Summary
نقدم هنا، بروتوكولا للتفريق بين الخلايا مساعد (GMحتي) T جرانولوسيتيماكروفاجيكولونيستيمولاتينجفاكتوربرودوسينج مورين من السذاجة خلايا CD4 + T، بما في ذلك عزل من السذاجة خلايا CD4 + T، التفريق بين الآلية العالمية،حتي وو تحليل متمايزة جنرال موتورزحتي الخلايا. يمكن تطبيق هذا الأسلوب للدراسات المتعلقة بتنظيم ووظيفة خلايا تيحالآلية العالمية.
Abstract
عامل المحببات-بلعم-مستعمرة-حفز (GM-CSF)-إنتاج الخلية مساعد (GMحتي) T عبارة عن مجموعة فرعية خلية مساعد تي محددة حديثا التي يغلب عليها الطابع تفرز GM-CSF دون إنتاج الانترفيرون (IFN) γ أو انترلوكين (إيل)-17 وهو العثور على تلعب دوراً أساسيا في نيوروينفلاميشن الذاتية. وستكون وسيلة لعزل خلايا CD4 + T ساذجة من تعليق خلية واحدة من سبلينوسيتيس وجنرال موتورزحتي الجيل خلية من خلايا CD4 + T السذاجة تقنية مفيدة في دراسة الخلية T بوساطة الحصانة وأمراض المناعة الذاتية. هنا يصف لنا أسلوب الذي يميز الماوس السذاجة خلايا CD4 + T إلى خلايا تيحجنرال موتورز تعززه إيل-7. وقيمت نتائج المفاضلة بتحليل التعبير السيتوكينات باستخدام تقنيات مختلفة، بما في ذلك داخل الخلايا سيتوكين تلطيخ جنبا إلى جنب مع التدفق الخلوي، كمية في الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، و فحوصات الممتز المرتبط بالانزيم (ELISA). استخدام بروتوكول التمايز تيحالآلية العالمية كما هو موضح هنا، أعرب حوالي 55% الخلايا GM-CSF مع تعبير الحد أدنى من IFNα أو إيل-17. وأكد التعبير السائد عن GM-CSF بخلايا تيحالآلية العالمية كذلك تحليل التعبير عن GM-CSF، و IFNα، وايل-17 على الصعيدين مرناً والبروتين. وهكذا، يمكن استخدام هذا الأسلوب التفريق بين خلايا CD4 + T السذاجة أن تيحجنرال موتورز الخلايا في المختبر، التي ستكون مفيدة في دراسة بيولوجيا الخلية GMحتي.
Introduction
خلايا CD4 + T مساعد (رح) مكونات أساسية للنظام المناعي، ولها دور حاسم في الدفاع المضيف ضد مسببات الأمراض الميكروبية وفي مراقبة السرطان والمناعة الذاتية1،،من23. عند تنشيط مستقبلات (تكر) خلية T، يمكن أن تكون متباينة السذاجة خلايا CD4 + "تي" في تيح1،حتي 2، تيح 17، أو تنظيم خلايا T (تريغ) تحت تأثير سيتوكين مختلف الأوساط2،4، 5. في الآونة الأخيرة، تم التعرف على مجموعة فرعية جديدة من خلايا تيح ، التي تنتج غالباً GM-CSF، واسمه جنرال موتورزحتي6. التفريق بين الخلايا المعدلة وراثياحتي تحركها إيل-7 من خلال تفعيل محول الإشارات ومنشط للنسخ 5 (STAT5). هذه الخلايا التعبير عن كمية كبيرة من GM-CSF حين وجود تعبير منخفضة من غيرها تيح-خلية السيتوكينات التوقيع مثل IFNγ وايل-176. تم العثور على GM-CSF تلعب دوراً حاسما في تطوير خلايا CD4 + T الخلية بوساطة نيوروينفلاميشن7،8. مقارنة مع IFNγ--أو إيل-17-الإعراب عن الخلايا أوتوريكتيفي T، معربا عن GM-CSF تي الخلايا المحولة إلى البرية من نوع الفئران (WT) تسبب ظهور أمراض سابقة وشدة المرض أعلى. وبالإضافة إلى ذلك، فشل خلايا تي Csf2--/--حمل النخاع الذاتية التجريبية (إي) بعد نقله أدوبتيفيلي إلى المستلمين WT، بينما خلايا تي التي تفتقر إلى IFNγ أو إيل-17A الإبقاء على القدرة على التوسط EAE7. وعلاوة على ذلك، تحسن حصار GM-CSF باستخدام الأجسام المضادة لتحييد خطورة المرض إي8. وعلاوة على ذلك، عن نقص في STAT5 في خلايا تي في الفئران في جيل تيحجنرال موتورز تقلص، ومن ثم، في مقاومة الفئران ع التنمية6. هذه النتائج تؤكد أهمية التعبير عن GM-CSF تيح الخلايا في أمراض المناعة الذاتية نيوروينفلاماتوري. وهكذا، سيكون إنشاء طريقة للتفريق بين الخلايا معربا عن GM-CSF تيح من السذاجة خلايا CD4 + T هامة في دراسة إمراضية neuroinflammation الذاتية والاستجابات المناعية T الخلية بوساطة. ومع ذلك، بروتوكول أن كفاءة يولد الخلايا المعدلة وراثياحتي من السذاجة مورين CD4 + لم يثبت.
