Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at differentiere murine granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T hjælper (THGM) celler fra naiv CD4 + T celler, herunder isolering af naive CD4 + T celler, differentiering af THGM, og analyse af differentierede THGM celler. Denne metode kan anvendes til undersøgelser af forordningen og funktion af THGM celler.
Abstract
Granulocyt-makrofag-koloni-stimulerende faktor (GM-CSF)-producerer T helper (THGM) celle er en nyligt identificerede T hjælper celle delmængde, som overvejende udskiller GM-CSF uden produktion af interferon (IFN) γ eller interleukin (IL) -17 og er fundet spil en væsentlig rolle i den autoimmune neuroinflammation. En metode til dyrkning af naive CD4 + T celler fra en enkelt celle suspension af splenocytes og THGM celle generation fra naiv CD4 + T celler ville være en nyttig teknik i studiet af T celle-medieret immunitet og autoimmune sygdomme. Her beskriver vi en metode, der adskiller mus naive CD4 + T-celler i THGM celler fremmes af IL-7. Resultatet af differentieringen blev vurderet ved analyse af cytokiner udtryk ved hjælp af forskellige teknikker, herunder intracellulære cytokin farvning kombineret med flowcytometri, en kvantitativ real-time polymerase kædereaktion (PCR), og enzym-forbundet immunosorbent assays (ELISA). Bruger THGM differentiering protokol som beskrevet her, udtrykt omkring 55% af cellerne GM-CSF med en minimal udtryk for IFNα eller IL-17. Den fremherskende udtryk af GM-CSF ved THGM celler blev yderligere bekræftet af analysen af udtryk af GM-CSF, IFNα og IL-17 på både mRNA og protein niveauer. Således, denne metode kan bruges til at differentiere naive CD4 + T-celler til THGM celler in vitro-, som vil være nyttige i studiet af THGM cellebiologi.
Introduction
CD4 + T hjælper (TH) celler er væsentlige elementer af immunforsvaret, at have afgørende roller i vært forsvaret mod mikrobielle patogener, kræft overvågning og autoimmunitet1,2,3. Ved T-celle receptoren (TCR) aktivering, naive CD4 + T celler kan opdeles i TH1, TH2, TH 17, eller regulerende T (langsomme) celler under indflydelse af forskellige cytokin miljøer2,4, 5. for nylig en ny delmængde af TH celler, som hovedsageligt producerer GM-CSF, blev identificeret og navngivne THGM6. Differentiering af THGM celler er drevet af IL-7 gennem aktivering af en signal transducer og en aktivator af transskription 5 (STAT5). Disse celler udtrykker en stor mængde af GM-CSF og samtidig have et lavt udtryk for andre TH-celle signatur cytokiner såsom IFNγ og IL-176. GM-CSF blev fundet til at spille en afgørende rolle i udviklingen af CD4 + T-celle-medieret neuroinflammation7,8. I forhold til IFNγ - eller IL-17-udtrykker autoreactive T celler, celler GM-CSF-udtrykker T er overført til wild-type (WT) mus forårsaget en tidligere sygdom udbrud og højere sygdommens sværhedsgrad. Derudover mislykkedes Csf2- / - T celler at fremkalde eksperimentelle autoimmune encephalomyelitis (EAE) efter adoptively overført til WT modtagere, mens T celler mangler IFNγ eller IL-17A bevaret evnen til at mægle EAE7. Desuden forbedret en blokade af GM-CSF ved hjælp af neutraliserende antistoffer EAE sygdom sværhedsgraden8. Desuden, mangel af STAT5 i T-celler i mus resulterede i en formindsket THGM generation og dermed i en modstand af mus til EAE udvikling6. Disse resultater understreger betydningen af GM-CSF-udtrykker TH celler i autoimmune neuroinflammatory sygdom. Således ville indføres en metode til at adskille GM-CSF-udtrykker TH celler fra naiv CD4 + T celler være vigtigt i studiet af patogenesen af autoimmune neuroinflammation og T-celle-medieret immunrespons. Dog en protokol der effektivt genererer THGM celler fra murine naive CD4 + ikke er blevet etableret.
