Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Visualisere genetisk varianter, kort mål og punkt mutasjoner i morfologiske vev sammenheng med en RNA i Situ hybridisering analysen

Published: August 14, 2018 doi: 10.3791/58097
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Advanced Cell Diagnostics, Inc

Summary

Her beskriver vi i situ hybridisering analysen som gir sensitive og bestemt påvisning av sekvenser idet kort idet 50 nukleotider med enkelt-nukleotid oppløsning på encellede nivå. Analysen, som kan utføres automatisk eller manuelt, kan Aktiver visualisering av skjøte varianter, korte sekvenser og mutasjoner vev kontekst.

Abstract

Presisjon medisin er svært avhengig av nøyaktig påvisning av biomarkers, er det et økende behov for standardisert og robust teknologi som måler RNA biomarkers i situ i klinisk eksemplarer. Mens grind-og-binde analyser som RNAseq og kvantitative RT PCR aktiverer svært følsom gene expression målinger, de også kreve RNA utvinning og dermed hindre verdifulle uttrykk analyse morfologiske vev kontekst. I situ hybridisering (ISH) analysen beskrevet her kan oppdage RNA målet sekvenser idet kort idet 50 nukleotider i enkelt-nukleotid oppløsning og på encellede nivå. Denne analysen er utfyllende til tidligere utviklet kommersielle analysen og gir sensitive og bestemt i situ påvisning av skjøte varianter, kort mål og punkt mutasjoner i vevet. I denne protokollen, var sonder designet for å målrette unike ekson veikryss for to klinisk viktige skjøte-varianter, EGFRvIII og METΔ14. Gjenkjenning av kort mål sekvenser ble demonstrert av bestemte påvisning av CDR3 sekvenser av T-celle reseptorer α og β i Jurkat T-celle linje. Også vist er nytten av denne ISH analysen for æren av RNA målet sekvenser med enkelt-nukleotid oppløsning (punkt mutasjoner) gjennom visualisering av EGFR L858R og KRAS G12A enkelt-nukleotid variasjoner i linjer med automatisert farging plattformer. Oppsummert viser protokollen en spesialisert RNA ISH analysen som gjør påvisning av skjøte varianter, korte sekvenser og mutasjoner i situ for manuell ytelse og automatisert stainers.

Introduction

Høy gjennomstrømming transcriptomic teknologier som microarrays og neste generasjons RNA sekvensering (RNAseq) har eksponentielt forbedret oppdagelsen av RNA biomarkers med diagnostiske prognostiske og prediktiv klinisk verdi for ulike sykdommer, inkludert kreft1,2. For å fremme bruk av disse biomarkers i presisjon medisin, det er en høy behovet for standardisert og robust teknologier som kan måle RNA biomarkers vev kontekst av klinisk prøver. Mens etablert grind-og-binde analyser som RNAseq og kvantitative RT PCR aktiverer svært følsom gene expression målinger, den nødvendige vev homogenisering og RNA isolasjon innebærer tap av i vivo celle-type spesifisitet og morfologiske informasjon3. Konvensjonelle i situ RNA gjenkjenning metoder mangler sensitivitet og spesifisitet nødvendig å måle pålitelig sjeldne eller lav-uttrykke RNA biomarkers i vev sammenheng4.

En kommersiell i situ hybridisering (ISH) analysen (f.eks., RNAscope analysen) er en teknologi som har taklet disse utfordringene og kan også svært sensitive og spesifikke visualisering av enkelt RNA molekyler større enn 300 nukleotider vev morfologiske kontekst. Denne typen analysen bruker en unik oligonucleotide sonde ca 6-20 dobbel-Z sonde par kombinert med en avansert hybridisering-baserte signal forsterkning5.

Denne studien beskriver en spesialisert RNA ISH analysen, BaseScope, utfyllende til tidligere designet kommersielle teknologi som kan oppdage RNA målet sekvenser idet kort idet 50 nukleotider single nukleotid oppløsning. Denne analysen adresser intrikate kompleksiteten i transcriptome og gjelder for nøyaktig påvisning av ekson veikryss, kort mål sekvenser og punkt mutasjoner i vev sammenheng (tabell 1) som to dobbel-Z sonde par. Denne rapporten viser komplett analysen protokollen og dens bruk i deteksjon av skjøte varianter, CDR3 sekvenser for T-celle reseptor kloner, og enkelt-nukleotid mutasjoner i FFPE cellen linjer og tumor vev.

Protocol

De menneskelige svulst prøvene som brukes i denne studien var deidentified og kjøpt fra kommersielle kilder til lokale etiske retningslinjer for menneskelig forskning.

