Summary
Nous présentons ici un protocole pour différencier murin granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing cellules T auxiliaires (THGM) de cellules CD4 + T naïves, notamment l’isolement des cellules CD4 + T naïves, différenciation des THGM, et analyse des cellules THGM différenciées. Cette méthode peut être appliquée aux études de la régulation et fonction des cellules THGM.
Abstract
Le granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF)-produisant des lymphocytes T helper (THGM) est un sous-ensemble de cellules d’assistance T nouvellement identifié qui principalement sécrète GM-CSF sans produire l’interféron (IFN) γ ou interleukine (IL) -17 et se trouve à jouent un rôle essentiel dans la neuro-inflammation auto-immune. Une méthode d’isolement de cellules T CD4 + naïf d’une suspension de cellules individuelles des splenocytes et génération de cellules THGM de cellules T CD4 + naïve serait une technique utile dans l’étude de l’immunité à médiation cellulaire T et maladies auto-immunes. Nous décrivons ici une méthode qui le différencie des cellules T CD4 + naïf de souris en cellules THGM promues par l’IL-7. Le résultat de la différenciation a été évalué par l’analyse de l’expression de cytokines à l’aide de différentes techniques, notamment des cytokines intracellulaires coloration combinée avec la cytométrie en flux, une quantitative PCR en temps réel (PCR), et dosages immuno-enzymatiques (ELISA). Utilisant le protocole de différenciation THGM comme décrit ici, environ 55 % des cellules exprimé GM-CSF avec une expression minimale d’IFNα ou IL-17. L’expression prédominante de GM-CSF par les cellules THGM a été confirmée par l’analyse de l’expression du GM-CSF, IL-17 niveaux d’ARNm et protéines et IFNα. Ainsi, cette méthode peut être utilisée pour différencier les cellules T CD4 + naïf à THGM cellules in vitro, qui sera utile dans l’étude de la biologie cellulaire THGM.
Introduction
Cellules CD4 + T auxiliaires (TH) sont des éléments essentiels du système immunitaire, ayant un rôle crucial dans la défense de l’hôte contre les agents pathogènes microbiens, dans la surveillance du cancer et l’auto-immunité1,2,3. Lors de l’activation de récepteur (TCR) de lymphocytes T, cellules T CD4 naïves peuvent être différenciés en TH1, TH2, TH 17, ou réglementaires T (Treg) cellules sous l’influence de cytokines différents milieux2,4, 5. récemment, un sous-ensemble de nouveau des cellules TH , qui produit principalement des GM-CSF, a été identifié et nommé THGM6. La différenciation des cellules THGM est entraînée par l’IL-7 par le biais de l’activation d’un transducteur de signal et un activateur de transcription 5 (STAT5). Ces cellules expriment une grande quantité de GM-CSF tout en ayant une faible expression des autres TH-cell signature cytokines telles que l’IFNγ et IL-176. GM-CSF s’est avéré jouent un rôle essentiel dans le développement de CD4 + T cell-mediated neuroinflammation7,,8. Par rapport à IFNγ ou IL-17-exprimant des cellules autoréactives T, T exprimant le GM-CSF cellules transférés à sauvage souris (WT) faits une apparition précoce de la maladie et la gravité de la maladie. En outre, les cellules de T de Csf2- / - n’a pu induire encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) après avoir été transféré Moutschen aux destinataires WT, tandis que les cellules T dépourvues d’IFNγ ou IL-17 a conservé la capacité de provoquer des EAE7. En outre, un blocus de GM-CSF à l’aide d’anticorps neutralisants amélioré EAE maladie gravité8. En outre, une carence de STAT5 dans les cellules T chez les souris a entraîné dans une génération THGM diminuée et, partant, à une résistance des souris EAE développement6. Ces résultats soulignent l’importance des lymphocytes T exprimant le GM-CSFH de maladie auto-immune thérapeutiques. Ainsi, en établissant une méthode pour différencier les cellules T exprimant le GM-CSFH de cellules T CD4 + naïve serait important dans l’étude de la pathogenèse de la neuro-inflammation auto-immune et immunité à médiation cellulaire T. Toutefois, un protocole qui efficacement génère des cellules THGM de murin naïf que CD4 + n’a pas été établi.