Her præsenterer vi en metode, der adskiller murine THGM celler fra naiv CD4 + T-celler. Denne protokol beskriver hele proceduren, herunder udvinding af milten fra musen, udarbejdelse af en enkelt celle suspension, CD4 positive udvælgelse, fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) og cellen TH differentiering og analyse. De differentierede T helper celler er analyseret af intracellulære cytokin farvning kombineret med flowcytometri at bestemme cytokin udtryk på én celle-plan af en kvantitativ real-time PCR til at bestemme cytokin udtryk på mRNA niveau, og ved ELISA at vurdere cytokin udtryk på protein niveau. Denne metode kan anvendes til undersøgelser af THGM cellebiologi under forskellige forhold, såsom EAE, hvor GM-CSF spiller en vigtig rolle i patogenesen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus bruges i denne protokol var på C57BL/6 genetiske baggrund og har til huse under specifikt patogenfrie betingelser på National University of Singapore. Alle eksperimenter blev udført ved hjælp af protokollerne er godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget af National University of Singapore.
1. reagens og materielle forberedelse
- Forberede 500 mL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS) med 2% føtal bovint serum (FBS) og 1 mM ethylendiamintetra syre (EDTA).
Bemærk: Hold buffer på isen under hele proceduren for optimale resultater. - Forberede 50 mL af komplet RPMI medier indeholdende RPMI 1640, 10% FBS, og 1% penicillin-streptomycin. Bruge komplet RPMI medier indeholdende 50 µM β-mercaptoethanol THGM celle differentiering. Tilføje β-mercaptoethanol i et stinkskab.
- Forberede 7,5 mL af en blanding, anti-CD3e antistoffer ved fortynding af anti-CD3e koncentreret materiel til 3 μg/mL i PBS. Pels 48-godt plader ved at tilføje 150 μl antistof blandingen til hver brønd og Inkuber plade ved 37 ° C i mindst 1 time eller ved 4 ° C natten over.
- Sterilisere et par saks og pincet og holde dem i 70% ethanol mellem dissektioner.
2. forberedelse af Murine Splenocytes
- Aflive mus (af 6-8 uger gamle) ved hjælp af et institutionelt godkendt CO2 kvælning eller livmoderhalskræft dislokation. Spray musen med 70% ethanol og montere den på en polystyren blok på ryggen. Overføre musen til en biologisk sikkerhed kabinet til at fortsætte med følgende trin.
- Hold huden ved hjælp af et par pincet og skære huden under brystkassen i venstre side for ca. 4 cm, ved hjælp af en saks. Åbn den peritoneale sac for at afsløre milten og bruge steril pincet til at udtrække milten.
- Placer en 70 μm celle si på en 50 mL tube og pre våd det med 2 mL buffer. Placer milt på celle si (2 – 3 milt for én celle SI) og udblødte dem ved hjælp af slutningen af et 5 mL sprøjte stemplet.
- Skyl si og røret flere gange med 1-2 mL af celle isolation buffer, indtil alle celler er skyllet ind i røret. Kassér celle sien og centrifugeres celler ved 350 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten.
- Resuspenderes celle med 5 mL kold (4 ° C) ammonium-chlorid-kalium (ACK) lysing buffer (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2-7.4) og forsigtigt bland dem i 2 min. tilføje 10 mL af komplet RPMI medier til at neutralisere ACK buffer og straks centrifugeres celler ved 350 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten efter centrifugeringen.
3. isolering af CD4 + T-celler ved hjælp af magnetiske CD4 Microbeads og en celle adskillelse kolonne
- Resuspenderes celle i 5 mL af celle isolation buffer. Filtrer cellesuspension ved hjælp af en forudgående separation filter (30 μm) ind i en ny 15-mL-rør til at fjerne eventuelle rester.
- Tage 10 μl af cellesuspension og foretage en 10 x fortynding ved at tilføje 90 μL af bufferen. Tag 10 μl af de fortyndede cellesuspension og bland det med 10 μL trypan blå til celle optælling. Tælle celler i en hemocytometer til at bestemme udbyttet af levedygtige celler.