1. sample, utstyr og forberedelse av reagenser

  1. FFPE prøven forberedelse
    1. Vev
      1. Umiddelbart etter disseksjon, reparere vevet (kuttes i blokker på 3-4 mm tykkelse) i 10% nøytrale fullbufrede formalin (NBF) 16 – 32 h ved romtemperatur (RT).
        Merk: Fiksering vil variere avhengig vev.
      2. Vask prøven med 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS) og tørke med en standard etanol (EtOH) serie (70% EtOH for 30-60 min., 80% EtOH for 30-60 min., 90% EtOH for 30-60 min., 95% EtOH for 30-60 min., 3 x 100% for EtOH 30-60 minutter) etterfulgt av xylen.
      3. Bygge inn prøven i parafin bruker standard prosedyrer6 og trim parafin blokker for å fjerne overflødig parafin.
        Merk: Blokkstørrelsen varierer avhengig av utvalgsstørrelsen vev, men en vanlig størrelse er 0,75 x 0.75 tommer2 eller mindre.
    2. Linjer
      1. Samle og pellets celler i henhold til de anbefalte metodene for bestemt celle linjen.
      2. Fastsette celler i 10% formaldehyd på RT 24 h på et rotator.
      3. Forberede celler som pellets i prewarmed behandling gel (f.eks., Histogel). Tillate pellet å stivne ved å plassere gel-celle pellet på et stykke parafilm på is, og la det sitte i 2-3 min. Submerge gel-celle pellet i 1 x PBS.
      4. Tørke og bygge inn celle pellets som beskrevet i trinn 1.1.1.
    3. Delen forberedelse
      1. Skjær innebygde vev/cellene i 5 ± 1 μm seksjoner med en mikrotom montere delene på elektrostatisk selvklebende glass lysbilder og air-dry dem over natten på RT.
        Merk: Lysbildene kan lagres på RT under uttørking for inntil 3 måneder.
      2. Plasser lysbildene i en objektglasstativet og stek montert vev lysbildene i sirkulerende luft ovn ved 60 ° C i 1 time før du utfører analysen.
        Merk: Bruke lysbilder umiddelbart eller lagre dem på RT med desiccants for opptil 1 uke. Langvarig lagring kan føre RNA degradering.
  2. Utstyr forberedelse
    1. Angi hybridisering ovnen til 40 ° C. Grundig våt humidifying papiret og fjerne eventuelle gjenværende dH2O. Sett inn papiret i fuktighet kontroll skuffen, og sett inn skuffen i hybridisering ovnen til prewarm i minst 30 min før bruk.
  3. Forberedelse av reagenser
    1. Fylle to fjerne agent retter med 200 mL xylen og fylle to flekker retter med 200 mL 100% EtOH, som skal brukes for deparaffinization av delene.
    2. Forberede 200 mL kommersielt tilgjengelig 1 x målet henting reagens ved å legge til 180 mL av dH2O 20 mL 10 x målet henting reagens. Sett to lysbildet holdere i en dampbåt. Fylle en lysbildeholderen med 200 mL 1 x målet henting reagens og fylle andre lysbildeholderen med 200 mL av dH2O. varme begge løsninger til en byll med dampbåten.
    3. Varm 50 x vaskebuffer til 40 ° C i 10-20 min. forberede 3 L av 1 x vaskebuffer fortynne 60 mL prewarmed 50 x vaskebuffer med 2,94 L dH2O.
    4. I avtrekksvifte, forberede 50% Gill Hematoxylin counterstaining løsning ved å legge til 100 mL Gill's Hematoxylin 100 mL dH2O. I avtrekksvifte, forberede bluing reagens (0.02% (w/v) ammoniakk vann) ved å legge til 1.43 mL 28-30% ammonium hydroksid 250 mL av dH2O.
    5. Prewarm mål sonder på 40 ° C i 10 min før sonde hybridisering og bringe forsterke reagenser (AMP 0-6) til RT.

