Summary
Здесь мы представляем протокол дифференцировать мышиных granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T (THGM) хелперы из клеток CD4 + T наивно, включая изоляции наивно CD4 + Т-клеток, дифференциация THGM, и анализ дифференцированных клеток THGM. Этот метод может применяться для изучения положения и функции клеток THGM.
Abstract
Гранулоцитарно макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ)-производство клеток T вспомогательный (THGM) является подмножеством недавно выявленных вспомогательные клетки T, что преимущественно выделяет ГМ-КСФ без производства Гамма интерферон (ИФН) или интерлейкина (IL) -17 и оказывается играть важную роль в аутоиммунных neuroinflammation. Метод изоляции клеток CD4 + T наивно от одноклеточного приостановления splenocytes и поколения клетки THGM от наивного CD4 + Т-клеток было бы полезным методом в исследовании T клеточный иммунитет и аутоиммунных заболеваний. Здесь мы описываем метод, который отличает мыши наивно CD4 + Т-клеток в клетки THGM, пропагандируемые IL-7. Итоги дифференциация оценивалась путем анализа выражения цитокинов, с использованием различных методов, включая внутриклеточных цитокинов, пятнать в сочетании с проточной цитометрии, количественных реального времени полимеразной цепной реакции (ПЦР), и энзим соединенный иммуноферментного анализа (ИФА). Используя протокол дифференциация THGM как описано здесь, около 55% клеток выразил ГМ-КСФ с минимальным выражением IFNα или ил-17. Преобладающим выражение ГМ-КСФ клетками THGM далее подтверждается анализ экспрессии и ГМ-КСФ, IFNα, Ил-17 уровня мРНК и белка. Таким образом, этот метод может использоваться для различения наивно клеток CD4 + T THGM клеток в пробирке, которые будут полезны в изучении биологии клетки THGM.
Introduction
Хелперы CD4 + T (TH) являются важнейшими компонентами иммунной системы, что решающую роль в принимающей обороны против патогенных микроорганизмов, наблюдения рак и аутоиммунные заболевания1,2,3. После активации клеток T рецептор (TCR) наивно CD4 + Т-клеток могут быть дифференцированы в TH1, T 2H, TH 17, или регулирования T (Treg) клеток под влиянием различных цитокинов кругах2,4, 5. Недавно, новый подмножество клеток TH , который преимущественно производит ГМ-КСФ, определены и назвал THGM6. Дифференцировка клеток THGM обусловлено IL-7 путем активации сигнала датчика и активатор транскрипции 5 (STAT5). Эти клетки выразить большое количество ГМ-КСФ имея низкий выражение других TH-клетки подпись цитокинов, таких как IFNγ и IL-176. Было установлено, что ГМ-КСФ играть решающую роль в развитии CD4 + Т клеток опосредованной neuroinflammation7,8. По сравнению с IFNγ - или ил-17-выражая аутореактивная Т-клеток, ГМ-КСФ выражая T клетки передана одичал тип (WT) мышей вызвало ранее заболевания и более высокой тяжести заболевания. Кроме того клетки T Csf2- / - не побудить Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE) после восприимчивую передается WT получателям, тогда как Т-клетки, не хватает IFNγ или ил 17а сохранили способность посредником ЕАЕ7. Кроме того блокада ГМ-КСФ использование нейтрализующих антител смягчены ЕАЕ болезни тяжести8. Кроме того дефицит STAT5 в Т-клетки мышей привело в уменьшилось поколения THGM и, следовательно, сопротивление мышей ЕАЕ развития6. Эти выводы подчеркивают важность ГМ-КСФ выражая TH клеток в neuroinflammatory аутоиммунных заболеваний. Таким образом установление метода дифференцировать ГМ-КСФ выражая TH клетки от наивного CD4 + Т-клеток было бы важно в изучении патогенеза аутоиммунного neuroinflammation и T клеточного иммунного ответа. Однако протокол, эффективно создает THGM клетки из мышиных наивен, что CD4 + установлено не было.