نقدم هنا أسلوب الذي يميز موريني جنرال موتورزحتي الخلايا من خلايا CD4 + T ساذجة. هذا البروتوكول وصف الإجراء بأكمله، بما في ذلك استخراج الطحال من الماوس، وإعداد تعليق خلية واحدة والتحديد خلايا CD4 إيجابية، والأسفار تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية)، والخلية تيح التمايز والتحليل. خلايا T المتباينة على مساعد يتم تحليلها بواسطة سيتوكين داخل الخلايا تلطيخ جنبا إلى جنب مع التدفق الخلوي لتحديد التعبير سيتوكين على مستوى خلية واحدة، قبل بكر كمية في الوقت الحقيقي لتحديد التعبير سيتوكين المستوى مرناً، و بإليزا لتقييم التعبير سيتوكين في مستوى البروتين. يمكن تطبيق هذا الأسلوب للدراسات المتعلقة ببيولوجيا الخلايا تيحالمعدلة وراثيا تحت ظروف مختلفة، مثل ع، حيث الآلية العالمية-الخدمات القطرية دوراً هاما في نشوء المرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الفئران المستخدمة في هذا البروتوكول على الخلفية الوراثية C57BL/6 ويضم تحت شروط معينة خالية من مسببات الأمراض في "جامعة سنغافورة الوطنية". جميع التجارب التي أجريت باستخدام البروتوكولات المعتمدة برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة "جامعة سنغافورة الوطنية".
1-كاشف وإعداد المواد
- إعداد 500 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) الذي يحتوي على 2% مصل بقرى الجنين (FBS) وحمض الإيثيلين 1 مم (يدتا).
ملاحظة: الاحتفاظ المخزن المؤقت على الجليد في جميع أنحاء الإجراء بأكمله لتحقيق أفضل النتائج. - إعداد 50 مل كاملة ربمي الوسائط التي تحتوي على ستربتوميسين البنسلين RPMI 1640 و 10% FBS و 1%. استخدام الوسائط ربمي الكامل الذي يحتوي على 50 ميكرومتر β-mercaptoethanol للتفريق بين الخلية GMحتي. إضافة β-mercaptoethanol في غطاء دخان.
- إعداد 7.5 مل من أن خليط الأجسام المضادة CD3e المضادة بإضعاف الأسهم المضادة-CD3e تتركز على 3 ميكروغرام/مل في برنامج تلفزيوني. معطف لوحات 48-جيدا بإضافة 150 ميكروليتر من خليط الأجسام المضادة لكل بئر واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية على الأقل 1 ح، أو عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- تعقيم زوج من مقص وملقط وإبقائها في الإيثانول 70% بين تشريح.
2-إعداد سبلينوسيتيس مورين
- Euthanize الماوس (من 6 – 8 أسابيع من العمر) استخدام الخنق2 CO الموافقة على المستوى المؤسسي أو التفكك عنق الرحم. رش الماوس مع الإيثانول 70% وجبل على كتلة البوليسترين على ظهرها. نقل الماوس لسلامة بيولوجية مجلس الوزراء المضي قدما في الخطوات التالية.
- اضغط الجلد باستخدام زوج من الملقط وقطع الجلد أسفل القفص الصدري على الجانب الأيسر لحوالي 4 سم، باستخدام زوج من مقص. فتح الكيس الصفاقى فضح الطحال واستخدام الملقط المعقم لاستخراج الطحال.
- ضع مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب 50 مل والرطب من قبل مع 2 مل من المخزن المؤقت. مكان في الطحال على مصفاة الخلية (2 – 3 الطحال لمصفاة خلية واحدة) ومسرات لهم استخدام نهاية المكبس حقنه 5 مل.