- Der centrifugeres celler ved 350 x g i 5 min. ved 4 ° C, og supernatanten.
- Resuspend celler i 90 μL af bufferen pr. 107 celler. Der tilsættes 10 μL af magnetiske CD4 microbeads pr. 107 celler. Inkuber celler i 15 min. ved 4 ° C. For optimale resultater, bland cellesuspension forsigtigt hvert 5 min under inkubation.
- Selvom cellerne inkubere, placere en adskillelse kolonne på den magnetiske stå. Pre våd kolonnen med 2 mL buffer.
- For enden af celle/perle inkubation cellerne vaskes med 5 mL buffer og centrifugeres dem ved 350 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten.
- Resuspend celler i 1 mL buffer, indlæse prøven i kolonnen celle adskillelse, og lad det flyde igennem. Brug en 15 mL centrifugeglas for at indsamle CD4-celle brøkdel. Der tilsættes 1 mL buffer til at vaske reservoiret, før det er tørt. Gentag trinnet vask 2 x.
- Fjern kolonnen celle adskillelse fra den magnetiske stå og placere den på en ny 15 mL-centrifugerør. Der tilsættes 2 mL af celle isolation buffer til kolonnen celle adskillelse og anvende stemplet fast for at tvinge cellerne af kolonnen.
- Der centrifugeres brøkdel på 350 x g i 5 min. ved 4 ° C til indhente CD4 + celler. Supernatanten.
4. rensning af Naive CD4 + T-celler (CD4+CD25-CD44loCD62LHej) af fluorescens-aktiveret celle sortering og THGM differentiering
- Resuspenderes opnåede CD4 + celler i 500 µL af buffer. Bland cellerne med et fluorescerende-konjugerede antistoffer blanding indeholdende CD4-PerCp (2,8 µg/mL), CD44-APC (2.4 µg/mL), CD25-PE (2 µg/mL), og CD62L-FITC (10 µg/mL) (tabel 1). Inkuber celler på isen i 20-30 min, mens beskytte dem mod lys.
Bemærk: Koncentrationen af antistoffer var optimeret tidligere i laboratoriet. Antallet af antistoffer opført er celler fra 1 – 2 mus. - Efter inkubation, cellerne vaskes med 5 mL buffer og centrifugeres celler ved 350 x g i 5 min. ved 4 ° C.
- Supernatanten og resuspend celler i 500 µL af buffer. Filtrere de celler igen ved hjælp af en nylon mesh.
- Overføre cellesuspension til FACS tube til celle sortering. Precoat samling FACS rør med 500 µL af buffer.
- Få et CD4+CD25-CD44loCD62LHej befolkning (af naive CD4+ T celler) af FACS sortering. Gate på CD4+CD25- første, og vælg derefter CD44loCD62LHej celler fra denne population.
- Indsamle naive CD4+ T celle fraktioner i en ny 15-mL-centrifugerør. Der centrifugeres celler ved 350 x g i 5 min. ved 4 ° C, og supernatanten.
- Resuspend naive CD4 + T-celler i en koncentration på 106 celler/mL i komplet RPMI medier indeholdende 50 µM β-mercaptoethanol.
- Opsug de anti-CD3e antistoffer bruges for precoating i 48-godt plade. Frø 0,25 mio (250 µL) celler i hver brønd med IL-7 (2 ng/mL), anti-CD28 (1 µg/mL), og anti-IFNγ (10 µg/mL) (tabel 1).
Bemærk: Koncentrationen af cytokin og antistoffer var optimeret tidligere i laboratoriet for en THGM Celledifferentiering. - Inkuber celler ved 37 ° C med 5% CO2 i 3 dage. Ændre ikke mediet under inkubation.
5. analyse af musen THGM celler genereret In Vitro
- Ved hjælp af et mikroskop, kontrollere Celledifferentiering 3 d efter differentiering. Høste cellerne og centrifugeres dem ved 350 x g i 5 min. ved 4 ° C. Vaske celler 2 x med komplet RPMI medier.