2. RNA i Situ hybridisering analysen

  1. Deparaffinization og dehydrering
    1. Etter bakervarer som beskrevet i trinn 1.1.3.2 (valgfri stoppe punkt 1), deparaffinize avsnittene i xylen i 5 min med agitering. Deparaffinize igjen i frisk xylen for 5 min. Dehydrate 100% EtOH i 2 minutter med agitasjon, og gjentar igjen i frisk 100% EtOH i 2 minutter.
    2. Luften tørr lysbilder for 5 min på 60 ° C i sirkulerende luft ovn eller på RT til de er helt tørr (valgfritt stopper punkt 2).
  2. Prøve pretreatments
    1. Inkuber delene med ~ 4 dråper av klar-å-bruke Hydrogenperoksid i 10 min på RT å slukke endogene peroxidase aktiviteten. Dekanter løsningen fra lysbildene og skyll to ganger med dH2O.
    2. Inkuber delene med 200 mL i målet henting reagensen i 15-30 minutter ved 100 ° C i en dampbåt.
      Merk: Inkubasjonstiden kan variere avhengig av vev type. I denne protokollen, ble målet henting utført i 15 min for både svulst prøver og celle pellets.
    3. Dekanter løsningen fra lysbildene, skyll to ganger med dH2O, dyppe i 100% EtOH for 3 min og tørr lysbildene på 60 ° C i sirkulerende luft ovn eller RT til helt tørr.
    4. Tegn en hydrofobe barriere rundt delen bruke hydrofobe penn, omtrent 0,75 x 0.75-tommene2.
      Merk: Det anbefales ikke å trekke en mindre barriere. For større deler må en større barriere trekkes.
    5. La barriere tørke helt 1 min, eller la over natten på RT (valgfritt stopper punkt 3).
    6. Plasser lysbildene i en lysbildeholderen og sett lysbildeholderen i fuktighet kontroll skuffen. Legg ~ 4 dråper Protease III til hvert lysbilde og ruge dem i 15-30 min ved 40 ° C i hybridisering ovnen i protein fordøyelse.
      Merk: Inkubasjonstiden kan variere avhengig av hvilken vev. I denne protokollen, ble protease fordøyelsen utført for 30 min for svulst prøver og 15 minutter for cellen pellets.
    7. Dekanter løsningen fra lysbildene og skyll to ganger med dH2O.
  3. Sonden hybridisering
    1. Legge til ~ 4 dråper riktig klar til bruk sonde løsningen å dekke hele seksjonen. Hvis bruker store deler, legge til ~ 5-6 dråper.
    2. Hybridize sonder for 2t ved 40 ° C i hybridisering ovnen. Dekanter løsningen fra lysbildene og vask lysbildene i 200 mL 1 x vaskebuffer i 2 minutter på RT med sporadiske agitasjon. Gjenta vask i dette trinnet.
  4. Signalforsterkning
    1. Inkuber delene med ~ 4 dråper av AMP 0 per lysbilde ved 40 ° C i hybridisering ovnen i 30 min. Decant løsningen og vask lysbildene i 200 mL 1 x vaskebuffer i 2 minutter på RT med sporadiske agitasjon. Gjenta vask i dette trinnet.
    2. Inkuber delene med ~ 4 dråper i AMP 1 per lysbilde ved 40 ° C i hybridisering ovnen i 15 min. Decant løsningen og vask lysbildene i 200 mL 1 x vaskebuffer i 2 minutter på RT med sporadiske agitasjon. Gjenta vask.
    3. Inkuber delene med ~ 4 dråper av AMP 2 per lysbilde ved 40 ° C i hybridisering ovnen i 30 min. Decant løsningen og vask lysbildene i 200 mL 1 x vaskebuffer i 2 minutter på RT med sporadiske agitasjon. Gjenta vask.
    4. Inkuber delene med ~ 4 dråper av AMP 3 per lysbilde ved 40 ° C i hybridisering ovnen i 30 min. Decant løsningen og vask lysbildene i 200 mL 1 x vaskebuffer i 2 minutter på RT med sporadiske agitasjon. Gjenta vask.
    5. Inkuber delene med ~ 4 dråper AMP 4 per lysbilde ved 40 ° C i hybridisering ovnen i 15 min. Decant løsningen og vask lysbildene i 200 mL 1 x vaskebuffer i 2 minutter på RT med sporadiske agitasjon. Gjenta vask.
    6. Inkuber delene med ~ 4 dråper AMP 5 per lysbilde RT for 30 min. Decant løsningen og vask lysbildene i 200 mL 1 x vaskebuffer i 2 minutter på RT med sporadiske agitasjon. Gjenta vask.
    7. Inkuber delene med ~ 4 dråper AMP 6 per lysbilde RT i 15 min. Decant løsningen og vask lysbildene i 200 mL 1 x vaskebuffer i 2 minutter på RT med sporadiske agitasjon. Gjenta vask.
  5. Signalgjenkjenning
    1. Forberede Fast rødt fargestoff arbeider løsning. For ett lysbilde med en 0,75 x 0.75-tommene2 barriere, tilsett 2 μL av Fast rødt-B fargestoffet 120 μL Fast rødt-en til en rør og bland godt.
      Merk: Avhengig av hydrofobe bommen og antall lysbilder, mengder rask rød fungerende løsning vil variere.
    2. Dekanter overflødig væske fra lysbildene og legge rask rød fargestoff arbeider løsning for lysbildene. Inkuber lysbilder for 10 min på RT i skuffen med en cover å unngå lyseksponering.
      Merk: Bruk Fast rødt arbeider løsning innen 5 min forberedelser, og ikke utsettes for direkte sollys eller UV-lys.
    3. Dekanter Fast rødt løsningen og skyll lysbildene to ganger med vann fra springen. Plass lysbildene i en objektglasstativet.
  6. Counterstaining
    1. Counterstain delene vev med 50% Gill Hematoxylin løsning i 2 minutter på RT. Wash lysbildene med vann fra springen og gjenta dette flere ganger til lysbildene er klare, mens delene være lilla. Dypp lysbildene i 0.02% ammoniakk vann for bluing (dip 2 – 3 ganger). Erstatte ammoniakk vannet med vann fra springen og vask lysbildene 3-5 ganger.
  7. Skyv montering
    1. Tørr lysbildene i en sirkulerende luft ovnen på 60 ° C i 15 min eller RT til helt tørr. Sted 1-2 dråper av montering reagensen på hvert lysbilde og sted coverslips over hver inndeling. Unngå overlappinger luftbobler. Luften tørr lysbilder for minst 5 min.
      Merk: Fast rødt underlaget er alkohol-sensitive. Ikke tørke lysbildene i alkohol.
  8. Visualisering
    1. Observere lysbildene under standard brightfield mikroskop.