- شطف بمصفاة وأنبوب عدة مرات مع 1-2 مل من المخزن المؤقت لعزل الخلية حتى يتم مسح كافة الخلايا في الأنبوب. تجاهل مصفاة الخلية والطرد المركزي الخلايا في 350 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند بيليه الخلية مع 5 مل من الباردة (4 درجة مئوية) أمونيوم كلوريد--البوتاسيوم (ACK) ليسينج المخزن المؤقت (Cl 150 مم NH4، 10 مم كهكو3مم 0.1 غ2يدتا؛ الرقم الهيدروجيني 7.2 – 7.4) ومزجها برفق للحد الأدنى 2 إضافة 10 مل من الإعلام ربمي كاملة لتحييد ACK المخزن المؤقت والطرد المركزي فورا الخلايا في 350 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية بعد الطرد المركزي.
3-عزل خلايا CD4 + تي الخلايا CD4 المغناطيسية ميكروبيدس وعمود فصل خلية باستخدام
- ريسوسبيند بيليه الخلية في 5 مل من المخزن المؤقت لعزل الخلية. تصفية تعليق خلية استخدام عامل تصفية قبل انفصال (30 ميكرومتر) في أنبوب 15 مل جديد لإزالة أي حطام.
- تأخذ 10 ميكروليتر من تعليق خلية وجعل 10 x إضعاف عن طريق إضافة ميكروليتر 90 من المخزن المؤقت. تأخذ 10 ميكروليتر من تعليق خلية المخفف ومزجها مع 10 ميكروليتر من تريبان الأزرق لخلية العد. عد الخلايا في هيموسيتوميتير لتحديد عائد خلايا قابلة للحياة.
- الطرد المركزي الخلايا في 350 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وتجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند الخلايا في ميكروليتر 90 من المخزن المؤقت كل 107 الخلايا. إضافة 10 ميكروليتر من ميكروبيدس CD4 المغناطيسي الواحدة 107 الخلايا. احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. لتحقيق أفضل النتائج، مزيج تعليق خلية بلطف كل 5 دقائق أثناء الحضانة.
- بينما هي تفرخ الخلايا، ضع عمود فصل على الوقوف المغناطيسية. قبل الرطب العمود مع 2 مل من المخزن المؤقت.
- في نهاية الحضانة خلية/حبة، تغسل الخلايا مع 5 مل من المخزن المؤقت والطرد المركزي لهم في 350 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من المخزن المؤقت، تحميل النموذج إلى عمود فصل الخلية، والسماح لها بالتدفق من خلال. استخدام أنبوب الطرد 15 مل لجمع الكسر خلايا CD4. أضف 1 مل من المخزن المؤقت لغسل الخزان قبل أن تكون جافة. كرر الخطوة 2 x الغسيل.
- إزالة عمود فصل خلية من موقف المغناطيسية ووضعه في أنبوب الطرد مركزي 15 مل جديدة. إضافة 2 مل من المخزن المؤقت لعزل الخلية إلى عمود فصل الخلايا وتطبيق المكبس بقوة لإجبار الخلايا من العمود.
- الطرد المركزي الكسر في 350 x ز لمدة 5 دقائق عند درجة 4 مئوية للحصول على خلايا CD4 +. تجاهل المادة طافية.
4-تنقية خلايا CD4 + T ساذج (CD4+CD25–CD44لوCD62Lمرحبا) بتمايز الخلية الفرز وجنرال موتورزحتي Fluorescence المنشط
- ريسوسبيند بيليه خلايا CD4 + التي تم الحصول عليها في 500 ميليلتر من المخزن المؤقت. مزيج من الخلايا مع مزيج الأجسام مضادة مترافق الفلورسنت التي تحتوي على خلايا CD4-بيركب (2.8 ميكروغرام/مل)، CD44-آسيا والمحيط الهادئ (2.4 ميكروغرام/مل)، CD25-PE (2 ميكروغرام/مل)، و CD62L-فيتك (10 ميكروغرام/مل) (الجدول 1). احتضان الخلايا على الجليد لمدة 20-30 دقيقة، مع حماية لهم من الضوء.
ملاحظة: تم الأمثل تركيزات الأجسام المضادة سابقا في المعمل. عدد الأجسام المضادة المدرجة للخلايا من الفئران 1 – 2. - وبعد الحضانة، تغسل الخلايا مع 5 مل من المخزن المؤقت والطرد المركزي الخلايا في 350 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 500 ميليلتر من المخزن المؤقت. تصفية الخلايا مرة أخرى باستخدام شبكة من نايلون.
- نقل تعليق خلية إلى أنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية لفرز الخلايا. بركات أنابيب جمع نظام مراقبة الأصول الميدانية مع 500 ميليلتر من المخزن المؤقت.