Bemærk: Differentierede celler er større i størrelse end naiv CD4 + T-celler. - Resuspend celler i 1 mL af komplet RPMI medier. Tag 10 μL cellesuspension og bland det godt med 10 μL trypan blå til at bestemme den celle nummer med en hemocytometer. Opdele differentierede celler i tre potions for en restimulering og analyse.
Bemærk: Intracellulære cytokin farvning og ELISA assays kræver ≥0.5 million celler, og qPCR analyse kræver ≥ 1 million celler. -
For intracellulære cytokin farvning, restimulere celler med phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) (100 ng/mL) og ionomycin (1 μg/mL) i nærværelse af en protein transport inhibitor (1 µL/mL) for 4-6 h.
- Høste cellerne og bejdse dem med anti-CD4 antistof (PerCP-konjugeret, 0,2 mg/mL, 1: 100 fortynding; eller FITC-konjugeret, 0,5 mg/mL, 1: 100 fortynding) i 30 min.
- Fix cellerne med 200 μl af fiksering buffer til 20-60 min. Efter fiksering, vask celler 2 x med 1 mL af permeabilization buffer.
- Udføre intracellulær farvning med antistoffer mod GM-CSF (PE-konjugeret, 0,2 mg/mL, 1: 100 fortynding), IL-17A (FITC-konjugeret, 0,5 mg/mL, 1: 100 fortynding; APC-conjugated, 0,2 mg/mL, 1: 100 fortynding), IL-4 (APC-konjugeret, 0,2 mg/mL, 1: 100 fortynding) og IFNγ (APC-konjugeret, 0,2 mg/mL, 1: 100 fortynding; PE-conjugated, 0,2 mg/mL, 1: 100 fortynding) i 30 min. i mørke.
- For en qPCR analyse af cytokin genekspression af differentierede celler, aktivere celler med plade-bundet anti-CD3e (3 μg/mL) (precoating plade som beskrevet i trin 1.3). På 3 h efter stimulering, høste celler for at isolere total RNA ved hjælp af en phenol RNA udvinding reagens til at forberede qPCR cDNA. Primere og program, der bruges til qPCR er angivet i tabel 2 og 3, henholdsvis.
- Til analyse af cytokin protein sekretion af differentierede celler restimulere celler med plade-bundet anti-CD3e (3 μg/mL) i 24 timer (precoating plade som beskrevet i trin 1.3). Høste cellekultur supernatanten for IL-17 og GM-CSF ELISA til at bestemme deres koncentrationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Naive CD4 + T celler isoleret fra to 8-uge-forhenværende mandlige C57BL/6 mus var opdelt i tre dele. En del af cellerne var opdeles i THGM celler efter protokollen beskrevet. En anden del blev kulturperler under en THGM betingelse i nærværelse af anti-IL-4 antistof (10 µg/mL) for at teste indflydelse af en IL-4 blokade i differentieringen af THGM. Den sidste del var kulturperler under TH17 differentiering betingelse (3 µg/mL anti-CD3e, 1 µg/mL anti-CD28, 10 ng/mL TGFβ, 30 ng/mL IL-6, 10 µg/mL anti-IFNγ og 10 µg/mL anti-IL-4). Efter 3 dage af differentiering, blev cellerne høstet og restimuleret analysere cytokin udtryk af intracellulære cytokin farvning, qPCR og ELISA. Resultater fra intracellulære cytokin farvning og FACS analyse viste, at omkring 55% af cellerne kulturperler THGM differentiering betingelse var GM-CSF-udtrykker celler (figur 1A), mens kun omkring 2% af celler differentierede under THudtrykt 17 tilstand GM-CSF. Desuden, resulterede i forhold til den TH17 differentiering betingelse, som genereres 8.17% IL-17-producerende celler, THGM differentiering betingelse kun i omkring 1% af IL-17-udtrykker celler. På de to differentiering betingelser testet, kun en lille brøkdel af cellerne udtrykt IFNγ (< 1%). Derudover få IL-4-udtrykker T celler (< 1%) blev set i THGM eller TH17 kultur (figur 1B). Disse resultater viste, at bruger beskrevet THGM celle differentiering betingelse, vi har med succes genereret T helper celler, der overvejende udtrykker GM-CSF.
