Summary
Här beskriver vi en i situ hybridisering analys som gör det möjligt för känsligt och specifikt påvisande av sekvenser så kort som 50 nukleotider med single-nucleotide upplösning på enskild cell nivå. Analysen, som kan utföras manuellt eller automatiskt, kan aktivera visualisering av skarv varianter, korta sekvenser och mutationer inom ramen för vävnad.
Abstract
Eftersom precision medicin är starkt beroende av korrekt påvisande av biomarkörer, finns det ett ökande behov av standardiserade och robust teknik som mäter RNA biomarkörer i situ i kliniska prover. Medan grind-och-bind analyser som RNAseq och kvantitativ RT-PCR aktivera mycket känsliga gen uttryck mätningar, de också kräva RNA-extraktion och därmed förhindra värdefulla uttryck analys inom ramen för morfologiska vävnad. I situ hybridisering (ISH) analysen beskrivs här kan upptäcka RNA mål sekvenser så kort som 50 nukleotider med single-nucleotide upplösning och encelliga nivån. Denna analys är ett komplement till tidigare utvecklade kommersiella analysen och möjliggör känsligt och specifikt i situ detektering av skarv varianter, kort mål och punktmutationer i vävnaden. I detta protokoll, var sonder utformade för att rikta unika exon korsningar för två kliniskt viktiga skarv varianter, EGFRvIII och METΔ14. Påvisande av kort mål sekvenser visades av specifik detektion av CDR3 sekvenser av T-cell receptorer α och β i Jurkat T-cell linje. Också visat är nyttan av denna ISH analys för skillnaden av RNA mål sekvenser med single-nucleotide upplösning (punktmutationer) genom visualisering av EGFR L858R och KRAS G12A single-nucleotide variationer i cellinjer som använder automatiserad färgning plattformar. Sammanfattningsvis visar protokollet en specialiserad RNA ISH-analysen som möjliggör upptäckt av skarv varianter, korta sekvenser och mutationer i situ för manuell och automatiserad stainers.
Introduction
Hög genomströmning transcriptomic tekniker såsom microarrays och nästa generations RNA-sekvensering (RNAseq) förbättrats exponentiellt upptäckten av RNA biomarkörer med diagnostiska, prognostiska och prediktiva kliniska värde för olika sjukdomar inklusive cancer1,2. För att främja användningen av dessa biomarkörer i precision medicin, det finns en hög behovet av standardiserade och robust teknik som kan mäta RNA biomarkörer inom vävnad ramen för kliniska prover. Medan allmänt etablerad grind-och-bind analyser som RNAseq och kvantitativ RT-PCR aktivera mycket känsliga gen uttryck mätningar, det krävs vävnad homogenisering och RNA isolering innebär förlust av i vivo celltyp specificitet och morfologisk information3. Konventionella i situ RNA upptäckt metoder saknar känslighet och specificitet som krävs för att tillförlitligt mäta sällsynta eller låg-uttryckande RNA biomarkörer inom den vävnad sammanhang4.
En kommersiell i situ -hybridisering (ISH) analys (t.ex., RNAscope analysen) är en teknik som har tacklat dessa utmaningar och också möjliggör en mycket känsliga och specifika visualisering av enda RNA-molekyler som är större än 300 nukleotider inom ramen för morfologiska vävnad. Denna typ av analys använder en unik oligonukleotiden sonden design av cirka 6 – 20 dubbel-Z sonden par kombinerat med en avancerad hybridisering-baserade signal förstärkning5.
Denna studie beskriver en specialiserad RNA ISH analys, BaseScope, kompletterar den tidigare designat kommersiell teknik som kan upptäcka RNA mål sekvenser så kort som 50 nukleotider enda nukleotid upplösning. Denna analys tar intrikata komplexiteten i transkriptom och är tillämplig för korrekt påvisande av exon korsningar, kort mål sekvenser och punktmutationer i vävnad samband (tabell 1) använder så lite som ett dubbel-Z sonden par. Detta betänkande visar komplett assay protokollet och dess användning för detektion av skarv varianter, CDR3 sekvenser för T-cell receptor kloner, och single-nucleotide mutationer i FFPE cell linjer och tumörvävnad.
Protocol
De mänskliga tumörprover som används i denna studie var deidentified och förvärvade från kommersiella källor enligt lokala etiska riktlinjer för mänsklig forskning.
1. prov, utrustning och REAGENSBEREDNING
-
FFPE provberedning
- Vävnaderna
- Omedelbart efter dissektion, fixa vävnaden (skuren i Block 3 – 4 mm i tjocklek) i 10% neutral buffrad formalin (NBF) för 16 – 32 h i rumstemperatur (RT).