Здесь мы представляем метод, который отличает мышиных THGM клетки от наивного CD4 + Т-клеток. Этот протокол описывает всю процедуру, включая извлечение хандры от мыши, подготовка одноклеточных подвеска, выбор положительный CD4, активируемых флуоресценции клеток, сортируя (FACS) и клеток TH дифференциация и анализа. Дифференцированные Т-хелперы анализируются внутриклеточных цитокинов, пятнать в сочетании с проточной цитометрии определить выражение cytokine на уровне одной ячейки, Количественная ПЦР в реальном времени чтобы определить выражение cytokine на уровне мРНК, и по ELISA оценить выражение cytokine уровня белка. Этот метод может применяться для исследования биологии клетки THGM в различных условиях, таких как ЕАЕ, где ГМ-КСФ играет важную роль в патогенезе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все мыши, используемые в настоящем протоколе были на фоне генетических C57BL/6 и размещается в определенных условиях свободной от возбудителя в национальном университете Сингапура. Все эксперименты проводились с использованием протоколов, одобренных институциональный уход животных и использование Комитета из национального университета Сингапура.
1. реагента и подготовка
- Подготовка 500 мл фосфат амортизированное saline (PBS), содержащий 2% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА).
Примечание: Сохраняйте буфер на льду на протяжении всей процедуры для получения оптимальных результатов. - Подготовка 50 мл полного RPMI носителя, содержащего RPMI 1640, 10% FBS и 1% пенициллин стрептомицином. Используйте полный RPMI СМИ, содержащие 50 мкм β-меркаптоэтанол для дифференцировки клеток THGM. Добавьте β-меркаптоэтанол зонта.
- Подготовьте 7,5 мл смеси антитела анти CD3e путем разбавления анти CD3e в основном складе 3 мкг/мл в PBS. Слой пластины 48-хорошо, добавив 150 мкл антител смеси для каждой скважины и инкубировать пластины при 37 ° C по меньшей мере 1 h, или на 4 ° C на ночь.
- Стерилизовать пару ножниц и щипцы и держать их в 70% этанол между вскрытия.
2. Подготовка мышиных Splenocytes
- Усыпить мыши (по 6-8 недель) с помощью институционально утвержденного CO2 удушья или шейки матки дислокации. Спрей мышь с 70% этанола и смонтировать его на полистирола блок на своей спине. Передать мыши биологической безопасности кабинета выполните следующие действия.
- Придерживайте кожу с помощью пары щипцов и вырезать кожу чуть ниже грудной клетки на левой стороне для около 4 см, используя ножницы. Откройте перитонеальный sac подвергать селезенки и использовать стерильные щипцы для извлечения селезенки.
- Поместите стрейнер ячейки 70 мкм на 50 мл трубки и предварительно смочить его с 2 мл буфера. Селезенки на ячейки фильтра (2-3 селезенки для одной ячейки фильтра) и размякнуть их с помощью конца поршень шприца 5 мл.
- Промойте ситечко и трубка несколько раз с 1-2 мл ячейки изоляции буфера до тех пор, пока все ячейки сбрасываются в трубу. Отменить ячейки сита и центрифуги клетки на 350 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
- Ресуспензируйте клетки лепешка с 5 мл холодной (4 ° C) аммония хлорид-калия (ACK) лизировать буфер (150 мм NH4Cl, 10 мм KHCO3, 0,1 мм Na2ЭДТА; рН 7,2 – 7,4) и осторожно перемешать добавить 10 мл 2 мин полный RPMI СМИ для нейтрализации ACK буфер и немедленно центрифуга клетки на 350 x g 5 мин при 4 ° C. Отбросить надосадке после центрифугирования.
3. изоляция CD4 + T клетки с помощью магнитных CD4 микрошарики и столбец разделения клетки
- Ресуспензируйте Пелле клеток в 5 мл буфера изоляции клеток. Фильтрации суспензии клеток, используя фильтр разделительный (30 мкм) в новый 15-мл пробирку для удаления любого мусора.
- Возьмите 10 мкл суспензии клеток и сделать 10 x разрежения, добавив 90 мкл буфера. Взять 10 мкл суспензии клеток разреженных и смешайте его с 10 мкл Трипановый синий для подсчета клеток. Подсчитать ячейки в Горяева для определения урожайности жизнеспособных клеток.
- Центрифуга клетки на 350 x g 5 минут при температуре 4 ° C и удалить супернатант.
