Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att skilja murina granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T helper (THGM) celler från naiva CD4 + T-celler, inklusive isolering av naiva CD4 + T-celler, differentiering av THGM, och analys av differentierade THGM celler. Denna metod kan tillämpas på studier av förordningen och funktion av THGM celler.
Abstract
Den granulocyt-makrofag-granulocytkolonistimulerande faktorn (GM-CSF)-producerande T helper (THGM) cell är en nyligen identifierade T helper cell delmängd som huvudsakligen utsöndrar GM-CSF utan att producera interferon (IFN) γ eller interleukin (IL) -17 och finns att spela en viktig roll i de autoimmun neuroinflammation. En metod för isolering av naiva CD4 + T-celler från en enskild cell suspension av splenocytes och THGM cell generation från naiva CD4 + T-celler skulle vara en användbar teknik i studien av T-cell-medierad immunitet och autoimmuna sjukdomar. Här beskriver vi en metod som skiljer mus naiva CD4 + T-celler i THGM celler främjas av IL-7. Resultatet av differentieringen bedömdes genom analys av cytokiner uttrycket med hjälp av olika tekniker, inklusive intracellulära cytokin färgning kombinerade med flödescytometri, en kvantitativ realtids polymeras-kedjereaktion (PCR), och Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). Cirka 55% av cellerna med THGM differentiering-protokollet som beskrivs här, och uttryckte GM-CSF med en minimal uttryck av IFNα eller IL-17. Dominerande uttrycket av GM-CSF genom THGM celler bekräftades ytterligare analys av uttryck för GM-CSF, IFNα och IL-17 på både mRNA och protein nivåer. Således denna metod kan användas för att differentiera naiva CD4 + T-celler till THGM celler in vitro-, som kommer att vara användbar i studiet av THGM cellbiologi.
Introduction
CD4 + T helper (TH) celler är viktiga komponenter i immunsystemet, med avgörande roller i värd försvar mot mikrobiella patogener, i cancer surveillance, autoimmunitet1,2,3. Vid T-cell receptor (TCR) aktivering, naiva CD4 + T-celler kan differentieras i TH1, TH2, TH 17, eller regulatoriska T (Treg) celler under påverkan av olika cytokin FOI2,4, 5. nyligen en ny delmängd av TH celler, som huvudsakligen producerar GM-CSF, identifierades och heter THGM6. Differentiering av THGM celler drivs av IL-7 genom aktivering av en signal givare och en aktivator av transkription 5 (STAT5). Dessa celler uttrycker en stor mängd GM-CSF samtidigt ha ett lågt uttryck av andra TH-cell signatur cytokiner såsom IFNγ och IL-176. GM-CSF befanns spelar en avgörande roll i utvecklingen av CD4 + T cell-medierad neuroinflammation7,8. Jämfört med IFNγ - eller IL-17-uttryckande autoreaktiva T celler, celler GM-CSF-uttryckande T överförs till vildtyp (WT) möss orsakade en tidigare sjukdomsdebuten och högre sjukdomens svårighetsgrad. Dessutom misslyckades Csf2- / - T-celler att inducera experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) efter överförs adoptively till WT mottagare, medan T-celler saknar IFNγ eller IL-17A behållit förmågan att medla EAE7. Dessutom förbättras en blockad av GM-CSF med neutraliserande antikroppar EAE sjukdom svårighetsgrad8. Dessutom resulterade en brist på STAT5 i T-celler i möss i en minskad THGM generation, och därmed i ett motstånd av möss till EAE utveckling6. Dessa resultat understryker vikten av GM-CSF-uttryckande TH celler i autoimmuna neuroinflammatoriska sjukdomen. Således, att fastställa en metod för att skilja GM-CSF-uttryckande TH -celler från naiva CD4 + T-celler skulle vara viktigt i studien av patogenesen vid autoimmuna neuroinflammation och T cellmedierade immunsvaret. Men ett protokoll som effektivt genererar THGM celler från murina naiva CD4 + inte har fastställts.