Representative Results

I situ hybridisering analysen arbeidsflyten:
Arbeidsflyten er avbildet i figur 1 og består av fire deler: permeabilization av eller vev med målet henting og protease løsninger, hybridization av følere for å målet RNA, signal forsterkning og visualisering av signalet. Signalet kan også kvantifiseres bruker digital tenkelig programvaresystemer eller i en semi kvantitative måte basert på antall prikker per celle. Manuelle fremgangsmåten som er beskrevet i figur 2 har også blitt fullt automatisert i auto-flekk handelssystemer.

Representant flekker for ekson krysset gjenkjenning (EGFRvIII skjøte variant): EGFRvIII er en variant av epidermal vekstfaktor reseptor som oppstår fra en i-ramme genomisk sletting av exons 2 til 7, fører til constitutively aktive kreftfremkallende signalering7 . Analysen ble brukt til å identifisere EGFRvIII status i FFPE glioblastom (GBM) svulst prøver. Enkelt dobbelt-Z sonder ble utformet for å omfatte ekson veikryss for å oppdage enten WT, mutant eller begge utskrifter (figur 3A). WT EGFR sonder span veikryss exons 1 og 2 (E1/E2) eller exons 7 og 8 (E7/E8), mens EGFRvIII-spesifikke sonder span av exons 1 og 8 (E1/E8). En vanlig sonde som spenner over av exons 8 og 9 (E8/E9) ble også brukt til å oppdage totale EGFR (både WT og EGFRvIII transkripsjoner). Alle sonder ble så brukt til å kontrollere EGFR i FFPE GBM prøver. De to representative eksemplene vist i figur 3B ble tatt fra en større studie. EGFR status ble bekreftet av et uavhengig metoden, RT PCR. Begge WT sonder oppdaget signal i begge prøver, som indikerer at de to utvalgene uttrykke WT EGFR (figur 3B). Men mutant sonden bare viste signal oppdagelsen i EGFRvIII + utvalget, bekrefter at dette eksemplet er faktisk positivt for EGFRvIII varianten (figur 3B, venstre panel). Derimot finner mutant sonden signalet i EGFRvIII-utvalget (figur 3B, høyre panel). Til sammen viser disse resultatene at ekson krysset analysen kan identifisere EGFRvIII status i GBM FFPE svulst prøver.

Representant flekker for kort mål:
Den CDR3 eller komplementære avgjørende område 3, er et svært variabel domene i T-celle reseptorer. Den CDR3 sekvensen er vanligvis ganske kort; for eksempel den CDR3 α og β sekvenser fra Jurkat T-celle linje er 51 og 48 nukleotider i lengde, henholdsvis (figur 4A). Identifisere bestemte CDR sekvenser i Jurkat celler, antisense prober for CDR3 α β som er uttrykt i Jurkat T-celle linjen ble generert, i tillegg til følelse sonder for CDR3 α og β som negativ kontroll sonder. Alle sonder ble testet i FFPE forberedt Jurkat celler med analysen. Robust flekker ble observert med anti-følelse sonder for begge CDR3 α og β i de Jurkat cellene, mens følelse sonder oppdaget liten eller ingen signal (figur 4B). Disse resultatene viser evne til kort mål analysen å skjelne mellom svært variabel men korte CDR sekvenser for T-celle reseptor kloner.

