Summary
Her presenterer vi en protokoll for å skille murine granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T hjelper (THGM) celler fra naiv CD4 + T celler, inkludert isolering av naiv CD4 + T celler, differensiering av THGM, og analyse av differensierte THGM celler. Denne metoden kan brukes til studier av regulering og funksjon av THGM celler.
Abstract
De granulocytt-macrophage-koloni-stimulerende faktoren (GM-CSF)-produserer T helper (THGM) celle er et nylig identifisert T hjelper celle delsett som hovedsakelig skiller GM-CSF uten å produsere interferon (IFN) γ eller interleukin (IL) -17 er å spille en viktig rolle i den autoimmune neuroinflammation. En metode for isolering av naiv CD4 + T celler fra en enkeltcelle suspensjon av splenocytes og THGM generasjon fra naiv CD4 + T celler ville være en nyttig teknikk i studiet av T celle-mediert immunitet og autoimmune sykdommer. Her beskriver vi en metode som skiller musen naiv CD4 + T celler i THGM celler fremmes av IL-7. Utfallet av differensiering ble vurdert av analyse av cytokiner uttrykket i ulike teknikker, inkludert intracellulær cytokin flekker kombinert med flowcytometri, en kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjons (PCR), og enzym knyttet immunosorbent analyser (ELISA). Bruker THGM differensiering protokollen som beskrevet her, uttrykte om lag 55% av cellene GM-CSF med en minimal uttrykk for IFNα eller IL-17. Dominerende uttrykket av GM-CSF av THGM celler ble ytterligere bekreftet av analyse av uttrykk for GM-CSF, IFNα og IL-17 både mRNA og protein. Dermed denne metoden kan brukes til å skille naiv CD4 + T celler til THGM celler i vitro, som vil være nyttig i studiet av THGM cellebiologi.
Introduction
CD4 + T hjelper (TH) celler er viktige komponenter i immunsystemet, har avgjørende roller i vert forsvar mot mikrobielle patogener, kreft overvåking og i autoimmunitet1,2,3. Ved T-celle reseptor (TCR) aktivering, naiv CD4 + T celler kan differensieres til TH1 TH2, TH 17 eller forskriftsmessige T (Treg) celler under påvirkning av ulike cytokin miljøer2,4, 5. nylig en ny gruppe TH celler, som hovedsakelig produserer GM-CSF, ble identifisert og navngitt THGM6. Differensiering av THGM celler er drevet av IL-7 gjennom aktivering av en signal svinger og aktivator transkripsjon 5 (STAT5). Disse celler uttrykke mye GM-CSF samtidig ha en lav uttrykk for andre TH-celle signatur cytokiner som IFNγ og IL-176. GM-CSF ble funnet for å spille en avgjørende rolle i utviklingen av CD4 + T celle-mediert neuroinflammation7,8. Sammenlignet med IFNγ - eller IL-17-uttrykke autoreactive T celler, celler GM-CSF-uttrykke T overført til vill-type (WT) mus forårsaket en tidligere sykdommen utbruddet og høyere sykdommens alvorlighetsgrad. I tillegg er Csf2- / - T celler mislyktes å indusere eksperimentelle autoimmune immunsviktvirus (EAE) etter blir adoptively overført til WT mottakere, mens T-celler mangler IFNγ eller IL-17A beholdt evnen til å megle EAE7. Videre ameliorated en blokade av GM-CSF bruker nøytraliserende antistoffer EAE sykdom alvorlighetsgrad8. Videre resulterte mangel på STAT5 i T-celler i mus i en redusert THGM generasjon, og dermed i en motstand av mus EAE utvikling6. Disse funnene understreker betydningen av GM-CSF-uttrykke TH celler i autoimmune neuroinflammatory sykdom. Dermed vil etablere en metode for å skille GM-CSF-uttrykke TH celler fra naiv CD4 + T celler være viktig i studiet av patogenesen av autoimmune neuroinflammation og T-celle-mediert immunreaksjoner. Men en protokoll som effektivt genererer THGM celler fra murine naiv CD4 + ikke er fastslått.