Här presenterar vi en metod som skiljer murina THGM celler från naiva CD4 + T-celler. Det här protokollet beskriver hela förfarandet, inklusive utvinning av mjälte från musen, utarbetandet av en encellig suspension, CD4 positiva val, cellen fluorescens-aktiverat sortering (FACS) och cellen TH differentiering och analys. De differentierade T-hjälpare cellerna analyseras av intracellulära cytokin färgning kombinerade med flödescytometri att bestämma cytokin uttrycket på enskild cell nivå, genom en kvantitativ realtids-PCR att bestämma cytokin uttrycket på mRNA-nivå, och med ELISA att bedöma cytokin uttrycket på proteinnivå. Denna metod kan tillämpas på studier THGM cellbiologi under olika förhållanden, såsom EAE, där GM-CSF spelar en viktig roll i patogenesen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla möss som används i detta protokoll var på C57BL/6 genetiska bakgrunden och inrymt särskilda villkor patogenfria vid National University of Singapore. Alla experimenten utfördes med hjälp av protokoll som godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén av National University of Singapore.
1. reagens och Material förberedelse
- Förbereda 500 mL fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) som innehåller 2% fetalt bovint serum (FBS) och 1 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA).
Obs: Håll bufferten på is under hela förfarandet för optimalt resultat. - Förbereda 50 mL av komplett RPMI media som innehåller RPMI 1640, 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin. Använda komplett RPMI media som innehåller 50 µM β-merkaptoetanol för THGM celldifferentiering. Lägg till de β-merkaptoetanol i dragskåp.
- Förbereda 7,5 mL av blandningen anti-CD3e antikroppar genom spädning av anti-CD3e koncentrerade lager till 3 μg/mL i PBS. Coat 48 brunnar genom att lägga till 150 μL av antikropp blandningen till varje brunn och inkubera plattan vid 37 ° C i minst 1 h, eller vid 4 ° C över natten.
- Sterilisera ett par saxar och pincetter och hålla dem i 70% etanol mellan dissektioner.
2. beredning av murina Splenocytes
- Avliva musen (av 6 – 8 veckor gamla) med ett institutionellt-godkända CO2 kvävning eller cervikal dislokation. Spray musen med 70% etanol och montera den på en Polystyrol-block på ryggen. Flytta musen till biologiska säkerhetsdragskåp att fortsätta med följande steg.
- Håll huden med hjälp av ett par pincett och skära huden nedanför revbenen på vänster sida för ca 4 cm, med ett par saxar. Öppna den peritoneal sac för att exponera mjälte och Använd steril pincett för att extrahera mjälte.
- Placera en sil med 70 μm i cellen på en 50 mL tub och pre blöt det med 2 mL buffert. Placera mjälte på cell silen (2 – 3 mjälte för en cell SIL) och lös upp dem med i slutet av en 5 mL sprutkolven.
- Skölj den SIL och tube flera gånger med 1 – 2 mL cell isolering buffert tills alla celler spolas in i röret. Kassera cell silen och centrifugera cellerna på 350 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
- Återsuspendera cellpelleten med 5 mL kall (4 ° C) ammonium-klorid-kalium (ACK) lyseringslösning buffert (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA, pH 7,2-7,4) och blanda dem försiktigt för 2 min. Tillsätt 10 mL av komplett RPMI media att neutralisera ACK buffert och omedelbart Centrifugera cellerna på 350 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten efter centrifugeringen.
3. isolering av CD4 + T-celler med hjälp av magnetiska CD4 mikrokulor och en Cell Separation kolumn
- Återsuspendera cellpelleten i 5 mL cell isolering buffert. Filtrera cellsuspension med en före separation filter (30 μm) in i en ny 15mL tub att ta bort eventuellt skräp.
- Ta 10 μL av cellsuspensionen och göra en 10 x utspädning genom att lägga till 90 μl buffert. Ta 10 μL av utspädda cellsuspensionen och blanda det med 10 μL av trypan blå för cell inventering. Räkna cellerna i en hemocytometer att bestämma avkastningen av viabla celler.
- Centrifugera cellerna vid 350 x g i 5 minuter vid 4 ° C och kasta bort supernatanten.
