Summary
ここで非小細胞肺癌を勉強する時間とコスト削減モデルとしてマウス肺腺癌細胞の低侵襲同系同所性同種移植モデルについて述べる。
Abstract
マウス モデルの使用は様々 な疾患の病態生理を研究するため不可欠であります。肺癌に対するいくつかのモデルがあります、モデルだけでなく、移植モデルに設計遺伝子を含みます。ただし、遺伝子組み換えマウス モデルは時間がかかり、高価ないくつかの同所性同種移植モデルが再現しにくいに対しです。ここでは、代替同所性同種移植モデルとして肺腫瘍細胞の非侵襲的な気管の配信方法は記述されています。マウス肺腺癌細胞と同系移植の受信者の使用は、完全にアクティブな免疫システムの存在下で腫瘍を勉強できます。さらに、腫瘍の遺伝子操作は細胞移植になりますこのモデル, 腫瘍の増殖や腫瘍細胞の遺伝子発現の遺伝的要因の影響を研究する魅力的な時間節約アプローチは生理的条件下でプロファイルする前に。それ肺腺癌細胞を示す本モデルを用いた T 細胞サプレッサーの増加レベルを表現は、in vitro における栽培と比較して、自然の環境で栽培されたは死リガンド 1 (PD L1) プログラム。
Introduction
肺がんは男性と女性の両方の1で最大の癌関連キラーではまだまだです。確かに、アメリカの癌協会によると毎年多くの人々 は胸、前立腺および結腸癌の一緒に1のよりも肺癌で死ぬ。肺がんの最も豊富なサブタイプは、非小細胞肺癌 (NSCLC) 患者の大半が血管新生の主の最初の行設定でプラチナ ベースの化学療法で治療された最近まで、阻害剤2。患者のサブセットのみ未分化リンパ腫キナーゼ (アルク) または ROS1、上皮成長因子受容体 (EGFR) の発癌性突然変異を隠すし、利用可能なターゲット薬3,4と扱うことができます。免疫チェックポイント阻害剤の出現により、今までは、患者の 20-40% だけは免疫療法5に応答が、肺癌患者に新たな希望が生じた。それ故に、さらに研究は免疫チェックポイント療法を微調整し、組合せ治療オプションを調査してこの結果を改善するために必要です。
肺癌の研究、前臨床モデルの広大な配列があります、モデル (ジェム) の条件付きのアクティブ化後、土着の腫瘍が発生するの化学物質や発ガン性物質や遺伝子組み換えマウスによって引き起こされる自発的なモデルを含む遺伝子および/または腫瘍サプレッサーの遺伝子6,7,8の不活化。これらのモデルは、肺腫瘍の開発の基本的なプロセスを調査する特定の値が、繁殖、広範なマウスも必要になります、実験は時間がかかる。したがって、潜在的な阻害を評価する多くの研究はひと肺癌細胞株を免疫不全マウス9注入皮下皮下 (患者由来) 異種移植モデルの利点を取る。
これらのモデルで腫瘍の micromilieu は必要に応じては表されませんしたがって、研究者も使用する同所性同種移植モデルどこ肺実質10、11,12,13に静脈内投与、intrabronchially、または直接に、腫瘍細胞が挿入され、 14,15,16,17,18,19,20。これらのメソッドのいくつかは、技術的に困難な再現して研究者の集中的な訓練を必要とすることは困難です。21ここで我々 は非侵襲的な同所性気管移植による免疫マウス、腫瘍が 3 ~ 5 週間以内に開発して、T 細胞の発現を誘導するために、人間の腫瘍の重要な類似を表わす、適応抑制プログラム死リガンド 1 (PD L1) 腫瘍の細胞。11,12,20マウス腫瘍細胞の使用に由来するジェム モデルと同系の受信者マウスが免疫細胞を含む腫瘍微小環境の適切な研究をします。さらに、体外移植肺腫瘍の遺伝要因の影響の調査を容易にする前に、遺伝子編集 CRISPR/Cas9 技術22のようなツールは使用できます。
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Protocol
下を通りのすべて実験的プロトコルは倫理的なガイドラインに従ってくださいし、オーストリア連邦省の科学、研究および経済によって承認されました。
注:ここでのプロトコルは、同系の受信者にマウス肺腺癌細胞の同所性同種移植モデルをについて説明します。セルは KrasLSL G12Dの腫瘍肺から分離することが: p53フロリダ州/フロリダ(KP) マウス7,18, 利用可能な場合、社内と同じ背景とセックスのマウスに移植しました。セルは、他の研究グループから提供された、正確なバック グラウンドは不明のまま、最大許容値を保証する移植の C57BL/6 と 129S マウス間のクロスの F1 世代の使用お勧めします。
1. セル準備
- 種子 KP 細胞 10% ウシ胎仔血清 (FCS)、グルタミン、100 U/mL ペニシリンと 100 μ g/mL ストレプトマイシン (以下、標準培養液) を添加した RPMI で約 50% の confluency に移植する前に 24 時間の。37 ° C、5% CO2約 95% の細胞培養を孵化させなさい相対湿度。
- 次の日に 10 cm プレートあたり 5 分の 1 mL のトリプシン-EDTA (0.05% リン酸緩衝生理食塩水 [PBS]) を使用してセルを収穫し、その後、9 ml の標準培養液中の剥離細胞を再懸濁します。