Her presenterer vi en metode som skiller murine THGM celler fra naiv CD4 + T celler. Denne protokollen beskriver hele prosedyren, inkludert utvinning av milten fra musa, utarbeidelse av en enkeltcelle suspensjon, CD4 positiv valg, fluorescens-aktivert cellen sortering (FACS) og TH cellen differensiering og analyse. Differensiert T hjelper celler analyseres av intracellulær cytokin flekker kombinert med flowcytometri å bestemme cytokin uttrykket på encellede nivå, av en kvantitativ sanntid PCR å bestemme cytokin uttrykket på mRNA nivå, og med ELISA å vurdere cytokin uttrykket på protein nivå. Denne metoden kan brukes til studier av THGM cellebiologi under ulike forhold, for eksempel EAE, der GM-CSF spiller en viktig rolle i patogenesen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus brukes i denne protokollen var på C57BL/6 genetisk bakgrunn og plassert under bestemte patogen-gratis forhold ved National University of Singapore. Alle eksperimentene ble utført ved hjelp av protokoller godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen av National University of Singapore.
1. reagenser og materiale forberedelse
- Forberede 500 mL fosfat-bufret saltvann (PBS) som inneholder 2% fosterets bovin serum (FBS) og 1 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA).
Merk: Holde bufferen på is gjennom hele prosedyren for optimale resultater. - Forberede 50 mL av komplett RPMI mediet som inneholder RPMI 1640, 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin. Bruk fullstendig RPMI mediet som inneholder 50 µM β-mercaptoethanol for THGM celledifferensiering. Legge til β-mercaptoethanol i avtrekksvifte.
- Forberede 7,5 mL av en anti-CD3e antistoff blanding fortynne anti-CD3e konsentrert lager til 3 μg/mL i PBS. Coat 48-vel plater ved å legge 150 μL av antistoff blandingen i hver brønn og ruge platen på 37 ° C i minst 1 time eller på 4 ° C over natten.
- Sterilisere et par saks og tang og holde dem i 70% etanol mellom disseksjoner.
2. utarbeidelse av Murine Splenocytes
- Euthanize musen (av 6-8 uker gamle) bruker en godkjent av institusjonelt CO2 kvelning cervical forvridning. Spray musen med 70% etanol og montere den på polystyren blokk på ryggen. Overføre musen til en biologisk sikkerhet regjering fortsette med trinnene nedenfor.
- Hold huden med en tang og kutt huden under ribbe buret til venstre for ca 4 cm, med en saks. Åpne peritoneal sac for å avdekke milten og bruke sterilt tang til å trekke ut milten.
- Plasser en 70 μm celle sil på en 50 mL tube og pre våt den med 2 mL buffer. Plasser spleens på cellen silen (2-3 spleens for én celle sil) og macerate dem ved slutten av en 5 mL sprøytestempelet.
- Skyll sil og rør flere ganger med 1-2 mL celle isolasjon bufferen til alle celler tømmes inn i røret. Forkaste celle silen og sentrifuge cellene på 350 x g i 5 min på 4 ° C. Kast nedbryting.
- Resuspend celle pellets med 5 mL kaldt (4 ° C) ammonium-klor-kalium (ACK) lysing buffer (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA, pH 7.2-7.4) og bland dem forsiktig for 2 min. legge 10 mL fullfører RPMI media å nøytralisere ACK bufre og umiddelbart sentrifuge cellene på 350 x g i 5 min på 4 ° C. Kaste nedbryting etter sentrifugering.
3. isolering av CD4 + T celler ved hjelp av magnetiske CD4 Microbeads og en celle separasjon kolonne
- Resuspend celle pellet i 5 mL celle isolasjon bufferen. Filtrere celle suspensjon bruke filtere pre separasjon (30 μm) i en ny 15-mL tube for å fjern rusk.
- Ta 10 μL celle suspensjon og lage en 10 x fortynning ved å legge til 90 μL buffer. Ta 10 μL utvannet celle suspensjon og bland det med 10 μL trypan blå for cellen opptelling. Tell cellene i en hemocytometer å finne avkastningen av levedyktige cellers.