- Att resuspendera cellerna i 90 μl buffert per 107 celler. Tillsätt 10 μL av magnetiska CD4 mikrokulor per 107 celler. Inkubera cellerna för 15 min vid 4 ° C. För optimalt resultat, blanda cellsuspensionen försiktigt var 5: e minut under inkubation.
- Även om cellerna ruvning, placera en separation kolumn på magnetiska stativet. Pre våt kolumnen med 2 mL buffert.
- I slutet av cell/pärla ruvning, tvätta cellerna med 5 mL buffert och centrifugera dem 350 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
- Att resuspendera cellerna i 1 mL buffert, läsa in provet i kolumnen cellen separation och låt det flöda genom. Använd en 15 mL centrifugrör för att samla andelen CD4-Cells. Tillsätt 1 mL buffert att tvätta behållaren innan det är torrt. Upprepa tvätt 2 x.
- Ta bort kolumnen cellen separation från magnetiska stativet och placera den på en ny 15 mL centrifugrör. Tillsätt 2 mL av cell isolering buffert till kolumnen cellen separation och tillämpa kolven ordentligt för att tvinga cellerna av kolumnen.
- Centrifugera bråket vid 350 x g i 5 minuter vid 4 ° C att få CD4 +-celler. Kassera supernatanten.
4. rening av naiva CD4 + T-cellerna (CD4+CD25–CD44loCD62LHej) genom fluorescens-aktiverad Cell sortering och THGM differentiering
- Återsuspendera erhållna CD4 + cellpelleten i 500 µL buffert. Blanda cellerna med en fluorescerande-konjugerade antikroppar blandning som innehåller CD4-PerCp (2,8 µg/mL), CD44-APC (2,4 µg/mL), CD25-PE (2 µg/mL), och CD62L-FITC (10 µg/mL) (tabell 1). Inkubera cellerna på is för 20 – 30 min, samtidigt skydda dem från ljus.
Obs: Koncentrationen av antikroppar var optimerad tidigare i labbet. Antalet antikroppar som anges är för celler från 1 – 2 möss. - Efter inkubering, tvätta cellerna med 5 mL buffert och centrifugera cellerna på 350 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 500 µL buffert. Filtrera celler igen med en nylon mesh.
- Överföra cellsuspensionen till FACS rör för cellen sortera. Precoat samling FACS rören med 500 µL buffert.
- Erhålla en CD4+CD25–CD44loCD62LHej befolkningen (av naiva CD4+ T celler) av FACS sortering. Grind på CD4+CD25– första, och välj sedan CD44loCD62LHej celler från denna population.
- Samla naiva CD4+ T cell fraktioner i ett nytt 15 mL centrifugrör. Centrifugera cellerna vid 350 x g i 5 minuter vid 4 ° C och kasta bort supernatanten.
- Återsuspendera de naiva CD4 + T-cellerna med en koncentration på 106 celler/mL i komplett RPMI media som innehåller 50 µM β-merkaptoetanol.
- Aspirera anti-CD3e antikroppar används för precoating i 48-väl plattan. Utsäde 0,25 miljoner (250 µL) celler i varje brunn med IL-7 (2 ng/mL), anti-CD28 (1 µg/mL), och anti-IFNγ (10 µg/mL) (tabell 1).
Obs: Koncentrationerna av cytokin och antikroppar var optimerad tidigare i lab för en THGM celldifferentiering. - Inkubera cellerna vid 37 ° C med 5% CO2 i 3 dagar. Ändra inte mediet under ruvningen.
5. analys av musen THGM celler genereras In Vitro
- Kontrollera med hjälp av ett Mikroskop celldifferentiering 3 d efter differentiering. Skörda cellerna och centrifugera dem 350 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Tvätta cellerna 2 x med komplett RPMI media.
Obs: Differentierade celler är större än naiva CD4 + T-celler. - Att resuspendera cellerna i 1 mL av komplett RPMI media. Ta 10 μl cellsuspension och blanda väl med 10 μL av trypan blå att bestämma antalet cell med en hemocytometer. Dela differentierade celler i tre brygder för en restimulering och analys.