- الحصول على خلايا CD4+CD25–CD44لوCD62Lمرحبا السكان (من السذاجة CD4+ تي الخلايا) بفرز نظام مراقبة الأصول الميدانية. بوابة على CD4+CD25– الأولى، ومن ثم حدد CD44لوCD62Lمرحبا الخلايا من هذه الفئة من السكان.
- جمع السذاجة CD4+ تي خلية الكسور في أنبوب 15 مل أجهزة الطرد مركزي جديدة. الطرد المركزي الخلايا في 350 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وتجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند الخلايا CD4 + T السذاجة بتركيز 106 خلايا/مل في إكمال ربمي الوسائط التي تحتوي على 50 ميكرومتر β-ميركابتوثانول.
- نضح الأجسام المضادة CD3e المضادة المستخدمة بريكواتينج في لوحة 48-جيدا. البذور 0.25 مليون (250 ميليلتر) خلايا في كل بئر مع 7-إيل (2 نانوغرام/ملليلتر)، مكافحة-CD28 (1 ميكروغرام/مل)، ومكافحة--IFNγ (10 ميكروغرام/مل) (الجدول 1).
ملاحظة: تم الأمثل تركيزات سيتوكين والأجسام المضادة سابقا في مختبر لتفريق خلية GMحتي. - احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 لمدة 3 أيام. لا تقم بتغيير في المتوسط خلال الاحتضان.
5-تحليل الخلايا المعدلة وراثيا الماوس تيحالمتولدة في المختبر
- استخدام مجهر، تحقق من التفريق بين الخلية 3 د بعد المفاضلة. حصاد الخلايا والطرد المركزي لهم في 350 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تغسل الخلايا 2 x مع وسائط الإعلام ربمي كاملة.
ملاحظة: خلايا متمايزة أكبر في الحجم من السذاجة خلايا CD4 + T. - ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من وسائط الإعلام ربمي كاملة. تأخذ 10 ميكروليتر من تعليق خلية ومزجها جيدا مع 10 ميكروليتر من تريبان الأزرق لتحديد عدد الخلايا مع هيموسيتوميتير. تقسيم الخلايا المتمايزة الجرع ثلاثة ريستيموليشن والتحليل.
ملاحظة: تلطيخ سيتوكين داخل الخلايا وفحوصات أليسا تتطلب الخلايا ≥0.5 مليون، ويتطلب تحليل qPCR الخلايا ≥ 1 مليون. -
لتلطيخ سيتوكين داخل الخلايا، ريستيمولاتي الخلايا مع phorbol 12-ميريستاتي 13-خلات (PMA) (100 نانوغرام/ملليلتر) وإيونوميسين (1 ميكروغرام/مل) حضور مثبط نقل بروتين (1 ميليلتر/mL) ح 4 – 6.
- حصاد الخلايا ووصمة عار لهم مع الأجسام المضادة-CD4 (بيركب-مترافق، 0.2 مغ/مل، تمييع 1: 100؛ أو مترافق FITC، 0.5 ملغ/مل، تمييع 1: 100) لمدة 30 دقيقة.
- إصلاح الخلايا مع 200 ميكروليتر من المخزن المؤقت للتثبيت لمدة 20-60 دقيقة. بعد تثبيت البرنامج، تغسل الخلايا 2 x مع 1 مل من بيرميبيليزيشن المخزن المؤقت.
- القيام بتلوين داخل الخلايا مع الأجسام المضادة ضد GM-CSF (PE-مترافق، 0.2 مغ/مل، تمييع 1: 100)، إيل-17A (مترافق FITC، 0.5 ملغ/مل، تمييع 1: 100؛ أبككونجوجاتيد، 0.2 مغ/مل، تمييع 1: 100)، إيل-4 (آسيا والمحيط الهادئ-مترافق، 0.2 مجم/ملليلتر، تمييع 1: 100)، و IFNγ (آسيا والمحيط الهادئ-مترافق، 0.2 ملغ/مل، تمييع 1: 100؛ بيكونجوجاتيد، 0.2 مغ/مل، تمييع 1: 100) لمدة 30 دقيقة في الظلام.
- تحليل qPCR للتعبير الجيني سيتوكين من الخلايا المتمايزة، تنشيط الخلايا مع ربط لوحة مكافحة--CD3e (3 ميكروغرام/مل) (بريكواتينج اللوحة كما هو موضح في الخطوة 1، 3). في 3 ح بعد التنشيط، حصاد الخلايا لعزل الحمض النووي الريبي إجمالي استخدام كاشف استخراج فينول الجيش الملكي النيبالي إعداد كدنا قبكر. يتم سرد أجهزة الإشعال والبرنامج المستخدم قبكر في الجدولين 2 و 3، على التوالي.
