Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para diferenciar murino células auxiliares (THGM) T granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing de células T CD4 + de ingênuo, incluindo o isolamento de células T CD4 + de ingênuo, diferenciação de THGM, e análise de células THGM diferenciadas. Esse método pode ser aplicado aos estudos do regulamento e função das células THGM.
Abstract
O fator de Granulócito-macrófago-colônia-estimulando (GM-CSF)-produzir células de T auxiliar (THGM) é um subconjunto de célula auxiliar de T recentemente identificado que predominantemente segrega GM-CSF, sem produzir o interferon (IFN)-γ ou interleucina (IL) -17 e encontra-se a desempenham um papel essencial no neuroinflammation auto-imune. Um método de isolamento de células T CD4 + de ingênua de uma suspensão de célula única de splenocytes e geração de células THGM de células T CD4 + de ingênuo seria uma técnica útil no estudo da imunidade mediada por células T e doenças auto-imunes. Aqui nós descrevemos um método que diferencia as células T CD4 + de ingênuo rato em células THGM promovidas pela IL-7. O resultado da diferenciação foi avaliado pela análise da expressão de citocinas, usando técnicas diferentes, incluindo citocinas intracelulares mancha combinada com citometria de fluxo, um quantitativo em tempo real cadeia da polimerase (PCR), e ensaios imunoenzimático (ELISA). Usando o protocolo de diferenciação THGM conforme descrito aqui, cerca de 55% das células expressa GM-CSF, com uma expressão mínima de IFNα ou IL-17. A expressão predominante de GM-CSF pelas células THGM foi confirmada pela análise da expressão de IFNα, GM-CSF e IL-17 a nível do mRNA e proteínas. Assim, este método pode ser usado para diferenciar ingênuo células T CD4 + THGM em vitro, células que serão úteis no estudo da biologia de pilha de THGM.
Introduction
Células de CD4 + T auxiliar (TH) são componentes essenciais do sistema imunológico, tendo papéis cruciais na defesa do hospedeiro contra patógenos microbianos, na vigilância do câncer e em auto-imunidade1,2,3. Após a ativação do receptor (TCR) de células T, células T CD4 + de ingênuo podem ser diferenciadas em TH1, TH2, TH 17, ou regulamentar T (Treg) as células sob a influência de diferentes citocinas www.UniEthos.org.br2,4, 5. recentemente, um novo subconjunto de células TH , que produz predominantemente GM-CSF, foi identificado e nomeado THGM6. A diferenciação de células THGM é impulsionada por IL-7 através da ativação de um transdutor de sinal e um ativador de transcrição 5 (STAT5). Estas células expressam uma grande quantidade de GM-CSF, tendo uma baixa expressão de outros TH-célula assinatura citocinas como relato e IL-176. GM-CSF, verificou-se a desempenhar um papel crítico no desenvolvimento de CD4 + neuroinflammation mediada por células T7,8. Comparado ao relato - ou IL-17-expressando as células auto-reativas T, GM-CSF-expressando T células transferidos para o selvagem-tipo ratos (WT), causados um início de doença anterior e a maior severidade da doença. Além disso, as células T Csf2- / - não conseguiram induzir encefalomielite auto-imune experimental (EAE) depois enviaram transferidos para destinatários WT, Considerando que células T falta de relato ou IL-17A reteve a capacidade de mediar EAE7. Além disso, um bloqueio de GM-CSF, usando anticorpos neutralizantes amenizada EAE doença gravidade8. Além disso, uma deficiência de STAT5 em células T em camundongos resultou em uma geração THGM diminuída e, portanto, em uma resistência dos ratos a EAE desenvolvimento6. Estes resultados ressaltam a importância das células T GM-CSF-expressandoH na doença auto-imune MPTP. Assim, estabelecer um método para diferenciar as células T GM-CSF-expressandoH de células T CD4 + de ingênuo seria importante no estudo da patogênese de neuroinflammation auto-imune e respostas de imune mediada por células T. No entanto, um protocolo que eficientemente gera células THGM de murino naïve que CD4 + não foi estabelecida.