Nous présentons ici une méthode qui se différencie des cellules THGM de cellules T CD4 naïves. Ce protocole décrit l’ensemble de la procédure, y compris l’extraction de la rate de la souris, la préparation d’une suspension de cellules individuelles, la sélection positive de CD4, la cellule activée par fluorescence triant (FACS) et la cellule TH différenciation et l’analyse. Lymphocytes T helper différenciés sont analysés par cytokine intracellulaire coloration combinée avec écoulement cytometry pour déterminer l’expression de cytokines au niveau unicellulaire, par une PCR quantitative en temps réel afin de déterminer l’expression de cytokines au niveau de l’ARNm, et par ELISA pour évaluer l’expression de cytokines au niveau de la protéine. Cette méthode peut être appliquée aux études de biologie cellulaire THGM dans diverses conditions, telles que EAE, où GM-CSF joue un rôle important dans la pathogenèse.
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Protocol
Toutes les souris utilisées dans le présent protocole ont été sur le bagage génétique de C57BL/6 et logés dans des conditions spécifiques à la National University of Singapore exempts de micro-organismes pathogènes. Toutes les expériences ont été effectuées à l’aide de protocoles approuvés par le Comité de l’urbanisme de l’Université nationale de Singapour et d’institutionnels animalier.
1. réactif et préparation du matériel
- Préparer 500 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 2 % sérum fœtal (SVF) et l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 1 mM.
Remarque : Conservez le tampon sur la glace tout au long de l’ensemble de la procédure pour des résultats optimaux. - Préparation de 50 mL de médias RPMI complet contenant de la pénicilline-streptomycine RPMI 1640, 10 % de SVF et 1 %. Utiliser les médias RPMI complets contenant 50 µM de β-mercaptoéthanol pour la différenciation des cellules THGM. Ajouter le β-mercaptoéthanol sous une hotte.
- Préparer 7,5 mL d’un mélange d’anticorps anti-CD3e en diluant le stock d’anti-CD3e concentrée à 3 μg/mL dans du PBS. Enduire les plaques 48 puits en ajoutant 150 μL du mélange anticorps à chaque puits et incuber les plaques à 37 ° C pendant au moins 1 h ou à 4 ° C jusqu’au lendemain.
- Stériliser une paire de ciseaux et pinces et conservez-les dans l’éthanol à 70 % entre les dissections.
2. préparation des Splenocytes murins
- Euthanasier la souris (de 6 à 8 semaines) à l’aide d’une asphyxie de2 CO approuvés sur le plan institutionnel ou dislocation cervicale. Vaporiser la souris avec l’éthanol à 70 % et de le monter sur un bloc de polystyrène sur le dos. Transférer la souris dans une armoire de procéder aux étapes suivantes de la sécurité biologique.
- Tendez la peau à l’aide d’une paire de pinces et couper la peau au-dessous de la cage thoracique du côté gauche pendant environ 4 cm, à l’aide d’une paire de ciseaux. Ouvrez le sac péritonéal pour exposer la rate et utilisez une pince stérile pour extraire la rate.
- Placer une passoire de cellule 70 μm sur un tube de 50 mL et mouillez-le avant avec 2 mL de tampon. Placez la rate sur la crépine de la cellule (2 – 3 rates pour crépine d’une seule cellule) et faites-les macérer avec la fin d’un piston de seringue de 5 mL.
- Rincer la crépine et le tube plusieurs fois avec 1 à 2 mL de tampon d’isolement cellulaire jusqu'à ce que toutes les cellules sont déversés dans le tube. Jeter la crépine de la cellule et centrifuger les cellules à 350 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
- Resuspendre le culot cellulaire avec 5 mL de froid (4 ° C) d’ammonium-chlorure-potassium (ACK), lyse tampon (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA ; pH 7,2 – 7,4) et mélanger doucement pour 2 min. Ajouter 10 mL de médias RPMI complet pour neutraliser l’accusé de réception tampon et Centrifuger immédiatement les cellules à 350 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant après la centrifugation.
3. séparation de lymphocytes T CD4 + des cellules à l’aide de microbilles magnétiques CD4 et une colonne de séparation cellulaire
- Resuspendre le culot dans 5 mL de tampon d’isolement cellulaire. La suspension de cellules à l’aide d’un filtre avant la séparation (30 μm) dans un nouveau tube de 15mL pour enlever tous les débris du filtre.
- Prenez 10 μl de la suspension cellulaire et faire une dilution de 10 x en ajoutant 90 μL de tampon. Prendre 10 μl de la suspension cellulaire dilué et mélangez-le avec 10 μL de trypan blue pour le comptage des cellules. Compter les cellules dans un hémocytomètre pour déterminer le rendement des cellules viables.
- Centrifuger les cellules à 350 x g pendant 5 min à 4 ° C et éliminer le surnageant.
- Remettre en suspension les cellules 90 μL de tampon par 107 cellules. Ajouter 10 μL de microbilles magnétiques de CD4 par 107 cellules. Incuber les cellules pendant 15 min à 4 ° C. Pour des résultats optimaux, mélanger la suspension cellulaire doucement toutes les 5 min pendant l’incubation.
- Alors que les cellules sont en incubation, placez une colonne de séparation sur le support magnétique. Pré humide la colonne avec 2 mL de tampon.
- À la fin de l’incubation de cellules/perle, laver les cellules avec 5 mL de tampon et les centrifuger à 350 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
- Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de tampon, charger l’échantillon dans la colonne de séparation cellulaire et laissez-le passer. Utiliser un tube à centrifuger de 15 mL pour recueillir la fraction de cellules CD4. Ajouter 1 mL de tampon pour laver le réservoir avant qu’il soit sec. Répétez l’étape de lavage 2 x.
- Supprimer la colonne de séparation cellulaire du support magnétique et le placer sur un nouveau tube à centrifuger 15 mL. Ajouter 2 mL de tampon d’isolement cellulaire à la colonne de séparation des cellules et appliquer le piston fermement pour forcer les cellules de la colonne.
- Centrifuger la fraction à 350 x g pendant 5 min à 4 ° C pour obtenir des cellules CD4 +. Jeter le surnageant.
4. la purification des cellules T CD4 + Naive (CD4+CD25–CD44loCD62LSalut) par différenciation cellulaire tri et THGM activés par Fluorescence
- Resuspendre le culot de cellules CD4 + obtenu dans 500 µL de tampon. Mélanger les cellules avec un mélange d’anticorps fluorescent conjugués contenant CD4-PerCp (2,8 µg/mL), CD44-APC (2,4 µg/mL), CD25-PE (2 µg/mL) et CD62L-FITC (10 µg/mL) (tableau 1). Incuber les cellules sur la glace pendant 20 à 30 min, tout en les protégeant de la lumière.
Remarque : Les concentrations d’anticorps ont été optimisées précédemment dans le laboratoire. Le nombre d’anticorps énumérés est pour les cellules de souris de 1 – 2. - Après l’incubation, laver les cellules avec 5 mL de tampon et centrifuger les cellules à 350 x g pendant 5 min à 4 ° C.
- Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules de 500 µL de tampon. Filtrer les cellules à l’aide une maille en nylon.
- Transférer la suspension de cellules dans un tube de FACS pour le tri des cellules. Précouche les tubes de prélèvement FACS avec 500 µL de tampon.
- Obtenir un CD4+CD25–CD44loCD62LSalut population (de naïve CD4+ T cellules) en triant les FACS. Porte de CD4+CD25– premiers et puis sélectionnez CD44loCD62LSalut les cellules de cette population.
- Recueillir les naïfs CD4+ T fractions de cellules dans un nouveau tube à centrifuger de 15 mL. Centrifuger les cellules à 350 x g pendant 5 min à 4 ° C et éliminer le surnageant.
- Remettre en suspension les cellules T CD4 + naïve à une concentration de 106 cellules/mL dans un milieu RPMI complet contenant 50 µM β-mercaptoéthanol.
- Aspirer les anticorps anti-CD3e utilisés pour preliminaire dans la plaque 48 puits. Cellules de semences 0,25 millions (250 µL) dans chaque puits avec l’IL-7 (2 ng/mL), anti-CD28 (1 µg/mL) et anti-IFNγ (10 µg/mL) (tableau 1).
Remarque : Les concentrations de cytokines et anticorps ont été optimisées précédemment dans le laboratoire pour une différenciation des cellules THGM. - Incuber les cellules à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 3 jours. Ne changez pas le milieu au cours de l’incubation.
5. l’analyse des cellules souris THGM Generated In Vitro
- À l’aide d’un microscope, vérifier la différenciation des cellules 3 d après la différenciation. Récolter les cellules et les centrifuger à 350 x g pendant 5 min à 4 ° C. Laver les cellules 2 x avec support complet de RPMI.
Remarque : Les cellules différenciées sont plus grands en taille que les cellules T CD4 + naïf. - Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de médias RPMI complet. Prenez 10 μl de suspension cellulaire et mélangez-le bien avec 10 μL de trypan blue pour déterminer le nombre de cellule avec un hémocytomètre. Diviser les cellules différenciées en trois potions pour une restimulation et d’analyse.
NOTE : Coloration Intracellular cytokine et tests ELISA nécessitent 0,5 million de cellules et analyse qPCR fonctionne avec ≥ 1 million. -
Pour la coloration de cytokine intracellulaire, relancer les cellules avec phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) (100 ng/mL) et ionomycine (1 μg/mL) en présence d’un inhibiteur de transport de protéines (1 µL/mL) pendant 4 à 6 h.
- Récolter les cellules et les taches avec un anticorps anti-CD4 (PerCP-conjugués, 0,2 mg/mL, dilution au 1/100 ; ou conjugué FITC, 0,5 mg/mL en dilution 1 : 100) pendant 30 min.
- Fixer les cellules avec 200 μL de tampon de fixation pour 20 à 60 min. Après fixation, laver les cellules 2 x avec 1 mL de tampon de perméabilisation.
- Effectuer la coloration intracellulaire avec des anticorps dirigés contre le GM-CSF (PE-conjugués, 0,2 mg/mL, dilution 1 : 100), IL-17 a (conjugué FITC, 0,5 mg/mL, dilution au 1/100 ; APC-conjugated, 0,2 mg/mL, dilution 1 : 100), IL-4 (APC-conjugués, 0,2 mg/mL, dilution 1 : 100) et IFNγ (APC-conjugués, 0,2 mg/mL, dilution au 1/100 ; PE-conjugated, 0,2 mg/mL, dilution 1 : 100) pendant 30 min à l’obscurité.
- Pour une analyse de qPCR de l’expression de gènes de cytokines par les cellules différenciées, activer les cellules avec plaque lié aux anti-CD3e (3 μg/mL) (recouvrant la plaque comme indiqué au point 1.3). À 3 h après la stimulation, récolter les cellules pour isoler l’ARN total utilisant un réactif de phénol RNA extraction afin de préparer le qPCR de cDNA. Le programme utilisé pour le qPCR et amorces sont répertoriés dans les tableaux 2 et 3, respectivement.
- Pour l’analyse de la sécrétion de protéine de cytokines par les cellules différenciées, relancer les cellules avec plaque lié aux anti-CD3e (3 μg/mL) pendant 24 h (recouvrant la plaque comme indiqué au point 1.3). Récolter le surnageant pour IL-17 et GM-CSF ELISA déterminer leurs concentrations de culture cellulaire.
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Representative Results
Les cellules T CD4 + naifs isolées de deux souris C57BL/6 mâles de 8 semaines ont été divisés en trois parties. Une portion des cellules est différenciée en suivant le protocole décrit les cellules THGM. Une autre partie a été cultivée dans des conditions THGM en présence d’anticorps anti-IL-4 (10 µg/mL) pour tester l’influence d’un blocus de l’IL-4 dans la différenciation des THGM. La dernière partie a été cultivée dans un état de différenciation 17 TH(3 µg/mL anti-CD3e, 1 µg/mL anti-CD28, 10 ng/mL TGFβ, 30 ng/mL IL-6, 10 µg/mL anti-IFNγ et 10 µg/mL anti-IL-4). Après 3 jours de différenciation, les cellules ont été récoltées et restimulés pour analyser l’expression de cytokines par coloration de cytokine intracellulaire, qPCR et ELISA. Provient de la coloration de cytokine intracellulaire et de l’analyse de FACS a démontré qu’environ 55 % des cellules cultivées dans l’état de différenciation THGM étaient les cellules exprimant le GM-CSF (Figure 1 a), alors que seulement 2 % des cellules différenciés sous la TH17 condition exprimée GM-CSF. En outre, par rapport à l’état de différenciation 17 THqui a généré les cellules productrices de IL-17 8,17 %, l’état de différenciation THGM entraîné seulement environ 1 % de cellules exprimant l’IL-17. Dans les conditions de la différenciation des deux testées, seule une petite fraction des cellules exprimé IFNγ (< 1 %). En outre, peu de cellules T exprimant l’IL-4 (< 1 %) ont été observés en culture 17 THGM ou TH(Figure 1 b). Ces résultats ont montré qu’à l’aide de l’état de différenciation cellulaire THGM décrit, nous avons généré avec succès les cellules T auxiliaires qui expriment principalement GM-CSF.
La différenciation réussie des cellules THGM a été confirmée par les résultats obtenus y et ELISA analyses afin d’examiner l’expression de GM-CSF et l’IL-17 niveaux d’ARN et protéine dans les cellules différenciées. Les cellules THGM générés avaient une expression significativement plus élevée de Csf2 , mais une expression beaucoup plus faible d’Il17 par rapport à la TH17 cellules (Figure 2 a). Comme le montre la Figure 2 b, protéine de GM-CSF a été détectée dans les surnageants de culture de 17 cellules fois THGM et TH. Néanmoins, la concentration de GM-CSF dans le surnageant de culture THGM était sur trois volets que dans TH17 cellules. En outre, les protéines de IL-17 (Figure 2 b), IFNγ et IL-4 étaient indétectables dans le surnageant de culture de cellules THGM. Étant donné que RORγt a été identifié comme le facteur de transcription maître TH17 cellules, tandis que STAT3 et STAT5 auraient dû être divulgués ont une grande importance dans le développement de TH17 et cellules THGM, respectivement, nous avons examiné leur ARNm expression dans les cellules de 17 THGM et TH. Il a été constaté que les cellules THGM avaient une expression beaucoup plus faible du Rorc et une expression de Stat5 plus élevée que la TH17 cellules (Figure 3). Fait intéressant, les cellules THGM avaient une expression légèrement inférieure (mais non significative) de la Stat3 gène par rapport à la TH17 cellules. Ces résultats indiquent que bien que la THGM et la TH17 différenciation sont régies par différents facteurs transcriptionnels, ils peuvent partager certaines caractéristiques communes.
Figure 1 : THGM cellules principalement express GM-CSF. Les cellules THGM et TH17 ont été récoltés le jour 3 après la différenciation. (A) pendant 5 h, les cellules ont été restimulés avec EGR et ionomycine en présence d’un inhibiteur de transport de protéines. L’expression du GM-CSF, IL-17 et IFNγ a été analysée par cytokine intracellulaire souillant suivi par cytométrie en flux. (B) l’IL-4 et IFNγ expression par TH17 ou cellules THGM a été analysée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Expression de l’IL-17, IFNγ et GM-CSF dans TH17 et cellules THGM. THGM TH17 cellules ont été récoltées et restimulés avec plaque lié aux anti-CD3e, 3 jours après la différenciation. (A) les cellules ont été récoltées pour isoler l’ARN pour la préparation de la cDNA, 3 h après la stimulation. Les expressions de Ifng, Il-17et Csf2 ont été déterminées par une PCR quantitative en temps réel (qPCR). (B) le surnageant de culture a été récoltée à 24 h après la stimulation, pour déterminer la concentration de GM-CSF dans les cellules THGM, ou cellules d’IL-17 tH17, par ELISA. (** p < 0,01, *** p < 0,001.) S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Expression des gènes Rorc, Stat3 et Stat5 dans TH17 et cellules T GM deH. Les cellules différenciées THGM et TH17 ont été récoltés et restimulés avec plaque lié aux anti-CD3e pendant 3 h ARN Total a été isolé pour préparer l’ADNc. Les expressions Rorc Stat3et Stat5 ont été déterminées par qPCR. (* p < 0,05, ** p < 0,01 ; NS = non significatif.) S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Nom | Concentration de stock | concentration de travail | Dilution | volume de 500 μL de tampon de coloration |
| CD4-PerCp | 0,2 mg/mL | 2.8 μg/mL | 1:71 | 7 ΜL |
| CD44-APC | 0,2 mg/mL | 2,4 μg/mL | 1:83 | 6 ΜL |
| CD25-PE | 0,2 mg/mL | 2 µg/mL | 1/100 | 5 ΜL |
| CD62L-FITC | 0,5 mg/mL | 10 μg/mL | 01:50 | 10 ΜL |
| GM-CSF-PE | 0,2 mg/mL | 2 µg/mL | 1/100 | |
| IL-17 A-FITC | 0,5 mg/mL | 5 μg/mL | 1/100 | |
| IL-17 A-APC | 0,2 mg/mL | 2 µg/mL | 1/100 | |
| IFNΓ-APC | 0,2 mg/mL | 2 µg/mL | 1/100 | |
| IFNΓ-PE | 0,2 mg/mL | 2 µg/mL | 1/100 | |
| IL-4-APC | 0,2 mg/mL | 2 µg/mL | 1/100 | |
| CD4-FITC | 0,5 mg/mL | 5 μg/mL | 1/100 | |
| IL-7 | 20 μg/mL | 2 ng/mL | 1 : 10000 | |
| Anti-CD28 | 0,5 mg/mL | 1 μg/mL | 1/500 | |
| Anti-IFNγ | 1 mg/mL | 10 μg/mL | 1/100 |
Tableau 1 : Utilisé des cytokines et anticorps.
| Apprêt | Séquence | |
| IFNg Vers l’avant | 5'-TCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAA-3' | |
| IFNg Marche arrière | 5'-TGGCTCTGCAGGATTTTCATG-3' | |
| Il-17 Vers l’avant | 5'-CTCCAGAAGGCCCTCAGACTAC-3' | |
| Il-17 Marche arrière | 5'-AGCTTTCCCTCCGCATTGACACAG-3' | |
| Csf2 Vers l’avant | 5'-TTTACTTTTCCTGGGCATTG-3' | |
| Csf2 Marche arrière | 5'-TAGCTGGCTGTCATGTTCAA-3' | |
| RORC Vers l’avant | 5'-TTTGGAACTGGCTTTCCATC-3' | |
| RORC Marche arrière | 5'-AAGATCTGCAGCTTTTCCACA-3' | |
| Stat3 Vers l’avant | 5'-TGGCCCTTTGGAATGAAGGGTACA-3' | |
| Stat3 Marche arrière | 5'-CACTGATGTCCTTTTCCACCCAAGT-3' | |
| STAT5 Vers l’avant | 5'-TGCCCGGCTGGAACTACACCTT-3' | |
| STAT5 Marche arrière | 5'-ATGCCCCCGATTTCCGAGTCAC-3' | |
Tableau 2 : Amorces pour qPCR.
| étape | Temp. (° C) | temps | Répétez | |
| 1 | 95 | 2 min | ||
| 2 | 95 | 3 s | ||
| 3 | 60 | 30 s | l’étape 2 et 3, 39 fois | lire la plaque |
| 4 | 65-95 | 5 s | l’étape 4, 30 fois, + 0,5 ° C chaque répétition | lire la plaque |
Tableau 3 : Programme PCR pour évaluer l’expression des gènes.
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Discussion
Ici, nous avons décrit un protocole d’une différenciation de THGM in vitro de cellules de souris naïves CD4 +, suivie d’une analyse des cellules différenciées pour valider la méthode. À noter, rate et les ganglions lymphatiques peut être utilisés pour naïve purification de cellules T CD4 + et différenciation THGM. L’expression de cytokines déterminée par cytokine intracellulaire coloration combiné avec écoulement cytometry a montré qu’environ 55 % des cellules ont été amenées à devenir des cellules exprimant le GM-CSF dans les conditions de THGM (Figure 1 a). Par rapport aux cellules en vertu de l’état de différenciation 17 TH, les cellules qui se différencient en vertu de la condition de THGM contenaient une concentration de fond d’une population exprimant l’IL-17 ; Toutefois, l’expression de gène d’il17 est indétectable par qPCR (Figure 2 a).
Fait intéressant, malgré l’ajout d’un anticorps neutralisant IFNγ, nous avons détecté un faible niveau d’expression de l’ARNm Ifng dans la TH17 et les cellules THGM, et moins de 1 % des cellules THGM étaient les cellules exprimant l’IFNγ. (Figures 1 - 2). Ceci en raison de la quantité insuffisante d’anticorps neutralisant IFNγ utilisables en l’État THGM, ou à une contamination éventuelle des cellules immunitaires innée (il est presque impossible d’obtenir des cellules T CD4 + de 100 % pure naïf) qui a fourni une quantité trace de IL-12 pour la génération de 1 cellule THpossible. Il est également possible que l’état de THGM que nous avons utilisé n’était pas en mesure de fermer complètement la transcription de Ifng. Nous aborderons cette question à l’avenir. Néanmoins, protéine pro-inflammatoire n’a pas décelé dans les surnageants de culture de GMHT ou TH17 par ELISA.
Dans le protocole présenté ici, nous avons seulement utilisé un anticorps bloquant IFNγ ainsi que de l’IL-7 pour différencier les THGM. Après 3 jours de différenciation dans ces conditions, plus de 50 % des cellules exprimé GM-CSF, mais pas IL-17, IL-4, ou IFNγ (Figure 1). En outre, l’expression du Rorc, le gène qui code pour RORγt, qui est essentielle à la différenciation de Th179, était significativement plus faible dans les cellules THGM par rapport à celle dans la TH17 cellules (Figure 3). Ce protocole est donc une méthode plus efficace pour la production de lymphocytes T exprimant le GM-CSF, qu’un autre précédemment indiqué10. Nos résultats démontrent également que, en plus de la pureté des cellules naïves T et signalisation d’IL-7, la prévention de la différenciation des lymphocytes T exprimant l’IFNγ est une clé pour la production de GM TH.
L’expression prédominante des cellules GM-CSF qui ont été générés en utilisant le protocole décrit démontre la différenciation réussie de THGM. Nous tenons à souligner que la qualité des cytokines et anticorps de différentes compagnies ou même des lots différents de la même entreprise ne peuvent pas être le même. Par conséquent, nous recommandons que le nombre de cytokines et anticorps utilisés dans la différenciation de cellules d’assistance T doit être testé afin de déterminer les conditions optimales.
En résumé, les cellules THGM qui ont été générés à l’aide de ce protocole expriment un niveau minimal de IL-17, IL-4, ou IFNγ. Nous sommes convaincus que ce protocole fonctionne bien dans la génération T exprimant le GM-CSFHGM cellules in vitro. Cette méthode peut être utilisée davantage étudier la biologie de cellules de THGM dans diverses conditions comme la neuro-inflammation auto-immune, y compris l’encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) chez les souris et les humaine sclérose en plaques, où GM-CSF joue un rôle important dans la pathogenèse de11.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par des subventions de l’Université nationale santé système de Singapour (T1-2014 Oct-12 et T1-2015 Sep-10).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Biowest | L0500-500 | |
| FBS Heat Inactivated | Capricorn | FBS-HI-12A | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10 | Diluted to 1x PBS in sterile water |
| EDTA | 1st Base | BUF-1053-100ml-pH8.0 | |
| 10x ACK buffer | Biolegend | 420301 | diluted in sterile water |
| Cell strainer | SPL Life Sciences | 93070 | |
| CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T | |
| Centrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5810R | |
| Sony SY3200 cell sorter | Sony | Sony SY3200 cell sorter | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 210261 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| FACS tube | Corning | 352054 | |
| 24 well cell culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 | eBioscience | 46-0041-82 | |
| PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) | eBioscience | 12-0251-82 | |
| anti-human/mouse CD44 APC | eBioscience | 17-0441-82 | |
| anti-mouse CD62L FITC | eBioscience | 11-0621-85 | |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | 640010 | |
| Hyclone Trypan Blue Solution | GE healthcare Life Sciences | SV30084.01 | |
| microscope | Nikon | Nikon Elipse TS100 | |
| Purified anti-mouse CD3e antibody | Biolegend | 100314 | |
| Purified hamster anti-mouse CD28 | BD Biosciences | 553295 | |
| Purified Rat anti-mouse IFNγ | eBioscience | 16-7312-85 | |
| Purified anti-mouse IL-4 Antibody | Biolegend | 504102 | |
| Recombinant Mouse IL-7 Protein | R&D system | 407-ML | |
| recombinant human TGF-beta | R&D system | 240-B-010 | |
| PMA | Merck Millipore | 19-144 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| GolgiPlug protein transport inhibitor | BD Biosciences | 51-2301KZ | |
| Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| anti-mouse GM-CSF PE | eBioscience | 12-7331-82 | |
| FITC anti-mouse IL-17A | Biolegend | 506908 | |
| APC anti-mouse IFN-gamma | Biolegend | 505810 | |
| GO Taq qPCR master mix | Promega | A6002 | |
| mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! | invitrogen | 88-7334-88 | |
| Mouse IL-17A Uncouted ELISA | invitrogen | 88-7371-22 |
References
- Zhu, J., Paul, W. E. CD4 T cells: fates, functions, and faults. Blood. 112, 1557-1569 (2008).
- Kara, E. E., et al. Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity. PLoS Pathogens. 10, e1003905 (2014).
- Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. Tumor Immunology meets...Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells. Oncoimmunology. 6, e1356149 (2017).
- Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).
- Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).
- Sheng, W., et al. STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation. Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).
- Codarri, L., et al. RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation. Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).
- El-Behi, M., et al. The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF. Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126, 1121-1133 (2006).
- Zhang, J., et al. A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF. Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).
- Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage. Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).