- Ресуспензируйте клетки в 90 мкл буфера за 107 клеток. Добавьте 10 мкл магнитных CD4 микрошарики за 107 клеток. Инкубировать клетки для 15 мин при 4 ° C. Для получения оптимальных результатов перемешать суспензию клеток нежно каждые 5 минут во время инкубации.
- В то время как инкубации клеток, место столбец разделения на магнитную подставку. Предварительно Намочите столбец с 2 мл буфера.
- В конце инкубации клеток/шарик вымыть клетки с 5 мл буфера и центрифуги их на 350 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
- Ресуспензируйте клеток в 1 мл буфера, загрузить образец в столбце разделения клетки и пусть она потока через. Используйте 15-mL пластиковых пробирок для сбора фракция CD4-клеток. Добавьте 1 mL буфера мыть резервуар, прежде чем это сухой. Повторите шаг 2 x стиральная.
- Удалите столбец разделения клетки из магнитного стенд и поместите его на новых пластиковых пробирок 15мл. Добавить 2 мл буфера изоляции клеток в столбце разделение ячеек и применить поршень прочно для того, чтобы заставить клетки из столбца.
- Центрифуга дроби на 350 x g 5 минут при температуре 4 ° C для получения CD4 + клеток. Выбросите супернатант.
4. Очистка наивный CD4 + Т-клеток (CD4+CD25–CD44ЛоCD62LПривет) активирована флуоресценции сортировки клеток и THGM дифференциация
- Ресуспензируйте полученные гранулы CD4 + клеток в 500 мкл буфера. Смешать клетки с флуоресцентных конъюгированных антител смеси, содержащей CD4-PerCp (2,8 мкг/мл), CD44-APC (2,4 мкг/мл), CD25-PE (2 мкг/мл) и CD62L-FITC (10 мкг/мл) (Таблица 1). Инкубируйте клетки на льду для 20-30 мин, защищая их от света.
Примечание: Ранее оптимизированы концентрации антител в лаборатории. Количество антител в списке является для клетки от 1 – 2 мышей. - После инкубации вымыть клетки с 5 мл буфера и центрифуги клетки на 350 x g 5 мин при 4 ° C.
- Отменить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 500 мкл буфера. Фильтр снова используя нейлоновая сетка клетки.
- Суспензию клеток передавать СУИМ трубка для сортировки клеток. Precoat коллекции СУИМ трубы с 500 мкл буфера.
- Получения CD4+CD25–CD44ЛоCD62LПривет населения (наивных CD4+ T клетки) сортируя СУИМ. Ворота на CD4+CD25– первый, а затем выберите CD44ЛоCD62LПривет клетки от этого населения.
- Собирать наивно CD4+ T клетки фракций в новом 15-mL пластиковых пробирок. Центрифуга клетки на 350 x g 5 минут при температуре 4 ° C и удалить супернатант.
- Ресуспензируйте наивно CD4 + Т-клеток в концентрации 106 клеток/мл в полной RPMI СМИ, содержащие 50 мкм β-меркаптоэтанол.
- Аспирационная антител анти CD3e, используется для намывного в 48-ну пластины. Семя 0,25 млн (250 мкл) клетки в каждой скважине с ил-7 (2 нг/мл), анти CD28 (1 мкг/мл) и анти IFNγ (10 мкг/мл) (Таблица 1).
Примечание: Концентрации цитокинов и антитела были оптимизированы ранее в лаборатории для дифференцировки клеток THGM. - Инкубируйте клетки при 37 ° C с 5% CO2 на 3 дня. Не изменяйте носитель во время инкубации.
5. Анализ клеток мыши THGM сгенерирована In Vitro
- С помощью микроскопа, проверьте дифференцировки клеток 3 d после дифференциации. Урожай клетки и центрифуги их на 350 x g 5 мин при 4 ° C. Вымыть клетки 2 x с полным RPMI СМИ.
Примечание: Дифференцированных клеток больше по размеру, чем наивно CD4 + Т-клеток. - Ресуспензируйте клеток в 1 мл полного RPMI средств массовой информации. Возьмите 10 мкл суспензии клеток и смешать его с 10 мкл Трипановый синий для определения количества клеток с Горяева. Разделите на три зелья рестимуляции и анализа дифференцированных клеток.
