Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll zur murine granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T (THGM)-Helferzellen von naiven CD4 + T-Zellen, einschließlich Isolierung von naiven CD4 + T-Zellen, Differenzierung von THGM, zu differenzieren und Analyse von differenzierten Zellen THGM. Diese Methode kann auf Studien der Verordnung und Funktion von THGM Zellen angewendet werden.
Abstract
Der Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF)-Herstellung von T-Helfer (THGM)-Zelle ist eine neu identifizierten T Helfer Zelle Teilmenge, die überwiegend sondert GM-CSF ohne Herstellung von Interferon (IFN) γ oder Interleukin (IL)-17 und wird festgestellt, dass Spielen Sie eine wesentliche Rolle in der autoimmunen Neuroinflammation. Eine Methode zur Isolierung von naiven CD4 + T-Zellen aus einer einzelligen Aussetzung der splenocyten und THGM Zellgeneration von naiven CD4 + T-Zellen wäre eine nützliche Technik in der Studie von T zellvermittelte Immunität und Autoimmunerkrankungen. Hier beschreiben wir eine Methode, die Maus naive CD4 + T-Zellen in THGM Zellen gefördert durch IL-7 unterscheidet. Das Ergebnis der Unterscheidung wurde durch die Analyse der Zytokine Ausdruck mit verschiedenen Techniken, einschließlich intrazelluläre Zytokin Färbung kombiniert mit Durchflusszytometrie, eine quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (PCR), beurteilt und Enzym-linked Immunosorbentprobe Assays (ELISA). Mit dem T-H-GM Differenzierung Protokoll wie beschrieben hier, etwa 55 % der Zellen ausgedrückt GM-CSF mit einem minimalen Ausdruck IFNα oder IL-17. Der vorherrschende Ausdruck von GM-CSF von THGM Zellen wurde durch die Analyse des Ausdrucks von GM-CSF, IFNα und IL-17 mRNA und Protein Ebene bestätigt. So können mit dieser Methode, naive CD4 + T-Zellen, T zu unterscheidenHGM Zellen in Vitro, die werden in der Studie von THGM Zellbiologie.
Introduction
CD4 + T-Helferzellen (TH) sind wesentliche Bestandteile des Immunsystems, da entscheidende Rollen in der Wirt Verteidigung gegen mikrobielle Krankheitserreger, in der Krebs-Überwachung, und Autoimmunität1,2,3. Bei der T-Zell-Rezeptor (TCR) Aktivierung naive CD4 + T-Zellen differenzieren sich in TH1, TH2, TH 17 oder regulatorischen T (Treg) Zellen unter dem Einfluss von verschiedenen Zytokin Milieus2,4, 5. vor kurzem eine neue Untergruppe von TH Zellen, die überwiegend GM-CSF produziert, wurde identifiziert und benannt THGM6. Die Differenzierung der Zellen THGM treibt IL-7 durch die Aktivierung von einem Signalwandler und Aktivator der Transkription 5 (STAT5). Diese Zellen eine große Menge von GM-CSF zum Ausdruck bringen und dabei eine geringe Expression von anderen T-H-Handy-Signatur Zytokine wie z. B. IFNγ und IL-176. GM-CSF erwies sich als eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von CD4 + T-Zell-vermittelten Neuroinflammation7,8. GM-CSF mit dem Ausdruck T Zellen im Vergleich zu IFNγ oder IL-17-exprimierenden autoreaktiven T-Zellen, in Wildtyp übertragen (WT) Mäusen verursacht ein früher Krankheitsbeginn und höheren Schweregrad der Erkrankung. Darüber hinaus scheiterte Csf2- / - T-Zellen induzieren Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) nach adoptively auf WT-Empfänger übertragen werden, während T-Zellen IFNγ oder IL-17A fehlt die Fähigkeit, EAE7vermitteln beibehalten. Darüber hinaus verbessert eine Blockade von GM-CSF mit neutralisierenden Antikörpern EAE Krankheit schwere8. Darüber hinaus führte ein Mangel an STAT5 in T-Zellen in Mäusen in einer verminderten THGM-Generation und somit in einen Widerstand von den Mäusen EAE Entwicklung6. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung von GM-CSF mit dem Ausdruck TH Zellen in autoimmune schwere Krankheit. So wäre eine Methode um GM-CSF mit dem Ausdruck TH Zellen von naiven CD4 + T-Zellen zu unterscheiden in der Untersuchung der Pathogenese von Autoimmunerkrankungen Neuroinflammation und T-Zell-vermittelten Immunantwort wichtig. Allerdings erzeugt ein Protokoll, das effizient THGM Zellen aus murinen naive CD4 + nicht etabliert hat.