- 診断でセルをカウントし、50 mL コニカル遠心管中の実験に必要なセルの数を転送します。
注: 2.5 105 x と 1 x 106 KP あたりマウス細胞を移植をお勧めしますが、これは研究者のニーズに基づいた適応かもしれない。 - その後、300 x gで 5 分間細胞を遠心、上清を吸引し、ピペットを使用して、血清および抗生物質無料 RPMI で (吸入マウスあたり 1 x 106 KP 細胞) の 2 × 107/mL の密度で細胞を再懸濁します、0.01 M エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を添加しました。
- 移植まで氷の上細胞を保ちます。
2. 同所性同種移植気管内配送で
- ケタミン (100 mg/kg 体重) とキシラジン (10 mg/kg 体重) の混合物の皮下注入によるマウス (8-12 週齢) を落ち着いた。
- 麻酔で設定し、挿管カテーテルを準備します。したがって、単にはさみで端を切断することによってカテーテルの針を鈍らせます。その後、針の端に完全にカテーテルをプッシュします。
- ペダル反射を介してしっかりつま先が締めつけることにより適切な麻酔レベルを確認し、眼軟膏を目に適用します。
- 縫合糸で、上顎中切歯をフックして挿管プラットフォーム (図 1 a) でマウスを修正し、胸が縫合下に垂直であることを確認します。
- 胸 (図 1 b) を照らすにフロントの足の間に光ファイバー ケーブルを配置します。
- 慎重にマウスの口を開くし、消毒フラット鉗子を使用して舌を抜きます。喉頭喉頭蓋と披裂軟骨 (図 1) を視覚化して白色光の放出を探します。
- 気管の開口部がはっきりと見えると、カチッとカテーテルに気管 (図 1)。挿入するカテーテルの長さは、それは肺内腺癌細胞、肺の均一な分布を保証する分岐下行ってはならないので年齢や、動物のサイズによって異なります。すぐにカテーテルから針を抜きます。
- 気管内カテーテルの適切な配置は、白色光輝いているカテーテル (図 1E) によって示されます。気管内カテーテルの位置を確認するために、カテーテルに水を含む 1 mL 注射器を接続します。注射器で水は、呼吸 (図 1 f) に従って上下に急速に移動します。
注:経験豊富な研究者によっては、この手順を省略できます。 - チューブを手で保持することによって細胞懸濁液を温めるし、その後、カテーテルのハブの中心に 1 × 106セル (セルの数は変数にあります) を含む懸濁液 50 μ L をピペットします。懸濁液はすぐに吸引されます。その後、1 mL 注射器を接続し、肺内の一貫性のある配信を確保するために空気の 300 μ L を分注します。
- ゆっくりカテーテルを削除、挿管のプラットフォームから、マウスを削除、それが麻酔から回復するまで熱パッドの上に置きます。
3. フローサイトメトリー用肺準備
- 目的の実験的エンドポイントでケタミン (100 mg/kg 体重) とキシラジン (10 mg/kg 体重) の混合物の皮下注射によってマウスを落ち着いたし、頚部転位によって安楽死させます。
- 死体を 70% エタノールに浸漬し、テープを使用して解剖ボード上でマウスを固定します。
- 腹側正中切開を行い、軽く胸壁筋肉および腹部臓器を公開するために皮膚を反転します。横隔膜を穿刺、胸腔内を公開するハサミで肋骨を切る。
- 3 肺灌流を残して左心室に小さな開口部を切断した後 27 G の針を使用して血を許可する右心室を介して氷冷 PBS の ml の 6-8 倍。肺は血と完全に白にクリアされます。
- 肺を取り出し、はさみを使用して小さな断片に葉をみじん切り。2 mL 遠心チューブに肺部分を転送および肺消化バッファーの 1.5 mL でそれを孵化させなさい (RPMI、5% の FCS 150 U/mL コラゲナーゼ ・ 50 U/mL DNase 私)。
- 孵化させなさい肺個セット定数揺れと 37 ° C で 30-60 分。
- 70 μ m 携帯こし器を通って肺細胞懸濁液を 50 mL のチューブに転送します。滅菌 10 mL 注射器の背面とストレーナーをオフ、15 ml の 2% の FCS と PBS のストレーナーをすすいでください。
- 4 ° C で 5 分間 300 x gで細胞を遠心し、上清を吸引します。アンモニウム塩化カリウム (ACK) 溶解バッファーの 1 mL の細胞を再懸濁し、残留赤血球の換散のため室温で 5 分間インキュベートします。
- 4 ° C で 5 分間 300 x gで細胞を遠心し 2% の FCS と PBS の 1 mL の細胞を再懸濁します、流れの cytometry の23の目的の汚損のプロトコルに進みます。
注:30 %fcs と 10 %dmso を含む RPMI で別の方法として、セルが可能性があります再停止されると凍結凍結コンテナーを使用して、後で分析。