Representant flekker for punkt mutasjon EGFR L858R:
Punkt mutasjon sonder ble utviklet for å oppdage single nukleotid variasjoner og små innsettinger eller slettinger (indeler) i svulst sammenheng. Figur 5A demonstrerer evne i situ deteksjon av punkt mutasjon EGFR L858R (2573T > G). To sonder ble utformet: å oppdage L858R mutert EGFR sekvens, og en annen å oppdage EGFR L858 WT sekvensen. Begge sonder ble testet i to FFPE forberedt cellelinjer: H2229, som bare uttrykker EGFR L858 WT; og H1975, som er heterozygote for EGFR L858R mutasjon. L858R mutant sonden oppdaget signal bare i H1975 celle linjen, men ikke i H2229 cellen linje. Imidlertid oppdaget WT sonden signal i begge linjer. Likeledes finne 5B visualiserer i situ påvisning av punkt mutasjon KRAS G12A (35 G > C). To sonder ble utviklet for å oppdage den KRAS G12A MT og KRAS G12 WT sekvenser og testet på den HuT78 cellen (som bare uttrykker KRAS G12 WT) og den SW116 celle linjen (som er heterozygote for KRAS G12A mutasjon). Mens KRAS G12 WT sonden oppdaget signal i begge linjer, oppdaget KRAS G12A sonden bare signal i SW116 cellen linje. Sammen viser disse dataene teknisk mulighet til punkt mutasjon analysen oppdage single nukleotid polymorfismer i celler og vev sammenheng.

Representant flekker for automatisert i situ analysen:
Automatisert analyser tillate et større antall prøver å kjøres mer pålitelig, minimere mellom brukeren variasjon og hands-on tid og generere konsekvent reproduserbar resultater. Derfor utviklet en automatisk versjon av analysen. For å demonstrere automatisert farging med denne analysen, ble registrering av skjøte variant METΔ14 undersøkt. Denne varianten er resultatet av ekson 14 i MET genet hoppes under pre-mRNA skjøting, som fører til grunnleggende aktivisering og kreftfremkallende transformasjon av MET reseptor8,9. Å spesifikt gjenkjenne METΔ14 varianten, to ekson krysset sonder ble utformet: en som strekker seg mellom exons 13 og 15 (E13/E15) å oppdage METΔ14 variant transkripsjon, og en annen som strekker seg mellom exons 14 og 15 (E14/E15) å oppdage WT MØTTE transkripsjon (figur 6A). Begge sonder ble testet i 2 FFPE forberedt cellelinjer: H596, som uttrykker METΔ14 varianten, og A549, som uttrykker WT MØTTE genet. Begge sonder viste utelukker uttrykk mønstre, med E13/E15 sonden bare oppdage signal i H596 cellene og E14/E15 sonden bare oppdage signal i A549 cellene (tall 6B og 6 C). Til slutt, sonden for dapB viste noe signal, som angir ingen bakgrunn signal (tall 6B og 6 C). Samlet viser disse dataene bestemte gjenkjenning av MET variant METΔ14 i situ bruker automatiserte BaseScope analysen.

Figure 1
Figur 1 : Analysen arbeidsflyten. Arbeidsflyten består av 4 hovedtrinn: forbehandling til permeabilize celler og vev, sonde hybridisering mål RNA, signal forsterkning og signalisere gjenkjenning av visualisering under brightfield eller fluorescerende mikroskop. Enkelte punkter kan kvantifiseres bruker et digitalt bilde analyse plattform. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Illustrasjon av manuell analysen protokollen. Hele analysen kan gjennomføres på 9 h. forbehandling ganger kan variere avhengig av vev type, så det anbefales å se vedlegg A i brukerhåndboken for vev forbehandling anbefalinger angående inkubasjonstiden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Representant bilder av ekson junction. (A) vises her er ekson organisasjonen for EGFR WT og EGFRvIII utskrifter og en skjematisk viser dobbelt-Z ekson krysset sonder som skreve krysset for å oppdage EGFR WT eller EGFRvIII. (B) i ekson krysset analysen ble utført på to FFPE glioblastom prøver ved sonder i (A), og en positiv kontroll sonde, POLR2A og negativ kontroll sonde, dapB. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Representant bilder av kort mål sekvens gjenkjenning. (A) vises her er CDR3 sekvenser i Jurkat celler. Sekvensen i svart er en flankemanøveren felles sekvens sekvensen i rødt er unik for enten CDR3α eller CDR3β. Enkelt dobbelt-Z kort mål sekvens sonder ble utformet mot disse sekvensene. (B) kort mål analysen ble utført på Jurkat celler utarbeidet som en FFPE celle pellet bruker anti-følelse eller følelse sonder målretting sekvenser i (A), og dapB ble brukt som en negativ kontroll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Representant bilder av punkt mutasjon. (A) analysen ble utført på H2229 cellene (homozygous for EGFR L858) og H1975 (heterozygote for EGFR L858R mutasjon) utarbeidet som en FFPE celle pellet bruker enkelt dobbelt-Z punkt mutasjon sonder målretting EGFR L858 WT rekkefølgen eller EGFR L858R mutert sekvens. (B) punkt mutasjon analysen ble utført på HuT78 cellene (homozygous for KRAS G12A) og SW116 (heterozygote for KRAS G12A mutasjon) utarbeidet som en FFPE celle pellet bruker enkelt dobbelt-Z punkt mutasjon sonder målretting KRAS G12 WT rekkefølgen eller KRAS G12A mutert sekvens. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Representant bilder av automatisert farging med ekson krysset analysen. (A) vises her er ekson organisasjonen for MØTTE WT og METΔ14 utskrifter og en skjematisk viser enkelt dobbelt-Z ekson krysset sonder som skreve krysset for å oppdage MØTTE WT eller METΔ14. (B) og (C) automatisert ekson krysset analysen ble utført på H596 cellene (uttrykke METΔ14) og A549 (uttrykke MØTTE WT) utarbeidet som en FFPE celle pellet bruker sonder i (A), og negativ kontroll sonde dapB. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Ekson Junction Kort sekvens Punkt mutasjon
Skjøte variant/isoformen Sekvenser mellom 50 og 300 nt Punkt mutasjon
Sirkulær RNA (circRNA) Svært homologe sekvenser Kort indel
Gene fusion CDR3 sekvens for TCR kloner Gene redigering
Gene knockout (KO) Pre-miRNA
Små nucleolar RNA (snoRNA)
Gene redigering