- Sentrifuge cellene på 350 x g i 5 min på 4 ° C og kast nedbryting.
- Resuspend cellene i 90 μL buffer per 107 celler. Tilsett 10 μL av magnetiske CD4 microbeads per 107 celler. Inkuber cellene i 15 min på 4 ° C. For optimale resultater, bland celle suspensjon forsiktig hver 5 min under inkubasjon.
- Mens cellene er incubating, plassere en separasjon kolonne på magnetiske stativ. Pre våt kolonnen med 2 mL buffer.
- På slutten av den celle/perle inkubering, vask cellene med 5 mL bufferen og sentrifuge dem 350 x g i 5 min på 4 ° C. Kast nedbryting.
- Resuspend cellene i 1 mL av bufferen, belaste prøven i kolonnen cellen separasjon og la det flyte gjennom. Bruk en 15-mL sentrifuge tube for å samle CD4 celler brøken. Legg 1 mL av buffer å vaske reservoaret før den er tørr. Gjenta vask trinn 2 x.
- Fjerne kolonnen cellen separasjon av magnetiske stativet og plasser den på en ny 15 mL sentrifuge tube. Legge til 2 mL celle isolasjon bufferen til kolonnen cellen separasjon og bruke stempelet fast for å tvinge cellene av kolonnen.
- Sentrifuge brøken 350 x g i 5 min på 4 ° C å få CD4 + celler. Kast nedbryting.
4. rensing av Naive CD4 + T celler (CD4+CD25-CD44loCD62LHei) av fluorescens-aktivert celle sortering og THGM differensiering
- Resuspend fått CD4 + celle pellet i 500 µL av bufferen. Bland cellene med en fluorescerende-konjugerte antistoffer blanding som inneholder CD4-PerCp (2,8 µg/mL), CD44-APC (2,4 µg/mL), CD25-PE (2 µg/mL), og CD62L-FITC (10 µg/mL) (tabell 1). Inkuber cellene på is 20-30 min, samtidig beskytte dem fra lys.
Merk: Konsentrasjonen av antistoffer var optimalisert tidligere i laboratoriet. Antistoffer oppført er for celler fra 1 – 2 mus. - Etter inkubasjon, vask cellene med 5 mL bufferen og sentrifuge cellene på 350 x g i 5 min på 4 ° C.
- Forkast nedbryting og resuspend cellene i 500 µL av bufferen. Filtrere cellene med en nylon maske.
- Overføre celle suspensjon slik FACS celle sortering. Precoat samling FACS rør med 500 µL av bufferen.
- Få en CD4+CD25-CD44loCD62LHei befolkningen (av naiv CD4+ T celler) av FACS sortering. Gate på CD4+CD25- først, og velg deretter CD44loCD62LHei celler fra denne befolkningen.
- Samle naive CD4+ T celle brøker i en ny 15-mL sentrifuge tube. Sentrifuge cellene på 350 x g i 5 min på 4 ° C og kast nedbryting.
- Resuspend de naive CD4 + T cellene i en konsentrasjon av 106 celler/mL i fullstendig RPMI mediet som inneholder 50 µM β-mercaptoethanol.
- Sug opp anti-CD3e antistoffer brukes for precoating i 48-vel plate. Frø 0,25 millioner (250 µL) celler i hver brønn med IL-7 (2 ng/mL), anti-CD28 (1 µg/mL) og anti-IFNγ (10 µg/mL) (tabell 1).
Merk: Konsentrasjonen av cytokin og antistoffer var optimalisert tidligere i laboratoriet en THGM celledifferensiering. - Inkuber cellene på 37 ° C med 5% CO2 i 3 dager. Endre ikke mediet under incubation.
5. analyse av musen THGM cellene generert In Vitro
- Bruk et mikroskop kontrollere celledifferensiering 3 d etter differensiering. Høste celler og sentrifuge dem 350 x g i 5 min på 4 ° C. Vask cellene 2 x med komplett RPMI medier.