Obs: Fixering tid varierar beroende på vävnadstyp och storlek. - Tvätta provet med 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och torka med en vanlig etanol (EtOH) serie (70% EtOH för 30 – 60 min, 80% EtOH för 30 – 60 min, 90% EtOH för 30 – 60 min, 95% EtOH för 30 – 60 min, 3 x 100% EtOH 30 – 60 min) följt av xylen.
- Bädda in provet i paraffin använder standardprocedurerna6 och trimma den paraffin-blocken som behövs för att ta bort överflödig paraffin.
Obs: Blockstorlek varierar beroende på vävnad urvalets storlek, men en typisk storlek är 0,75 x 0,75 tum2 eller mindre.
- Omedelbart efter dissektion, fixa vävnaden (skuren i Block 3 – 4 mm i tjocklek) i 10% neutral buffrad formalin (NBF) för 16 – 32 h i rumstemperatur (RT).
- Cellinjer
- Samla och pellet celler enligt de rekommendera metoderna för den specifika cellinje.
- Fixa celler i 10% formaldehyd på RT för 24 h på en rotator.
- Förbereda celler som en pellet i förvärmd bearbetning gel (t.ex., Histogel). Tillåta pelleten stelnar genom att placera gel-cellpelleten på en bit parafilm på is, och låt det sitta i 2 – 3 min. Sänk gel-cellpelleten i 1 x PBS.
- Torkar och bädda in cell pellets som beskrivs i steg 1.1.1.
- Avsnittet förberedelse
- Skär inbäddade vävnader och celler i 5 ± 1 μm sektioner med en mikrotom, montera avsnitten på elektrostatiskt självhäftande glasskivor och lufttorka dem över natten på RT.
Obs: Bilder kan lagras på RT under uttorkning för upp till 3 månader. - Placera glasen i en objektglashållaren och grädda monterade vävnad bilder i en cirkulerande luft ugn på 60 ° C för 1 h innan du utför analysen.
Obs: Använd bilderna omedelbart eller lagra dem på RT med torkmedel för upp till 1 vecka. Långvarig lagring kan resultera i RNA nedbrytning.
- Skär inbäddade vävnader och celler i 5 ± 1 μm sektioner med en mikrotom, montera avsnitten på elektrostatiskt självhäftande glasskivor och lufttorka dem över natten på RT.
- Vävnaderna
-
Utrustning förberedelse
- Ange hybridisering ugnen till 40 ° C. Grundligt våt befuktning papper och ta bort eventuella kvarvarande dH2O. Infoga papperet i luftfuktighet kontroll facket, och infoga facket i hybridisering ugnen till prewarm för minst 30 min innan användning.
-
REAGENSBEREDNING
- Fyll två clearing agent rätter med 200 mL xylen och fyll två färgning rätter med 200 mL 100% EtOH, som kommer att användas för avparaffinering av sektioner.
- Förbereda 200 mL av kommersiellt tillgängliga 1 x mål hämtning reagens genom att lägga till 180 mL av dH2O 20 mL 10 x mål hämtning reagens. Placera två bild innehavare i en ångbåt. Fyll en diapositivhållaren med 200 mL 1 x mål hämtning reagens och fyll den andra diapositivhållaren med 200 mL dH2O. värme båda lösningar till en koka med ångaren.
- Varm 50 x Tvättbuffert till 40 ° C för 10 – 20 min. förbereda 3 L 1 x Tvättbuffert genom att späda ut 60 mL föruppvärmd 50 x Tvättbuffert med 2,94 L dH2O.
- I ett dragskåp, förbereda 50% Gills Hematoxylin från lösning genom att tillsätta 100 mL Gills Hematoxylin till 100 mL dH2O. I dragskåp, förbereda blåelse reagens (0,02% (w/v) ammoniak vatten) genom att lägga till 1,43 mL 28 – 30% ammoniumhydroxid till 250 mL dH2O.
- Prewarm mål sonder vid 40 ° C i 10 min innan sonden hybridisering och föra ljudförstärkande reagenserna (0 – 6 AMP) till RT.
2. RNA In Situ hybridisering analys
-
Avparaffinering och uttorkning
- Efter gräddningen som beskrivs i steg 1.1.3.2 (tillval stoppställe 1), deparaffinize avsnitten i xylen för 5 min med agitation. Deparaffinize igen i färska xylen för 5 min. Dehydrate i 100% EtOH för 2 min med agitation, och upprepa igen i fräsch 100% EtOH i 2 min.
- Luft torka bilderna för 5 min vid 60 ° C i en cirkulerande luft ugn eller på RT tills de är helt torra (tillval stoppställe 2).
-
Prov förbehandlingar
- Inkubera i avsnitt med ~ 4 droppar av färdiga att använda väteperoxid för 10 min vid RT att släcka den endogena peroxidasaktiviteten. Dekantera lösningen från glasen och skölj dem två gånger med dH2O.