Tabell 1: programmer i i situ analysen. Det er 3 hovedkategorier for anvendelser av denne analysen: ekson junction, korte lsekvens og punkt mutasjon. I hver kolonne er eksempler bruksområde for hver kategori.

Discussion

I denne rapporten ble romanen ISH analysen protokollen og tilhørende programmer diskutert i detalj. Analysen gir direkte visualisering av ekson veikryss, kort-mål og svært homologe sekvenser og punkt mutasjoner i vev sammenheng. Analysen er basert på RNAscope teknologi5 og er derfor i stand til å enkelt molekyl gjenkjenning. Men på grunn av en avansert høytaleranlegg, kan signalet oppdages med probes som inneholder som en dobbel-Z par eller en mål mal lengde på bare 50 nukleotider. Fordi sonder kan være så kort som et enkelt dobbelt-Z i lengde, gir dette gjenkjenning av ekson veikryss, kort-mål og svært homologe sekvenser og punkt mutasjoner (tabell 1).

Vellykket forestilling av analysen er det flere tekniske anbefalinger. Først skal vev være fast i frisk 10% nøytrale fullbufrede formalin (NBF) ved romtemperatur for 16 – 32 h10. Underfixation (< 16 h) eller overfixation (> 32 h) vil svekke ytelsen til analysen og kan kreve ytterligere optimalisering. Andre, for å sikre optimal kontroll av temperatur og fuktighet, som er nødvendig for robust sonde hybridisering og signal forsterkning, lysbildet behandling system og hybridisering ovnen skal brukes for protokollen trinn 2.3 til 5 (protease forbehandling, sonde hybridisering, signalforsterkning og signalgjenkjenning). Tredje, overflødig gjenværende buffere bør være riktig decanted før hvert trinn gjennom protokollen (men ikke så mye at delene vev tørke ut). Hvis lysbildene tørke ut, utvikler betydelig uspesifisert signal. Fjerde avhengig vev, kan forbehandling optimalisering være nødvendig. Bruker det galt protease eller utfører for suboptimal lengre tid kan resultere i under - eller over - digestion og vil negativt påvirke signalet. Endelig er det viktig å alltid løpe positive og negative kontroller med test sonder. Negativ kontroll sonder sikre at det ingen bakgrunn signal, og positiv kontroll sonder sikre at analysen er gjort riktig og at RNA kvaliteten i utvalget er optimal for å tolke testresultatene sonde. Hvis det er ikke noe signal med positiv kontroll proben, så RNA kvaliteten i utvalget er sannsynlig suboptimal et signal kan ikke ses med test sonden.

I tillegg til manuell analysen var muligheten til å utføre analysen på automatiserte stainers også demonstrert (figur 6). Denne automatiserte ISH analysen gir en høy signal-til-støy-forhold og gjelder for de samme programmene som vist i tabell 1. men fordelene av automatiserte analysen inkluderer standardisering av analysen, minimering av mellom brukeren variasjon og hands-on tid, og godtgjørelse for høy gjennomstrømming screening av vevsprøver på en pålitelig måte.

Mens immunohistochemistry (IHC) og qRT PCR tillater påvisning av skjøte varianter (spesielt EGFRvIII), i FFPE kliniske eksemplarer, disse teknikkene kan mangler nødvendig spesifisitet og tilbyr ikke innsikt i romlig oppløsning på splice variantuttrykk, henholdsvis11,12. En viktig fordel med analysen i denne protokollen er den svært sensitive og spesifikke visualiseringen av skjøte veikryss samtidig bevare morfologiske vev sammenheng. Her var analysens evne til å målrette unike ekson veikryss for flere skjøte-varianter, inkludert EGFRvIII og METΔ14, viste (tall 3 og 6). I tillegg har analysen vist å oppdage skjøte varianten AR-V7 i prostatakreft, flere isoformene av ErbB4 i hjernen, og bekreftelse av knockout av sirkulære RNA Cdr1as i musen hjernen3,13,14.