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Representative Results
腫瘍微小環境の PD L1 の発現を刺激するかどうかをテストする気管内腫瘍細胞配信を通じて同所性同種移植モデルを使用しました。したがって、10 週間後腫瘍誘導に Cre リコンビナーゼ発現アデノ ウイルス (Ad.Cre) 配信24土着 KP モデル (KP 細胞) からマウス肺 AC 細胞を分離しました。その後、肺は、緑色蛍光タンパク質 (GFP) を用いた AC 細胞をラベル付け-気管内配信を介して免疫、同系マウスにそれらにしみ込んでレンチ ウイルス25とがんを表現します。モデルを検証するため、我々 は腫瘍細胞の量が異なるを移植し、生存分析を行った。予想通り、受信者のマウスの生存率の明らかな移植細胞数に相関を示したし、2 x 10 の6セルの受信者に対して 2 週間と 10 週間くらい 2.5 x 10 の5細胞 (図 2 a) の受信者の間生存期間であった。肺は、生存時間解析用マウスの死に続く解剖され、我々 腫瘍結節 (図 2 b) 肺のすべての葉全体の均一な分布に気づいた。腫瘍の形態に関する比較した土着の KRASG12D移植腫瘍-腫瘍7を駆動 (図 2) の明らかな違いに気付かなかったと。
移植した腫瘍細胞の PD L1 表現を勉強するには、は、安楽死の受信者マウス 1 x 10 の6セルの移植後 3 週間とフローサイトメトリーによる解析のため肺に準備します。培養細胞と比較して PD L1+陽性細胞に大きな変化がわかりました PD L1 式のプローブと GFP+細胞のゲーティング、の in vitro (図 2 D)。例えば、遺伝子変異や PD L1 の薬理学的治療の効果を調査する使用可能な生理学的条件下での腫瘍細胞の遺伝子発現をテストする時間を節約モデルとしてこのモデルを検証しましたので、AC 肺細胞内の式。
図 1: 気管肺腫瘍細胞移植します。ポリスチレン蓋、15 mL の 2 つの管と 6.0 絹糸を使用してこのパネル自家製番組の挿管 (A) プラットフォームです。光芯線 (B) マウスと (C) の胸に優しく舌を抜き後、指示は、気管の開口部から白い光を見ることができます。マウスの (DおよびE) の適切な配置は、カテーテルを通して輝く光で示され、検証済み (F) 水の上下の動きで 1 mL 注射器に配置することができます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: マウス肺次の同系は、AC の肺細胞気管移植の形態。(A) このパネルが受信者のマウス腫瘍細胞量の同所性同種移植のカプラン Meier 分析結果を表示します。気管内の配達のため使用される腫瘍細胞の量はの凡例に示されます。(B) これは受信者マウス腫瘍細胞の肺の代表的な写真です。5 x 10 の5セルを受信、故人の 43 日間移植マウスの肺には表示されます。(C) このパネルを示しますのヘマトキシリン ・ エオシン染色土着腫瘍の肺セクションの次の Ad.Cre 配信 (左側のパネル) と 5 x 105腫瘍細胞 (右側のパネル) の同所性同種移植を次の 6 週間 10 週間指定されたエリア (下) の高倍率を含みます。(D)、PD-L1 GFP+ KP でフローサイトメトリーを用いて式 (移植、赤) の前に標準的な条件下で培養細胞から分離・同所性同種移植マウス肺 3 週間後次生着 (移植, 青)。ラット IgG2a PE Cyanine7 は、アイソタイプ コントロールとして使用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
肺の肺生理学的および病理学的イベントを研究するには、様々 な試薬の注入のための侵襲的、非侵襲的な気管内挿管法が広く使われている26,27,28,29 ,30,31,32。がん分野で研究者は、気管を使用 (および鼻腔内) 肺上皮細胞における体細胞突然変異を導入する Cre リコンビナーゼ発現ウイルスの注入。P53 floxed マウス7でマウスを飼育している場合 Ad.Cre またはレンチ ウイルスの管理は KRAS LSL G12D マウス、付随して導入された細胞における p53 のノックアウトの発癌性 K ‐ ras の条件付き活性化をことができます。マウス腫瘍と人間の腫瘍の高い類似性と同様に、動物の死に至るまでの初期の段階から肺腫瘍を勉強することは、非常に人気のあるこれらのモデルになります。しかし、実用的な観点からこのモデルは、異なる遺伝子型を勉強する広範なマウス繁殖を必要があります、いくつかの遺伝子型で実験かかることがあります年に実験的エンドポイントまでの腫瘍誘導から。増加マウス領域が必要ですし、したがって、費マウス住宅。
簡単に CRISPR Cas9 技術22を使用して腫瘍細胞を操作する可能性は、腫瘍の増殖と腫瘍発現プロファイルの選択した遺伝子の影響を研究する簡単な選択肢を同所性同種移植モデルになります。腫瘍細胞へのタグ付けは、生きているセルの撮像素子を使用して腫瘍増殖またはそのタグによって腫瘍細胞を並べ替えるために、リアルタイムの監視を使用できます。また、そのラベルによると腫瘍細胞 (すなわち、腫瘍負担) の簡単な定量化できます。いったん確立すれば、この腫瘍細胞の配信方法は再現性が高いです。尾経由で同所性同種移植と比較して配信を静脈、腫瘍細胞は腫瘍のセルのプロパティを変更することが血とそのコンポーネントへの暴露に対し肺、自然環境に直送します。さらに、血流と肺に血管外漏出に腫瘍細胞の生存に及ぼす操作遺伝子は明確ではないと、肺に配信されるセルの量の遺伝子型に依存した変化があります。
ここで説明するモデルで腫瘍肺全体に広がる対称。これにより、別の収穫と異なる病変の解析、1 つ葉が流れフローサイトメトリー解析を受けることが免疫組織化学的解析、肺ライセート調製の別葉を使用できますが、上記のよう例えば、等.使用セル数に依存して以下の気管内配信 3-10 週間で受信者のマウスの死で腫瘍の結果を育っています。これにより、個々 のニーズに移植された細胞の数に適応する研究者とより小さいセル数を増やすと長い腫瘍の増殖と腫瘍細胞曝露における微小環境。その一方で、高い細胞数は薬剤投与の期間を短縮する薬理学的研究の必要があります。
いったん確立すれば、腫瘍細胞の気管内投与は再現性が高いです。ただし、この手順を実行するときに考慮するいくつかの重要なポイントがあります。最初に、組織の損傷を避けるためカテーテルが挿入されるとき舌を鉗子で把持し、特に、移動させるときに注意が必要があります。カテーテルの配置、研究者が気管の開口部を見つけるに白色光を見ることができる明らかに不可欠です。それにもかかわらず、間違えて、カテーテル簡単に挿入できる並置の食道。したがって、上記のように気管内カテーテルの適切な配置を常にチェックをお勧めします。ディープにカテーテルを置くことを避けるために重要です (すなわち、カテーテルは気管支分岐下配置する必要がありますできません)。これは肺細胞の均一な分布を保証と、それゆえ、肺の中の腫瘍。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、ティッシュ セクションの準備で彼女の助けのサフィア Zahma を感謝したいです。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mouse lung adenocarcinoma cell line | isolated in house | ||
| C57Bl/6 mice | F1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks) | ||
| 129S mice | |||
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11544446 | |
| Fetal Calf Serum | Life Technologies | 11573397 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Life Technologies | 11548876 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 11539876 | |
| Trypsin, 0.25% (1x) with EDTA | Life Technologies | 11560626 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| Ketasol (100 mg/mL Ketamine) | Ogris Pharma | 8-00173 | |
| Xylasol (20 mg/mL Xylazine) | Ogris Pharma | 8-00178 | |
| BD Insyste (22 GA 1.00 IN) | BD | 381223 | |
| Blunt forceps | Roboz | RS8260 | |
| Leica CLS150 LED | Leica | 30250004 | Fibre Light Illuminator |
| Student Iris Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| DNase I (RNase-Free) | New England Biolabs | M0303S | |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100017 | |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5982-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-82 |
References
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