- Inkubera i avsnitt med 200 mL av målet hämtning reagens för 15 – 30 min vid 100 ° C i en ångbåt.
Obs: Inkubationstiden kan variera beroende på vävnadstyp. I detta protokoll utfördes mål hämtning för 15 min för både tumörprover och cell pellets. - Dekantera lösningen från bilderna, skölj två gånger med dH2O, doppa i 100% EtOH för 3 min, och torr som bilderna på 60 ° C i en cirkulerande luft ugn eller på RT tills helt torr.
- Rita en hydrofoba barriär runt i avsnittet använda en hydrofoba penna, cirka 0,75 x 0,75 tum2.
Obs: Det rekommenderas inte att rita ett mindre hinder. För större delar behöver ett större hinder att dras. - Låt barriären torka helt i 1 min eller lämna över natten på RT (tillval stoppställe 3).
- Placera glasen i en hållare och placera diapositivhållaren i luftfuktighet kontroll facket. Tillsätt ~ 4 droppar proteas III till varje bild och inkubera dem i 15 – 30 min vid 40 ° C i hybridisering ugnen för protein matsmältningen.
Obs: Inkubationstiden kan variera beroende på vävnad. I detta protokoll utfördes proteas matsmältningen för 30 min för tumörprover och 15 min för cell pellets. - Dekantera lösningen från glasen och skölj dem två gånger med dH2O.
-
Sonden hybridisering
- Tillsätt ~ 4 droppar lämplig ready-to-use sonden lösningen att täcka hela avsnittet. Om du använder större delar, Lägg till ~ 5-6 droppar.
- Hybridisera sonderna för 2 h vid 40 ° C i hybridisering ugnen. Dekantera lösningen från glasen och tvätta bilderna i 200 mL 1 x Tvättbuffert i 2 min på RT med enstaka agitation. Upprepa förfarandet tvätt i det här steget.
-
Signalerar förstärkning
- Inkubera i avsnitt med ~ 4 droppar av AMP 0 per bild vid 40 ° C i hybridisering ugnen i 30 min. Dekantera lösningen och tvätta bilderna i 200 mL 1 x Tvättbuffert i 2 min på RT med enstaka agitation. Upprepa förfarandet tvätt i det här steget.
- Inkubera i avsnitt med ~ 4 droppar av AMP 1 per bild vid 40 ° C i hybridisering ugnen i 15 min. Dekantera lösningen och tvätta bilderna i 200 mL 1 x Tvättbuffert i 2 min på RT med enstaka agitation. Upprepa förfarandet för tvätt.
- Inkubera i avsnitt med ~ 4 droppar av AMP 2 per bild vid 40 ° C i hybridisering ugnen i 30 min. Dekantera lösningen och tvätta bilderna i 200 mL 1 x Tvättbuffert i 2 min på RT med enstaka agitation. Upprepa förfarandet för tvätt.
- Inkubera i avsnitt med ~ 4 droppar av AMP 3 per bild vid 40 ° C i hybridisering ugnen i 30 min. Dekantera lösningen och tvätta bilderna i 200 mL 1 x Tvättbuffert i 2 min på RT med enstaka agitation. Upprepa förfarandet för tvätt.
- Inkubera i avsnitt med ~ 4 droppar av AMP 4 per bild vid 40 ° C i hybridisering ugnen i 15 min. Dekantera lösningen och tvätta bilderna i 200 mL 1 x Tvättbuffert i 2 min på RT med enstaka agitation. Upprepa förfarandet för tvätt.
- Inkubera i avsnitt med ~ 4 droppar av AMP 5 per bild på RT för 30 min. Dekantera lösningen och tvätta bilderna i 200 mL 1 x Tvättbuffert i 2 min på RT med enstaka agitation. Upprepa förfarandet för tvätt.
- Inkubera i avsnitt med ~ 4 droppar av AMP 6 per bild på RT för 15 min. Dekantera lösningen och tvätta bilderna i 200 mL 1 x Tvättbuffert i 2 min på RT med enstaka agitation. Upprepa förfarandet för tvätt.
-
Signaldetektion
- Laga snabbt röda färgämnet arbetar lösning. För en bild med en 0,75 x 0,75 tum2 barriär, tillsätt 2 μL snabbt röd-B färgämnet till 120 μL av snabb röd-A till röret och blanda väl.
Obs: Beroende på storleken på den hydrofoba barriär och antalet bilder, volymer snabbt röd arbetslösning varierar. - Häll av överflödig vätska från glasen och tillsätt snabbt röda färgämnet arbetar lösning på bilderna. Inkubera bilderna för 10 min vid RT i facket med en täckmantel för att undvika ljus exponering.