Hier präsentieren wir eine Methode, die naive CD4 + T-Zellen murine THGM Zellen unterscheidet. Dieses Protokoll beschreibt das gesamte Verfahren, einschließlich der Entnahme der Milz von der Maus, die Vorbereitung eine einzellige Suspension, die CD4 positive Selektion, die Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS) und die TH Zelle Differenzierung und Analyse. Die differenzierte T-Helferzellen werden analysiert, indem intrazellulären Zytokin Färbung kombiniert mit Durchflusszytometrie zu bestimmen, die Cytokine Ausdruck Ebene einzellige durch eine quantitative Echtzeit-PCR die Zytokin-Expression auf mRNA-Ebene zu bestimmen und von ELISA die Zytokin-Expression auf proteinebene zu bewerten. Diese Methode kann auf Studien von THGM Zellbiologie unter verschiedenen Bedingungen, wie z. B. EAE, angewendet werden, wo GM-CSF eine wichtige Rolle in der Pathogenese spielt.
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Protocol
Alle Mäuse, die in diesem Protokoll verwendeten waren auf den genetischen Hintergrund der C57BL/6 und unter bestimmten Pathogen-freies Bedingungen an der National University of Singapore untergebracht. Alle Experimente wurden durchgeführt mit Protokollen, die durch die institutionellen Animal Care and Use Committee von der National University of Singapore genehmigt.
(1) Reagenz und Vorbereitung des Materials
- Bereiten Sie 500 mL von Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), enthält 2 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 mM Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA vor).
Hinweis: Halten Sie den Puffer auf dem Eis während des gesamten Verfahrens um optimale Ergebnisse zu erzielen. - Bereiten Sie 50 mL komplette RPMI Medium mit RPMI 1640, 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin vor. Verwenden Sie vollständige RPMI Medium mit 50 µM β-Mercaptoethanol fürH-GM T-Zell-Differenzierung. Fügen Sie der β-Mercaptoethanol in einer Dampfhaube.
- Bereiten Sie 7,5 mL eines Anti-CD3e-Antikörper-Gemisches durch Anti-CD3e konzentriert Lager 3 μg/ml in PBS verdünnen. Beschichten Sie 48-Well Platten zu, indem jedes gut 150 μL der Antikörper-Mischung hinzufügen und über Nacht inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für mindestens 1 h oder bei 4 ° C.
- Sterilisieren Sie ein paar Scheren und Pinzetten zu und halten sie in 70 % igem Ethanol zwischen Sezierungen.
2. Vorbereitung des murinen Splenocyten
- Einschläfern die Maus (von 6 – 8 Wochen alt) mit einem institutionell genehmigt CO2 Erstickung oder Zervikale Dislokation. Sprühen Sie die Maus mit 70 % Ethanol und Klebe es auf polystyrolblock auf dem Rücken. Übertragen Sie die Maus zu einem biologischen Sicherheitsschrank mit den folgenden Schritten fortfahren.
- Halten Sie die Haut mit einer Pinzette und schneiden Sie die Haut unterhalb des Brustkorbs auf der linken Seite für ca. 4 cm, mit einer Schere. Öffnen Sie die peritoneale Sac zu entlarven die Milz und sterilen Pinzette verwenden, um die Milz zu extrahieren.
- Legen Sie ein 70 μm Zelle Sieb auf eine 50 mL-Tube und vornässen Sie es mit 2 mL des Puffers. Legen Sie die Milz auf der Zelle-Sieb (2 – 3 Milz für eine Zelle Sieb) und mazeriert mit Ende des Spritzenkolbens eine 5 mL.