Merk: Differensierte celler er større enn naiv CD4 + T celler. - Resuspend cellene i 1 mL av komplett RPMI medier. Ta 10 μL celle suspensjon og bland det godt med 10 μL trypan blå til å fastslå hvor cellen med en hemocytometer. Del differensierte celler i tre potions for en restimulation og analyse.
Merk: Intracellulær cytokin flekker og ELISA analyser krever ≥0.5 millioner celler, og qPCR analyse krever ≥ 1 millioner celler. -
For intracellulær cytokin flekker, restimulate cellene med phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (100 ng/mL) og ionomycin (1 μg/mL) i nærvær av en protein transport hemmer (1 µL/mL) for 4-6 h.
- Høste celler og stain dem med anti-CD4 antistoff (PerCP-konjugerte, 0,2 mg/mL, 1: 100 fortynning, eller FITC-konjugerte, 0,5 mg/mL, 1: 100 fortynning) i 30 min.
- Fastsette cellene med 200 μL fiksering bufferen i 20 – 60 min. Fiksering, vaskes cellene 2 x med 1 mL av permeabilization buffer.
- Utføre intracellulær farging med antistoffer mot GM-CSF (PE-bøyd 0,2 mg/mL, 1: 100 fortynning), IL-17A (FITC-konjugerte, 0,5 mg/mL, 1: 100 fortynning; APC-conjugated, 0,2 mg/mL, 1: 100 fortynning), IL-4 (APC-bøyd 0,2 mg/mL, 1: 100 fortynning) og IFNγ (APC-bøyd 0,2 mg/mL, 1: 100 fortynning; PE-conjugated, 0,2 mg/mL, 1: 100 fortynning) i 30 min i mørket.
- For en qPCR analyse av cytokin genuttrykk av differensierte celler, kan du aktivere cellene med plate-bundet anti-CD3e (3 μg/mL) (precoating platen som beskrevet i trinn 1.3). På 3 h etter stimulering, høste celler for å isolere totale RNA bruker en fenol RNA utvinning reagens for å forberede cDNA av qPCR. Den grunning og programmet brukt for qPCR er oppført i tabellene 2 og 3, henholdsvis.
- For analyse av cytokin protein sekresjon av differensierte celler, restimulate cellene med plate-bundet anti-CD3e (3 μg/mL) for 24 h (precoating platen som beskrevet i trinn 1.3). Høste cellekultur supernatant for IL-17 og GM-CSF ELISA bestemme konsentrasjonene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Naive CD4 + T celler isolert fra to 8-uke-gamle mannlige C57BL/6 mus ble delt i tre deler. En del av cellene var differensiert i THGM celler følger protokollen beskrevet. En annen del ble kultivert under en THGM tilstand i nærvær av anti-IL-4 antistoff (10 µg/mL) for å teste påvirkning av en IL-4 blokaden i differensiering av THGM. Den siste delen ble kultivert under en TH17 differensiering tilstand (3 µg/mL anti-CD3e, 1 µg/mL anti-CD28, 10 ng/mL TGFβ, 30 ng/mL IL-6, 10 µg/mL anti-IFNγ og 10 µg/mL anti-IL-4). Etter 3 dager av differensiering var cellene høstet og restimulated for å analysere cytokin uttrykket intracellulær cytokin flekker, qPCR og ELISA. Resultater fra intracellulær cytokin flekker og FACS analyse viste at rundt 55% av cellene kultivert under THGM differensiering tilstanden var GM-CSF-uttrykke celler (figur 1A), mens bare ca 2% av cellene differensiert under THuttrykt 17 tilstand GM-CSF. I tillegg resulterte sammenlignet TH17 differensiering tilstanden som genereres 8.17% IL-17-produserende celler, THGM differensiering betingelsen bare i ca 1% av IL-17-uttrykke celler. Under de to differensiering forholdene testet, bare en liten andel av cellene uttrykte IFNγ (< 1%). Videre noen IL-4-uttrykke T-celler (< 1%) ble sett i THGM eller TH17 kultur (figur 1B). Disse resultatene viste at bruker beskrevet THGM cellen differensiering tilstanden, vi har vellykket generert T hjelper celler som uttrykker hovedsakelig GM-CSF.
