Summary
Nous décrivons ici un modèle de transplantation orthotopique syngénique minimalement invasives des cellules d’adénocarcinome pulmonaire souris comme un modèle de temps - et réduction des coûts pour étudier le cancer du poumon non à petites cellules.
Abstract
L’utilisation de modèles murins est indispensable pour l’étude de la physiopathologie des maladies diverses. En ce qui concerne le cancer du poumon, plusieurs modèles sont disponibles, y compris les organismes génétiquement machiné des modèles ainsi que les modèles de la transplantation. Cependant, les modèles de souris génétiquement modifiées sont long et coûteux, que certains modèles de transplantation orthotopique sont difficiles à reproduire. Ici, une méthode de livraison non invasif par voie intratrachéale de cellules de tumeur du poumon comme un modèle de transplantation orthotopique alternative est décrite. L’utilisation de cellules d’adénocarcinome pulmonaire souris et receveurs de greffe syngénique permet à étudier la tumorigenèse sous la présence d’un système immunitaire pleinement active. En outre, les manipulations génétiques de tumeur cellules avant transplantation rend ce modèle une approche intéressante de gagner du temps pour étudier l’impact des facteurs génétiques sur la croissance tumorale et l’expression des gènes cellulaires tumorales profils dans des conditions physiologiques. En utilisant ce modèle, nous montrons ce poumon cellules d’adénocarcinome express niveaux accrus de l’éliminateur de lymphocytes programmé mort-ligand 1 (PD-L1) lorsqu’il est cultivé dans leur milieu naturel par rapport à la culture in vitro.
Introduction
Cancer du poumon est toujours de loin le plus grand tueur de liés au cancer dans les hommes et les femmes1. En effet, selon l’American Cancer Society, chaque année plus de personnes meurent du cancer du poumon que du cancer du sein, la prostate et du côlon cancer ensemble1. Jusqu'à récemment, la majorité des patients souffrant de cancer de poumon non à petites cellules (NSCLC), qui est le plus abondant sous-type de cancer du poumon, ont été traitée avec une chimiothérapie à base de platine dans un cadre de première ligne, principalement avec l’ajout de l’angiogenèse inhibiteurs de la2. Seulement un sous-ensemble de patients recèle oncogènes mutations dans le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), kinase de lymphome anaplasique (ALK), ou dans ROS1 et peut être traité avec disponible ciblant médicaments3,4. Avec l’avènement des inhibiteurs de la point de contrôle immunitaire, nouvel espoir pour les patients atteints de cancer du poumon a été soulevée, même si jusqu'à présent, seulement 20 à 40 % des patients répondent à l’immunothérapie5. Par conséquent, plus recherche est nécessaire pour améliorer ce résultat en thérapie immunitaire de point de contrôle de réglage fin et d’étudier les options de traitement combinatoire.
Pour étudier le cancer du poumon, une vaste gamme de modèles précliniques sont disponible, y compris les modèles spontanés déclenché par des produits chimiques et les agents cancérigènes et les souris génétiquement modifiée modèles (GEMM) où autochtones tumeurs surviennent suite à l’activation conditionnelle d' oncogènes et/ou l’inactivation du suppresseur de tumeur gènes6,7,8. Ces modèles sont particulièrement utile pour étudier les processus fondamentaux dans le développement de tumeurs du poumon, mais elles exigent également une vaste souris d’élevage, et expériences sont coûteuses en temps. Par conséquent, plusieurs études évaluant les inhibiteurs potentiels Profitez des modèles de xénogreffes de (patient dérivés) sous-cutané où lignées de cellules cancéreuses du poumon humain sont injectées par voie sous-cutanée de souris immunodéficientes9.
Dans ces modèles, le micromilieu des tumeurs n’est pas représenté en conséquence ; par conséquent, les chercheurs utilisent aussi des modèles de transplantation orthotopique, où les cellules tumorales sont injectées par voie intraveineuse, intrabronchially ou directement dans le poumon parenchyme10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20. Certaines de ces méthodes sont techniquement difficiles, difficiles à reproduire et nécessitent une formation intensive des chercheurs. 21 ici, nous avons adapté un orthotopique non invasif, méthode de transplantation par voie intratrachéale chez les souris immunocompétentes, où les tumeurs se développent dans les 3 à 5 semaines et présentent une similitude importante de tumeurs humaines, à induire l’expression de la T-cellule suppresseur programmé mort-ligand 1 (PD-L1) sur les cellules tumorales. 11 , 12 , 20 l’utilisation de cellules de tumeur de souris provenant de modèles GEMM et souris destinataires syngéniques permet une étude appropriée du microenvironnement tumoral, y compris les cellules immunitaires. En outre, gène outils comme CRISPR/Cas9 technologie22 d’édition peut être utilisé in vitro avant la transplantation qui facilite la recherche sur l’impact des facteurs génétiques dans la tumorigenèse du poumon.
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Protocol
Tous les protocoles expérimentaux comme indiqué ci-dessous suivent les directives éthiques et ont été approuvés par le ministère fédéral autrichien de la Science, la recherche et l’économie.
Remarque : Le protocole ici décrit un modèle orthotopique de transplantation de cellules d’adénocarcinome pulmonaire souris dans syngéniques bénéficiaires. Les cellules peuvent être isolées des poumons avec tumeur de KrasLSL-G12D: p53fl/fl (KP) souris7,18, si elles sont disponibles en interne et transplantées chez des souris de même sexe et de fond. Si les cellules proviennent d’autres groupes de recherche et de l’arrière-plan exacte reste inconnue, nous recommandons l’utilisation de la génération F1 d’un croisement entre les souris C57BL/6 et 129S comme des greffés afin de garantir une tolérance maximale.
1. préparation de la cellule
- KP semence cellules 24h avant la transplantation à environ 50 % confluence dans RPMI additionné de sérum de veau foetal de 10 % (FCS), glutamine et 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine (ci-après dénommé le milieu de culture standard). Incuber les cultures cellulaires à 37° C, 5 % de CO2et environ 95 % d’humidité relative.
- Le lendemain, récolter les cellules en utilisant 1 mL de trypsine-EDTA (0,05 % dans une solution saline tamponnée au phosphate [PBS]) pendant 5 min par plaque de 10 cm et, par la suite, remettre en suspension les cellules individuelles avec 9 mL de milieu de culture standard.
- Compter les cellules dans un hémocytomètre et transférer le nombre de cellules nécessaires pour les expériences dans un tube à centrifuger conique de 50 mL.
Remarque : Nous vous recommandons de repiquage entre 2. 5 x 105 et KP 1 x 106 cellules / souris, mais cela pourrait être adapté selon les besoins du chercheur. - Par la suite, centrifuger les cellules pendant 5 min à 300 x g, aspirer le surnageant et, à l’aide d’une pipette, remettre en suspension les cellules à une densité de 2 x 107/ml (pour l’inhalation de 1 x 106 cellules de KP par souris) dans le sérum et sans antibiotique RPMI , additionné de 0,01 M d’acide tétraacétique (EDTA).
- Conserver les cellules sur la glace jusqu'à la transplantation.
2. Orthotopic Transplantation via intratrachéale livraison
- Endormir une souris (8-12 semaines d’âge) par une injection sous-cutanée d’un mélange de kétamine (100 mg/kg de poids corporel) et de xylazine (10 mg/kg de poids corporel).
- Pendant ce temps l’anesthésie définit dans, préparez le cathéter pour l’intubation. Par conséquent, émousser l’aiguille d’un cathéter en coupant simplement la fin avec des ciseaux. Par la suite, retirer le cathéter intégralement sur l’extrémité de l’aiguille.
- Confirmer le niveau approprié de l’anesthésie en pédale réflexe via orteil ferme pinçant et pommade ophtalmique pour les yeux.
- Difficulté de la souris sur la plate-forme de l’intubation (Figure 1 a) en accrochant ses incisives supérieures sur une suture et confirmer que la poitrine est verticale sous la suture.
- Placer un câble à fibre optique entre les pattes avant pour éclairer la poitrine (Figure 1 b).
- Soigneusement, ouvrir la bouche de la souris et tirez sur la languette à l’aide de pinces plates désinfectée. Recherchez l’émission de lumière blanche pour localiser le larynx et visualiser les cartilages de l’épiglotte et le cartilage (Figure 1).
- Une fois que l’ouverture de la trachée est clairement visible, faites doucement glisser la sonde dans la trachée (Figure 1). La longueur du cathéter doit être inséré dépend de l’âge et la taille de l’animal, car il ne devrait pas aller au-dessous de la bifurcation pour garantir une répartition uniforme du poumon cellules d’adénocarcinome du poumon. Retirer rapidement l’aiguille du cathéter.
- Le positionnement correct de la sonde dans la trachée est indiqué par la lumière blanche qui brille à travers le cathéter (Figure 1E). Afin de confirmer le placement de la sonde dans la trachée, fixez une seringue de 1 mL contenant de l’eau au cathéter. L’eau dans la seringue sera rapidement bouger de haut en bas selon la respiration (Figure 1F).
Remarque : Cette étape peut être omise par des chercheurs expérimentés. - Réchauffer la suspension cellulaire en tenant le tube dans la main et, par la suite, distribuer 50 µL de la suspension contenant 1 x 106 cellules (le nombre de cellules peut être variable) dans le centre de l’embase du cathéter. La suspension va être aspirée immédiatement. Ensuite, fixez une seringue de 1 mL et administrer 300 µL d’air pour assurer une répartition homogène dans les poumons.
- Délicatement retirer le cathéter, retirer la souris de la plate-forme de l’intubation et mettez-le sur une bouillote jusqu'à ce qu’il récupère de l’anesthésie.
3. poumon préparation pour cytométrie en flux
- Le point de terminaison souhaité expérimentale, endormir la souris par une injection sous-cutanée d’un mélange de kétamine (100 mg/kg de poids corporel) et de xylazine (10 mg/kg de poids corporel) et il euthanasier par dislocation cervicale.
- Tremper la carcasse dans l’éthanol à 70 % et garantir la souris sur une planche de dissection à l’aide de ruban adhésif.
- Faire une incision médiane ventrale et retourner doucement la peau pour exposer les muscles de la paroi thoracique et les organes abdominaux. La perforation de la membrane et couper les côtes avec des ciseaux pour exposer la cavité thoracique.
- Perfuse les poumons 3 x avec 6 à 8 mL de PBS glacé à travers le ventricule droit à l’aide d’une aiguille de 27 G après avoir coupé une petite ouverture dans le ventricule gauche pour permettre au sang de quitter. Les poumons doivent être provisionnés du sang, tourner complètement blanc.
- Retirez les poumons et émincer les lobes en petits morceaux à l’aide de ciseaux. Transférer les morceaux de poumons dans un tube de microcentrifuge de 2 mL et il incuber dans 1,5 mL de tampon de digestion de poumon (RPMI, 5 % FCS, collagénase de U/mL 150 50 U/mL DNase et j’ai j’ai).
- Incuber le poumon pieces 30-60 min à 37 ° C et sous agitation constante.
- Transférer la suspension de cellules pulmonaires à travers un tamis de cellule 70 µm dans un tube de 50 mL. Désactivez la passoire avec le dos d’une seringue stérile de 10 mL et rincer la crépine avec 15 mL de PBS avec 2 % FCS.
- Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à 4 ° C et aspirer le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de tampon de lyse (ACK) d’ammonium-chlorure-potassium et les incuber pendant 5 min à température ambiante pendant la lyse des érythrocytes résiduelles.
- Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à 4 ° C et remettre en suspension les cellules dans 1 mL de PBS avec 2 % FCS et aller de l’avant avec le protocole de coloration désiré pour écoulement cytometry23.
Remarque : Alternativement, les cellules peuvent être charriés dans RPMI contenant 30 % de FCS et 10 % de DMSO et gelés à l’aide d’un gel contenant pour une analyse ultérieure.
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Representative Results
Nous avons utilisé le modèle de transplantation orthotopique par livraison de cellules tumorales par voie intratrachéale pour tester si le microenvironnement tumoral stimule expression PD-L1. Par conséquent, nous avons isolé cellules pulmonaires AC souris du modèle KP autochtone (cellules de KP), dix semaines après induction tumorale via Cre recombinase-exprimant l’adénovirus (Ad.Cre) livraison24. Par la suite, nous avons marqué le poumon cellules AC en utilisant une protéine fluorescente verte (GFP)-eux exprimant les lentivirus25 et orthotopically implanté dans la prestation des souris immunocompétentes, syngénique via intratrachéale. Pour valider le modèle, nous avons transplanté des quantités différentes de cellules tumorales et analyses de survie. Comme prévu, la survie de souris destinataires est corrélée au nombre de cellules implantées, et la durée de survie était de 2 semaines pour les bénéficiaires de 2 x 106 cellules à environ 10 semaines pour les bénéficiaires de 2,5 x 105 cellules (Figure 2 a). Lorsque les poumons ont été disséqués après la mort des souris utilisées pour l’analyse de survie, nous avons remarqué une répartition égale des nodules de la tumeur dans tous les lobes des poumons (Figure 2 b). Concernant la morphologie des tumeurs, nous avons comparé les tumeurs transplantées avec autochtone KRASG12D-driven tumeurs7 et n’a pas remarqué une différence évidente (Figure 2).
Pour étudier l’expression de PD-L1 des cellules tumorales transplantés, nous euthanasiés destinataires souris 3 semaines après la transplantation de 1 x 106 cellules et préparé les poumons pour analyse en cytométrie en flux. PD-L1 expression de détection et blocage des cellules GFP+ , nous avons identifié un important changement dans les cellules positives par rapport à des cellules cultivées PD-L1+ in vitro (Figure 2D). Par conséquent, nous avons validé ce modèle comme un modèle de gagner du temps pour tester des modifications d’expression génique dans les cellules tumorales dans des conditions physiologiques, qui, par exemple, peuvent être utilisées pour étudier les effets des altérations génétiques ou des traitements pharmacologiques sur le PD-L1 expression dans les cellules pulmonaires AC.
Figure 1 : La transplantation de cellules de tumeur de poumon d’intratrachéale. (A), ce panneau indique l’artisanale intubation plate-forme à l’aide d’un couvercle en polystyrène, deux tubes de 15 mL et une suture de soie 6.0. (B) le fil de la fibre optique est dirigé vers la poitrine de la souris et (C) après en tirant doucement sur la languette, lumière blanche émise par l’ouverture de la trachée peut être vu. Positionnement correct (D et E) de la souris est indiqué par la lumière qui brille à travers le cathéter et peut être vérifié (F) par le mouvement vertical de l’eau placée dans une seringue de 1 mL. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Morphologie des poumons de souris après les syngéniques, intratrachéale transplantation de cellules pulmonaires AC. (A), ce panneau indique une analyse de Kaplan Meier des souris bénéficiaires après la transplantation orthotopique de différentes quantités de cellules tumorales. Le montant des cellules tumorales utilisés pour acheminer par voie intratrachéale est indiqué dans la légende de. (B) il s’agit d’une image représentative d’un poumon d’une souris bénéficiaire de cellules tumorales. Montré est le poumon d’une souris qui a reçu 5 x 105 cellules et décédé à 43 jours après la transplantation. (C), ce panneau indique un hématoxyline et éosine coloration de la section de poumon de tumeurs autochtones dix semaines après la livraison de Ad.Cre (panneau de gauche) et 6 semaines après la transplantation orthotopique de 5 x 105 cellules de tumeur (panneau de droite), y compris un grossissement plus élevé des zones indiquées (en bas). (D) le PD-L1 expression a été mesurée par cytométrie de flux à la GFP+ KP cellules après culture in vitro dans des conditions normalisées (avant la transplantation, rouge) et après une transplantation orthotopique et isolement de poumons de souris 3 semaines prise de greffe suivante (après la transplantation, bleue). Rat IgG2a PE-Cyanine7 a été utilisé comme un contrôle de l’isotype. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Afin d’étudier les manifestations physiologiques et pathologiques de poumon dans le poumon, méthodes intubation par voie intratrachéale invasive et non invasive pour l’instillation de différents réactifs sont largement utilisé26,27,28,29 ,30,31,32. Dans le domaine du cancer, les chercheurs utilisent l’intratrachéale (et par voie nasale) l’instillation de virus exprimant une recombinase-Cre à introduire des mutations somatiques dans les cellules épithéliales de poumon. L’administration d’un Ad.Cre ou un lentivirus permet l’activation conditionnelle de l’oncogène K-ras chez la souris KRAS-LSL-G12D, concomitamment avec la partie détachable de la p53 dans les cellules transduits, lorsque les souris sont élevés avec de souris p53-floxed7. La possibilité d’étudier la tumorigénèse du poumon de stade le plus précoce jusqu'à la mort de l’animal, mais aussi une grande similarité entre les tumeurs de souris et de tumeurs humaines, rend ces modèles extrêmement populaire. Cependant, d’un point de vue pratique, ce modèle nécessite la reproduction de nombreuses souris pour étudier les différents génotypes, et chez certains génotypes, expériences peuvent prendre jusqu'à un an d’induction tumorale jusqu'à ce que le point de terminaison expérimentale. Cela nécessite d’espace accru de souris et, par conséquent, les coûts pour les souris logement.
La possibilité de facilement manipuler des cellules tumorales in vitro en utilisant CRISPR-Cas9 technologie22 fait modèles transplantation orthotopique une alternative rapide pour étudier l’impact de certains gènes sur la croissance tumorale et profils d’expression de tumeur. Le marquage des cellules tumorales peut être utilisé pour la surveillance en temps réel de la croissance tumorale à l’aide d’appareils d’imagerie de cellules vivantes ou de trier des cellules tumorales selon leurs étiquettes. Cela permet également une simple quantification des cellules tumorales (c'est-à-dire le fardeau tumoral) selon leurs étiquettes. Une fois établie, cette méthode de livraison des cellules tumorales est très reproductible. Par rapport à une transplantation orthotopique par queue veine livraison, les cellules tumorales sont envoyées directement à leur milieu naturel dans les poumons, tandis que l’exposition au sang et ses composants peut modifier les propriétés de cellule de tumeur. En outre, les effets des gènes manipulés sur la survie des cellules tumorales dans la circulation sanguine et l’extravasation vers les poumons ne sont pas claires et peuvent entraîner des altérations liées à génotype dans la quantité des cellules envoyées vers les poumons.
Dans le modèle décrit ici, les tumeurs répartis symétriquement dans le poumon. Cela permet à la récolte et l’analyse des différentes lésions distinctes, par exemple, un lobe peut être soumis à analyse en cytométrie en flux comme décrit ci-dessus, si un autre lobe peut être utilisé pour l’analyse immunohistochimique, préparation lysat de poumon, etc. De plus en plus résultat de tumeurs dans la mort de la souris bénéficiaire dans les 3 à 10 semaines suivant l’accouchement par voie intratrachéale, dépend du nombre de cellules utilisées. Cela permet au chercheur d’adapter le nombre de cellules transplantées aux besoins de chacun, et plus petit nombre de cellules permettre la croissance tumorale plus longtemps et exposition cellule tumorale pour le microenvironnement. En revanche, un nombre plus élevé de la cellule peut être souhaitable pour les études pharmacologiques raccourcir le délai de livraison de drogue.
Une fois établie, l’administration intratrachéale des cellules tumorales est très reproductible. Cependant, certains points critiques sont à considérer lors de l’exécution de cette procédure. Tout d’abord, doit être prudent pour éviter d’endommager les tissus lorsque le déplacement de la languette avec la pince et, en particulier, lorsque le cathéter est inséré. Pour la mise en place du cathéter, il est essentiel que le chercheur peut voir clairement la lumière blanche pour localiser l’ouverture de la trachée. Néanmoins, par erreur, le cathéter peut être facilement inséré dans le œsophage juxtaposé. Par conséquent, nous recommandons toujours vérifier le placement correct de la sonde dans la trachée, comme décrit ci-dessus. Il est également essentiel pour éviter de placer le cathéter au profond (c'est-à-dire, le cathéter ne doit pas être placé au-dessous de la bifurcation bronchique). Ceci garantit une répartition uniforme des cellules pulmonaires et, partant, des tumeurs dans les poumons.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs aimeraient remercier Safia Zahma pour son aide avec la préparation des coupes de tissus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mouse lung adenocarcinoma cell line | isolated in house | ||
| C57Bl/6 mice | F1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks) | ||
| 129S mice | |||
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11544446 | |
| Fetal Calf Serum | Life Technologies | 11573397 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Life Technologies | 11548876 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 11539876 | |
| Trypsin, 0.25% (1x) with EDTA | Life Technologies | 11560626 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| Ketasol (100 mg/mL Ketamine) | Ogris Pharma | 8-00173 | |
| Xylasol (20 mg/mL Xylazine) | Ogris Pharma | 8-00178 | |
| BD Insyste (22 GA 1.00 IN) | BD | 381223 | |
| Blunt forceps | Roboz | RS8260 | |
| Leica CLS150 LED | Leica | 30250004 | Fibre Light Illuminator |
| Student Iris Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| DNase I (RNase-Free) | New England Biolabs | M0303S | |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100017 | |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5982-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-82 |
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