Summary
Burada, fare granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T yardımcı (THGM) hücreleri yalıtım saf CD4 + T hücreleri, THGM, farklılaşma da dahil olmak üzere saf CD4 + T hücrelerden ayırt etmek için bir iletişim kuralı mevcut ve farklılaştırılmış THGM hücre analizi. Bu yöntem çalışmaları Yönetmeliğin ve THGM hücre işlevi uygulanır.
Abstract
Granülosit-makrofaj-koloni uyarıcı faktör (GM-CSF)-T yardımcı (THGM) hücresi üretim ağırlıklı olarak interferon (IFN) γ veya interlökin (IL) -17 üretmeden GM-CSF salgılar ve için bulunan yeni saptanan bir T yardımcı hücresi alt budur otoimmün neuroinflammation önemli bir rol oynamaktadır. Bir yöntem tecrit splenocytes bir tek hücreli askıya saf CD4 + T hücreleri ve THGM hücre üretimi saf CD4 + T hücreleri, T hücre-aracılı bağışıklık ve otoimmün hastalıklar içinde yararlı bir yöntem olacaktır. Burada THGM hücrelere IL-7 tarafından terfi fare saf CD4 + T hücreleri ayırır yöntemi açıklanmaktadır. Farklılaşma sonucu hücre içi sitokin akış sitometresi ile bir nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir tepkimesi (PCR), kombine boyama da dahil olmak üzere farklı yöntemlerle sitokinler ifade analizi tarafından değerlendirildi ve enzim bağlı immunosorbent deneyleri (ELISA). THGM farklılaşma Protokolü burada açıklandığı gibi kullanarak, hücreleri yaklaşık % 55'i IFNα veya IL-17 en az bir ifade ile GM-CSF ifade. GM-CSF THGM hücreleri tarafından baskın ifade daha fazla GM-CSF, IFNα ve IL-17 mRNA ve protein düzeylerinde ifade analizi tarafından doğrulandı. Böylece, bu yöntem saf CD4 + T hücreleri t ayırt etmek için kullanılabilirHGM hücreleri vitro, hangi THGM hücre biyolojisi çalışmada yararlı olacak.
Introduction
CD4 + T yardımcı (TH) hücreleri mikrobiyal patojenler karşı ana savunma, kanser gözetim ve otoimmünite1,2,3çok önemli rolleri olan bağışıklık sisteminin temel bileşenleridir. T hücre reseptör (TCR) etkinleştirme, üzerine saf CD4 + T hücreleri TH1, TH2 farklılaşmış, TH 17 veya düzenleyici T (Treg) farklı sitokin ni2,4, etkisi altında hücreleri. 5. son zamanlarda, ağırlıklı olarak GM-CSF üreten yeni hücre alt grubunu TH , tespit ve THGM6adında. THGM hücrelere farklılaşma sinyal dönüştürücü aktivasyonu ve bir aktivatör transkripsiyon 5 (STAT5) IL-7 tarafından tahrik edilmektedir. Bu hücreler diğer THdüşük bir ifade yaparken GM-CSF büyük miktarda hızlı-IFNγ ve IL-176gibi imza sitokinler hücre. GM-CSF CD4 + T hücre-aracılı neuroinflammation7,8gelişiminde önemli bir rol oynamaya bulundu. IFNγ - veya IL-17-ifade autoreactive T hücrelere kıyasla, GM-CSF-ifade T bir önceki hastalığı başlangıçlı ve daha yüksek hastalık şiddeti neden vahşi-türüne aktarılan (WT) fare hücreleri. IFNγ veya IL-17A eksik T hücreleri EAE7aracılık yeteneğini muhafaza, ancak buna ek olarak, Csf2- / - T hücreleri deneysel otoimmun ensefalomiyelit (EAE) ikna etmek WT alıcıya aktarılan adoptively sonra başarısız oldu. Ayrıca, GM-CSF nötralize antikorları kullanarak bir abluka EAE hastalık şiddeti8iyileştirmiştir. Ayrıca, STAT5 T hücrelerin farelerde eksikliği azalmış THGM üretimi ve bu nedenle, bir direnç farelerin EAE geliştirme6' sonuçlandı. Bu bulgular önemini GM-CSF-ifade TH hücre otoimmün neuroinflammatory hastalığında altını çiziyor. Böylece, saf CD4 + T hücreleri GM-CSF-ifade TH hücrelerden ayırt etmek için bir yöntem oluşturma otoimmün neuroinflammation ve T hücre-aracılı bağışıklık yanıtı patogenezinde çalışmada önemli olacaktır. Ancak, bir protokol bu verimli THGM hücreleri fare saf kurulmuştur CD4 + değil oluşturur.