Vellykket differensiering av THGM celler ble ytterligere bekreftet av resultater fra qPCRs og ELISA søk for å undersøke uttrykk for GM-CSF og IL-17 på både RNA og protein i differensierte celler. Genererte THGM cellene hadde en betydelig høyere uttrykk for Csf2 , men et mye lavere uttrykk for Il17 forhold til TH17 celler (figur 2A). Som vist i figur 2B, ble GM-CSF protein oppdaget i kultur supernatants fra både THGM og TH17 celler. Likevel GM-CSF konsentrasjonen i THGM kultur supernatant var om tredelt som i TH17 celler. I tillegg var proteiner av IL-17 (figur 2B), IFNγ og IL-4 undetectable i THGM cellekultur supernatant. Siden RORγt er identifisert som master transkripsjon faktoren TH17 celler, mens STAT3 og STAT5 har vist seg å ha en stor betydning i utviklingen av TH17 og THGM celler, henholdsvis, undersøkte vi deres mRNA uttrykk i THGM og TH17 cellene. Det ble funnet at THGM cellene hadde en betydelig lavere uttrykk for Rorc og et høyere Stat5 uttrykk enn TH17 celler (Figur 3). Interessant, THGM cellene hadde en litt lavere (men ikke signifikant) uttrykket av Stat3 genet sammenlignet TH17 celler. Disse resultatene indikerte at selv om THGM og TH17 differensiering styres av ulike transcriptional faktorer, de kan dele noen fellestrekk.
Figur 1: THGM celler hovedsakelig express GM-CSF. THGM og TH17 celler ble høstet dag 3 etter differensiering. (A) For 5 h, cellene var restimulated med PMA og ionomycin i nærvær av en protein transport inhibitor. Uttrykket av GM-CSF, IL-17, og IFNγ ble analysert av intracellulær cytokin flekker etterfulgt av flowcytometri. (B) The IL-4 og IFNγ uttrykk av TH17 eller THGM celler ble analysert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Uttrykk for IL-17, IFNγ og GM-CSF TH17 og THGM celler. THGM og TH17 celler ble høstet og restimulated med plate-bundet anti-CD3e, 3 dager etter differensiering. (A) celler ble brukt for å isolere RNA for cDNA forberedelse, 3t etter stimulering. Av Ifng, Il-17og Csf2 var bestemt av en kvantitativ sanntid PCR (qPCR). (B) kultur supernatant ble slaktet på 24 h etter stimulering, å bestemme konsentrasjonen av GM-CSF i THGM celler, eller IL-17 i TH17 celler, med ELISA. (** p < 0,01, *** p < 0,001.) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Rorc, Stat3, og Stat5 genuttrykk TH17 og THGM celler. Differensiert THGM og TH17 celler ble høstet og restimulated med plate-bundet anti-CD3e for 3 h. totale RNA ble isolert å forberede cDNA. Rorc, Stat3og Stat5 uttrykkene ble fastsatt av qPCR. (* p < 0,05, ** p < 0.01; NS = ikke betydelig.) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| navn | Lager konsentrasjon | arbeider konsentrasjon | Fortynning | volum i 500 μL flekker buffer |
| CD4-PerCp | 0,2 mg/mL | 2,8 μg/mL | 1:71 | 7 ΜL |
| CD44-APC | 0,2 mg/mL | 2.4 μg/mL | 1:83 | 6 ΜL |
| CD25-PE | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | 5 ΜL |
| CD62L-FITC | 0,5 mg/mL | 10 μg/mL | 1:50 | 10 ΜL |
| GM-CSF-PE | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| IL-17A-FITC | 0,5 mg/mL | 5 μg/mL | 1: 100 | |
| IL-17A-APC | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| IFNΓ-APC | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| IFNΓ-PE | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| IL-4-APC | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| CD4-FITC | 0,5 mg/mL | 5 μg/mL | 1: 100 | |
| IL-7 | 20 μg/mL | 2 ng/mL | 1:10000 | |
| Anti-CD28 | 0,5 mg/mL | 1 μg/mL | 1:500 | |
| Anti-IFNγ | 1 mg/mL | 10 μg/mL | 1: 100 |
Tabell 1: Brukt cytokiner og antistoffer.