Obs: Använd den snabbt röda arbetar lösning inom 5 min av förberedelser, och utsätt den inte för direkt solljus eller UV-ljus. - Häll snabbt röd lösningen och skölj bilderna två gånger med kranvatten. Placera glasen i en objektglashållaren.
- Laga snabbt röda färgämnet arbetar lösning. För en bild med en 0,75 x 0,75 tum2 barriär, tillsätt 2 μL snabbt röd-B färgämnet till 120 μL av snabb röd-A till röret och blanda väl.
-
Counterstaining
- Counterstain avsnitten vävnad med 50% Gills Hematoxylin lösning för 2 min på RT. Wash bilderna med kranvatten och upprepa detta flera gånger tills bilderna är tydliga, medan avsnitten fortfarande lila. Doppa glasen i 0,02% ammoniak vatten för blåelse (doppa 2 – 3 gånger). Ersätta ammoniak vattnet med kranvatten och tvätta bilderna 3 – 5 gånger.
-
Slädmontage
- Torra bilder i en cirkulerande luft ugn på 60 ° C under 15 minuter eller på RT tills helt torr. Placera 1-2 droppar av montering reagens på varje bild och plats coverslips över varje avsnitt. Undvika någon svällning av luftbubblor. Luften torr bilderna för minst 5 min.
Obs: Snabbt röd substratet är alkohol-känsliga. Inte torka glasen i alkohol.
- Torra bilder i en cirkulerande luft ugn på 60 ° C under 15 minuter eller på RT tills helt torr. Placera 1-2 droppar av montering reagens på varje bild och plats coverslips över varje avsnitt. Undvika någon svällning av luftbubblor. Luften torr bilderna för minst 5 min.
-
Visualisering
- Iaktta bilderna i standard brightfield Mikroskop.
Representative Results
I situ hybridisering analys arbetsflödet:
Arbetsflödet är avbildad i figur 1 och består av fyra delar: permeabilisering av celler eller vävnader med målet hämtning och proteas lösningar, hybridisering av sonderna till målet RNA, signalerar förstärkning och visualisering av signalen. Signalen kan också kvantifieras med digitala bildsystem av programvara eller i ett semikvantitativt sätt baserat på antalet punkter per cell. Manuella proceduren som beskrivs i figur 2 har också varit helt automatiserad i kommersiella auto-färgning system.
Representativa färgning för exon junction upptäckt (EGFRvIII skarv variant): EGFRvIII är en variant av epidermal tillväxtfaktor receptor som uppstår från en i-frame genomisk radering av exoner 2-7, vilket leder till konstitutivt aktiv onkogena signalering7 . Analysen användes för att identifiera EGFRvIII status i tumörprover FFPE glioblastom (GBM). Enda dubbel-Z sonderna var avsedda att spänna exon korsningar för att upptäcka antingen WT, mutant, eller båda avskrifter (figur 3A). WT EGFR sonderna span korsningar av antingen exonerna 1 och 2 (E1/E2) eller exoner 7 och 8 (E7/E8), medan de EGFRvIII-specifika proberna span korsningen av exonerna 1 och 8 (E1/E8). En gemensam sond som sträcker sig över korsningen av exonerna 8 och 9 (E8/E9) användes också för att upptäcka totala EGFR (både WT och EGFRvIII avskrifter). Alla sonderna användes sedan för att fastställa EGFR status i FFPE GBM prover. De två representativa exempel som visas i figur 3B togs från en större studie. EGFR status bekräftades av en oberoende metod, RT-PCR. Båda WT sonder upptäckt signal i båda exemplaren, som anger att de två proverna express WT EGFR (figur 3B). Mutant sonden visade dock endast signaldetektion i EGFRvIII + provet, bekräftar att detta prov är faktiskt positivt för den EGFRvIII varianten (figur 3B, vänster paneler). Däremot upptäcka muterade sonden inte signal i EGFRvIII-provet (figur 3B, rätt panelerna). Sammantaget visar dessa resultaten att exon junction analysen kan identifiera EGFRvIII status i GBM FFPE tumörprover.
Representativt färgning för kort mål:
Den CDR3, eller kompletterande avgörande region 3, är en mycket varierande domän i T-cell receptorer. CDR3 sekvensen är vanligtvis ganska kort; till exempel CDR3 α och β sekvenser från raden Jurkat T-cell är 51 och 48 nukleotider i längd, respektive (figur 4A). För att identifiera de specifika CDR sekvenser uttryckt i Jurkat celler, antisense sonder för CDR3 α och β som uttrycks i raden Jurkat T-cell genererades, förutom känsla sonder för CDR3 α och β som negativ kontroll sonder. Alla sonderna testades sedan FFPE-beredd Jurkat-celler med analysen. Robust färgning observerades med anti känsla sonder för båda CDR3 α och β i de Jurkat cellerna, medan känsla sonder upptäckt lite till ingen signal (figur 4B). Dessa resultat visar kort mål analysen förmåga att urskilja mellan mycket rörlig men kort CDR sekvenser för T-cell receptor kloner.