Burada saf CD4 + T hücreleri fare THGM hücrelerden ayırır bir yöntem mevcut. Bu iletişim kuralı fareden dalak çıkarma, bir tek hücre süspansiyon, CD4 pozitif seçim, floresans aktif hücre (FACS) sıralama ve TH hücre hazırlanması da dahil olmak üzere tüm yordamı açıklar farklılaşma ve analiz. Farklılaştırılmış T yardımcı hücreleri tek hücre düzeyinde sitokin ifade mRNA düzeyinde belirlemek için nicel bir gerçek zamanlı PCR tarafından sitokin ifade belirlemek için akış sitometresi ile kombine boyama hücre içi sitokin tarafından incelenir ve protein düzeyinde sitokin ifade değerlendirmek için ELISA tarafından. Bu yöntem THGM hücre biyolojisi EAE, nerede GM-CSF patogenezinde önemli bir rol oynar gibi çeşitli koşullarda çalışmaları uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol için kullanılan tüm fareler üzerinde C57BL/6 genetik arka plan vardı ve Singapur Ulusal Üniversitesi, patojen-Alerjik belirli koşullarda muhafaza. Tüm deneyler kurumsal hayvan bakım ve Singapur Ulusal Üniversitesi kullanım Komitesi tarafından onaylanmış protokolleri kullanılarak yapıldı.
1. reaktif ve malzeme hazırlığı
- Fosfat tamponlu tuz (PBS) % 2 fetal Sığır serum (FBS) ve 1 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) içeren 500 mL hazırlayın.
Not: en iyi sonuçlar için tüm prosedürü boyunca buzda arabellek tutun. - 50 mL RPMI 1640, %10 FBS ve % 1 penisilin streptomisin içeren tam RPMI ortam hazırlamak. 50 µM β-mercaptoethanol THGM hücre farklılaşması için içeren komple RPMI medya kullanın. β-mercaptoethanol bir duman mahallede ekleyin.
- Bir anti-CD3e antikor karışımı 7.5 mL anti-CD3e konsantre stok PBS 3 μg/ml sulandrarak hazırlayın. Her şey için 150 μL antikor karışımı ekleyerek 48-şey plakaları ceket ve plaka için en az 1 h 37 ° C'de veya 4 ° C'de gecede kuluçkaya.
- Bir çift makas ve forseps sterilize ve gruptakiler arasında % 70 etanol içinde saklayın.
2. fare Splenocytes hazırlanması
- (Toplam 6 – 8 haftalık) fare ötenazi bir kurumsal olarak onaylı CO2 boğulma veya servikal çıkması kullanarak. Fare % 70 etanol ile sprey ve sırtında polistren blokta monte edin. Biyolojik Emanet aşağıdaki adımlarla devam kabin fareyi aktarın.
- Forseps bir çift kullanarak cilt tutun ve yaklaşık 4 cm, makas kullanarak için sol tarafında göğüs kafesi altındaki deriyi kesme. Dalak ve steril forseps dalak ayıklamak için kullanın periton sac açın.
- 50 mL tüp üzerinde 70 mikron hücre süzgeç koyun ve ön tampon 2 mL ile ıslak. Dalağı hücre süzgeç (2-3 dalağı bir hücre süzgeç için) yerleştirin ve 5 mL şırınga dalgıç sonuna kullanarak macerate.