- لتحليل إفراز البروتين سيتوكين من الخلايا المتمايزة، ريستيمولاتي الخلايا مع ربط لوحة مكافحة--CD3e (3 ميكروغرام/مل) ح 24 (precoating اللوحة كما هو موضح في الخطوة 1، 3). حصاد ثقافة الخلية طاف 17 إيل و "إليزا" GM-CSF لتحديد تركيزات بهم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تقسيم خلايا CD4 + T ساذج المعزولة من الفئران الذكور C57BL/6 اثنين عمرها 8 الأسبوع إلى ثلاثة أجزاء. كان يميز جزء واحد من الخلايا إلى خلايا تيحجنرال موتورز بعد البروتوكول وصف. وكان مثقف جزء آخر تحت شرط GMحتي حضور الأجسام المضادة-إيل-4 (10 ميكروغرام/مل) لاختبار تأثير حصار إيل-4 في التفريق بين جنرال موتورزحتي. وكان مثقف الجزء الأخير تحت شرط تمايز 17 رح(3 ميكروغرام/مل مكافحة--CD3e 1 ميكروغرام/مل المضادة-CD28، 10 نانوغرام/مل TGFβ, 30 نانوغرام/مليلتر إيل-6، 10 ميكروغرام/مل مكافحة--IFNγ و 10 ميكروغرام/مل مكافحة--إيل-4). بعد 3 أيام تمايز، حصاد الخلايا وتحقيقنا لتحليل التعبير سيتوكين تلطيخ سيتوكين داخل الخلايا وقبكر، وإليزا. وأظهرت النتائج من تلطيخ سيتوكين داخل الخلايا وتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية أن حوالي 55% الخلايا المستزرعة بشرط المفاضلة الآلية العالميةحتي تم الإعراب عن GM-CSF الخلايا (الشكل 1A)، بينما فقط حوالي 2% الخلايا متباينة تحت تيحالشرط 17 أعرب GM-CSF. وبالإضافة إلى ذلك، بالمقارنة مع حالة التمايز 17 رحالتي ولدت 8.17% إيل-17-إنتاج الخلايا، شرط المفاضلة الآلية العالميةحتي فقط أسفر عن حوالي 1% خلايا إيل-17-وإذ يعرب عن. تحت شروط التمايز بين اختبار، أعرب جزء صغير فقط من الخلايا IFNγ (< 1%). وعلاوة على ذلك، عدد قليل من خلايا تي إيل-4-وإذ يعرب عن (< 1%) شوهدت في الثقافة 17 غمحتي أو تيح(الشكل 1B). وأظهرت هذه النتائج أن استخدام وصف الآلية العالميةحتي الخلية التمايز الشرط، أننا قد بنجاح إنشاء تي مساعد الخلايا التي تبدي غالباً GM-CSF.
كذلك أكد ناجحة التفريق بين الخلايا المعدلة وراثياحتي النتائج من قبكرس وإليزا فحوصات للنظر في التعبير عن GM-CSF وايل-17 على مستويات كل من الجيش الملكي النيبالي والبروتين في الخلايا المتمايزة. الخلايا تيحالآلية التي تم إنشاؤها كان تعبير أعلى بكثير من Csf2 ولكن تعبير أقل بكثير من Il17 بالمقارنة مع تيح17 الخلايا (الشكل 2A). كما هو مبين في الشكل 2، تم الكشف عن البروتين GM-CSF في supernatants ثقافة من خلايا تيحجنرال موتورز وتيح17. ومع ذلك، كان تركيز GM-CSF في ثقافة جنرال موتورزحتي طاف حول ثلاثة إضعاف ذلك في تيح17 الخلايا. وباﻹضافة إلى ذلك، كانت البروتينات إيل-17 (الشكل 2)، IFNγ، وايل-4 لا يمكن الكشف عنها في ثقافة الخلية GMحتي طافية. حيث تم التعرف على RORγt كعامل النسخ الرئيسية في تيح17 الخلايا، بينما STAT3 و STAT5 وتبين أن لها أهمية كبيرة في تطوير تيح17 وخلايا تيحالآلية العالمية، على التوالي، ودرسنا ما مرناً التعبير في الخلايا المعدلة وراثياحتي وتيح17. ووجد أن الخلايا المعدلة وراثياحتي بتعبير أقل بكثير من لحق وتعبير Stat5 أعلى من تيح17 الخلايا (الشكل 3). وكان من المثير للاهتمام، الخلايا المعدلة وراثياحتي تعبير أقل قليلاً (ولكن ليس كبيرا) من Stat3 مقارنة الجينات تيح17 الخلايا. هذه النتائج أنه على الرغم من أن الآلية العالميةحتي وتيح17 التمايز تحكمها عوامل النسخي مختلفة، وأنها قد تشترك بعض السمات المشتركة.