Den succesfulde differentiering af THGM celler blev yderligere bekræftet af resultaterne fra qPCRs og ELISA-undersøgelser for at undersøge udtryk for GM-CSF, IL-17 på både RNA og protein niveau i de differentierede celler. De genererede THGM celler havde et betydeligt højere udtryk for Csf2 , men en meget lavere udtryk for Il17 i forhold til TH17 celler (figur 2A). Som vist i figur 2B, blev GM-CSF protein opdaget i kultur analysere fra både THGM og TH17 celler. Dog, koncentrationen af GM-CSF i THGM kultur supernatanten var omkring tre af der i TH17 celler. Derudover var proteiner af IL-17 (figur 2B), IFNγ og IL-4 målbart i THGM cellekultur supernatanten. Da RORγt er blevet identificeret som master transskription faktor af TH17 celler, mens STAT3 og STAT5 har vist sig at have en stor betydning i udviklingen af TH17 og THgenetisk modificerede celler, henholdsvis, vi undersøgt deres mRNA udtryk i de THGM og TH17 celler. Det blev konstateret, at THGM celler havde et betydeligt lavere udtryk for Rorc og en højere Stat5 udtryk end TH17 celler (figur 3). Interessant, THGM celler havde en lidt lavere (men ikke signifikant) udtryk af Stat3 gen sammenlignet med TH17 celler. Disse resultater viste, at selv om THGM og TH17 differentiering er underlagt forskellige transcriptional faktorer, de kan dele visse fælles træk.
Figur 1: THGM celler overvejende udtrykkelige GM-CSF. THGM og TH17 celler blev høstet på dag 3 efter differentiering. (A) For 5 h, cellerne var restimuleret med PMA og ionomycin i overværelse af en protein transport hæmmer. Udtryk af GM-CSF, IL-17, og IFNγ blev analyseret af intracellulære cytokin farvning fulgt ved flowcytometri. (B) den IL-4 og IFNγ udtryk af TH17 eller THGM celler blev analyseret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Udtryk af IL-17, IFNγ og GM-CSF i TH17 og THGM celler. THGM og TH17 celler blev høstet og restimuleret med plade-bundet anti-CD3e, 3 dage efter differentiering. (A) celler blev høstet for at isolere RNA til cDNA forberedelse, 3 h efter stimulering. Udtryk for Ifng, Il-17og Csf2 var bestemt af en kvantitativ real-time PCR (qPCR). (B) kultur supernatanten blev høstet på 24 h efter stimulation, til at bestemme koncentrationen af GM-CSF i THgenetisk modificerede celler, eller IL-17 i TH17 celler ved ELISA. (** p < 0,01, *** p < 0,001.) Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Rorc, Stat3, og Stat5 genekspression i TH17 og THGM celler. Differentierede THGM og TH17 celler blev høstet og restimulated med plade-bundet anti-CD3e til 3 h. Total RNA blev isoleret at forberede cDNA. Rorc, Stat3og Stat5 udtrykkene var bestemt af qPCR. (* p < 0,05, ** p < 0,01; NS = ikke betydelig.) Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Navn | Stock koncentration | arbejde koncentration | Fortynding | bind i 500 μL farvning buffer |
| CD4-PerCp | 0,2 mg/mL | 2.8 μg/mL | 1:71 | 7 ΜL |
| CD44-APC | 0,2 mg/mL | 2.4 μg/mL | 1:83 | 6 ΜL |
| CD25-PE | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | 5 ΜL |
| CD62L-FITC | 0,5 mg/mL | 10 μg/mL | 1:50 | 10 ΜL |
| GM-CSF-PE | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| IL-17A-FITC | 0,5 mg/mL | 5 μg/mL | 1: 100 | |
| IL-17A-APC | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| IFNΓ-APC | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| IFNΓ-PE | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| IL-4-APC | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| CD4-FITC | 0,5 mg/mL | 5 μg/mL | 1: 100 | |
| IL-7 | 20 μg/mL | 2 ng/mL | 1: 10000 | |
| Anti-CD28 | 0,5 mg/mL | 1 μg/mL | 1: 500 | |
| Anti-IFNγ | 1 mg/mL | 10 μg/mL | 1: 100 |
Tabel 1: Brugt cytokiner og antistoffer.