- Spülen Sie den Filter und Schlauch mehrmals mit 1 – 2 mL Zelle isoliert Puffer bis alle Zellen in das Rohr gespült werden. Entsorgen Sie die Zelle Sieb und Zentrifugieren der Zellen bei 350 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
- Aufschwemmen der Zelle Pellet mit 5 mL kalt (4 ° C) Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK) Lyse Puffer (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0, 1 mM Na2EDTA; pH 7,2-7,4) und vorsichtig mischen sie für 2 min. Fügen Sie 10 mL komplette RPMI-Medien, die ACK zu neutralisieren Puffer und sofort Zentrifugieren der Zellen bei 350 X g für 5 min bei 4 ° C. Entsorgen Sie den überstand nach der Zentrifugation.
3. Isolation der CD4 + T-Zellen mit magnetischen CD4 Microbeads und eine Zelle Trennsäule
- Die Zelle Pellet in 5 mL Zelle isoliert Puffer aufzuwirbeln. Filtern Sie die Zellsuspension mit Vorabscheidung Filter (30 μm) in eine neue 15-mL-Tube, um alle Ablagerungen zu entfernen.
- 10 μL der Zellsuspension und machen Sie eine 10 X Verdünnung durch Zugabe von 90 μL des Puffers. Nehmen Sie 10 μl verdünnter Zellsuspension und mischen Sie es mit 10 μL Trypan blau für Zellzählung. Zählen der Zellen in einer Hemocytometer, die Rendite der lebensfähigen Zellen bestimmen.
- Zentrifugieren der Zellen bei 350 X g für 5 min bei 4 ° C und den überstand verwerfen.
- Die Zellen in 90 μL des Puffers pro 107 Zellen aufzuwirbeln. Fügen Sie 10 μL der magnetischen CD4 Microbeads pro 107 Zellen. Inkubieren Sie die Zellen für 15 min bei 4 ° c Um optimale Ergebnisse zu erzielen Mischen der Zellsuspension sanft alle 5 Minuten während der Inkubation.
- Während die Zellen Inkubation werden, setzen Sie eine Trennsäule auf die magnetische Halterung. Vornässen der Spalte mit 2 mL des Puffers.
- Am Ende der Zelle/Wulst Inkubation waschen Sie die Zellen mit 5 mL des Puffers und Zentrifugieren sie 350 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
- Aufschwemmen der Zellen in 1 mL des Puffers, laden Sie die Probe in die Zelle Trennsäule und lassen Sie es fließen. Verwenden Sie ein 15-mL Zentrifugenröhrchen, um den Anteil der CD4-Zellen zu sammeln. Fügen Sie 1 mL des Puffers, das Reservoir zu waschen, bevor er trocken ist. Wiederholen Sie Waschschritt 2 X.
- Entfernen Sie die Zelle Trennsäule aus der Magnetstativ und legen Sie es auf einem neuen Zentrifugenröhrchen 15 mL. Die Zelle Trennsäule 2 mL Zelle isoliert Puffer hinzu und wenden Sie den Kolben fest, um die Zellen aus der Spalte zu erzwingen.
- Zentrifugieren Sie den Bruch bei 350 X g für 5 min bei 4 ° C, CD4 +-Zellen zu erhalten. Verwerfen Sie den überstand.
4. Reinigung der Naive CD4 + T-Zellen (CD4+CD25–CD44loCD62LHallo) durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung und THGM Differenzierung
- Die erhaltenen CD4 + Zellen Pellet in 500 µL Puffer aufzuwirbeln. Mischen Sie die Zellen mit einem Leuchtstoff-konjugierten Antikörpern Gemisch mit CD4-PerCp (2,8 µg/mL), CD44-APC (2,4 µg/mL), CD25-PE (2 µg/mL), und CD62L-FITC (10 µg/mL) (Tabelle 1). Inkubieren Sie die Zellen für 20-30 min auf Eis und vor Licht zu schützen.
Hinweis: Die Konzentrationen der Antikörper wurden bisher im Labor optimiert. Die Anzahl der Antikörper aufgeführt ist für Zellen von 1 – 2 Mäuse. - Nach der Inkubation der Zellen mit 5 mL des Puffers zu waschen und Zentrifugieren der Zellen bei 350 X g für 5 min bei 4 ° c
- Den überstand verwerfen und Zellen in 500 µL Puffer aufzuwirbeln. Filtern Sie die Zellen wieder mit einem Nylon-Netzgewebe.