- Hücrelerin tümünü tüpüne atılır kadar süzgeç ve tüp birkaç kez 1-2 mL hücre izolasyon arabelleği ile yıkayın. Hücre süzgeç atmak ve 350 x g 4 ° C'de 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.
- Hücre Pelet 5 mL soğuk (4 ° C) amonyum-klorür-arabellek (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA; pH 7.2-7,4) lysing potasyum (ACK) ile resuspend ve onları için 2 dk. eklemek 10 mL ACK nötralize etmek için tam RPMI medya karışımı yavaşça tampon ve hemen 350 x g 4 ° C'de 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi Süpernatant Santrifüjü sonra atın.
3. manyetik CD4 lastikteki ve bir hücre ayrılık sütun kullanarak yalıtım CD4 + t hücreleri
- Hücre Pelet hücre izolasyon arabellek 5 mL resuspend. Herhangi bir enkaz kaldırmak için yeni bir 15 mL tüp içine bir ön ayırma filtresi (30 mikron) kullanma hücre süspansiyon filtre.
- Hücre süspansiyon 10 μL take ve 10 x seyreltme 90 μL arabelleği ekleyerek. Seyreltilmiş hücre süspansiyon 10 μL alıp trypan hücre sayımı için mavi 10 μL ile karıştırın. Hücrelerin verim belirlemek için bir hemasitometre hücreleri saymak.
- 350 x g 4 ° C'de 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
- Arabellek 90 μL hücrelerde başına 107 hücre resuspend. Manyetik CD4 lastikteki 107 hücre başına 10 μL ekleyin. 4 ° C'de 15 dakika için hücreleri kuluçkaya En iyi sonuçlar için hücre süspansiyon kuluçka sırasında hafifçe her 5 dakika karıştırın.
- Hücreleri kuluçka iken, bir ayrılık sütun manyetik sandalyesine koyun. Sütun 2 mL arabelleği ile önceden ıslak.
- Hücre/boncuk inkübasyon sonunda 5 mL arabelleği hücrelerle yıkama ve onları vasıl 350 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.
- 1 mL arabelleği hücrelerde resuspend, örnek hücre ayrılık sütuna yük ve akışı sağlar. 15 mL santrifüj tüpü CD4 hücre kesir toplamak için kullanın. Önce kuru göl yıkamak için arabellek 1 mL ekleyin. 2 x çamaşır adımı yineleyin.
- Hücre ayrılık sütun manyetik standından çıkarın ve bir yeni 15 mL santrifüj tüpü yerleştirin. Hücre izolasyon arabelleğinin 2 mL hücre ayrılık sütununu ekleyin ve pistonu sıkıca sütun hücreleri zorlamak için geçerlidir.
- 350 x g 5 min 4 ° C'de CD4 + hücre elde etmek için de kesir santrifüj kapasitesi. Süpernatant atmak.
4. arıtma Naive CD4 + T hücre (CD4+CD25-CD44loCD62LMerhaba) Floresan aktif hücre sıralama ve THGM farklılaşma tarafından
- Elde edilen CD4 + hücre Pelet arabellek 500 µL içinde resuspend. Hücreleri CD4-PerCp içeren bir floresan Birleşik antikorlar karışımı ile karıştırın (2.8 µg/mL), CD44-APC (2.4 µg/mL), CD25-PE (2 µg/mL) ve CD62L-FITC (10 µg/mL) (Tablo 1). 20-30 dk, buz hücrelerdeyse ışıktan koruyarak kuluçkaya.
Not: Antikorlar konsantrasyonları daha önce laboratuarda optimize. 1-2 fareler hücrelerden için listelenen antikorlar sayısıdır. - Kuluçka sonra arabellek 5 mL hücrelerle yıkama ve 350 x g 4 ° C'de 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi
- Süpernatant atın ve 500 µL arabelleği hücrelerde resuspend. Tekrar bir naylon mesh kullanarak hücreleri filtre.