| Primer | Sekvens | |
| Ifng Fremover | 5-TCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAA-3 " | |
| Ifng Omvendt | 5-TGGCTCTGCAGGATTTTCATG-3 " | |
| Il-17 Fremover | 5-CTCCAGAAGGCCCTCAGACTAC-3 " | |
| Il-17 Omvendt | 5-AGCTTTCCCTCCGCATTGACACAG-3 " | |
| Csf2 Fremover | 5-TTTACTTTTCCTGGGCATTG-3 " | |
| Csf2 Omvendt | 5-TAGCTGGCTGTCATGTTCAA-3 " | |
| Rorc Fremover | 5-TTTGGAACTGGCTTTCCATC-3 " | |
| Rorc Omvendt | 5-AAGATCTGCAGCTTTTCCACA-3 " | |
| Stat3 Fremover | 5-TGGCCCTTTGGAATGAAGGGTACA-3 " | |
| Stat3 Omvendt | 5-CACTGATGTCCTTTTCCACCCAAGT-3 " | |
| Stat5 Fremover | 5-TGCCCGGCTGGAACTACACCTT-3 " | |
| Stat5 Omvendt | 5-ATGCCCCCGATTTCCGAGTCAC-3 " | |
Tabell 2: Primere for qPCR.
| Trinn | Temp. (° C) | tid | Gjenta | |
| 1 | 95 | 2 min | ||
| 2 | 95 | 3 s | ||
| 3 | 60 | 30 s | Trinn 2 og 3, 39 ganger | lese platen |
| 4 | 65-95 | 5 s | Trinn 4: 30 ganger, + 0,5 ° C hver gjenta | lese platen |
Tabell 3: PCR program å vurdere genuttrykk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskrev vi protokollen en i vitro THGM differensiering fra musen naiv CD4 + celler, etterfulgt av en analyse av differensierte celler å validere metoden. Av notatet, kan både milten og lymfeknutene brukes for naiv CD4 + T celle rensing og THGM differensiering. Cytokin uttrykket bestemmes av intracellulær cytokin flekker kombinert med flowcytometri viste at rundt 55% av cellene ble indusert bli GM-CSF-uttrykke celler under forutsetning av THGM (figur 1A). I forhold til celler under forutsetning av TH17 differensiering, inneholdt cellene differensiert under forutsetning av THGM et bakgrunn nivå av en IL-17-uttrykke befolkning; men er il17 genuttrykk undetectable av qPCR (figur 2A).
Interessant, til tross for tillegg av et IFNγ nøytraliserende antistoff, vi har oppdaget et lavt nivå av Ifng mRNA uttrykk i både TH17 og THGM cellene, og mindre enn 1% av THGM cellene var IFNγ-uttrykke celler. (Tall 1 - 2). Dette kan skyldes utilstrekkelig mengden IFNγ-nøytralisere antistoff brukes i betingelsen THGM eller en mulig forurensing av medfødte immunceller (det er nesten umulig å få 100% ren naiv CD4 + T celler) som et spor beløp av IL-12 for mulig TH1 celle generasjon. Det er også mulig at betingelsen THGM vi ikke var kjøpedyktig helt slå transkripsjon av Ifng. Vi vil ta dette problemet i fremtiden. Likevel ble IFNγ protein ikke funnet i kultur supernatants THGM eller TH17 med ELISA.
I protokollen presenteres her, brukt vi bare en IFNγ blokkering antistoff sammen med IL-7 THGM differensiering. Etter 3 dager for differensiering under denne tilstanden, mer enn 50% av cellene uttrykte GM-CSF, men ikke IL-17, IL-4 eller IFNγ (figur 1). I tillegg uttrykk for Rorc, genet som koder RORγt, som er avgjørende for Th17 differensiering9, var betydelig lavere i THGM cellene forhold i TH17 celler (Figur 3). Denne protokollen er derfor en mer effektiv metode for generering av GM-CSF-uttrykke T celler enn en annen rapportert tidligere10. Resultatene viste også at i tillegg til renhet av naiv T celler og IL-7 signalering, forebygging av IFNγ-uttrykke T celledifferensiering er en nøkkel for THGM generasjon.