- Übertragen Sie die Zellsuspension auf einen FACS-Schlauch für Zellsortierung. Precoat FACS primärgefäßen mit 500 µL Puffer.
- Erhalten eine CD4+CD25–CD44loCD62LHallo Bevölkerung (der naiven CD4+ T Zellen) durch FACS sortieren. Tor auf CD4+CD25– erste, und wählen Sie dann CD44loCD62LHallo Zellen aus dieser Population.
- Sammeln Sie die naiven CD4+ T Zelle Fraktionen in einem neuen 15-mL Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren der Zellen bei 350 X g für 5 min bei 4 ° C und den überstand verwerfen.
- Aufzuwirbeln Sie die naive CD4 + T-Zellen in einer Konzentration von 106 Zellen/mL in komplette RPMI Medium mit 50 µM β-Mercaptoethanol.
- Aspirieren Sie die Anti-CD3e-Antikörper für die anschwemmung in der 48-Well-Platte verwendet. 0,25 Millionen (250 µL) Samenzellen in jede Vertiefung mit IL-7 (2 ng/mL), Anti-CD28 (1 µg/mL) und Anti-IFNγ (10 µg/mL) (Tabelle 1).
Hinweis: Die Konzentrationen von Antikörpern und Zytokinen wurden bisher im Labor für ein THGM Zelldifferenzierung optimiert. - 3 Tage inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C mit 5 % CO2 . Ändern Sie das Medium nicht während der Inkubation.
5. Analyse der Maus THGM Zellen erzeugt In Vitro
- Überprüfen Sie unter Verwendung eines Mikroskops, die Zelldifferenzierung 3 d nach der Differenzierung. Ernten der Zellen und Zentrifugieren sie 350 X g für 5 min bei 4 ° C. Waschen Sie die Zellen 2 X mit kompletten RPMI-Medien.
Hinweis: Differenzierte Zellen sind größer als naive CD4 + T-Zellen. - Die Zellen in 1 mL der komplette RPMI Medien aufzuwirbeln. Nehmen Sie 10 μl Zellsuspension und mischen Sie es gut mit 10 μL Trypan blau, um die Anzahl von Zellen mit einer Hemocytometer zu bestimmen. Teilen Sie differenzierte Zellen in drei Tränke für eine Restimulation und Analyse.
Hinweis: Intrazelluläre Zytokin Färbung und ELISA-Assays erfordern ≥0.5 Millionen Zellen und qPCR Analyse erfordert ≥ 1 Million Zellen. -
Für intrazelluläre Zytokin Färbung, restimulieren Zellen mit Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA) (100 ng/mL) und Ionomycin (1 μg/mL) in Anwesenheit von Protein-Transport-Inhibitor (1 µL/mL) für 4 – 6 h.
- Ernten der Zellen und Färben sie mit Anti-CD4 Antikörper (PerCP konjugiert, 0,2 mg/mL, 1: 100 Verdünnung; oder FITC-konjugiert, 0,5 mg/mL, 1: 100 Verdünnung) für 30 min.
- Befestigen Sie die Zellen mit 200 μl Puffer Fixierung für 20 – 60 min. Waschen Sie nach der Fixierung der Zellen 2 X mit 1 mL Permeabilisierung Puffer.
- Führen Sie intrazelluläre Färbung mit Antikörper gegen GM-CSF (PE-konjugiert, 0,2 mg/mL, 1: 100 Verdünnung), IL-17A (FITC-konjugiert, 0,5 mg/mL, 1: 100 Verdünnung; APC-conjugated, 0,2 mg/mL, 1: 100 Verdünnung), IL-4 (APC-konjugiert, 0,2 mg/mL, 1: 100 Verdünnung) und IFNγ (APC-konjugiert, 0,2 mg/mL, 1: 100 Verdünnung; PE-conjugated, 0,2 mg/mL, 1: 100 Verdünnung) für 30 min in der Dunkelheit.