Kort målgjenkjenning sekvens av denne ISH analysen gir visualisering av RNA sekvenser idet kort idet 50 nukleotider i lengde, som demonstrert av gjenkjenning av CDR3 sekvenser fra Jurkat celler (Figur 3). Analysen kan også detektere gensekvenser som er svært homologe til andre familiemedlemmer eller arter, som vist av Revêchon et al., som brukte kort mål analysen for å oppdage menneskelige progerin uttrykt i musen subkutan hvit fettvev15. I tillegg kan liten nucleolar RNA (snoRNA), CRISPR-mediert genet redigering og forløper-microRNA være oppdaget i situ med kort mål analysen. Nylig kombinert Fu et al. denne ISH analysen med IHC å identifisere nøyaktig celler i netthinnen uttrykke pre-miRNA mir125b16.

Mutasjon profilering i svulster er avgjørende for å studere utviklingen av svulster og for utvikling av målrettet terapi. Mens mutasjon profilering kan oppnås via høy gjennomstrømming sekvensering, denne teknologien kan ikke en fullgod løsning intratumoral heterogenitet eller koble genetiske endringer med cellular morfologi17,18. Gjenkjenning av punkt mutasjoner bruker denne ISH analysen gir æren av RNA målet sekvenser på en enkelt-base-oppløsning, som godkjent av gjenkjenning av EGFR L858R og KRAS G12A single nukleotid variasjoner i linjer (figur 5). Videre brukt Baker et al. punkt mutasjon analysen målrette flere mutasjoner i BRAF KRAS og PIK3CA oncogenes i tykktarmskreft18. De kunne identifisere og romlig kart sjeldne mutant subclones av kreftceller, til slutt viser hvordan bidrar til intra-svulst heterogenitet.

Oppsummert, er en spesialisert RNA ISH analysen utviklet. Denne metoden tillater påvisning av skjøte varianter, korte sekvenser og mutasjoner i situ. Det er sensitiv, spesifikke, målbare og tilpasningsdyktig ytelse både av manuelle metoder og automatisert stainers.

Disclosures

Alle forfattere er ansatt av avansert celle Diagnostics, Inc.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HybEZ Oven (110 or 220 VAC) or HybEZ II Oven (110 or 220V) ACD 310010 or 310013 (HybEZ™), 321710 or 321720 (HybEZ™ II)
HybEZ Humidity Control Tray (with lid) ACD 310012
ACD EZ-Batch Slide Rack (20 slide capacity) 1 rack 310017 ACD 310017
HybEZ Humidifying Paper ACD 310015
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen (required)  Vector Laboratory  H-4000
SuperFrost Plus Slides (required)  Fisher Scientific  12-550-15
10% neutral-buffered formalin (NBF)  MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Paraffin wax MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Microtome MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Gill’s Hematoxylin I  American Master Tech Scientific/MLS  HXGHE1LT MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Xylene  Fisher Scientific/MLS X3P-1GAL MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Tissue-Tek Vertical 24 Slide Rack  American Master Tech Scientific/MLS LWSRA24 MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Tissue-Tek Staining Dishes  American Master Tech Scientific/MLS LWT4457EA MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Tissue-Tek Clearing Agent Dishes, xylene resistant  American Master Tech Scientific/MLS LWT4456EA MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
100% alcohol (EtOH)  American Master Tech Scientific/MLS ALREACS MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
VectaMount Permanent Mounting Medium (required) Vector Labs  H-5000
Cover Glass, 24 mm x 50 mm Fisher Scientific/MLS  12-545-F MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Ammonium hydroxide, 28–30% Sigma-Aldrich/MLS 320145-500mL MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Carboy (>3L) MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Oster Steamer Model 5712, Black and Decker Steamer HS3000, or the Braun Multiquick FS 20 Steamer / /
Digital thermometer MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Water bath or incubator, capable of holding temperature at 40 +/– 1 °C MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Pipettors and tips, 1–1,000 μL MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Distilled water MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Tubes (various sizes) MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Fume hood MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Graduated cylinder MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Parafilm MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Paper towel or absorbent paper MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Microcentrifuge MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Microscope and accessories MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Drying oven, capable of holding temperature at 60 +/– 1 °C MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Formaldehyde MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Histogel Fisher Scientific/MLS 22-110-678
BaseScope Reagent Kit - RED Advanced Cell Diagnostics 322900
BaseScope Hs-EGFR-E1E2 Advanced Cell Diagnostics 701701
BaseScope Hs-EGFR-E1E8 Advanced Cell Diagnostics 701711
BaseScope Hs-EGFR-E7E8 Advanced Cell Diagnostics 701721
BaseScope Hs-EGFR-E8E9 Advanced Cell Diagnostics 701731
BaseScope Hs-MET-E14E15 Advanced Cell Diagnostics 701811
BaseScope Hs-MET-E13E15 Advanced Cell Diagnostics 701801
BaseScope Hs-KRAS-G12A Advanced Cell Diagnostics 705491
BaseScope Hs-KRAS-G12-nt35WT Advanced Cell Diagnostics 705531
BaseScope Hs-EGFR-L858R Advanced Cell Diagnostics 705451
BaseScope Hs-EGFR-L858WT Advanced Cell Diagnostics 705461
BaseScope Control Probe Pack Human Advanced Cell Diagnostics 322975