Representativt färgning för punktmutation EGFR L858R:
Punktmutation sonder har utvecklats för att upptäcka enda nukleotid variationer och små infogningar eller borttagningar (INDELs) inom ramen för tumör. Figur 5A visar förmåga för i situ detektion av point mutation EGFR L858R (2573T > G). Två sonder utformades: en att upptäcka L858R muterade EGFR sekvens, och en annan att upptäcka EGFR L858 WT sekvensen. Båda sonder testades i två FFPE-beredd cellinjer: H2229, som endast uttrycker EGFR L858 WT; och H1975, som är heterozygota för EGFR L858R mutation. L858R mutant sonden upptäckts signal endast i raden H1975 cell men inte i den H2229 cellen fodrar. Dock upptäckt WT sonden signal i båda cellinjer. Likaså figur 5B visualiserar i situ upptäckt av point mutation KRAS G12A (35 G > C). Två sonder har utformats att upptäcka KRAS G12A MT och KRAS G12 WT sekvenser och sedan testats på raden HuT78 cell (som endast uttrycker KRAS G12 WT) och den SW116 cellen fodrar (som är heterozygota för KRAS G12A mutation). Medan KRAS G12 WT sonden upptäckts signal i båda cellinjer, upptäckt KRAS G12A sonden endast signal i SW116 cell linje. Dessa data tillsammans och visar teknisk kapacitet punktmutation analysens att upptäcka enda nukleotid polymorfismer i samband med celler och vävnad.
Representativt färgning för automatiserad i situ -analysen:
Automatiserade analyser möjliggör ett större antal prover kan köras mer tillförlitligt, minimera variabiliteten mellan användaren och praktiska tid och generera konsekvent reproducerbara resultat. Därför utvecklades en automatisk version av analysen. För att demonstrera automatiserad färgning med denna analys, undersöktes upptäckt av skarv variant METΔ14. Denna variant är resultatet av exon 14 i MET genen som hoppat under pre-mRNA splicing, vilket leder till konstitutiv aktivering och Onkogen transformation av MET receptor8,9. För att specifikt identifiera den METΔ14 varianten, två exon junction sonder utformades: en som sträcker sig över korsningen av exonerna 13 och 15 (E13/E15) för att upptäcka METΔ14 variant avskriften, och en annan som sträcker sig över korsningen av exonerna 14 och 15 (E14/E15) för att upptäcka de WT träffade avskrift (figur 6A). Båda sonder testades sedan i 2 FFPE-beredd cellinjer: H596, som uttrycker den METΔ14 varianten, och A549, som uttrycker genen WT träffade. Båda sonder visade utesluter uttrycksmönster, med E13/E15 sonden bara upptäcka signal i de H596 cellerna och E14/E15 sonden bara upptäcka signal i A549 celler (siffror 6B och 6 C). Slutligen proben för dapB visade ingen signal, som visar ingen bakgrund signal (siffror 6B och 6 C). Sammantaget visar dessa data specifika upptäckt av MET variant METΔ14 i situ utnyttja den automatiserade BaseScope assay.
Figur 1 : Assay arbetsflödet. Arbetsflödet består av 4 viktiga steg: förbehandling till permeabilize celler eller vävnad, sond hybridisering till target RNA, signalerar förstärkning, och signal upptäckt genom visualisering under brightfield eller fluorescerande Mikroskop. Enskilda punkter kan kvantifieras med hjälp av en digital bild analysplattform. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Illustration av protokollet manuell analys. Hela analysen kan slutföras i 9 h. förbehandling kan variera beroende på vävnadstyp, så det är klokt att konsultera bilaga A i användarhandboken för vävnad förbehandling rekommendationer angående inkubationstiden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Representativa bilder av exon junction upptäckt. (A) visas här är exon organisationen för EGFR WT och EGFRvIII avskrifter och en schematisk föreställande dubbel-Z exon junction sonder som grenslar korsningen för att upptäcka EGFR WT eller EGFRvIII. (B) exon junction analysen utfördes på två FFPE glioblastoma prover med sonderna som anges i (A), liksom en positiv kontroll sond, POLR2A och negativ kontroll sond, dapB. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Representativa bilder av kort mål sekvens upptäckt. (A) visas här är CDR3 sekvenser i Jurkat celler. Sekvensen i svart är en kompletterande gemensamma sekvens och sekvensen i rött är unik till antingen CDR3α eller CDR3β. Enda dubbel-Z kort mål sekvens sonder utformades mot dessa sekvenser. (B), kort mål analysen utfördes på Jurkat celler förberedda som ett FFPE cellpelleten använder anti förnuft eller känsla sonder inriktning sekvenser (a), och dapB användes som en negativ kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Representativa bilder av punktmutation upptäckt. (A) analysen utfördes på H2229 (homozygota för EGFR L858) och H1975 celler (heterozygot för EGFR L858R mutation) förberedda som ett FFPE cellpelleten använder enda dubbel-Z point mutation sonder inriktning EGFR L858 WT ordningsföljden eller EGFR L858R muterad sekvens. (B), punktmutation analysen utfördes på HuT78 (homozygota för KRAS G12A) och SW116 celler (heterozygot) för KRAS G12A mutation) förberedda som ett FFPE cellpelleten använder enda dubbel-Z point mutation sonder inriktning sekvensen KRAS G12 WT eller KRAS G12A muterad sekvens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Representativa bilder av automatiserad färgning med exon junction analys. (A) visas här är exon organisationen för träffade WT och METΔ14 avskrifter och en schematisk föreställande enda dubbel-Z exon junction sonder som grenslar korsningen för att upptäcka träffade WT eller METΔ14. (B) och (C), automatiserade exon junction analysen utfördes på H596 (som uttrycker METΔ14) och A549 celler (som uttrycker träffade WT) förberedda som ett FFPE cellpelleten använder sonderna som anges i (A), samt negativ kontroll sond dapB. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Exon Junction | Kort sekvens | Punktmutation |
| Skarva variant/isoform | Sekvenserna mellan 50 och 300 nt | Punktmutation |
| Cirkulär RNA (circRNA) | Mycket homologa sekvenser | Kort ditsatta |
| Gen fusion | CDR3 sekvens för TCR kloner | Gen redigering |
| Gen knockout (KO) | Pre-miRNA | |
| Liten nukleolära RNA (snoRNA) | ||
| Gen redigering |
Tabell 1: applikationer av den i situ assay. Det finns 3 huvudsakliga kategorier för tillämpningar av denna analys: exon junction, kort mål sekvens och punktmutation. Anges i varje kolumn är några specifika exempel på för varje kategori.
Discussion
I betänkandet diskuterades roman ISH assay protokollet och dess tillämpningar i detalj. Analysen möjliggör direkt visualisering av exon korsningar, kort-mål och mycket homologa sekvenser och punktmutationer i samband med vävnad. Analysen bygger på RNAscope teknik5 och kan således enda molekyl upptäckt. Dock på grund av en avancerad förstärkarsystem, kan signalen upptäckas med sonder som innehåller så lite som ett dubbel-Z par eller med en target mall längd på bara 50 nukleotider. Eftersom sonderna kan vara så kort som en enda dubbel-Z i längd, möjliggör detta upptäckt av exon korsningar, kort-mål och mycket homologa sekvenser och punktmutationer (tabell 1).
För framgångsrika resultat av analysen finns det flera tekniska rekommendationer. Först, vävnader bör fastställas i färsk 10% neutral buffrad formalin (NBF) vid rumstemperatur för 16 – 32 h10. Underfixation (< 16 h) eller overfixation (> 32 h) kommer att försämra resultatet av analysen och kan kräva ytterligare optimering. För det andra, för att säkerställa optimal kontroll av temperatur och fuktighet, som krävs för robust sonden hybridisering och signal förstärkning, bilden bearbetning system och hybridisering ugn bör användas för protokollet steg 2,3 till 5 (proteas förbehandling, sond hybridisering, signal förstärkning och signaldetektion). Tredje, överskott kvarvarande buffertar bör vara ordentligt dekanteras före varje steg i hela protokollet (men inte så mycket att vävnadssnitt torka ut). Om glasen torka ut, utvecklar betydande icke-specifik signal. Fjärde, beroende på vävnadstyp av, förbehandling optimering kan vara nödvändigt. Använder den fel proteashämmaren eller utför för en suboptimal tidsperiod kan resultera i under - eller över - digestion och kommer att negativt påverka signalen. Avslutningsvis är det viktigt att alltid köra positiva och negativa kontroller med test sonderna. Negativ kontroll sonder säkerställa att ingen bakgrund signal och positiv kontroll sonder säkerställa att analysen har gjorts korrekt och att RNA kvaliteten i provet är optimal för att tolka testresultat sonden. Om det finns ingen signal med positiv kontroll sonden, sedan RNA i provet är sannolikt suboptimala och en signal kan inte ses med test sonden.
Förutom manuell analysen var förmågan att utföra analysen på automatiserade stainers också påvisas (figur 6). Denna automatiserade ISH-analys ger en hög signal-brus-förhållande och är tillämpliga för samma program som visas i tabell 1. men fördelarna med en automatiserad analys inkluderar standardisering av assay villkor, minimering av Inter användaren variabilitet och hands-on tid, och ersättning för high-throughput screening av vävnadsprover på ett tillförlitligt sätt.