- Aktivieren Sie für eine qPCR-Analyse der Zytokin-Genexpression durch differenzierte Zellen die Zellen mit Platte gebundene Anti-CD3e (3 μg/mL) (auftragwerk der Platte wie unter Punkt 1.3 beschrieben). Um 3 Uhr nach der Stimulation Ernte der Zellen, um die Gesamt-RNS mit ein Phenol RNA-Extraktion-Reagenz zur cDNA Vorbereitung das qPCR zu isolieren. Die Grundierungen und Programm für die qPCR verwendet sind in den Tabellen 2 und 3, aufgeführt.
- Restimulieren Sie für die Analyse der Zytokin Protein Sekretion von differenzierten Zellen Zellen mit Platte gebundene Anti-CD3e (3 μg/mL) für 24 h (auftragwerk der Platte wie unter Punkt 1.3 beschrieben). Ernten Sie die Zellkultur überstand für IL-17 und GM-CSF ELISA ihre Konzentration zu bestimmen.
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Representative Results
Naive CD4 + T-Zellen, die aus zwei 8 Wochen alten männlichen C57BL/6 Mäusen isoliert wurden in drei Teile unterteilt. Ein Teil der Zellen unterschieden wurde in THGM Zellen nach dem Protokoll beschrieben. Ein weiterer Teil wurde unter einer Bedingung THGM in Anwesenheit von Anti-IL-4 Antikörper (10 µg/mL) kultiviert, um den Einfluss einer IL-4-Blockade bei der Differenzierung von THGM zu testen. Der letzte Teil war unter einer TH17 Differenzierung Bedingung (3 µg/mL Anti-CD3e, 1 µg/mL Anti-CD28, 10 ng/mL TGFβ, 30 ng/mL IL-6, 10 µg/mL Anti-IFNγ und 10 µg/mL Anti-IL-4) kultiviert. Nach 3 Tagen der Differenzierung wurden die Zellen geerntet und restimuliert um zu analysieren, die Zytokin-Expression von intrazellulären Zytokin Färbung, qPCR und ELISA. Ergebnisse aus der intrazellulären Zytokin Färbung und FACS Analyse gezeigt, dass etwa 55 % der Zellen kultiviert unter der Bedingung THGM Differenzierung GM-CSF-exprimierenden Zellen (Abbildung 1A), während nur etwa 2 % der Zellen unter der THdifferenziert ausgedrückt 17 Zustand GM-CSF. Darüber hinaus ergaben sich im Vergleich zu den TH17 Differenzierung Zustand, der 8,17 % IL-17-produzierenden Zellen erzeugt, die THGM Differenzierung Bedingung nur in etwa 1 % der IL 17-exprimierenden Zellen. Unter den zwei Differenzierung Bedingungen getestet, nur ein kleiner Bruchteil der Zellen ausgedrückt IFNγ (< 1 %). Darüber hinaus einige IL-4 mit dem Ausdruck T-Zellen (< 1 %) wurden in THGM oder TH17 Kultur (Abbildung 1 b) gesehen. Diese Ergebnisse zeigten, dass wir mit den beschriebenen THGM Zelle Differenzierung Zustand, erfolgreich T-Helfer-Zellen generiert haben, die überwiegend GM-CSF Ausdrücken.
Die erfolgreiche Differenzierung von THGM Zellen bestätigte weitere Ergebnisse von qPCRs und ELISA Tests, um den Ausdruck von GM-CSF und IL-17 auf RNA und Protein Ebenen in den differenzierten Zellen zu untersuchen. Die generierten THGM-Zellen hatten einen deutlich höheren Ausdruck Csf2 aber ein viel niedrigere Ausdruck der Il17 im Vergleich zu der TH17 Zellen (Abbildung 2A). Wie in Abbildung 2 bdargestellt, wurde GM-CSF Protein in Kultur Überstände von THGM und TH17 Zellen nachgewiesen. Dennoch war die GM-CSF-Konzentration in der THGM Kultur überstand über dreifache davon in TH17 Zellen. Darüber hinaus wurden Proteine von IL-17 (Abb. 2 b), IFNγ und IL-4 in der THGM Zellkultur überstand nicht nachweisbar. Da RORγt als master Transkriptionsfaktors TH17 identifiziert wurde Zellen, während STAT3 und STAT5 haben gezeigt, dass eine große Bedeutung in der Entwicklung von TH17 und THGM Zellen, bzw. haben, untersuchten wir die mRNA Ausdruck in den THGM und TH17 Zellen. Es wurde festgestellt, dass die THGM-Zellen einen deutlich geringeren Ausdruck des Rorc und einen höheren Stat5 Ausdruck als TH17 hatten Zellen (Abbildung 3). Interessanterweise hatten die THGM Zellen etwas niedrigeren (aber nicht signifikanten) Ausdruck des Stat3 gen im Vergleich zu der TH17 Zellen. Diese Ergebnisse zeigten, dass, obwohl der T-H-GM und der TH17 Differenzierung unterliegen verschiedenen transcriptional Faktoren, können sie einige gemeinsame Merkmale teilen.