الشكل 1: جنرال موتورزحتي الخلايا الغالب صريح GM-CSF. كانت حصاد الخلايا تيحجنرال موتورز وتيح17 في اليوم الثالث بعد المفاضلة. (أ) ح 5، كانت تحقيقنا الخلايا مع سلطة النقد الفلسطينية وإيونوميسين حضور مثبط نقل بروتين. وقد تم تحليل التعبير عن GM-CSF، وايل-17، و IFNγ تلطيخ سيتوكين داخل الخلايا متبوعة التدفق الخلوي. وقد تم تحليل التعبير (ب) إيل-4، و IFNγ بالخلايا المعدلة وراثياحتي أو تيح17. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 2: التعبير عن 17 إيل و IFNγ GM-CSF في تيح17 والخلايا المعدلة وراثياحتي- حصاد الخلايا 17 غمحتي وتيحوتحقيقنا مع ربط لوحة مكافحة--CD3e، 3 أيام بعد المفاضلة. كانت تحصد الخلايا (A) لعزل الحمض النووي الريبي لإعداد كدنا، ح 3 بعد التنشيط. التعبير عن إيفنجو إيل-17 Csf2 يحددها PCR الوقت الحقيقي كمية (قبكر). وكان حصاد ح 24 (ب) ثقافة طافية بعد التحفيز، لتحديد تركيز GM-CSF في خلايا تيحالآلية العالمية، أو الخلايا إيل-17 في تيح17، قبل أليسا. (* * ف < 0.01، * * * ف < 0.001.) الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: لحق و Stat3، و Stat5 التعبير الجيني في تيح17 والخلايا المعدلة وراثياحتي- كانت تحصد الخلايا 17 غمحتي متمايزة وتيحوريستيمولاتيد مع ربط لوحة مكافحة--CD3e حاء 3 "مجموع الجيش الملكي النيبالي" كانت معزولة لإعداد كدنا. حددت التعبيرات لحق، و Stat3، و Stat5 قبكر. (* p < 0.05، * * ف < 0.01؛ NS = ليس كبيرا.) الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الاسم | تركز الأسهم | تركيز العمل | تمييع | وحدة التخزين في 500 ميكروليتر تلطيخ المخزن المؤقت |
| CD4-بيركب | 0.2 مغ/مل | 2.8 ميكروغرام/مل | 1:71 | ميكروليتر 7 |
| CD44-آسيا والمحيط الهادئ | 0.2 مغ/مل | 2.4 ميكروغرام/مل | 1:83 | ميكروليتر 6 |
| CD25-PE | 0.2 مغ/مل | 2 ميكروغرام/مل | 1: 100 | 5 ميكروليتر |
| CD62L-فيتك | 0.5 ملغ/مل | 10 ميكروغرام/مل | 01:50 | 10 ميكروليتر |
| GM-CSF-PE | 0.2 مغ/مل | 2 ميكروغرام/مل | 1: 100 | |
| إيل-17A-فيتك | 0.5 ملغ/مل | 5 ميكروغرام/مل | 1: 100 | |
| إيل-17A-آسيا والمحيط الهادئ | 0.2 مغ/مل | 2 ميكروغرام/مل | 1: 100 | |
| IFNΓ--آسيا والمحيط الهادئ | 0.2 مغ/مل | 2 ميكروغرام/مل | 1: 100 | |
| IFNΓ--PE | 0.2 مغ/مل | 2 ميكروغرام/مل | 1: 100 | |
| إيل-4-آسيا والمحيط الهادئ | 0.2 مغ/مل | 2 ميكروغرام/مل | 1: 100 | |
| CD4-فيتك | 0.5 ملغ/مل | 5 ميكروغرام/مل | 1: 100 | |
| إيل-7 | 20 ميكروغرام/مل | 2 نانوغرام/مليلتر | 1:10000 | |
| مكافحة CD28 | 0.5 ملغ/مل | 1 ميكروغرام/مل | 1: 500 | |
| مكافحة--IFNγ | 1 ملغ/مل | 10 ميكروغرام/مل | 1: 100 |
الجدول 1: استخدام السيتوكينات والأجسام المضادة.
