों और मानव एकाधिक स्केलेरोसिस, जहां जीएम-सीएसएफ एक नाटकों में प्रयोगात्मक स्व-प्रतिरक्षा encephalomyelitis (EAE) सहित रोगजनन में महत्वपूर्ण भूमिका11.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस अध्ययन में सिंगापुर के राष्ट्रीय विश्वविद्यालय स्वास्थ्य प्रणाली (t1-2014 Oct-12 और t1-2015 Sep-10) से अनुदान का समर्थन किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Biowest | L0500-500 | |
| FBS Heat Inactivated | Capricorn | FBS-HI-12A | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10 | Diluted to 1x PBS in sterile water |
| EDTA | 1st Base | BUF-1053-100ml-pH8.0 | |
| 10x ACK buffer | Biolegend | 420301 | diluted in sterile water |
| Cell strainer | SPL Life Sciences | 93070 | |
| CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T | |
| Centrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5810R | |
| Sony SY3200 cell sorter | Sony | Sony SY3200 cell sorter | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 210261 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| FACS tube | Corning | 352054 | |
| 24 well cell culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 | eBioscience | 46-0041-82 | |
| PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) | eBioscience | 12-0251-82 | |
| anti-human/mouse CD44 APC | eBioscience | 17-0441-82 | |
| anti-mouse CD62L FITC | eBioscience | 11-0621-85 | |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | 640010 | |
| Hyclone Trypan Blue Solution | GE healthcare Life Sciences | SV30084.01 | |
| microscope | Nikon | Nikon Elipse TS100 | |
| Purified anti-mouse CD3e antibody | Biolegend | 100314 | |
| Purified hamster anti-mouse CD28 | BD Biosciences | 553295 | |
| Purified Rat anti-mouse IFNγ | eBioscience | 16-7312-85 | |
| Purified anti-mouse IL-4 Antibody | Biolegend | 504102 | |
| Recombinant Mouse IL-7 Protein | R&D system | 407-ML | |
| recombinant human TGF-beta | R&D system | 240-B-010 | |
| PMA | Merck Millipore | 19-144 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| GolgiPlug protein transport inhibitor | BD Biosciences | 51-2301KZ | |
| Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| anti-mouse GM-CSF PE | eBioscience | 12-7331-82 | |
| FITC anti-mouse IL-17A | Biolegend | 506908 | |
| APC anti-mouse IFN-gamma | Biolegend | 505810 | |
| GO Taq qPCR master mix | Promega | A6002 | |
| mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! | invitrogen | 88-7334-88 | |
| Mouse IL-17A Uncouted ELISA | invitrogen | 88-7371-22 |
References
- Zhu, J., Paul, W. E. CD4 T cells: fates, functions, and faults. Blood. 112, 1557-1569 (2008).
- Kara, E. E., et al. Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity. PLoS Pathogens. 10, e1003905 (2014).
- Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. Tumor Immunology meets...Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells. Oncoimmunology. 6, e1356149 (2017).
- Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).
- Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).
- Sheng, W., et al. STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation. Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).
- Codarri, L., et al. RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation. Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).
- El-Behi, M., et al. The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF. Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126, 1121-1133 (2006).
- Zhang, J., et al. A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF. Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).
- Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage. Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).