| Primer | Sekvens | |
| Ifng Fremad | 5'-TCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAA-3' | |
| Ifng Omvendt | 5'-TGGCTCTGCAGGATTTTCATG-3' | |
| Il-17 Fremad | 5'-CTCCAGAAGGCCCTCAGACTAC-3' | |
| Il-17 Omvendt | 5'-AGCTTTCCCTCCGCATTGACACAG-3' | |
| Csf2 Fremad | 5'-TTTACTTTTCCTGGGCATTG-3' | |
| Csf2 Omvendt | 5'-TAGCTGGCTGTCATGTTCAA-3' | |
| Rorc Fremad | 5'-TTTGGAACTGGCTTTCCATC-3' | |
| Rorc Omvendt | 5'-AAGATCTGCAGCTTTTCCACA-3' | |
| Stat3 Fremad | 5'-TGGCCCTTTGGAATGAAGGGTACA-3' | |
| Stat3 Omvendt | 5'-CACTGATGTCCTTTTCCACCCAAGT-3' | |
| Stat5 Fremad | 5'-TGCCCGGCTGGAACTACACCTT-3' | |
| Stat5 Omvendt | 5'-ATGCCCCCGATTTCCGAGTCAC-3' | |
Tabel 2: Primere for qPCR.
| trin | Temp. (° C) | tid | Gentag | |
| 1 | 95 | 2 min | ||
| 2 | 95 | 3 s | ||
| 3 | 60 | 30 s | trin 2 og 3, 39 gange | Læs plade |
| 4 | 65-95 | 5 s | trin 4, 30 gange, + 0,5 ° C hvert Gentag | Læs plade |
Tabel 3: PCR program til at vurdere genekspression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskrev vi en protokol for en in vitro- THGM differentiering fra mus naive CD4 + celler, efterfulgt af en analyse af de differentierede celler til at validere metoden. Af note, kan både milt og lymfeknuder bruges til naive CD4 + T-celle rensning og THGM differentiering. Cytokin udtryk bestemmes af intracellulære cytokin farvning kombineret med flowcytometri viste, at omkring 55% af celler blev tilskyndet til at blive GM-CSF-udtrykker celler under THGM tilstand (figur 1A). I forhold til celler under TH17 differentiering tilstand, indeholdt de celler, der opdelte THGM betingelse en baggrundsniveau af befolkningens IL-17-udtrykke; dog er il17 genekspression ikke målbart af qPCR (figur 2A).
Interessant, på trods af tilføjelsen af en IFNγ neutraliserende antistof, vi opdaget et lavt niveau af Ifng mRNA udtryk i både TH17 og THgenetisk modificerede celler, og mindre end 1% af THGM cellerne var udtryk for IFNγ celler. (Figur 1 - 2). Dette kunne skyldes en utilstrækkelig mængde af IFNγ-neutraliserende antistof bruges i betingelsen THGM eller til en eventuel kontaminering af medfødte immunceller (det er næsten umuligt at få 100% ren naive CD4 + T-celler), der er fastsat et spor mængde af IL-12 for den mulige TH1 celle generation. Det er også muligt at THGM tilstand vi brugte ikke var i stand til helt at slukke omskrivning af Ifng. Vi vil løse dette problem i fremtiden. Ikke desto mindre blev IFNγ protein ikke fundet i kultur analysere THGM eller TH17 ved ELISA.
I protokollen præsenteres her, brugte vi kun en blokering af IFNγ antistof sammen med IL-7 THGM differentiering. Efter 3 dage af differentiering under denne betingelse, mere end 50% af cellerne udtrykt GM-CSF, men ikke IL-17, IL-4 eller IFNγ (figur 1). Desuden udtryk for Rorc, i genet der koder RORγt, som er afgørende for Th17 differentiering9, var betydeligt lavere i de THGM celler i forhold til der TH17 celler (figur 3). Denne protokol er derfor en mere effektiv metode for generation af GM-CSF-udtrykker T celler end en anden rapporteret tidligere10. Vores resultater viste også, at ud over renheden af naive T celler og IL-7 signalering, forebyggelse af IFNγ udtryk for T-celle differentieringen er en nøgle til THGM generation.