Dominerende uttrykket av GM-CSF cellene som ble generert ved hjelp av beskrevet protokollen vist vellykket differensiering av THGM. Vi ønsker å påpeke at kvaliteten på cytokiner og antistoffer fra ulike selskaper eller til og med forskjellige partier fra samme selskap kan ikke være det samme. Vi anbefaler derfor at antall cytokiner og antistoffer i T hjelper celledifferensiering bør testes for å finne ut den optimale tilstanden.
Oppsummert THGM celler som ble generert ved hjelp av denne protokollen uttrykke et minimalt nivå av IL-17, IL-4 eller IFNγ. Vi er overbevist om at denne protokollen fungerer godt i generere GM-CSF-uttrykke THGM celler i vitro. Denne metoden kan brukes til å ytterligere studere biologi THGM celler i ulike forhold som autoimmune neuroinflammation, inkludert eksperimentelle autoimmune immunsviktvirus (EAE) i mus og menneskelige multippel sklerose, der GM-CSF spiller en viktig rolle i patogenesen11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av tilskudd fra den National University Health System of Singapore (T1-2014 oktober-12 og T1-2015 Sep-10).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Biowest | L0500-500 | |
| FBS Heat Inactivated | Capricorn | FBS-HI-12A | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10 | Diluted to 1x PBS in sterile water |
| EDTA | 1st Base | BUF-1053-100ml-pH8.0 | |
| 10x ACK buffer | Biolegend | 420301 | diluted in sterile water |
| Cell strainer | SPL Life Sciences | 93070 | |
| CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T | |
| Centrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5810R | |
| Sony SY3200 cell sorter | Sony | Sony SY3200 cell sorter | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 210261 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| FACS tube | Corning | 352054 | |
| 24 well cell culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 | eBioscience | 46-0041-82 | |
| PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) | eBioscience | 12-0251-82 | |
| anti-human/mouse CD44 APC | eBioscience | 17-0441-82 | |
| anti-mouse CD62L FITC | eBioscience | 11-0621-85 | |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | 640010 | |
| Hyclone Trypan Blue Solution | GE healthcare Life Sciences | SV30084.01 | |
| microscope | Nikon | Nikon Elipse TS100 | |
| Purified anti-mouse CD3e antibody | Biolegend | 100314 | |
| Purified hamster anti-mouse CD28 | BD Biosciences | 553295 | |
| Purified Rat anti-mouse IFNγ | eBioscience | 16-7312-85 | |
| Purified anti-mouse IL-4 Antibody | Biolegend | 504102 | |
| Recombinant Mouse IL-7 Protein | R&D system | 407-ML | |
| recombinant human TGF-beta | R&D system | 240-B-010 | |
| PMA | Merck Millipore | 19-144 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| GolgiPlug protein transport inhibitor | BD Biosciences | 51-2301KZ | |
| Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| anti-mouse GM-CSF PE | eBioscience | 12-7331-82 | |
| FITC anti-mouse IL-17A | Biolegend | 506908 | |
| APC anti-mouse IFN-gamma | Biolegend | 505810 | |
| GO Taq qPCR master mix | Promega | A6002 | |
| mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! | invitrogen | 88-7334-88 | |
| Mouse IL-17A Uncouted ELISA | invitrogen | 88-7371-22 |
References
- Zhu, J., Paul, W. E. CD4 T cells: fates, functions, and faults. Blood. 112, 1557-1569 (2008).
- Kara, E. E., et al. Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity. PLoS Pathogens. 10, e1003905 (2014).
- Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. Tumor Immunology meets...Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells. Oncoimmunology. 6, e1356149 (2017).
- Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).
- Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).
- Sheng, W., et al. STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation. Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).
- Codarri, L., et al. RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation. Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).
- El-Behi, M., et al. The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF. Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126, 1121-1133 (2006).
- Zhang, J., et al. A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF. Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).
- Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage. Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).