Obs: Intracellulära cytokin färgning och ELISA-analyser kräver ≥0, 5 miljoner celler, och qPCR-analys kräver ≥ 1 miljon celler. -
För intracellulära cytokin färgning, restimulera cellerna med phorbol 12-isopropylmyristat 13-acetat (PMA) (100 ng/mL) och ionomycin (1 μg/mL) i närvaro av ett protein transport hämmare (1 µL/mL) för 4-6 h.
- Skörda cellerna och färga dem med anti-CD4 antikropp (PerCP-konjugerad, 0,2 mg/mL, 1: 100 utspädning; eller FITC-konjugerad, 0,5 mg/mL, 1: 100 utspädning) för 30 min.
- Fixa cellerna med 200 μL av fixering buffert för 20 – 60 min. Efter fixeringen, tvätta cellerna 2 x med 1 mL permeabilisering buffert.
- Utföra intracellulära färgning med antikroppar mot GM-CSF (PE-konjugerad, 0,2 mg/mL, 1: 100 utspädning), IL-17A (FITC-konjugerad, 0,5 mg/mL, 1: 100 utspädning; APC-conjugated, 0,2 mg/mL, 1: 100 utspädning), IL-4 (APC-konjugerad, 0,2 mg/mL, 1: 100 utspädning) och IFNγ (APC-konjugerad, 0,2 mg/mL, 1: 100 utspädning; PE-conjugated, 0,2 mg/mL, 1: 100 utspädning) för 30 min i mörker.
- För en qPCR-analys av cytokin genuttrycket av differentierade celler, aktivera cellerna med plattan-bundna anti-CD3e (3 μg/mL) (precoating plattan enligt beskrivningen i steg 1.3). På 3 h efter stimulering, skörda cellerna för att isolera total-RNA med en fenol RNA extraktion reagens för att förbereda cDNA för qPCR. De primers och program som används för qPCR listas i tabellerna 2 och 3, respektive.
- För analys av cytokin protein utsöndringen av differentierade celler, restimulera cellerna med plattan-bundna anti-CD3e (3 μg/mL) för 24 h (precoating plattan enligt beskrivningen i steg 1.3). Skörda i cellkultur supernatant för IL-17 och GM-CSF ELISA att fastställa deras koncentrationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Naiva CD4 + T-celler som isolerats från två 8-vecka-gammal manliga C57BL/6 möss delades in i tre delar. En del av cellerna var differentieras efter THGM celler efter protokollet beskrivs. En annan del var odlade under ett THGM tillstånd i närvaro av anti-IL-4 antikropp (10 µg/mL) för att testa påverkan av en IL-4 blockad i differentieringen av THGM. Den sista delen var odlade under ett TH17 differentiering tillstånd (3 µg/mL anti-CD3e, 1 µg/mL anti-CD28, 10 ng/mL TGFβ, 30 ng/mL IL-6, 10 µg/mL anti-IFNγ och 10 µg/mL anti-IL-4). Efter 3 dagar av differentiering, var cellerna skördas och restimulerat för att analysera cytokin uttrycket av intracellulära cytokin färgning, qPCR och ELISA. Resultaten från den intracellulära cytokin färgning och FACS analys visade att ca 55% av cellerna odlade på THGM differentiering villkor var GM-CSF-uttryckande celler (figur 1A), medan endast cirka 2% av cellerna differentierade under THuttryckt 17 tillstånd GM-CSF. Dessutom resulterade jämfört med villkoret TH17 differentiering som genereras 8.17% IL-17-producerande celler, THGM differentiering villkoret endast i ungefär 1% av IL-17-uttryckande celler. Med de två differentiering testade, endast en bråkdel av cellerna uttryckt IFNγ (< 1%). Dessutom några IL-4-uttryckande T-celler (< 1%) sågs i THGM eller TH17 kultur (figur 1B). Dessa resultat visade att använda beskrivas THGM cell differentiering villkoret, har vi framgångsrikt att genereras T-hjälpare celler som huvudsakligen express GM-CSF.