| التمهيدي | التسلسل | |
| إيفنج إلى الأمام | --تكاجتجكاتاجاتجتجاجا 5 '-3' | |
| إيفنج عكس | --تجكتكتجكاجاتتتكاتج 5 '-3' | |
| إيل-17 إلى الأمام | --كتككاجاجكككتكاجاكتاك 5 '-3' | |
| إيل-17 عكس | --أجكتتكككتككجكاتجاكاكاج 5 '-3' | |
| Csf2 إلى الأمام | --تتاكتتتككتججكاتج 5 '-3' | |
| Csf2 عكس | --تاجكتجكتجتكاتجتكا 5 '-3' | |
| لحق إلى الأمام | --تتجاكتجكتتككاتك 5 '-3' | |
| لحق عكس | --آجاتكتجكاجكتتتككاكا 5 '-3' | |
| Stat3 إلى الأمام | --تجكككتتجاتجاججتاكا 5 '-3' | |
| Stat3 عكس | --كاكتجاتجتككتتتككاكككاجت 5 '-3' | |
| Stat5 إلى الأمام | --تجكككجكتجاكتاكاككت 5 '-3' | |
| Stat5 عكس | --أتجكككككجاتتككجاجتكاك 5 '-3' | |
الجدول 2: كبسولة تفجير ل qPCR.
| الخطوة | درجة الحرارة. (درجة مئوية) | الوقت | كرر | |
| 1 | 95 | 2 دقيقة | ||
| 2 | 95 | 3 s | ||
| 3 | 60 | 30 s | الخطوة 2 و 3، 39 مرات | اقرأ اللوحة |
| 4 | 65-95 | 5 s | الخطوة 4، 30 مرة، + 0.5 درجة مئوية كل تكرار | اقرأ اللوحة |
الجدول 3: بكر البرنامج لتقييم التعبير الجيني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا يمكننا وصف بروتوكول في المختبر جنرال موتورزحتي التمايز من الماوس السذاجة CD4 + الخلايا، متبوعاً بتحليل الخلايا المتمايزة للتحقق من صحة الأسلوب. ملاحظة، يمكن استخدام الطحال والغدد الليمفاوية السذاجة CD4 + تي خلية تنقية والتمايز جنرال موتورزحتي. كانت المستحث التعبير سيتوكين يحدده سيتوكين داخل الخلايا تلطيخ جنبا إلى جنب مع التدفق الخلوي وأظهرت أن حوالي 55% الخلايا لتصبح خلايا معربا عن الآلية العالمية-الخدمات القطرية بشرط GMحتي (الشكل 1A). بالمقارنة مع الخلايا بشرط التمايز 17 رح، الخلايا التي ميزت بشرط تيحالآلية العالمية الواردة على مستوى خلفية من السكان بالتعبير عن 17 إيل؛ ومع ذلك، التعبير الجيني il17 غير قابل للكشف من قبكر (الشكل 2A).
من المثير للاهتمام، على الرغم من إضافة جسم تحييد IFNγ، اكتشفنا تدني مستوى التعبير مرناً إيفنج تيح17 والخلايا تيحالآلية العالمية، وأقل من 1% الخلايا المعدلة وراثياحتي تم الإعراب عن IFNγ الخلايا. (الأرقام 1 - 2). وهذا نظراً لكمية غير كافية من الأجسام المضادة IFNγ تحييد يمكن في حالة غمحتي، أو من تلوث المحتمل للخلايا المناعية الفطرية (من المستحيل تقريبا الحصول على خلايا CD4 + T السذاجة نقية 100%) التي قدمت تتبع كمية إيل-12 للجيل 1 خلية تيحممكن. من الممكن أيضا أن الشرط جنرال موتورزحتي استخدمنا لم يكن قادراً على إيقاف تماما النسخ من إيفنج. وسنتناول هذه المسألة في المستقبل. على الرغم من ذلك، لم يتم اكتشاف البروتين IFNγ بإليزا في supernatants ثقافة جنرال موتورزحتي أو تيح17.
في البروتوكول المعروضة هنا، فقط استخدام جسم مضاد IFNγ-وقف جنبا إلى جنب مع إيل-7 للتفريق بين جنرال موتورزحتي. بعد 3 أيام تمايز تحت هذا الشرط، أعرب أكثر من 50% الخلايا GM-CSF، ولكن لا إيل-17، إيل-4، أو IFNγ (الشكل 1). وباﻹضافة إلى ذلك، التعبير عن لحق، والجينات التي ترميز RORγt، وهي ذات أهمية حاسمة ل التمايز Th179، كان أقل بكثير في الخلايا المعدلة وراثياحتي مقارنة بالتي في تيح17 الخلايا (الشكل 3). هذا البروتوكول، لذلك، طريقة أكثر كفاءة لتوليد خلايا تي معربا عن GM-CSF مما آخر ذكرت سابقا10. النتائج التي توصلنا إليها أيضا أظهرت، بالإضافة إلى نقاء السذاجة تي الخلايا والإشارات إيل-7، منع التفريق بين الخلية تي IFNγ--وإذ يعرب عن مفتاح لتوليد غم رح.