Abbildung 1: THGM Zellen vorwiegend ausdrückliche GM-CSF. THGM und TH17 Zellen wurden am 3. Tag nach der Differenzierung geerntet. (A) für 5 h wurden die Zellen mit PMA und Ionomycin in Anwesenheit einer Protein-Transport-Inhibitor restimuliert. Der Ausdruck von GM-CSF, IL-17 und IFNγ war von intrazellulären Zytokin Färbung gefolgt von Durchflusszytometrie analysiert. (B) die IL-4 und IFNγ Ausdruck von TH17 oder THGM Zellen wurde analysiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Expression von IL-17, IFNγ und GM-CSF in TH17 und THGM Zellen. THGM und TH17 Zellen wurden geerntet und restimuliert mit Platte gebundene Anti-CD3e, 3 Tage nach der Differenzierung. (A) Zellen wurden geerntet, um RNA cDNA Vorbereitung, 3 h nach der Stimulation zu isolieren. Die Ausdrücke der Ifng, Il-17und Csf2 wurden durch eine quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) ermittelt. (B) die Kultur überstand war bei 24 h nach der Stimulation zur Bestimmung der Konzentration von GM-CSF in THGM Zellen geerntet oder IL-17 tH17 Zellen von ELISA. (** p < 0,01, *** p < 0,001.) Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Rorc, Stat3, und Stat5 Genexpression in TH17 und THGM Zellen. Differenzierte THGM und TH17 Zellen wurden geerntet und restimulated mit Platte gebundene Anti-CD3e für 3 h Gesamt-RNS isoliert, cDNA vorzubereiten. Die Rorc, Stat3und Stat5 Ausdrücke wurden durch qPCR ermittelt. (* p < 0,05, ** p < 0,01; NS = nicht signifikante.) Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Name | Lager Konzentration | Arbeiten-Konzentration | Verdünnung | Volumen in 500 μl Puffer Färbung |
| CD4-PerCp | 0,2 mg/mL | 2,8 μg/mL | 1:71 | 7 ΜL |
| CD44-APC | 0,2 mg/mL | 2.4 μg/mL | 1:83 | 6 ΜL |
| CD25-PE | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | 5 ΜL |
| CD62L-FITC | 0,5 mg/mL | 10 μg/mL | 01:50 | 10 ΜL |
| GM-CSF-PE | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| IL-17A-FITC | 0,5 mg/mL | 5 μg/mL | 1: 100 | |
| IL-17A-APC | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| IFNΓ-APC | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| IFNΓ-PE | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| IL-4-APC | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| CD4-FITC | 0,5 mg/mL | 5 μg/mL | 1: 100 | |
| IL-7 | 20 μg/mL | 2 ng/mL | 1: 10000 | |
| Anti-CD28 | 0,5 mg/mL | 1 μg/mL | 1: 500 | |
| Anti-IFNγ | 1 mg/mL | 10 μg/mL | 1: 100 |
Tabelle 1: Zytokine und Antikörper verwendet.