- Hücre süspansiyon hücre sıralama bir FACS tüp aktarın. Arabellek 500 µL koleksiyonu FACS tüplerini precoat.
- Bir CD4 elde+CD25-CD44loCD62LMerhaba nüfus (saf CD4,+ T hücreleri) FACS sıralama tarafından. CD4 kapıya+CD25- ilk ve o zaman seçme CD44loCD62LMerhaba hücreleri bu popülasyon.
- Saf CD4 toplamak+ T hücre kesirler yeni 15 mL santrifüj tüpüne. 350 x g 4 ° C'de 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
- Saf CD4 + T hücreleri 106 hücre/mL 50 µM β-mercaptoethanol içeren tam RPMI medyada bir konsantrasyon, resuspend.
- Precoating 48-şey plaka için kullanılan anti-CD3e antikorlar Aspire edin. Her şey 7 Il ile tohum 0,25 milyon (250 µL) hücrelerinde (2 ng/mL), anti-CD28 (1 µg/mL) ve anti-IFNγ (10 µg/mL) (Tablo 1).
Not: Sitokin ve antikorlar konsantrasyonları önceden laboratuarında bir THGM hücre farklılaşması için optimize. - %5 CO2 37 ° C'de hücreler için 3 gün kuluçkaya. Orta kuluçka sırasında değiştirmeyin.
5. analiz fare THGM hücre Vitro oluşturulan
- Bir mikroskop kullanarak, sonra farklılaşma hücre farklılaşma 3 d kontrol edin. Hücreleri hasat ve onları vasıl 350 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi Hücreler 2 yıkama x komple RPMI medya ile.
Not: Farklılaşmış hücreler daha naif CD4 + T hücre boyutu büyük. - 1 mL tam RPMI medya hücrelerde resuspend. Hücre süspansiyon 10 μL alıp trypan bir hemasitometre ile cep numarasını belirlemek için mavi 10 μL ile iyi karıştırın. Bir restimulation ve analiz için üç iksir farklılaşmış hücreler bölün.
Not: Hücre içi sitokin boyama ve ELISA deneyleri ≥0.5 milyon hücre gerektirir ve ≥ 1 milyon hücre qPCR analiz gerektirir. -
Hücre içi sitokin boyama için hücreleri phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) ile restimulate (100 ng/mL) ve ionomycin (1 μg/mL) 4-6 h için protein taşıma inhibitörü (1 µL/mL) huzurunda.
- Hücreleri hasat ve onları anti-CD4 antikor ile leke (0.2 mg/mL, 1: 100 seyreltme; PerCP-Birleşik, veya FITC-Birleşik, 0,5 mg/mL, 1: 100 seyreltme) 30 dk için.
- Hücreleri 200 μL fiksasyon arabelleği için 20-60 dk ile düzeltmek. Fiksasyon sonra hücreleri 2 yıkama x 1 mL permeabilization arabelleği ile.
- Hücre içi GM-CSF (PE-Birleşik, 0.2 mg/mL, 1: 100 seyreltme), karşı antikor ile IL-17A (FITC-Birleşik, 0,5 mg/mL, 1: 100 seyreltme; boyama. gerçekleştirmek APC-conjugated, 0.2 mg/mL, 1: 100 seyreltme), IL-4 (APC-Birleşik, 0.2 mg/mL, 1: 100 seyreltme) ve IFNγ (APC-Birleşik, 0.2 mg/mL, 1: 100 seyreltme; PE-conjugated, 0.2 mg/mL, 1: 100 seyreltme) 30 dk içinde belgili tanımlık karanlık için.
- Sitokin gen ekspresyonu farklılaşmış hücreler tarafından qPCR analiz için (1.3 adımda anlatıldığı gibi plaka precoating) hücreleri plaka bağlı anti-CD3e (3 μg/mL) ile aktif hale getirin. Stimülasyon sonra 3 h toplam RNA cDNA için qPCR hazırlamak için fenol RNA ayıklama reaktif kullanarak yalıtmak için hücre hasat. Astar ve qPCR için kullanılan program Tablo 2 ve 3, anılan sıraya göre listelenir.
- Sitokin protein salgılanması farklılaşmış hücreler tarafından analiz için plaka bağlı anti-CD3e (3 μg/mL) hücrelerle 24 h (1.3 adımda anlatıldığı gibi plaka precoating) için restimulate. Hücre kültürü IL-17 ve GM-CSF ELISA için onların konsantrasyonu belirlemek için süpernatant hasat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İki 8-hafta-yaşlı erkek C57BL/6 fare izole naive CD4 + T hücreleri üç porsiyon ayrıldı. Hücrelerin bir kısmı açıklanan protokol sonrası THGM hücrelere farklı. Başka bir bölümü anti-IL-4 antikor (10 µg/mL) huzurunda bir THGM koşulda THGM farklılaşma Il-4 abluka etkisini test etmek için kültürlü. Son bölümü (3 µg/mL anti-CD3e, 1 µg/mL anti-CD28, 10 ng/mL TGFβ, 30 ng/mL Il-6, 10 µg/mL anti-IFNγ ve 10 µg/mL anti-IL-4) bir TH17 farklılaşma koşul altında kültürlü. Farklılaşma 3 gün sonra hücreler hasat ve sitokin ifade analiz etmek için hücre içi sitokin boyama, qPCR ve ELISA tarafından restimulated. Hücre içi sitokin boyama ve FACS analiz sonuçları gösterdi yaklaşık % 55'inin THGM farklılaşma koşul altında kültürlü hücreler hücreleri (Şekil 1A), GM-CSF-ifade edildi, ancak hücreleri sadece yaklaşık % 2 altında THAyrıştırılan 17 durumu GM-CSF dile getirdi. Buna ek olarak, %8,17 IL 17 üreten hücrelerin oluşturan TH17 ayırt etme durumuna göre THGM farklılaşma durumu sadece yaklaşık % 1'ıl-17-ifade hücreleri sonuçlandı. Test iki farklılaşma koşullarda hücreleri yalnızca küçük bir kısmını IFNγ ifade (< % 1). Ayrıca, kaç IL 4 ifade T hücre (< % 1) THGM veya TH17 kültür (Şekil 1B) görüldü. Bu sonuçlar açıklanan THGM hücre farklılaşması koşulu kullanarak, biz başarıyla ağırlıklı olarak GM-CSF hızlı T yardımcı hücreleri üretilip olduğunu gösterdi.
Başarılı farklılaşma THGM hücrelerinin daha fazla qPCRs sonuçlarından tarafından onaylandı ve GM-CSF ve IL-17 farklılaştırılmış hücrelerin RNA ve protein düzeyde ifade incelemek için ELISA deneyi. Oluşturulan THGM hücreleri Csf2 anlamlı olarak daha yüksek bir ifade vardı ama Il17 bir çok daha düşük bir ifade için TH17 hücreleri (Şekil 2A) göre. Şekil 2Biçinde gösterildiği gibi GM-CSF protein kültür supernatants THGM ve TH17 hücrelerden algılandı. Yine de, GM-CSF konsantrasyon süpernatant THGM kültüründe hakkındaydı bu TH17 Üçlü hücreleri. Buna ek olarak, proteinler, IL-17 (Şekil 2B), IFNγ ve Il-4 THGM hücre kültürü süpernatant tespit edilemez. RORγt TH17 ana transkripsiyon faktörü tespit edilmiştir beri süre STAT3 ve STAT5 hücreleri TH17 ve THGM hücreleri, gelişiminde büyük önem sırasıyla olmasını gösterilmiştir, biz onların mRNA muayene THGM ve TH17 hücrelerdeki ifade. Bu THGM hücre Rorc önemli ölçüde daha düşük bir ifadesidir ve TH17 daha yüksek bir Stat5 ifade vardı bulundu hücreleri (Şekil 3). İlginçtir, THGM hücreleri biraz daha düşük (ancak değil önemli) ifadesine sahip Stat3 gen için TH17 hücreleri karşılaştırıldığında. Her ne kadar belirtilen bu sonuçlar THGM ve TH17 farklılaşma farklı transkripsiyon faktörleri tarafından yönetilen, ortak bazı özellikleri paylaşabilir.
Resim 1: THGM ağırlıklı olarak hızlı GM-CSF hücreleri. THGM ve TH17 hücreleri gün 3'den sonra farklılaşma hasat edildi. (A)5 h için hücreleri PMA ve ionomycin huzurunda bir protein taşıma inhibitörü ile restimulated. GM-CSF, IL-17 ve IFNγ ifadesi hücre içi sitokin akış sitometresi tarafından takip boyama tarafından analiz edildi. (B) Il-4 ve IFNγ ifade TH17 veya THGM hücreleri tarafından analiz edildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: İfade, IL-17, IFNγ ve GM-CSF TH17 ve THGM hücreleri. THGM ve TH17 hücre hasat ve 3 gün sonra farklılaşma plaka bağlı anti-CD3e ile restimulated. (A)hücreleri cDNA hazırlık, stimülasyon sonra 3 h için RNA yalıtmak için hasat. Ifng, IL-17ve Csf2 ifadelerin nicel gerçek zamanlı PCR (qPCR) tarafından belirlenmiştir. (B) kültür süpernatant 24 h GM-CSF THGM hücrelerdeki konsantrasyonu belirlemek için stimülasyon sonra hasat veya IL-17 tH17 hücreleri, ELISA tarafından. (** p < 0,01, *** p < 0,001.) Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Rorc, Stat3 ve Stat5 gen ekspresyonu TH17 ve THGM hücreleri. Farklılaştırılmış THGM ve TH17 hücre hasat edildi ve restimulated plaka bağlı anti-CD3e için 3 h. ile toplam RNA cDNA hazırlamak için izole edildi. Rorc, Stat3ve Stat5 ifadeleri qPCR tarafından belirlenmiştir. (* p < 0,05, ** p < 0,01; NS = önemli değil.) Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Adı | Hisse senedi toplama | çalışma konsantrasyonu | Seyreltme | 500 hacmindeki μL arabellek boyama |
| CD4-PerCp | 0.2 mg/mL | 2.8 μg/mL | 1:71 | 7 μL |
| CD44-APC | 0.2 mg/mL | 2.4 μg/mL | 1:83 | 6 μL |
| CD25-PE | 0.2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | 5 μL |
| CD62L-FITC | 0,5 mg/mL | 10 μg/mL | 1:50 | 10 μL |
| GM-CSF-PE | 0.2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| IL-17A-FITC | 0,5 mg/mL | 5 μg/mL | 1: 100 | |
| IL-17A-APC | 0.2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| IFNΓ-APC | 0.2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| IFNΓ-PE | 0.2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| IL-4-APC | 0.2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| CD4-FITC | 0,5 mg/mL | 5 μg/mL | 1: 100 | |
| IL-7 | 20 μg/mL | 2 ng/mL | 1:10000 | |
| Anti-CD28 | 0,5 mg/mL | 1 μg/mL | 1:500 | |
| Anti-IFNγ | 1 mg/mL | 10 μg/mL | 1: 100 |
Tablo 1: sitokinler ve antikorlar kullanılır.