Framgångsrika differentiering av THGM celler bekräftades ytterligare av resultaten från qPCRs och ELISA-analyser för att undersöka uttrycket av GM-CSF och IL-17 på både RNA och protein nivåer i differentierade celler. Genererade THGM cellerna hade en betydligt högre uttryck av Csf2 men en mycket lägre uttryck för Il17 jämfört TH17 celler (figur 2A). Som visas i figur 2B, upptäcktes GM-CSF protein i cellkulturer från både THGM och TH17 celler. Ändå, GM-CSF koncentrationen i THGM kultur supernatant var ungefär trefaldiga detta i TH17 celler. Dessutom var proteiner av IL-17 (figur 2B), IFNγ och IL-4 omätbara i de THGM cellkulturen supernatant. Eftersom RORγt har identifierats som den master transkriptionsfaktor TH17 celler, medan STAT3 och STAT5 har visat sig ha en stor betydelse i utvecklingen av TH17 och THGM celler, respektive, vi granskat deras mRNA uttryck i THGM och TH17 celler. Det konstaterades att THGM cellerna hade en betydligt lägre uttryck för Rorc och ett högre Stat5 uttryck än TH17 celler (figur 3). Intressant, THGM cellerna hade en något lägre (men ej signifikant) uttryck av den Stat3 gen jämfört med TH17 celler. Dessa resultat visade att även om THGM och TH17 differentiering regleras av olika transkriptionell faktorer, de kan dela vissa gemensamma funktioner.
Figur 1: THGM celler huvudsakligen express GM-CSF. THGM och TH17 celler skördats på dag 3 efter differentiering. (A) för 5 h, cellerna var restimulerat med PMA och ionomycin i närvaro av ett protein transport-hämmare. Uttrycket av GM-CSF, IL-17 och IFNγ analyserades av intracellulära cytokin färgning följt av flödescytometri. (B) The IL-4 och IFNγ uttryck av TH17 eller THGM celler analyserades. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Uttryck av IL-17, IFNγ och GM-CSF i TH17 och THGM celler. THGM och TH17 celler skördas och restimulerat med plattan-bundna anti-CD3e, 3 dagar efter differentiering. (A) celler skördats för att isolera RNA för cDNA förberedelse, 3 h efter stimulering. Uttrycken av Ifng, Il-17och Csf2 bestämdes genom en kvantitativ realtids-PCR (qPCR). (B), kulturen supernatant skördades på 24 h efter stimulering, att bestämma koncentrationen av GM-CSF i THGM celler, eller IL-17 i TH17 celler, med ELISA. (** p < 0,01, *** p < 0.001.) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Rorc, Stat3, och Stat5 genuttryck i TH17 och THGM celler. Differentierade THGM och TH17 celler skördats och restimulerat med plattan-bundna anti-CD3e för 3 h. Total-RNA isolerades att förbereda cDNA. Rorcoch Stat3 Stat5 uttrycken bestämdes av qPCR. (* p < 0,05, ** p < 0,01; NS = inte betydande.) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Namn | Beståndet koncentration | arbeta koncentration | Utspädning | volym i 500 μL färgning buffert |
| CD4-PerCp | 0,2 mg/mL | 2.8 μg/mL | 1:71 | 7 ΜL |
| CD44-APC | 0,2 mg/mL | 2,4 μg/mL | 1: 83 | 6 ΜL |
| CD25-PE | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | 5 ΜL |
| CD62L-FITC | 0,5 mg/mL | 10 μg/mL | 1:50 | 10 ΜL |
| GM-CSF-PE | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| IL-17A-FITC | 0,5 mg/mL | 5 μg/mL | 1: 100 | |
| IL-17A-APC | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| IFNΓ-APC | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| IFNΓ-PE | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| IL-4-APC | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| CD4-FITC | 0,5 mg/mL | 5 μg/mL | 1: 100 | |
| IL-7 | 20 μg/mL | 2 ng/mL | 1:10000 | |
| Anti-CD28 | 0,5 mg/mL | 1 μg/mL | 1: 500 | |
| Anti-IFNγ | 1 mg/mL | 10 μg/mL | 1: 100 |
Tabell 1: Används cytokiner och antikroppar.