| Grundierung | Sequenz | |
| IFNG Nach vorne | 5'-TCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAA-3 " | |
| IFNG Rückgängig zu machen | 5'-TGGCTCTGCAGGATTTTCATG-3 " | |
| Il-17 Nach vorne | 5'-CTCCAGAAGGCCCTCAGACTAC-3 " | |
| Il-17 Rückgängig zu machen | 5'-AGCTTTCCCTCCGCATTGACACAG-3 " | |
| Csf2 Nach vorne | 5'-TTTACTTTTCCTGGGCATTG-3 " | |
| Csf2 Rückgängig zu machen | 5'-TAGCTGGCTGTCATGTTCAA-3 " | |
| RORC Nach vorne | 5'-TTTGGAACTGGCTTTCCATC-3 " | |
| RORC Rückgängig zu machen | 5'-AAGATCTGCAGCTTTTCCACA-3 " | |
| STAT3 Nach vorne | 5'-TGGCCCTTTGGAATGAAGGGTACA-3 " | |
| STAT3 Rückgängig zu machen | 5'-CACTGATGTCCTTTTCCACCCAAGT-3 " | |
| Stat5 Nach vorne | 5'-TGCCCGGCTGGAACTACACCTT-3 " | |
| Stat5 Rückgängig zu machen | 5'-ATGCCCCCGATTTCCGAGTCAC-3 " | |
Tabelle 2: Primer für qPCR.
| Schritt | Temp. (° C) | Zeit | Wiederholen Sie die | |
| 1 | 95 | 2 min | ||
| 2 | 95 | 3 s | ||
| 3 | 60 | 30 s | Schritt 2 und 3, 39 mal | Platte zu lesen |
| 4 | 65-95 | 5 s | Schritt 4, 30-mal + 0,5 ° C wiederholen | Platte zu lesen |
Tabelle 3: PCR-Programm zur Bewertung der Genexpression.
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Discussion
Wir beschrieben hier ein Protokoll von einer in-vitro- THGM Differenzierung von Maus-naive CD4 +-Zellen, gefolgt von einer Analyse der differenzierten Zellen, die Methode zu validieren. Der Hinweis Milz und Lymphknoten naive CD4 + T-Zell-Reinigung und THGM Differenzierung einsetzbar. Die Cytokine Ausdruck von intrazellulären Zytokin Färbung kombiniert mit Durchflusszytometrie zeigte, dass etwa 55 % der Zellen bestimmt waren veranlasst, GM-CSF-exprimierenden Zellen unter der Bedingung THGM (Abbildung 1A) werden. Im Vergleich zu Zellen unter der Bedingung TH17 Differenzierung, enthalten die Zellen, die unter der Bedingung THGM differenziert Hintergrundkonzentration der IL-17 mit dem Ausdruck der Bevölkerung; die il17 Genexpression ist jedoch nicht nachweisbar durch qPCR (Abbildung 2A).
Interessant ist, trotz der Zugabe von einem IFNγ neutralisierende Antikörper, wir ein niedriges Niveau der Ifng mRNA Expression in TH17 und die THGM-Zellen erkannt und weniger als 1 % der THGM Zellen wurden IFNγ exprimierenden Zellen. (Abbildungen 1 - 2). Dies könnte aufgrund der unzureichenden Menge an IFNγ-neutralisierende Antikörper verwendet werden, in dem THGM Zustand oder eine mögliche Kontaminierung der angeborenen immunen Zellen (es ist fast unmöglich, 100 % reine naive CD4 + T-Zellen zu erhalten), die eine Spur an IL-12 Menge für mögliche TH1 Zellgeneration. Es ist auch möglich, dass der THGM Zustand benutzten wir nicht in der Lage, die Transkription des Ifngkomplett abgeschaltet war. Wir werden dieses Problem in Zukunft zu beheben. Dennoch war IFNγ Protein in der Kultur-Überstände von THGM oder TH17 von ELISA nicht erkannt.
In dem hier vorgestellten Protokoll verwendet wir nur einen IFNγ-blockierende Antikörper zusammen mit IL-7 für die Differenzierung von THGM. Nach 3 Tagen der Differenzierung unter dieser Bedingung, mehr als 50 % der Zellen ausgedrückt, GM-CSF, aber nicht IL-17, IL-4 oder IFNγ (Abbildung 1). Darüber hinaus der Ausdruck des Rorc, das Gen kodiert, die RORγt, das ist entscheidend für die Th17 Differenzierung9, war 17 Zellen (Abbildung 3) in den im Vergleich zu der THTHGM-Zellen deutlich. Dieses Protokoll ist daher eine effizientere Methode zur Erzeugung von GM-CSF mit dem Ausdruck T-Zellen als ein anderes zuvor10gemeldet. Unsere Ergebnisse zeigten auch, dass neben der Reinheit der naiven T-Zellen und IL-7-Signalisierung, die Vermeidung von IFNγ exprimierenden T-Zell-Differenzierung einen Schlüssel für THGM-Generation ist.