| Astar | Sıra | |
| Ifng İleri | 5'-TCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAA-3' | |
| Ifng Ters | 5'-TGGCTCTGCAGGATTTTCATG-3' | |
| IL-17 İleri | 5'-CTCCAGAAGGCCCTCAGACTAC-3' | |
| IL-17 Ters | 5'-AGCTTTCCCTCCGCATTGACACAG-3' | |
| Csf2 İleri | 5'-TTTACTTTTCCTGGGCATTG-3' | |
| Csf2 Ters | 5'-TAGCTGGCTGTCATGTTCAA-3' | |
| RORC İleri | 5'-TTTGGAACTGGCTTTCCATC-3' | |
| RORC Ters | 5'-AAGATCTGCAGCTTTTCCACA-3' | |
| STAT3 İleri | 5'-TGGCCCTTTGGAATGAAGGGTACA-3' | |
| STAT3 Ters | 5'-CACTGATGTCCTTTTCCACCCAAGT-3' | |
| Stat5 İleri | 5'-TGCCCGGCTGGAACTACACCTT-3' | |
| Stat5 Ters | 5'-ATGCCCCCGATTTCCGAGTCAC-3' | |
Tablo 2: Astar qPCR için.
| adım | Temp. (° C) | zaman | tekrar | |
| 1 | 95 | 2 dk | ||
| 2 | 95 | 3 s | ||
| 3 | 60 | 30 s | Adım 2 ve 3, 39 kez | plaka okumak |
| 4 | 65-95 | 5 s | Adım 4, 30 kat + 0,5 ° C her tekrar | plaka okumak |
Tablo 3: PCR program gen ekspresyonu değerlendirmek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada bir iletişim kuralı yöntemi doğrulamak için farklılaştırılmış hücrelerin bir analizini tarafından takip fare saf CD4 + hücrelerden bir vitro THGM farklılaşma açıklanan. Not, dalak ve lenf bezleri saf CD4 + T hücre arıtma ve THGM farklılaşma için kullanılabilir. Hücre içi sitokin gösterdi ki hücreler yaklaşık % 55'i akış sitometresi ile kombine boyama tarafından belirlenen sitokin ifade indüklenen GM-CSF-ifade hücreleri (Şekil 1A) THGM koşul altında olmak. TH17 farklılaşma koşul altında hücrelere kıyasla, THGM koşul altında farklılaşmış hücre arka plan düzey IL 17 ifade bir nüfusun bulunan; Ancak, il17 gen ekspresyonu qPCR (Şekil 2A) tarafından tespit edilemez.
İlginçtir, bir IFNγ nötralize antikor eklenmesi rağmen Ifng mRNA ifade düşük düzeyde TH17 ve THGM hücreleri tespit ettik ve az % 1 THGM hücre hücreleri IFNγ ifade edildi. (Rakamlar 1 - 2). Bu IFNγ nötralize antikor yetersiz miktarda nedeniyle THGM durumda veya IL-12 eser miktarda sağlanan (hemen hemen % 100 saf saf CD4 + T hücreleri elde etmek mümkün değildir) doğuştan gelen bağışıklık hücreleri olası bir kirlenme için kullanılabilir olası TH1 hücre üretimi için. Biz kullanılan THGM durumu tamamen Ifngtranskripsiyon kapatmak mümkün değildi mümkündür. Gelecekte bu sorunu ele alacaktır. Yine de, IFNγ protein THGM veya TH17 kültür supernatants tarafından ELISA algılanmadı.
Burada sunulan iletişim kuralında, sadece THGM farklılaşma için bir IFNγ engelleme antikor 7 Il ile birlikte kullanılır. Bu koşul altında farklılaşma 3 gün sonra hücreleri % 50'den fazla ifade GM-CSF ama değil IL-17, IL-4 veya IFNγ (Şekil 1). Buna ek olarak, Rorcifade, gen Th17 farklılaşma9için kritik, önemli ölçüde içinde THkıyasla THGM hücrelerdeki 17 hücreleri (Şekil 3) daha düşük olduğunu RORγt, bu kodlar. Bu iletişim kuralı, bu nedenle, GM-CSF-ifade T hücrelerinin üretimi için daha başka daha önce10rapor daha verimli bir yöntem var. Bizim sonuçları da saf T hücreleri ve 7 Il-sinyal saflık yanı sıra IFNγ ifade T hücre farklılaşması önlenmesi bir anahtar THGM üretimi için gösterdi.