| Primer | Sekvens | |
| Ifng Framåt | 5'-TCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAA-3' | |
| Ifng Omvänd | 5'-TGGCTCTGCAGGATTTTCATG-3' | |
| Il-17 Framåt | 5'-CTCCAGAAGGCCCTCAGACTAC-3' | |
| Il-17 Omvänd | 5'-AGCTTTCCCTCCGCATTGACACAG-3' | |
| Csf2 Framåt | 5'-TTTACTTTTCCTGGGCATTG-3' | |
| Csf2 Omvänd | 5'-TAGCTGGCTGTCATGTTCAA-3' | |
| Rorc Framåt | 5'-TTTGGAACTGGCTTTCCATC-3' | |
| Rorc Omvänd | 5'-AAGATCTGCAGCTTTTCCACA-3' | |
| Stat3 Framåt | 5'-TGGCCCTTTGGAATGAAGGGTACA-3' | |
| Stat3 Omvänd | 5'-CACTGATGTCCTTTTCCACCCAAGT-3' | |
| Stat5 Framåt | 5'-TGCCCGGCTGGAACTACACCTT-3' | |
| Stat5 Omvänd | 5'-ATGCCCCCGATTTCCGAGTCAC-3' | |
Tabell 2: Primers för qPCR.
| steg | Temp. (° C) | tid | Upprepa | |
| 1 | 95 | 2 min | ||
| 2 | 95 | 3 s | ||
| 3 | 60 | 30 s | steg 2 och 3, 39 gånger | Läs plattan |
| 4 | 65 – 95 | 5 s | steg 4, 30 gånger, + 0,5 ° C varje upprepa | Läs plattan |
Tabell 3: PCR-program för att bedöma genuttryck.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskrivs vi ett protokoll för en in vitro- THGM differentiering från mus naiva CD4 + celler, följt av en analys av differentierade cellerna att validera metoden. Notera, kan både mjälten och lymfkörtlarna användas för naiva CD4 + T cell rening och THGM differentiering. Cytokin uttrycket bestäms av intracellulära cytokin färgning kombinerat med flödescytometri som visade att ca 55% av cellerna förmåddes att bli GM-CSF-uttryckande celler på THGM villkor (figur 1A). De celler som differentierade på THGM villkor jämfört med celler under villkoret TH17 differentiering, och innehöll en bakgrundsnivå av en IL-17-uttryckande befolkning; il17 genuttrycket är dock påvisas med qPCR (figur 2A).
Intressant, trots tillägg av en IFNγ neutraliserande antikropp, vi upptäckt en låg nivå av Ifng mRNA uttryck i både TH17 och THGM cellerna, och mindre än 1% THGM celler var IFNγ-uttryckande celler. (Siffrorna 1 - 2). Detta kunde på grund av otillräckliga mängden IFNγ-neutraliserande antikropp användas i THGM skick, eller att en eventuell förorening av innate immuna celler (det är nästan omöjligt att få 100% ren naiva CD4 + T-celler) som gav ett spår belopp av IL-12 för möjliga TH1 cell generation. Det är också möjligt att villkoret THGM använde vi inte kunde helt stänga av transkriptionen av Ifng. Vi kommer att lösa problemet i framtiden. Dock upptäcktes inte IFNγ protein i cellkulturer av THGM eller TH17 av ELISA.
I protokollet presenteras här, använde vi bara en IFNγ-blockerande antikropp tillsammans med IL-7 för THGM differentiering. Efter 3 dagar av differentiering enligt detta villkor, mer än 50% av cellerna uttryckt GM-CSF, men inte IL-17, IL-4 eller IFNγ (figur 1). Dessutom ett uttryck för Rorc, genen som kodar RORγt, som är kritiska för Th17 differentiering9, var betydligt lägre i THGM cellerna jämfört som i TH17 celler (figur 3). Detta protokoll är därför en mer effektiv metod för generering av GM-CSF-uttryckande T-celler än en annan rapporterade tidigare10. Våra resultat visade också att förutom renheten av naiva T-celler och IL-7 signalering, förebyggande av IFNγ-uttryckande T celldifferentiering är en nyckel för THGM generation.