Примечание: Пятнать внутриклеточных цитокинов и ELISA assays требуют ≥0.5 миллионов клеток, и ПЦР анализ требует ≥ 1 миллион клеток. -
Для окрашивания внутриклеточных цитокинов, активизации клеток с phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA) (100 нг/мл) и ionomycin (1 мкг/мл) в присутствии ингибитор транспортного белка (1 мкл/мл) для 4-6 ч.
- Урожай клетки и пачкает их с антитела анти CD4 (PerCP спрягаются, 0,2 мг/мл, 1: 100 разрежения; или FITC-спрягаются, 0.5 мг/мл, разведение 1: 100) за 30 мин.
- Исправьте клетки с 200 мкл буфера фиксации для 20 – 60 мин. После фиксации, вымыть клетки 2 x с 1 мл permeabilization буфера.
- Выполните внутриклеточных окрашивание с антителами против ГМ-КСФ (PE-спрягаются, 0,2 мг/мл, разбавления 1: 100), IL-17а (FITC-спрягаются, 0.5 мг/мл, разведение 1: 100; APC-conjugated, 0,2 мг/мл, разведение 1: 100), Ил-4 (APC-спрягаются, 0,2 мг/мл, разведении 1: 100), а IFNγ (APC-спрягаются, 0,2 мг/мл, разведение 1: 100; PE-conjugated, 0,2 мг/мл, разведение 1: 100) за 30 мин в темноте.
- Для ПЦР анализ экспрессии генов цитокинов, дифференцированных клеток Активируйте клетки с привязкой к пластине анти CD3e (3 мкг/мл) (грунтовочный пластины, как описано в шаге 1.3). В 3 ч после стимуляции урожай клетки, чтобы изолировать всего РНК с помощью фенола РНК добыча реагент для подготовки cDNA ПЦР. Грунты и программа, используемая для ПЦР, перечислены в таблицах 2 и 3, соответственно.
- Для анализа белка секрецию цитокинов путем дифференцированных клеток активизации клеток с привязкой к пластине анти CD3e (3 мкг/мл) на 24 часа (грунтовочный пластины, как описано в шаге 1.3). Урожай клеточной культуры супернатанта для Ил-17 и ГМ-КСФ ELISA для определения их концентрации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Наивный CD4 + Т-клеток, изолированных от двух 8-недельных самцов мышей C57BL/6 были разделены на три части. Одна часть клеток была дифференцированной в клетки THGM после описанных протокол. Другая часть была культивированный под условие THGM присутствии антитела анти Ил-4 (10 мкг/мл) для проверки влияния Ил-4 блокады в дифференциации THGM. Последняя часть была культивировали при условии TH17 дифференциации (3 мкг/мл анти CD3e, 1 мкг/мл анти CD28, 10 нг/мл TGFβ, Ил-6 30 нг/мл, 10 мкг/мл анти IFNγ и 10 мкг/мл анти Ил-4). После 3 дней дифференциации клетки были собраны и рестимулирован проанализировать выражение cytokine, окрашивание внутриклеточных цитокинов, ПЦР и ИФА. Результаты от пятнать внутриклеточных цитокинов и СУИМ анализ показал, что около 55% клетки культивировали при условии дифференцировки THGM были ГМ-КСФ выражая клеток (рис. 1а), тогда как только около 2% клеток дифференцированные по TH17 условие выразил ГМ-КСФ. Кроме того по сравнению с TH17 дифференциация условие, которое генерируется 8.17% Ил-17-продуцирующих клеток, дифференциация состояния THGM только привело к около 1% клеток ИЛ-17-выражения. В условиях двух дифференциация испытания, только небольшая часть клеток выразил IFNγ (< 1%). Кроме того несколько Ил-4-выражая Т-клетки (< 1%) были замечены в культуре THGM или TH17 (рис. 1B). Эти результаты показали, что использование описано состояние дифференциация клеток THGM, мы были успешно созданы Т-хелперы, которые преимущественно Экспресс ГМ-КСФ.