Açıklanan protokolü kullanılarak oluşturulan GM-CSF hücre baskın ifade THGM başarılı farklılaşma gösterdi. Sitokinler kalitesini işaret etmek istiyoruz ve antikorlar farklı şirketlerden veya hatta aynı şirketten farklı toplu işlemleri aynı olmayabilir. Bu nedenle, sitokinler ve antikorlar T yardımcı hücresi farklılaşma içinde kullanılan en uygun koşul bulmak için test edilmelidir önerilir.
Özet olarak, bu iletişim kuralını kullanan oluşturulan THGM hücreleri IL-17, en az düzeyde ifade Il-4 veya IFNγ. Biz bu protokolü de T GM-CSF-ifade oluşturmak için çalışır eminizHGM hücreleri içinde vitro. Bu yöntem daha fazla THGM hücreleri gibi otoimmün neuroinflammation deneysel otoimmun ensefalomiyelit (EAE) dahil olmak üzere, çeşitli koşullarda biyoloji çalışma için fare ve insan multipl skleroz, GM-CSF nerede oynuyor kullanılabilir bir 11patogenezinde önemli rol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu çalışmada Singapur Ulusal Üniversitesi Sağlık sistemi (T1-2014 Ekim-12 ve T1-2015 Eylül-10) gelen hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Biowest | L0500-500 | |
| FBS Heat Inactivated | Capricorn | FBS-HI-12A | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10 | Diluted to 1x PBS in sterile water |
| EDTA | 1st Base | BUF-1053-100ml-pH8.0 | |
| 10x ACK buffer | Biolegend | 420301 | diluted in sterile water |
| Cell strainer | SPL Life Sciences | 93070 | |
| CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T | |
| Centrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5810R | |
| Sony SY3200 cell sorter | Sony | Sony SY3200 cell sorter | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 210261 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| FACS tube | Corning | 352054 | |
| 24 well cell culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 | eBioscience | 46-0041-82 | |
| PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) | eBioscience | 12-0251-82 | |
| anti-human/mouse CD44 APC | eBioscience | 17-0441-82 | |
| anti-mouse CD62L FITC | eBioscience | 11-0621-85 | |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | 640010 | |
| Hyclone Trypan Blue Solution | GE healthcare Life Sciences | SV30084.01 | |
| microscope | Nikon | Nikon Elipse TS100 | |
| Purified anti-mouse CD3e antibody | Biolegend | 100314 | |
| Purified hamster anti-mouse CD28 | BD Biosciences | 553295 | |
| Purified Rat anti-mouse IFNγ | eBioscience | 16-7312-85 | |
| Purified anti-mouse IL-4 Antibody | Biolegend | 504102 | |
| Recombinant Mouse IL-7 Protein | R&D system | 407-ML | |
| recombinant human TGF-beta | R&D system | 240-B-010 | |
| PMA | Merck Millipore | 19-144 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| GolgiPlug protein transport inhibitor | BD Biosciences | 51-2301KZ | |
| Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| anti-mouse GM-CSF PE | eBioscience | 12-7331-82 | |
| FITC anti-mouse IL-17A | Biolegend | 506908 | |
| APC anti-mouse IFN-gamma | Biolegend | 505810 | |
| GO Taq qPCR master mix | Promega | A6002 | |
| mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! | invitrogen | 88-7334-88 | |
| Mouse IL-17A Uncouted ELISA | invitrogen | 88-7371-22 |
References
- Zhu, J., Paul, W. E. CD4 T cells: fates, functions, and faults. Blood. 112, 1557-1569 (2008).
- Kara, E. E., et al. Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity. PLoS Pathogens. 10, e1003905 (2014).
- Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. Tumor Immunology meets...Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells. Oncoimmunology. 6, e1356149 (2017).
- Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).
- Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).
- Sheng, W., et al. STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation. Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).
- Codarri, L., et al. RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation. Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).
- El-Behi, M., et al. The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF. Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126, 1121-1133 (2006).
- Zhang, J., et al. A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF. Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).
- Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage. Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).