Den fremherskende udtryk af GM-CSF celler, der blev genereret ved hjælp af den beskrevne protokol demonstreret den succesfulde differentiering af THGM. Vi vil gerne påpege, at kvaliteten af cytokiner og antistoffer fra forskellige firmaer eller endda af forskellige partier fra samme firma kan ikke være den samme. Vi anbefaler derfor, at antallet af cytokiner og antistoffer bruges i T hjælper Celledifferentiering bør testes for at finde den optimale tilstand.
I Resumé, THgenetisk modificerede celler, der blev genereret ved hjælp af denne protokol udtrykke et minimalt niveau af IL-17, IL-4, eller IFNγ. Vi er overbeviste om, at denne protokol fungerer godt i generering af GM-CSF-udtrykker THGM celler in vitro. Denne metode kan bruges til yderligere undersøgelse af THGM celler under forskellige forhold såsom autoimmune neuroinflammation, herunder eksperimentelle autoimmune encephalomyelitis (EAE) biologi i mus og menneskelige multipel sklerose, hvor GM-CSF spiller en vigtig rolle i patogenesen11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National University Health System of Singapore (T1-2014 okt-12 og T1-2015 Sep-10).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Biowest | L0500-500 | |
| FBS Heat Inactivated | Capricorn | FBS-HI-12A | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10 | Diluted to 1x PBS in sterile water |
| EDTA | 1st Base | BUF-1053-100ml-pH8.0 | |
| 10x ACK buffer | Biolegend | 420301 | diluted in sterile water |
| Cell strainer | SPL Life Sciences | 93070 | |
| CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T | |
| Centrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5810R | |
| Sony SY3200 cell sorter | Sony | Sony SY3200 cell sorter | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 210261 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| FACS tube | Corning | 352054 | |
| 24 well cell culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 | eBioscience | 46-0041-82 | |
| PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) | eBioscience | 12-0251-82 | |
| anti-human/mouse CD44 APC | eBioscience | 17-0441-82 | |
| anti-mouse CD62L FITC | eBioscience | 11-0621-85 | |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | 640010 | |
| Hyclone Trypan Blue Solution | GE healthcare Life Sciences | SV30084.01 | |
| microscope | Nikon | Nikon Elipse TS100 | |
| Purified anti-mouse CD3e antibody | Biolegend | 100314 | |
| Purified hamster anti-mouse CD28 | BD Biosciences | 553295 | |
| Purified Rat anti-mouse IFNγ | eBioscience | 16-7312-85 | |
| Purified anti-mouse IL-4 Antibody | Biolegend | 504102 | |
| Recombinant Mouse IL-7 Protein | R&D system | 407-ML | |
| recombinant human TGF-beta | R&D system | 240-B-010 | |
| PMA | Merck Millipore | 19-144 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| GolgiPlug protein transport inhibitor | BD Biosciences | 51-2301KZ | |
| Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| anti-mouse GM-CSF PE | eBioscience | 12-7331-82 | |
| FITC anti-mouse IL-17A | Biolegend | 506908 | |
| APC anti-mouse IFN-gamma | Biolegend | 505810 | |
| GO Taq qPCR master mix | Promega | A6002 | |
| mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! | invitrogen | 88-7334-88 | |
| Mouse IL-17A Uncouted ELISA | invitrogen | 88-7371-22 |
References
- Zhu, J., Paul, W. E. CD4 T cells: fates, functions, and faults. Blood. 112, 1557-1569 (2008).
- Kara, E. E., et al. Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity. PLoS Pathogens. 10, e1003905 (2014).
- Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. Tumor Immunology meets...Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells. Oncoimmunology. 6, e1356149 (2017).
- Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).
- Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).
- Sheng, W., et al. STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation. Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).
- Codarri, L., et al. RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation. Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).
- El-Behi, M., et al. The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF. Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126, 1121-1133 (2006).
- Zhang, J., et al. A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF. Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).
- Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage. Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).