Dominerande uttrycket av GM-CSF cellerna som genererades genom att använda protokollet beskrivs visat framgångsrika differentiering av THGM. Vi vill påpeka att kvaliteten på cytokiner och antikroppar från olika företag eller ens i olika satser från samma företag kan inte vara samma. Därför rekommenderar vi att antalet cytokiner och antikroppar används i T helper celldifferentiering bör testas för att ta reda på det optimala tillståndet.
Sammanfattningsvis, THGM celler som genererades med hjälp av detta protokoll uttrycker en miniminivå av IL-17, IL-4 eller IFNγ. Vi är övertygade om att detta protokoll fungerar bra i generera GM-CSF-uttryckande THGM celler in vitro. Denna metod kan användas att ytterligare studera biologi THGM celler i olika tillstånd såsom autoimmuna neuroinflammation, inklusive experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) hos möss och mänskliga multipel skleros, där GM-CSF spelar en viktig roll i patogenesen11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av bidrag från National University Health System av Singapore (T1-2014 okt-12 och T1-2015 Sep-10).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Biowest | L0500-500 | |
| FBS Heat Inactivated | Capricorn | FBS-HI-12A | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10 | Diluted to 1x PBS in sterile water |
| EDTA | 1st Base | BUF-1053-100ml-pH8.0 | |
| 10x ACK buffer | Biolegend | 420301 | diluted in sterile water |
| Cell strainer | SPL Life Sciences | 93070 | |
| CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T | |
| Centrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5810R | |
| Sony SY3200 cell sorter | Sony | Sony SY3200 cell sorter | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 210261 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| FACS tube | Corning | 352054 | |
| 24 well cell culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 | eBioscience | 46-0041-82 | |
| PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) | eBioscience | 12-0251-82 | |
| anti-human/mouse CD44 APC | eBioscience | 17-0441-82 | |
| anti-mouse CD62L FITC | eBioscience | 11-0621-85 | |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | 640010 | |
| Hyclone Trypan Blue Solution | GE healthcare Life Sciences | SV30084.01 | |
| microscope | Nikon | Nikon Elipse TS100 | |
| Purified anti-mouse CD3e antibody | Biolegend | 100314 | |
| Purified hamster anti-mouse CD28 | BD Biosciences | 553295 | |
| Purified Rat anti-mouse IFNγ | eBioscience | 16-7312-85 | |
| Purified anti-mouse IL-4 Antibody | Biolegend | 504102 | |
| Recombinant Mouse IL-7 Protein | R&D system | 407-ML | |
| recombinant human TGF-beta | R&D system | 240-B-010 | |
| PMA | Merck Millipore | 19-144 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| GolgiPlug protein transport inhibitor | BD Biosciences | 51-2301KZ | |
| Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| anti-mouse GM-CSF PE | eBioscience | 12-7331-82 | |
| FITC anti-mouse IL-17A | Biolegend | 506908 | |
| APC anti-mouse IFN-gamma | Biolegend | 505810 | |
| GO Taq qPCR master mix | Promega | A6002 | |
| mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! | invitrogen | 88-7334-88 | |
| Mouse IL-17A Uncouted ELISA | invitrogen | 88-7371-22 |
References
- Zhu, J., Paul, W. E. CD4 T cells: fates, functions, and faults. Blood. 112, 1557-1569 (2008).
- Kara, E. E., et al. Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity. PLoS Pathogens. 10, e1003905 (2014).
- Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. Tumor Immunology meets...Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells. Oncoimmunology. 6, e1356149 (2017).
- Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).
- Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).
- Sheng, W., et al. STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation. Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).
- Codarri, L., et al. RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation. Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).
- El-Behi, M., et al. The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF. Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126, 1121-1133 (2006).
- Zhang, J., et al. A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF. Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).
- Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage. Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).