Успешный дифференцировки клеток THGM также подтверждается результатами от МАЮ и assays ELISA для изучения экспрессии ГМ-КСФ и IL-17 на РНК и белка уровнях в дифференцированных клетках. Сгенерированный клетки THGM был значительно выше выражение Csf2 , но намного ниже выражение Il17 по сравнению с TH17 клеток (рис. 2A). Как показано на рисунке 2B, ГМ-КСФ белок был обнаружен в supernatants культуры от THGM и TH17 клеток. Тем не менее, ГМ-КСФ концентрация супернатанта THГМ культуры собиралась три раза, в ТЧ17 клетки. Кроме того обнаружить в культуре клеток THGM супернатанта белки Ил-17 (рис. 2B), IFNγ и Ил-4. Поскольку RORγt был назван мастер транскрипционный фактор TH17 клетки, а STAT3 и STAT5 было показано, имеют большое значение в развитии TH17 и клетки THGM, соответственно, мы исследовали их мРНК выражение в THGM и TH17 клетках. Было установлено, что клетки THGM был значительно ниже выражение РОРС и выше Stat5 выражение, чем TH17 клеток (рис. 3). Интересно, что клетки THGM был несколько ниже (но не значительные) выражение Stat3 гена по сравнению с TH17 клетки. Эти результаты показали, что хотя THGM и TH17 дифференциации, регулируются различными транскрипционный анализ факторов, они могут иметь некоторые общие черты.
Рисунок 1: THGM клетки преимущественно Экспресс ГМ-КСФ. THGM и TH17 клетки были собраны на 3 день после дифференциации. (A) для 5 h, клетки были рестимулирован с PMA и ionomycin в присутствии ингибитор транспортного белка. Выражение и ГМ-КСФ, IL-17, IFNγ был проанализирован внутриклеточных цитокинов пятнать следуют проточной цитометрии. (B) Ил-4 и IFNγ выражения TH17 или клетки THГМ было проанализировано. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Проявление Ил-17, IFNγ и ГМ-КСФ TH17 и клетки THGM. THGM и TH17 клетки были собраны и рестимулирован с привязкой к пластине анти CD3e, через 3 дня после дифференциации. (A) клетки были собраны изолировать РНК для подготовки cDNA, 3 ч после стимуляции. Количественная ПЦР в реальном времени (ПЦР) были определены выражения Ifng, Il-17, и Csf2 . (B) супернатанта культуры было собрано 24 ч после стимуляции, чтобы определить концентрацию GM-CSF в клетки THGM, или ил-17 в TH17 клеток, по ELISA. (** p < 0.01, *** p < 0,001.) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: РОРС, Stat3 и Stat5 экспрессии генов в клетки THGM и TH17. Дифференцированные GM THи TH17 клетки были собраны и рестимулирован с привязкой к пластине анти CD3e за 3 ч. всего РНК был изолирован подготовить cDNA. ПЦР были определены РОРС, Stat3и Stat5 выражения. (* p < 0,05, ** p < 0,01; NS = не значительные.) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Имя | Складе концентрация | Рабочая концентрация | Разбавление | объем в 500 мкл, окрашивание буфера |
| CD4-PerCp | 0.2 мг/мл | 2,8 мкг/мл | 1:71 | 7 МКЛ |
| CD44-APC | 0.2 мг/мл | 2.4 мкг/мл | 1:83 | 6 МКЛ |
| CD25-PE | 0.2 мг/мл | 2 мкг/мл | 1: 100 | 5 МКЛ |
| CD62L-FITC | 0.5 мг/мл | 10 мкг/мл | 1:50 | 10 МКЛ |
| ГМ КСФ PE | 0.2 мг/мл | 2 мкг/мл | 1: 100 | |
| IL-17А FITC | 0.5 мг/мл | 5 мкг/мл | 1: 100 | |
| IL-17А APC | 0.2 мг/мл | 2 мкг/мл | 1: 100 | |
| IFNΓ-APC | 0.2 мг/мл | 2 мкг/мл | 1: 100 | |
| IFNΓ-PE | 0.2 мг/мл | 2 мкг/мл | 1: 100 | |
| ИЛ-4-APC | 0.2 мг/мл | 2 мкг/мл | 1: 100 | |
| CD4-FITC | 0.5 мг/мл | 5 мкг/мл | 1: 100 | |
| IL-7 | 20 мкг/мл | 2 нг/мл | 1: 10000 | |
| Анти CD28 | 0.5 мг/мл | 1 мкг/мл | 1: 500 | |
| Анти IFNγ | 1 мг/мл | 10 мкг/мл | 1: 100 |
Таблица 1: Используется антител и цитокинов.
| Грунтовка | Последовательность | |
| IFNG Вперед | 5'-TCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAA-3' | |
| IFNG Реверс | 5'-TGGCTCTGCAGGATTTTCATG-3' | |
| Il-17 Вперед | 5'-CTCCAGAAGGCCCTCAGACTAC-3' | |
| Il-17 Реверс | 5'-AGCTTTCCCTCCGCATTGACACAG-3' | |
| Csf2 Вперед | 5'-TTTACTTTTCCTGGGCATTG-3' | |
| Csf2 Реверс | 5'-TAGCTGGCTGTCATGTTCAA-3' | |
| РОРС Вперед | 5'-TTTGGAACTGGCTTTCCATC-3' | |
| РОРС Реверс | 5'-AAGATCTGCAGCTTTTCCACA-3' | |
| Stat3 Вперед | 5'-TGGCCCTTTGGAATGAAGGGTACA-3' | |
| Stat3 Реверс | 5'-CACTGATGTCCTTTTCCACCCAAGT-3' | |
| Stat5 Вперед | 5'-TGCCCGGCTGGAACTACACCTT-3' | |
| Stat5 Реверс | 5'-ATGCCCCCGATTTCCGAGTCAC-3' | |
Таблица 2: Праймеры для ПЦР.
| шаг | Темп. (° C) | время | Повторите | |
| 1 | 95 | 2 мин | ||
| 2 | 95 | 3 s | ||
| 3 | 60 | 30 s | Шаг 2 и 3, 39 раз | читать пластина |
| 4 | 65-95 | 5 s | Шаг 4, 30 раз, + 0.5 ° C повторить | читать пластина |
Таблица 3: ПЦР программа для оценки экспрессии генов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описали протокол в vitro THGM дифференциации от мыши наивно CD4 + клеток, следуют анализ дифференцированных клеток для проверки метода. Следует отметить селезенке и лимфатических узлах может использоваться для наивного CD4 + Т-клеток очистки и THGM дифференциации. Выражение cytokine, определяется внутриклеточных цитокинов окрашивания, в сочетании с проточной цитометрии, показали, что около 55% клеток были вынуждены стать ГМ-КСФ выражая клеток в условиях THGM (рис. 1A). По сравнению с клеток в условиях TH17 дифференциации, клетки, которые различаются в условиях THGM содержится фоновый уровень ИЛ-17-выражая населения; Однако выражение гена il17 обнаружить, ПЦР (рис. 2A).
Интересно, что несмотря на добавление нейтрализуя антитело IFNγ, мы обнаружили низкий уровень экспрессии мРНК Ifng TH17 и клетки THГМ, и менее 1% клеток THГМ были IFNγ-выражая клетки. (Рисунки 1 - 2). Это могут быть из-за недостаточного количества IFNγ нейтрализуя антитела использованы в состоянии THGM, или возможного загрязнения innate иммунных клеток, (это почти невозможно получить 100% чисто наивно CD4 + Т-клеток), предоставляемые следовые количества Ил-12 для возможного поколения 1 клетки TH. Это также возможно, что состояние THGM, мы использовали не смог полностью выключить транскрипции Ifng. Мы будем решать эту проблему в будущем. Тем не менее IFNγ белка не был обнаружен в supernatants культуры THGM или TH17 по ELISA.
В протоколе, представленные здесь мы только использовали антитело блокирует IFNγ вместе с ил-7 для дифференциации THGM. После 3 дней при этом условии дифференцировки, более чем на 50% клеток выразил ГМ-КСФ, но не Ил-17, Ил-4, или IFNγ (рис. 1). Кроме того выражение РОРС, ген, который кодирует RORγt, которая имеет решающее значение для дифференциации Th179, была значительно ниже в клетки THGM, по сравнению с TH17 клеток (рис. 3). Этот протокол является, таким образом, более эффективный метод для поколения ГМ-КСФ выражая Т-клеток, чем другой сообщалось ранее10. Наши результаты также показали, что, помимо чистоты наивные Т-клеток и IL-7 сигнализации, предотвращение дифференцировки клеток T IFNγ-выражая является ключом для поколения THGM.