Immunhistokemi (IHC) och qRT-PCR tillåta för detektion av skarv varianter (särskilt EGFRvIII), i FFPE kliniska prover, dessa tekniker kan saknar nödvändiga specificitet och erbjuder inte insikt i den rumsliga upplösningen i skarven variant-uttryck, respektive11,12. En viktig fördel för analysen i detta protokoll är dess mycket känsliga och specifika visualisering av skarv korsningar samtidigt bevara morfologiska vävnad ramen. Här var analysens förmåga att just rikta unika exon korsningar för flera skarv varianter, inklusive EGFRvIII och METΔ14, påvisas (figur 3 och 6). Analysen har dessutom visat att upptäcka splice varianten AR-V7 i prostatacancer, flera isoformer av ErbB4 i hjärnan, och bekräftelse av knockout av cirkulär RNA Cdr1as mus hjärnan3,13,14.
Kort måldetektering sekvens av denna ISH analys möjliggör visualisering av RNA sekvenser så kort som 50 nukleotider i längd, vilket framgår av detektion av CDR3 sekvenser härrör från Jurkat celler (figur 3). Analysen kan också upptäcka gensekvenser som är mycket homologa till andra familjemedlemmar eller arter som framgår av Revêchon et al., som används kort mål analysen för att upptäcka mänsklig progerin uttryckt i mus subkutan vit fettvävnad15. Dessutom kan små nukleolära RNA (snoRNA), CRISPR-medierad gen redigering och föregångare-mikroRNA vara upptäckta i situ med kort mål-analys. Mer nyligen, Fu et al. kombinerat denna ISH analys med IHC att identifiera exakt celler i näthinnan uttrycker de pre-miRNA mir125b16.
Mutation profilering i tumörer är kritisk för att studera utvecklingen av tumörer och för att utveckla riktade terapier. Medan mutation profilering kan uppnås via hög genomströmning sekvensering, kan inte denna teknik fullt ut hantera intratumoral heterogenitet eller länk genetiska förändringar med cellulära morfologi17,18. Påvisande av punktmutationer som använder denna ISH analys möjliggör distinktion av RNA mål sekvenser på singel-base resolution, som validerats av detektion av EGFR L858R och KRAS G12A enda nukleotid variationer i cellinjer (figur 5). Dessutom används Baker et al. punktmutation analysen för att rikta flera mutationer i de BRAF, KRAS och PIK3CA onkogener i kolorektal cancer18. De kunde identifiera och rumsligt karta sällsynt muterade subkloner tumörceller, slutligen visar hur de bidrar till intra-tumör heterogenitet.
Sammanfattningsvis, har en specialiserad RNA ISH-analysen utvecklats. Denna metod möjliggör upptäckt av skarv varianter, korta sekvenser och mutationer i situ. Det är känsliga, specifika, mätbara och anpassningsbar prestanda både genom manuella metoder och på automatiserade stainers.
Disclosures
Samtliga författare är anställda av avancerad Cell Diagnostics, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HybEZ Oven (110 or 220 VAC) or HybEZ II Oven (110 or 220V) | ACD | 310010 or 310013 (HybEZ™), 321710 or 321720 (HybEZ™ II) | |
| HybEZ Humidity Control Tray (with lid) | ACD | 310012 | |
| ACD EZ-Batch Slide Rack (20 slide capacity) 1 rack 310017 | ACD | 310017 | |
| HybEZ Humidifying Paper | ACD | 310015 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen (required) | Vector Laboratory | H-4000 | |
| SuperFrost Plus Slides (required) | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 10% neutral-buffered formalin (NBF) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Paraffin wax | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Microtome | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Gill’s Hematoxylin I | American Master Tech Scientific/MLS | HXGHE1LT | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Xylene | Fisher Scientific/MLS | X3P-1GAL | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Tissue-Tek Vertical 24 Slide Rack | American Master Tech Scientific/MLS | LWSRA24 | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Tissue-Tek Staining Dishes | American Master Tech Scientific/MLS | LWT4457EA | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Tissue-Tek Clearing Agent Dishes, xylene resistant | American Master Tech Scientific/MLS | LWT4456EA | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| 100% alcohol (EtOH) | American Master Tech Scientific/MLS | ALREACS | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| VectaMount Permanent Mounting Medium (required) | Vector Labs | H-5000 | |
| Cover Glass, 24 mm x 50 mm | Fisher Scientific/MLS | 12-545-F | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Ammonium hydroxide, 28–30% | Sigma-Aldrich/MLS | 320145-500mL | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Carboy (>3L) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Oster Steamer Model 5712, Black and Decker Steamer HS3000, or the Braun Multiquick FS 20 Steamer | / | / | |