Aqui nós apresentamos um método que diferencia murino células THGM de células T CD4 + de ingênuo. Este protocolo descreve todo o processo, incluindo a extração do baço do mouse, a preparação de uma suspensão de célula única, a seleção positiva de CD4, a fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação e a célula TH análise e diferenciação. As T auxiliar células diferenciadas são analisadas por citocinas intracelulares mancha combinada com citometria de fluxo para determinar a expressão de citocinas, a nível de célula única, por um PCR quantitativo em tempo real para determinar a expressão de citocinas no nível de mRNA, e por ELISA para avaliar a expressão de citocinas no nível de proteína. Esse método pode ser aplicado aos estudos de biologia de célula THGM sob várias condições, tais como a EAE, onde o GM-CSF desempenha um papel importante na patogênese.
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Protocol
Todos os mouses utilizados neste protocolo foram sobre o fundo genético C57BL/6 e alojados sob condições específicas isentos de agentes patogénicos, da Universidade Nacional de Cingapura. Todos os experimentos foram realizados utilizando protocolos aprovados pelo Comité de uso da Universidade Nacional de Cingapura e institucional Cuidado Animal.
1. reagente e preparação de Material
- Prepare 500 mL de tampão fosfato salino (PBS) contendo 2% de soro fetal bovino (FBS) e 1 mM de ácido de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).
Nota: Mantenha o buffer no gelo durante todo o processo para obter melhores resultados. - Prepare 50 mL de mídia RPMI completa contendo penicilina-estreptomicina RPMI 1640, 10% FBS e 1%. Use mídia RPMI completa contendo 50 µM β-Mercaptoetanol para a diferenciação de células THGM. Adicione o β-Mercaptoetanol em uma coifa.
- Prepare 7,5 mL de uma mistura de anticorpo anti-CD3e diluindo concentrado anti-CD3e estoque a 3 μg/mL de PBS. Revestimento de placas boas 48 adicionando 150 μL da mistura de anticorpo para cada poço e incubar a placa a 37 ° C, durante pelo menos 1 h, ou a 4 ° C durante a noite.
- Esterilizar um par de tesouras e pinças e mantê-los em etanol a 70% entre as dissecções.
2. preparação dos Splenocytes murino
- Eutanásia o mouse (de 6 a 8 semanas de idade) usando um aprovado institucionalmente CO2 asfixia ou deslocamento cervical. Pulverize o mouse com 70% de etanol e montá-lo em um bloco de poliestireno em suas costas. Transferi o mouse para uma câmara de segurança biológica para prosseguir com as etapas a seguir.
- Segure a pele usando um par de pinças e cortar a pele abaixo da caixa torácica no lado esquerdo para cerca de 4 cm, usando um par de tesouras. Abra o saco peritoneal para expor o baço e usar Pinças esterilizadas para extrair o baço.
- Coloque um filtro de célula de 70 μm em um tubo de 50 mL e pre-molhe-o com 2 mL de tampão. Coloque os baços no filtro da célula (2 – 3 baços para filtro de uma célula) e macerá-los usando a extremidade de um êmbolo de seringa de 5 mL.
- Lave o filtro e tubo várias vezes com 1 a 2 mL de tampão de isolamento de célula até que todas as células são liberadas para dentro do tubo. Descartar o filtro célula e centrifugar as células a 350 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
- Ressuspender as células com 5 mL de frio (4 ° C) de amónio-cloreto-potássio (ACK) lise tampão (150mm NH4Cl, 10mm KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA; pH 7,2-7,4) e misture-os suavemente por 2 min. adicionar 10 mL de mídia RPMI completa para neutralizar o ACK buffer e centrifugar imediatamente as células a 350 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante após a centrifugação.
3. isolamento de T CD4 + células usando Microbeads magnéticos CD4 e uma coluna de separação de células
- Ressuspender as células em 5 mL de tampão de isolamento de célula. Filtre a suspensão de células usando um filtro de pré-separação (30 μm) para um novo tubo de 15mL para remover os detritos.
- Pegue 10 μL da suspensão celular e fazer uma diluição de 10 x adicionando 90 μL de tampão. Pegue 10 μL da suspensão celular diluídos e misturá-lo com 10 μL de trypan azul para a contagem de células. Conte as células em um hemocytometer para determinar o rendimento de células viáveis.
- Centrifugar as células a 350 x g por 5 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 90 μL de tampão por 107 células. Adicione 10 μL de microbeads magnéticos de CD4 por 107 células. Incube as celulas por 15 min a 4 ° C. Para obter melhores resultados, misture a suspensão de eritrócitos suavemente a cada 5 minutos durante a incubação.
- Enquanto as células estão incubando, coloca uma coluna de separação magnética depor. Pre-molhado a coluna com 2 mL de tampão.
- No final da incubação da célula/pérola, lavam-se as células com 5 mL de tampão e centrifugá-los a 350 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 1 mL de tampão, carregar a amostra para a coluna de separação de células e deixá-lo fluir. Use um tubo de centrífuga de 15 mL para coletar a fração de células CD4. Adicione 1 mL de tampão de lavar o reservatório antes de que está seco. Repita a etapa de lavagem 2 x.
- Remover a coluna da célula de separação do suporte magnético e colocá-lo em um novo tubo de centrífuga de 15 mL. Adicionar 2 mL de tampão de isolamento de célula para a coluna de separação de células e aplique o êmbolo com firmeza para forçar as células da coluna.
- Centrifugue a fração a 350 x g por 5 min a 4 ° C para obter células CD4 +. Desprezar o sobrenadante.
4. purificação das células T CD4 + Naive (CD4+CD25–CD44EisCD62LOi) por diferenciação celular classificação e THGM fluorescência-ativado
- Resuspenda o pellet de célula CD4 + a obtidos em 500 µ l de tampão. Misture as células com uma mistura de anticorpos fluorescentes-conjugados contendo CD4-PerCp (2,8 µ g/mL), CD44-APC (2,4 µ g/mL), CD25-PE (2 µ g/mL) e CD62L-FITC (10 µ g/mL) (tabela 1). Incube as células no gelo por 20 a 30 min, protegendo-os da luz.
Nota: As concentrações dos anticorpos foram otimizadas previamente no laboratório. O número de anticorpos listados é para células de camundongos de 1 – 2. - Após a incubação, as células com 5 mL de tampão de lavar e centrifugar as células a 350 x g por 5 min a 4 ° C.
- Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 500 µ l de tampão. Filtre as células novamente usando uma malha de nylon.
- Transfira a suspensão de células para um tubo de FACS para classificação de célula. Precoat os tubos de FACS coleção com 500 µ l de tampão.
- Obter um CD4+CD25–CD44EisCD62LOi população (ingênuo CD4+ T células) classificando os FACS. Portão em CD4+CD25– primeiras e em seguida, selecionadas CD44EisCD62LOi células a partir desta população.
- Recolher o ingênuo CD4+ T fracções de célula para um novo tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar as células a 350 x g por 5 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender as células T CD4 + de ingênuo em uma concentração de 106 células/mL em mídia RPMI completa contendo 50 µM β-Mercaptoetanol.
- Aspire os anticorpos anti-CD3e usados para precoating na placa de 48. Células de 0,25 milhões de sementes (250 µ l) em cada poço com IL-7 (2 ng/mL), anti-CD28 (1 µ g/mL) e antirelato (10 µ g/mL) (tabela 1).
Nota: As concentrações de anticorpos e citocinas foram otimizadas previamente no laboratório para uma diferenciação de células THGM. - Incube as células a 37 ° C com 5% de CO2 por 3 dias. Não altere o meio durante a incubação.
5. análise das células do rato THGM gerados In Vitro
- Usando um microscópio, verifica a diferenciação celular 3 d após a diferenciação. As células da colheita e centrifugá-los a 350 x g por 5 min a 4 ° C. Lavar as células 2 x com mídia RPMI completa.
Nota: Células diferenciadas são maiores em tamanho do que as células T CD4 + de ingênuo. - Ressuspender as células em 1 mL de mídia RPMI completa. Leve 10 μL da suspensão de células e misture bem com 10 μL de trypan azul para determinar o número de células com um hemocytometer. Divida células diferenciadas em três poções para um restimulation e análise.
Nota: Coloração de citocinas intracelulares e ensaios de ELISA exigem milhões de células ≥0.5 e qPCR análise requer ≥ 1 milhão células. -
Para coloracao intracelular cytokine, reestimular as células com phorbol myristate 12 13-acetato (PMA) (100 ng/mL) e ionomycin (1 μg/mL) na presença de um inibidor de transporte de proteína (1 µ l/mL) por 4-6 h.
- As células da colheita e manchá-las com anticorpo anti-CD4 (conjugada com PerCP, 0,2 mg/mL, diluição de 1: 100; ou conjugado FITC, 0,5 mg/mL, diluição de 1: 100) por 30 min.
- Consertar as células com 200 μL de tampão de fixação de 20 – 60 min. Após a fixação, lavar as células 2 x com 1 mL de tampão de permeabilização.
- Executar a coloracao intracelular com anticorpos contra o GM-CSF (PE-conjugados, 0,2 mg/mL, diluição de 1: 100), IL-17A (conjugado FITC, 0,5 mg/mL, diluição de 1: 100; APC-conjugated, 0,2 mg/mL, diluição de 1: 100), IL-4 (APC-conjugados, 0,2 mg/mL, diluição de 1: 100) e o relato (APC-conjugados, 0,2 mg/mL, diluição de 1: 100; PE-conjugated, 0,2 mg/mL, diluição de 1: 100) por 30 min no escuro.
- Para uma análise da expressão gênica de citocinas por células diferenciadas qPCR, ative as células com limite a placa anti-CD3e (3 μg/mL) (precoating a placa, conforme descrito na etapa 1.3). A 3 h após a estimulação, colhem as células para isolar o RNA total usando um reagente de extração de RNA de fenol para preparar cDNA para o qPCR. O programa usado para o qPCR e primeiras demão são listados nas tabelas 2 e 3, respectivamente.
- Para a análise da secreção de proteínas de citocinas por células diferenciadas, reestimular as células com limite a placa anti-CD3e (3 μg/mL) por 24 h (precoating a placa, conforme descrito na etapa 1.3). Recolher a sobrenadante para IL-17 e GM-CSF ELISA determinar as concentrações de cultura de células.
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Representative Results
Naive células T CD4 +, isoladas de dois camundongos C57BL/6 machos de 8 semanas de idade foram divididas em três partes. Uma parte das células foi diferenciada em células THGM o protocolo descrito a seguir. Outra parte foi cultivado sob uma condição de THGM na presença de anticorpo anti-IL-4 (10 µ g/mL) para testar a influência de um bloqueio de IL-4 na diferenciação de THGM. A última parcela foi cultivada sob uma condição de diferenciação 17 TH(3 µ g/mL anti-CD3e, 1 µ g/mL anti-CD28, 10 ng/mL TGFβ, IL-6 de 30 ng/mL, 10 µ g/mL antirelato e 10 µ g/mL anti-IL-4). Após 3 dias de diferenciação, as células foram colhidas e restimulated para analisar a expressão de citocinas por citocinas intracelulares coloração qPCR e ELISA. Resultados da coloração de citocinas intracelulares e análise de FACS demonstraram que cerca de 55% das células cultivadas sob a condição de diferenciação THGM GM-CSF-expressando células (figura 1A), Considerando que apenas cerca de 2% das células diferenciadas sob o TH17 condição expressa de GM-CSF. Além disso, em comparação com a condição de diferenciação 17 THque gerou 8.17% IL-17-células produtoras de, a condição de diferenciação THGM só resultou em cerca de 1% das células de IL-17-expressando. Sob as condições de dois diferenciação testadas, apenas uma pequena fração das células expressa relato (< 1%). Além disso, algumas células T IL-4-expressando (< 1%) foram vistos na cultura de 17 THGM ou TH(figura 1B). Estes resultados mostraram que usando a condição de diferenciação de células THGM descrita, nós com sucesso geraram células T helper que expressam predominantemente GM-CSF.
A bem sucedida diferenciação de células THGM mais foi confirmada pelos resultados de qPCRs e testes de ELISA para examinar a expressão de GM-CSF e IL-17 a nível do RNA e proteína nas células diferenciadas. As células THGM geradas tinham uma expressão significativamente maior de Csf2 , mas uma expressão muito menor de Il17 em comparação com o TH17 células (Figura 2A). Como mostrado na Figura 2B, proteína de GM-CSF foi detectada em sobrenadantes de cultura de tanto THGM TH17 de células. No entanto, a concentração de GM-CSF na cultura THGM sobrenadante foi sobre o triplo do que em TH17 células. Além disso, as proteínas de IL-17 (Figura 2B), relato e IL-4 foram indetectáveis na cultura de célula THGM sobrenadante. Desde que o RORγt foi identificado como o fator de transcrição mestre de TH17 células, enquanto STAT3 e STAT5 foram mostradas para ter uma grande importância no desenvolvimento do TH17 e células THGM, respectivamente, examinamos seu mRNA expressão nas células THGM e TH17. Verificou-se que as células THGM tinham uma expressão significativamente menor de Rorc e uma Stat5 maior do que o TH17 células (Figura 3). Curiosamente, as células THGM tinham uma expressão ligeiramente inferior (mas não significativa) da Stat3 gene em comparação com o TH17 células. Estes resultados indicaram que, embora a GM deHT e a TH17 diferenciação são regidos por diferentes fatores transcricionais, eles podem compartilhar algumas características comuns.
Figura 1: THGM células predominantemente expresso GM-CSF. THGM e TH17 células foram colhidas no dia 3, após a diferenciação. (A) por 5h, as células foram restimulated com PMA e ionomycin na presença de um inibidor de proteína de transporte. A expressão de GM-CSF, IL-17 e o relato foi analisada pela coloração de citocinas intracelulares seguido por citometria de fluxo. Expressão (B) a IL-4 e relato por TH17 ou células THGM foi analisado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Expressão de IL-17, relato e GM-CSF em TH17 e células THGM. THGM e TH17 células foram colhidas e restimulated com placa-limite anti-CD3e, 3 dias após a diferenciação. (A) células foram colhidas para isolar o RNA para a preparação do cDNA, 3 h após a estimulação. As expressões de Ifnge Il-17 Csf2 foram determinadas por um PCR quantitativo em tempo real (qPCR). (B) a sobrenadante de cultura foi colhida em 24 h após a estimulação, para determinar a concentração de GM-CSF em células THGM, ou IL-17 em TH17 células, por ELISA. (* * p < 0,01, * * * p < 0,001.) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Expressão gênica Rorc, Stat3 e Stat5 TH17 e células THGM. Diferenciada THGM e TH17 células foram colhidas e restimulated com placa-limite anti-CD3e para h. 3 o RNA Total foi isolado para preparar o cDNA. As expressões Rorc, Stat3e Stat5 foram determinadas por qPCR. (* p < 0.05, * * p < 0,01; NS = não significativo.) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome | Concentração das ações | concentração de trabalho | Diluição | volume de 500 μL de tampão de coloração |
| CD4-PerCp | 0,2 mg/mL | Μg/mL 2,8 | 1:71 | 7 ΜL |
| CD44-APC | 0,2 mg/mL | 2.4 μg/mL | 1:83 | 6 ΜL |
| CD25-PE | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | 5 ΜL |
| CD62L-FITC | 0,5 mg/mL | 10 μg/mL | 01:50 | 10 ΜL |
| GM-CSF-PE | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| IL-17A-FITC | 0,5 mg/mL | 5 μg/mL | 1: 100 | |
| IL-17A-APC | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| RELATO-APC | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| RELATO-PE | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| IL-4-APC | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| CD4-FITC | 0,5 mg/mL | 5 μg/mL | 1: 100 | |
| IL-7 | 20 μg/mL | 2 ng/mL | 1: 10000 | |
| Anti-CD28 | 0,5 mg/mL | 1 μg/mL | 1: 500 | |
| Antirelato | 1 mg/mL | 10 μg/mL | 1: 100 |
Tabela 1: Usado citocinas e anticorpos.
| Primeira demão | Sequência de | |
| IFNG Para a frente | 5'-TCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAA-3' | |
| IFNG Inverter | 5'-TGGCTCTGCAGGATTTTCATG-3' | |
| Il-17 Para a frente | 5'-CTCCAGAAGGCCCTCAGACTAC-3' | |
| Il-17 Inverter | 5'-AGCTTTCCCTCCGCATTGACACAG-3' | |
| Csf2 Para a frente | 5'-TTTACTTTTCCTGGGCATTG-3' | |
| Csf2 Inverter | 5'-TAGCTGGCTGTCATGTTCAA-3' | |
| RORC Para a frente | 5'-TTTGGAACTGGCTTTCCATC-3' | |
| RORC Inverter | 5'-AAGATCTGCAGCTTTTCCACA-3' | |
| STAT3 Para a frente | 5'-TGGCCCTTTGGAATGAAGGGTACA-3' | |
| STAT3 Inverter | 5'-CACTGATGTCCTTTTCCACCCAAGT-3' | |
| Stat5 Para a frente | 5'-TGCCCGGCTGGAACTACACCTT-3' | |
| Stat5 Inverter | 5'-ATGCCCCCGATTTCCGAGTCAC-3' | |
Tabela 2: Primers para qPCR.
| passo | Temp. (° C) | tempo | Repita | |
| 1 | 95 | 2 min | ||
| 2 | 95 | 3 s | ||
| 3 | 60 | 30 s | Passo 2 e 3, 39 vezes | Leia a placa |
| 4 | 65-95 | 5 s | Passo 4, 30 vezes, + 0,5 ° C a cada repetição | Leia a placa |
Tabela 3: Programa PCR para avaliar a expressão gênica.
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Discussion
Aqui descrevemos um protocolo de uma diferenciação de THGM em vitro de células de rato naïve CD4 +, seguida de uma análise das células diferenciadas para validar o método. Digno de nota, tanto o baço e linfonodos pode ser usados para ingênuo purificação de células T CD4 + e THGM diferenciação. A expressão de citocinas, determinada pela coloração de citocinas intracelulares combinado com citometria de fluxo mostraram que cerca de 55% das células foram induzidas a se tornar células de GM-CSF-expressando sob a condição de THGM (figura 1A). Em comparação com células sob a condição de diferenciação 17 TH, as células diferenciadas sob a condição de THGM continham um nível de fundo de uma população de IL-17-expressando; no entanto, a expressão do gene il17 é indetectável por qPCR (Figura 2A).
Curiosamente, apesar da adição de um anticorpo neutralizante do relato, detectamos um baixo nível de expressão de RNAm de Ifng em ambos o TH17 e as células THGM, e menos de 1% das células THGM foram relato-expressando as células. (Figuras 1 - 2). Isto poderia ser devido à quantidade insuficiente de anticorpos neutralizantes de relato usado na condição de THGM, ou a uma eventual contaminação inatas células do sistema imunológico (que é quase impossível obter células de CD4 + T 100% puro ingênuo) que forneceu uma pequena quantidade de IL-12 para a geração de 1 célula THpossível. Também é possível que a condição de THGM usamos não foi capaz de completamente desligado da transcrição de Ifng. Iremos abordar este assunto no futuro. Não obstante, proteína de relato não foi detectada nos sobrenadantes de cultura de THGM ou TH17 por ELISA.
O protocolo apresentado aqui, só usamos um anticorpo bloqueio relato juntamente com IL-7 para a diferenciação de THGM. Após 3 dias de diferenciação sob esta condição, mais de 50% das células expressa GM-CSF, mas não de IL-17, IL-4, ou relato (Figura 1). Além disso, a expressão de Rorc, o gene que codifica a RORγt, que é crítica para a diferenciação de Th179, foi significativamente menor nas células THGM comparadas no TH17 células (Figura 3). Este protocolo é, portanto, um método mais eficiente para a geração de células T GM-CSF-expressando de outra anteriormente relatado10. Nossos resultados também demonstraram que, além da pureza de ingênuo T células e sinalização de IL-7, a prevenção da diferenciação de células T relato-expressando é uma chave para geração de THGM.
A expressão predominante das células GM-CSF que foram gerados usando o protocolo descrito demonstrado a diferenciação bem-sucedida de THGM. Gostaríamos de salientar que a qualidade de citocinas e anticorpos de diferentes empresas ou até mesmo de diferentes lotes da mesma empresa não podem ser o mesmo. Portanto, é recomendável que o número de citocinas e anticorpos usados na diferenciação de célula auxiliar T deve ser testado a fim de descobrir a condição ideal.
Em resumo, as células THGM que foram geradas usando este protocolo expressam um nível mínimo de IL-17, IL-4, ou relato. Estamos confiantes que este protocolo funciona bem na geração de GM-CSF-expressando THGM células in vitro. Esse método pode ser usado para um estudo mais aprofundado da biologia das células THGM em diversas condições tais como neuroinflammation auto-imune, incluindo encefalomielite auto-imune experimental (EAE) em camundongos e humano esclerose múltipla, onde o GM-CSF desempenha um importante papel na patogênese11.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este estudo foi suportado por subvenções provenientes da Universidade Nacional saúde sistema de Cingapura (T1-2014 Oct-12 e T1-2015 Sep-10).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Biowest | L0500-500 | |
| FBS Heat Inactivated | Capricorn | FBS-HI-12A | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10 | Diluted to 1x PBS in sterile water |
| EDTA | 1st Base | BUF-1053-100ml-pH8.0 | |
| 10x ACK buffer | Biolegend | 420301 | diluted in sterile water |
| Cell strainer | SPL Life Sciences | 93070 | |
| CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T | |
| Centrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5810R | |
| Sony SY3200 cell sorter | Sony | Sony SY3200 cell sorter | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 210261 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| FACS tube | Corning | 352054 | |
| 24 well cell culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 | eBioscience | 46-0041-82 | |
| PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) | eBioscience | 12-0251-82 | |
| anti-human/mouse CD44 APC | eBioscience | 17-0441-82 | |
| anti-mouse CD62L FITC | eBioscience | 11-0621-85 | |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | 640010 | |
| Hyclone Trypan Blue Solution | GE healthcare Life Sciences | SV30084.01 | |
| microscope | Nikon | Nikon Elipse TS100 | |
| Purified anti-mouse CD3e antibody | Biolegend | 100314 | |
| Purified hamster anti-mouse CD28 | BD Biosciences | 553295 | |
| Purified Rat anti-mouse IFNγ | eBioscience | 16-7312-85 | |
| Purified anti-mouse IL-4 Antibody | Biolegend | 504102 | |
| Recombinant Mouse IL-7 Protein | R&D system | 407-ML | |
| recombinant human TGF-beta | R&D system | 240-B-010 | |
| PMA | Merck Millipore | 19-144 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| GolgiPlug protein transport inhibitor | BD Biosciences | 51-2301KZ | |
| Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| anti-mouse GM-CSF PE | eBioscience | 12-7331-82 | |
| FITC anti-mouse IL-17A | Biolegend | 506908 | |
| APC anti-mouse IFN-gamma | Biolegend | 505810 | |
| GO Taq qPCR master mix | Promega | A6002 | |
| mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! | invitrogen | 88-7334-88 | |
| Mouse IL-17A Uncouted ELISA | invitrogen | 88-7371-22 |
References
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