Der vorherrschende Ausdruck der GM-CSF Zellen, die erstellt wurden mit dem beschriebenen Protokoll zeigte die erfolgreiche Differenzierung von THGM. Wir möchten darauf hinweisen, dass die Qualität der Zytokine und Antikörper aus verschiedenen Unternehmen oder sogar von verschiedenen Chargen des gleichen Unternehmens möglicherweise nicht das gleiche. Wir empfehlen daher, die Anzahl der Zytokine und Antikörper, die in T-Helfer-Zell-Differenzierung verwendet getestet werden sollten, um den optimalen Zustand zu erfahren.
Zusammenfassend lässt sich sagen, THGM-Zellen, die mit diesem Protokoll generiert wurden zum Ausdruck bringen ein Mindestmaß an IL-17, IL-4 oder IFNγ. Wir sind zuversichtlich, dass dieses Protokoll funktioniert gut bei der Schaffung von GM-CSF mit dem Ausdruck THGM Zellen in Vitro. Diese Methode kann verwendet werden um weiter zu studieren, die Biologie des THGM Zellen bei verschiedenen Erkrankungen wie Autoimmunerkrankungen Neuroinflammation, einschließlich der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) bei Mäusen und menschlichen Multiple Sklerose, wo GM-CSF spielt eine wichtige Rolle in der Pathogenese11.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National University Health System of Singapore (T1-2014 12. Oktober und T1-2015-10 Sep).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Biowest | L0500-500 | |
| FBS Heat Inactivated | Capricorn | FBS-HI-12A | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10 | Diluted to 1x PBS in sterile water |
| EDTA | 1st Base | BUF-1053-100ml-pH8.0 | |
| 10x ACK buffer | Biolegend | 420301 | diluted in sterile water |
| Cell strainer | SPL Life Sciences | 93070 | |
| CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T | |
| Centrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5810R | |
| Sony SY3200 cell sorter | Sony | Sony SY3200 cell sorter | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 210261 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| FACS tube | Corning | 352054 | |
| 24 well cell culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 | eBioscience | 46-0041-82 | |
| PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) | eBioscience | 12-0251-82 | |
| anti-human/mouse CD44 APC | eBioscience | 17-0441-82 | |
| anti-mouse CD62L FITC | eBioscience | 11-0621-85 | |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | 640010 | |
| Hyclone Trypan Blue Solution | GE healthcare Life Sciences | SV30084.01 | |
| microscope | Nikon | Nikon Elipse TS100 | |
| Purified anti-mouse CD3e antibody | Biolegend | 100314 | |
| Purified hamster anti-mouse CD28 | BD Biosciences | 553295 | |
| Purified Rat anti-mouse IFNγ | eBioscience | 16-7312-85 | |
| Purified anti-mouse IL-4 Antibody | Biolegend | 504102 | |
| Recombinant Mouse IL-7 Protein | R&D system | 407-ML | |
| recombinant human TGF-beta | R&D system | 240-B-010 | |
| PMA | Merck Millipore | 19-144 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| GolgiPlug protein transport inhibitor | BD Biosciences | 51-2301KZ | |
| Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| anti-mouse GM-CSF PE | eBioscience | 12-7331-82 | |
| FITC anti-mouse IL-17A | Biolegend | 506908 | |
| APC anti-mouse IFN-gamma | Biolegend | 505810 | |
| GO Taq qPCR master mix | Promega | A6002 | |
| mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! | invitrogen | 88-7334-88 | |
| Mouse IL-17A Uncouted ELISA | invitrogen | 88-7371-22 |
References
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- Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. Tumor Immunology meets...Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells. Oncoimmunology. 6, e1356149 (2017).
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- Codarri, L., et al. RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation. Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).
- El-Behi, M., et al. The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF. Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126, 1121-1133 (2006).
- Zhang, J., et al. A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF. Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).
- Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage. Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).