التعبير السائد عن الخلايا المعدلة وراثيا-الخدمات القطرية التي تم إنشاؤها باستخدام بروتوكول وصف أثبت نجاح التفريق بين جنرال موتورزحتي. ونود أن نشير إلى أن نوعية السيتوكينات والأجسام المضادة من شركات مختلفة، أو حتى من دفعات مختلفة من نفس الشركة قد لا تكون هي نفسها. ولذلك، نوصي بأن عدد السيتوكينات والأجسام المضادة المستخدمة في تمييز الخلية مساعد تي ينبغي اختبار لمعرفة الحالة المثلى.
باختصار، أعرب خلايا تيحالآلية التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول الحد أدنى من إيل-17، إيل-4، أو IFNγ. ونحن واثقون من أن هذا البروتوكول يعمل جيدا في توليد معربا عن GM-CSF تيحجنرال موتورز الخلايا في المختبر. يمكن استخدام هذا الأسلوب يمكن لمزيد من الدراسة بيولوجيا الخلايا تيحالآلية العالمية في ظروف مختلفة مثل نيوروينفلاميشن المناعة الذاتية، بما في ذلك النخاع الذاتية التجريبية (إي) في الفئران والإنسان التصلب المتعدد، حيث يلعب GM-CSF دوراً هاما في إمراضية11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا الدراسة المنح المقدمة من "جامعة الصحة نظام سنغافورة الوطنية" (T1-2014-12 أكتوبر وسبتمبر T1-2015-10).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Biowest | L0500-500 | |
| FBS Heat Inactivated | Capricorn | FBS-HI-12A | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10 | Diluted to 1x PBS in sterile water |
| EDTA | 1st Base | BUF-1053-100ml-pH8.0 | |
| 10x ACK buffer | Biolegend | 420301 | diluted in sterile water |
| Cell strainer | SPL Life Sciences | 93070 | |
| CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T | |
| Centrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5810R | |
| Sony SY3200 cell sorter | Sony | Sony SY3200 cell sorter | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 210261 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| FACS tube | Corning | 352054 | |
| 24 well cell culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 | eBioscience | 46-0041-82 | |
| PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) | eBioscience | 12-0251-82 | |
| anti-human/mouse CD44 APC | eBioscience | 17-0441-82 | |
| anti-mouse CD62L FITC | eBioscience | 11-0621-85 | |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | 640010 | |
| Hyclone Trypan Blue Solution | GE healthcare Life Sciences | SV30084.01 | |
| microscope | Nikon | Nikon Elipse TS100 | |
| Purified anti-mouse CD3e antibody | Biolegend | 100314 | |
| Purified hamster anti-mouse CD28 | BD Biosciences | 553295 | |
| Purified Rat anti-mouse IFNγ | eBioscience | 16-7312-85 | |
| Purified anti-mouse IL-4 Antibody | Biolegend | 504102 | |
| Recombinant Mouse IL-7 Protein | R&D system | 407-ML | |
| recombinant human TGF-beta | R&D system | 240-B-010 | |
| PMA | Merck Millipore | 19-144 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| GolgiPlug protein transport inhibitor | BD Biosciences | 51-2301KZ | |
| Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| anti-mouse GM-CSF PE | eBioscience | 12-7331-82 | |
| FITC anti-mouse IL-17A | Biolegend | 506908 | |
| APC anti-mouse IFN-gamma | Biolegend | 505810 | |
| GO Taq qPCR master mix | Promega | A6002 | |
| mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! | invitrogen | 88-7334-88 | |
| Mouse IL-17A Uncouted ELISA | invitrogen | 88-7371-22 |
References
- Zhu, J., Paul, W. E. CD4 T cells: fates, functions, and faults. Blood. 112, 1557-1569 (2008).
- Kara, E. E., et al. Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity. PLoS Pathogens. 10, e1003905 (2014).
- Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. Tumor Immunology meets...Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells. Oncoimmunology. 6, e1356149 (2017).
- Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).
- Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).
- Sheng, W., et al. STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation. Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).
- Codarri, L., et al. RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation. Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).
- El-Behi, M., et al. The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF. Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126, 1121-1133 (2006).
- Zhang, J., et al. A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF. Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).
- Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage. Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).