| Digital thermometer | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Water bath or incubator, capable of holding temperature at 40 +/– 1 °C | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Pipettors and tips, 1–1,000 μL | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Distilled water | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Tubes (various sizes) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Fume hood | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Graduated cylinder | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Parafilm | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Paper towel or absorbent paper | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Microcentrifuge | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Microscope and accessories | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Drying oven, capable of holding temperature at 60 +/– 1 °C | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Formaldehyde | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Histogel | Fisher Scientific/MLS | 22-110-678 | |
| BaseScope Reagent Kit - RED | Advanced Cell Diagnostics | 322900 | |
| BaseScope Hs-EGFR-E1E2 | Advanced Cell Diagnostics | 701701 | |
| BaseScope Hs-EGFR-E1E8 | Advanced Cell Diagnostics | 701711 | |
| BaseScope Hs-EGFR-E7E8 | Advanced Cell Diagnostics | 701721 | |
| BaseScope Hs-EGFR-E8E9 | Advanced Cell Diagnostics | 701731 | |
| BaseScope Hs-MET-E14E15 | Advanced Cell Diagnostics | 701811 | |
| BaseScope Hs-MET-E13E15 | Advanced Cell Diagnostics | 701801 | |
| BaseScope Hs-KRAS-G12A | Advanced Cell Diagnostics | 705491 | |
| BaseScope Hs-KRAS-G12-nt35WT | Advanced Cell Diagnostics | 705531 | |
| BaseScope Hs-EGFR-L858R | Advanced Cell Diagnostics | 705451 | |
| BaseScope Hs-EGFR-L858WT | Advanced Cell Diagnostics | 705461 | |
| BaseScope Control Probe Pack Human | Advanced Cell Diagnostics | 322975 |
References
- Bolha, L., Ravnik-Glavač, M., Glavač, D. Circular RNAs: Biogenesis, Function, and a Role as Possible Cancer Biomarkers. International Journal of Genomics. 2017, 6218353 (2017).
- Yamada, A., Yu, P., Lin, W., Okugawa, Y., Boland, C. R., Goel, A. A RNA-Sequencing approach for the identification of novel long non-coding RNA biomarkers in colorectal cancer. Scientific Reports. 8 (1), 575 (2018).
- Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution. Molecular Neurobiology. , Epub ahead of print (2017).
- Mahmood, R., Mason, I. In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections. Methods in Molecular Biology. 461, 675-686 (2008).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Paraffin processing of tissue. Protocols Online. , Available from: https://www.protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/ (2016).
- An, Z., Aksoy, O., Zheng, T., Fan, Q. W., Weiss, W. A. Epidermal growth factor receptor and EGFRvIII in glioblastoma: signaling pathways and targeted therapies. Oncogene. , Epub ahead of print (2018).
- Frampton, G. M., et al. Activation of MET via diverse exon 14 splicing alterations occurs in multiple tumor types and confers clinical sensitivity to MET inhibitors. Cancer Discovery. 5 (8), 850-859 (2015).
- Awad, M. M., et al. MET Exon 14 Mutations in Non-Small-Cell Lung Cancer Are Associated With Advanced Age and Stage-Dependent MET Genomic Amplification and c-Met Overexpression. Journal of Clinical Oncology. 34 (7), 721-730 (2016).
- Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 134 (6), 907-922 (2010).
- Gan, H. K., Cvrljevic, A. N., Johns, T. G. The epidermal growth factor receptor variant III (EGFRvIII): where wild things are altered. Federation of European Biochemical Societies Journal. 280 (21), 5350-5370 (2013).
- Wheeler, S. E., Egloff, A. M., Wang, L., James, C. D., Hammerman, P. S., Grandis, J. R. Challenges in EGFRvIII detection in head and neck squamous cell carcinoma. Public Library of Science One. 10 (2), e0117781 (2015).
- Zhu, Y., et al. Novel Junction-specific and Quantifiable In Situ Detection of AR-V7 and its Clinical Correlates in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer. European Urology. , Epub ahead of print (2017).
- Piwecka, M., et al. Loss of a mammalian circular RNA locus causes miRNA deregulation and affects brain function. Science. , Epub ahead of print (2017).
- Revêchon, G., et al. Rare progerin-expressing preadipocytes and adipocytes contribute to tissue depletion over time. Scientific Reports. 7 (1), 4405 (2017).
- Fu, Y., et al. Functional ectopic neuritogenesis by retinal rod bipolar cells is regulated by miR-125b-5p during retinal remodeling in RCS rats. Scientific Reports. 7 (1), 1011 (2017).
- Yates, L. R., et al. Subclonal diversification of primary breast cancer revealed by multiregion sequencing. Nature Medicine. 21 (7), 751-759 (2015).
- Baker, A. M., et al. Robust RNA-based in situ mutation detection delineates colorectal cancer subclonal evolution. Nature Communications. 8 (1), 1998 (2017).