Преобладающим выражение ГМ-КСФ клеток, которые были созданы с использованием описанных протокол продемонстрировал успешной дифференциации THGM. Мы хотели бы отметить, что качество цитокинов и антитела от различных компаний, или даже из разных партий из той же компании не могут быть одинаковыми. Поэтому мы рекомендуем, что количество цитокинов и антитела, используемые в T вспомогательный клеточная дифференцировка должны быть проверены с тем, чтобы выяснить оптимальные условия.
В целом, клетки THGM, которые были созданы, используя этот протокол Экспресс минимальный уровень ИЛ-17, Ил-4, или IFNγ. Мы уверены, что этот протокол работает хорошо в создании ГМ-КСФ выражая THGM клеток в пробирке. Этот метод может использоваться для дальнейшего изучения биологии клетки THGM в различных условиях, например аутоиммунных neuroinflammation, включая Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE) мышей и людей рассеянный склероз, где играет ГМ-КСФ важную роль в патогенезе11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано субсидий из национального университета здравоохранения системы Сингапура (T1-2014-Окт-12 и 10 сентября T1-2015).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Biowest | L0500-500 | |
| FBS Heat Inactivated | Capricorn | FBS-HI-12A | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10 | Diluted to 1x PBS in sterile water |
| EDTA | 1st Base | BUF-1053-100ml-pH8.0 | |
| 10x ACK buffer | Biolegend | 420301 | diluted in sterile water |
| Cell strainer | SPL Life Sciences | 93070 | |
| CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T | |
| Centrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5810R | |
| Sony SY3200 cell sorter | Sony | Sony SY3200 cell sorter | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 210261 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| FACS tube | Corning | 352054 | |
| 24 well cell culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 | eBioscience | 46-0041-82 | |
| PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) | eBioscience | 12-0251-82 | |
| anti-human/mouse CD44 APC | eBioscience | 17-0441-82 | |
| anti-mouse CD62L FITC | eBioscience | 11-0621-85 | |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | 640010 | |
| Hyclone Trypan Blue Solution | GE healthcare Life Sciences | SV30084.01 | |
| microscope | Nikon | Nikon Elipse TS100 | |
| Purified anti-mouse CD3e antibody | Biolegend | 100314 | |
| Purified hamster anti-mouse CD28 | BD Biosciences | 553295 | |
| Purified Rat anti-mouse IFNγ | eBioscience | 16-7312-85 | |
| Purified anti-mouse IL-4 Antibody | Biolegend | 504102 | |
| Recombinant Mouse IL-7 Protein | R&D system | 407-ML | |
| recombinant human TGF-beta | R&D system | 240-B-010 | |
| PMA | Merck Millipore | 19-144 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| GolgiPlug protein transport inhibitor | BD Biosciences | 51-2301KZ | |
| Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| anti-mouse GM-CSF PE | eBioscience | 12-7331-82 | |
| FITC anti-mouse IL-17A | Biolegend | 506908 | |
| APC anti-mouse IFN-gamma | Biolegend | 505810 | |
| GO Taq qPCR master mix | Promega | A6002 | |
| mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! | invitrogen | 88-7334-88 | |
| Mouse IL-17A Uncouted ELISA | invitrogen | 88-7371-22 |
References
- Zhu, J., Paul, W. E. CD4 T cells: fates, functions, and faults. Blood. 112, 1557-1569 (2008).
- Kara, E. E., et al. Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity. PLoS Pathogens. 10, e1003905 (2014).
- Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. Tumor Immunology meets...Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells. Oncoimmunology. 6, e1356149 (2017).
- Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).
- Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).
- Sheng, W., et al. STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation. Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).
- Codarri, L., et al. RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation. Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).
- El-Behi, M., et al. The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF. Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126, 1121-1133 (2006).
- Zhang, J., et al. A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF. Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).
- Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage. Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).