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bolha, L., Ravnik-Glavač, M., Glavač, D. Circular RNAs: Biogenesis, Function, and a Role as Possible Cancer Biomarkers. International Journal of Genomics. 2017, 6218353 (2017).
  2. Yamada, A., Yu, P., Lin, W., Okugawa, Y., Boland, C. R., Goel, A. A RNA-Sequencing approach for the identification of novel long non-coding RNA biomarkers in colorectal cancer. Scientific Reports. 8 (1), 575 (2018).
  3. Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution. Molecular Neurobiology. , Epub ahead of print (2017).
  4. Mahmood, R., Mason, I. In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections. Methods in Molecular Biology. 461, 675-686 (2008).
  5. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
  6. Paraffin processing of tissue. Protocols Online. , Available from: https://www.protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/ (2016).
  7. An, Z., Aksoy, O., Zheng, T., Fan, Q. W., Weiss, W. A. Epidermal growth factor receptor and EGFRvIII in glioblastoma: signaling pathways and targeted therapies. Oncogene. , Epub ahead of print (2018).
  8. Frampton, G. M., et al. Activation of MET via diverse exon 14 splicing alterations occurs in multiple tumor types and confers clinical sensitivity to MET inhibitors. Cancer Discovery. 5 (8), 850-859 (2015).
  9. Awad, M. M., et al. MET Exon 14 Mutations in Non-Small-Cell Lung Cancer Are Associated With Advanced Age and Stage-Dependent MET Genomic Amplification and c-Met Overexpression. Journal of Clinical Oncology. 34 (7), 721-730 (2016).
  10. Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 134 (6), 907-922 (2010).
  11. Gan, H. K., Cvrljevic, A. N., Johns, T. G. The epidermal growth factor receptor variant III (EGFRvIII): where wild things are altered. Federation of European Biochemical Societies Journal. 280 (21), 5350-5370 (2013).
  12. Wheeler, S. E., Egloff, A. M., Wang, L., James, C. D., Hammerman, P. S., Grandis, J. R. Challenges in EGFRvIII detection in head and neck squamous cell carcinoma. Public Library of Science One. 10 (2), e0117781 (2015).
  13. Zhu, Y., et al. Novel Junction-specific and Quantifiable In Situ Detection of AR-V7 and its Clinical Correlates in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer. European Urology. , Epub ahead of print (2017).
  14. Piwecka, M., et al. Loss of a mammalian circular RNA locus causes miRNA deregulation and affects brain function. Science. , Epub ahead of print (2017).
  15. Revêchon, G., et al. Rare progerin-expressing preadipocytes and adipocytes contribute to tissue depletion over time. Scientific Reports. 7 (1), 4405 (2017).
  16. Fu, Y., et al. Functional ectopic neuritogenesis by retinal rod bipolar cells is regulated by miR-125b-5p during retinal remodeling in RCS rats. Scientific Reports. 7 (1), 1011 (2017).
  17. Yates, L. R., et al. Subclonal diversification of primary breast cancer revealed by multiregion sequencing. Nature Medicine. 21 (7), 751-759 (2015).
  18. Baker, A. M., et al. Robust RNA-based in situ mutation detection delineates colorectal cancer subclonal evolution. Nature Communications. 8 (1), 1998 (2017).

Tags

Biologi problemet 138 RNA mutasjon skjøte variant kort mål i situ hybridisering ISH FFPE
Visualisere genetisk varianter, kort mål og punkt mutasjoner i morfologiske vev sammenheng med en RNA <em>i Situ</em> hybridisering analysen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Anderson, C. M., Laeremans, A.,… More

Anderson, C. M., Laeremans, A., Wang, X. M. M., Wu, X., Zhang, B., Doolittle, E., Kim, J., Li, N., Pimentel, H. X. Y., Park, E., Ma, X. J. Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay. J. Vis. Exp. (138), e58097, doi:10.3791/58097 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter