Summary
여기 우리는 비 작은 세포 폐 암 공부 시간 및 비용 절감 모델 마우스 폐 선 암 세포의 침 습 syngeneic orthotopic 이식 모델을 설명 합니다.
Abstract
마우스 모델의 사용은 다양 한 질병의 병 태 생리학 공부를 위한 불가결. 폐암에 관하여 몇 가지 모델을 사용할 수 있습니다, 그리고 유전자를 포함 하 여 설계 모델 뿐만 아니라 이식 모델. 그러나, 유전자 조작된 마우스 모델은 어렵고 비싼, 일부 orthotopic 이식 모델은 재현 하기 어려운 반면. 여기, 대체 orthotopic 이식 모델로 폐 종양 세포의 비-침략 적 intratracheal 전달 방법 설명 되어 있습니다. 마우스 폐 선 암 세포 및 syngeneic 이식 받는 사람을 사용 하 여 완전히 활성 면역 체계의 존재 아래 tumorigenesis 공부 수 있습니다. 또한, 종양의 유전자 조작 세포 이식 게 생리 적인 조건 하에서 프로이 모델 종양 성장과 종양 세포 유전자 발현에 유전 요인의 영향을 공부 하는 매력적인 시간 절약 접근 하기 전에. 우리는 폐 선 암 셀 표시이 모델을 사용 하 여 T 세포 억제기의 빠른 증가 수준 생체 외에서 재배에 비해 그들의 자연 환경에서 성장 하는 때 죽음-ligand 1 (PD-L1) 프로그램.
Introduction
폐암은 아직까지 남자와 여자 둘 다1에서 가장 큰 암 관련 살인자 이다. 실제로, 미국 암 협회에 따르면 매년 유 방, 전립선, 결 장 암 함께1보다 폐암의 다이 더 많은 사람들이. 최근까지, 비 작은 세포 폐암 (NSCLC)는 폐암의 가장 풍부한 하위에서에서 고통 받는 환자의 대부분 주로 신생의 추가 함께 첫 줄 속에서 백 금 기반의 화학 요법으로 치료 했다 억제제2. 환자의 부분 집합 anaplastic 림프 종 키나 제 (ALK), 또는 ROS1, 표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR), 종양 돌연변이 비호 하 고 사용할 수 있는 대상 약3,4대우 될 수 있다. 검사점 면역 억제제의 도래와 함께 폐 암 환자에 대 한 새로운 희망이 생겨났다, 비록 지금까지만 20-40%의 환자는 면역 치료5에 응답. 따라서, 추가 연구 필요 면역 검사점 치료를 미세 조정 하 고 조합 치료 옵션을 조사 하 여이 결과 개선 합니다.
폐암 연구, 전 임상 모델의 광대 한 배열을 사용할 수 있습니다, 그리고 자발적인 모델 등 모델 (GEMM) 학위 종양의 조건부 활성화 다음 발생 화학 물질과 발암 물질과 유전자 조작된 마우스에 의해 실행 oncogenes 또는 종양 억제기 유전자6,,78의 비활성화. 이 모델은 폐 종양 개발의 기본 프로세스를 조사 하기 위해 특정 값의 하지만 그들은 또한 광범위 한 쥐 사육, 요구 그리고 실험은 시간이 걸리는. 따라서, 많은 연구 잠재적인 억제제 평가 활용 피하 (환자-파생)이 종이 식 모델 immunodeficient 마우스9에 인간의 폐 암 세포 라인은 피하 주입.
이 모델에서 종양의 micromilieu 표시 되지 않습니다 따라; 따라서, 연구원은 또한 orthotopic 이식 모델 사용, 어디 종양 세포는 주입 정 맥, intrabronchially, 또는 직접 폐 실질10,,1112,13, 14,15,16,17,18,,1920. 이러한 메서드 중 일부는 기술적으로 도전적인, 재현할 수 및 연구자의 집중적인 훈련을 필요로입니다. 21 여기 우리는 비-침략 적 orthotopic immunocompetent 쥐, 종양 3-5 주 이내 개발과 인간의 종양, T-세포의 표현을 유도 하에 상당한 유사성을 전시에 intratracheal 이식 방법 적응 억압 죽음-ligand 1 (PD-L1) 종양 세포에 프로그램. 11 , 12 , GEMM 모델에서 파생 된 20 마우스 종양 세포를 사용 하며 syngeneic 받는 사람 마우스 면역 세포를 포함 하 여 종양 microenvironment의 적절 한 공부 또한, CRISPR/Cas9 기술22 같은 도구를 편집 하는 유전자 생체 이식 폐 tumorigenesis에서 유전적 요인의 영향의 조사를 용이 하 게 하기 전에 사용할 수 있습니다.
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Protocol
모든 실험 프로토콜 개요로 아래 윤리 지침 그리고 과학의 오스트리아 연방 정부, 연구 및 경제에 의해 승인 했다.
참고: 여기에 프로토콜 syngeneic 받는 사람으로 orthotopic 이식 모델을 마우스 폐 선 암 셀을 설명합니다. 셀 KraLSL-G12D의 종양-베어링 폐에서 격리 될 수 있습니다: p53fl/플로리다 (KP) 마우스7,18, 가능한 경우 사내, 그리고 동일한 배경 및 섹스의 쥐로 이식. 셀 다른 연구 그룹에서 제공 하는 경우 정확한 배경을 알 수 없는 남아 최대한 관용을 보장 받는 이식으로 C57BL/6와 129S 쥐 사이 십자가의 F1 세대의 사용을 권장 합니다.
1. 세포 준비
- 씨앗 KP RPMI 보충 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 글루타민, 및 100 U/mL 페니실린 및 100 μ g/mL 스 (표준 문화 매체 라 함)에 약 50 %confluency 이식 하기 전에 24 h 세포. 37 ° C, 5% CO2, 그리고 약 95%에서 세포 배양 품 어 상대 습도.
- 다음 날에서 10 cm 접시 당 5 분에 대 한 트립 신-EDTA (인산 염 버퍼 염 [PBS]에 0.05%)의 1 mL를 사용 하 여 셀을 수확 하 고 그 후, 표준 문화 매체의 9 mL와 분리 된 세포를 resuspend.
- hemocytometer 셀 고 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 실험에 필요한 셀의 수를 전송.
참고: 105 x 2.5와 1 x 106 KP 사이 마우스, 당 세포를 이식 하는 것이 좋습니다 있지만 연구자의 요구에 따라이 적응 될 수도 있습니다. - 그 후, 300 x g에 5 분에 대 한 셀을 원심, 상쾌한, 발음 그리고, 혈 청 RPMI 항생제 무료에서 2 x 107/mL (1 x 106 KP 셀 마우스 당 흡입)에 대 한의 밀도에 셀 resuspend는 피 펫을 사용 하 여, 0.01 M ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 보충.
- 얼음에 세포 이식까지 유지.
2. Orthotopic 이식 Intratracheal 배달을 통해
- 케 타 민 (100mg/kg의 몸 무게)와 xylazine (체중의 10mg/kg)의 혼합물의 피하 주입에 의해 마우스 (나이 8-12 주)을 진정.
- 마 취 설정, 삽 관 법에 대 한 카 테 터를 준비 합니다. 따라서, 단순히가 위 끝을 절단 하 여 카 테 터의 바늘을 둔. 그 후, 테를 완전히 밀어 바늘의 끝.
- 페달 반사를 통해 회사 발가락 곤란 하 여 마 취의 적절 한 수준을 확인 하 고 눈에 안과 연 고를 적용.
- 삽 관 법 플랫폼 (그림 1A)에 봉합을 통해 그것의 위 앞 니를 연결 하 여 마우스를 해결 하 고 가슴은 봉합 아래 수직 확인.
- 광섬유 케이블을 (그림 1B) 가슴을 밝히는 앞 다리 사이 놓습니다.
- 신중 하 게 마우스의 입을 열고 소독된 플랫 집게를 사용 하 여 혀를 꺼내. 후 두를 찾아서 후두개와 arytenoid 연골 (그림 1C) 시각화 하얀 빛의 방출에 대 한 보세요.
- 기도의 오프닝은 명확 하 게 보이는, 일단 기도 (그림 1D)으로 테 밀어 부드럽게. 이후 선 암 세포는 폐 내 폐의 동등한 배급을 보장 하기 위해 분기 아래 갈 하지 삽입 카 테 터의 길이 나이 및 동물의 크기에 따라 달라 집니다. 빨리 테에서 바늘을 제거 합니다.
- 기도에 카 테 테 르의 적절 한 배치 (그림 1E) 카 테 터를 통해 빛나는 하얀 빛으로 표시 됩니다. 기도에 카 테 터의 위치를 확인 하려면 포함 된 카 테 터를 물 1 mL 주사기를 연결 합니다. 주사기에 물 급속 하 게 호흡 (그림 1 층)에 따라 아래로 이동 합니다.
참고: 숙련 된 연구자에 의해이 단계를 생략할 수 있습니다. - 세포 현 탁 액을 손으로 튜브를 개최 하 여 따뜻하고, 그 후, 플라스틱 카 테 터 허브의 센터에 1 x 106 셀 (셀 수 변수를 수 있습니다)를 포함 하는 서 스 펜 션의 50 µ L. 정지는 즉시 발음 될 것입니다. 그 후, 1 mL 주사기를 연결 하 고 300 µ L 폐 내에서 일관성 있는 배포를 보장 하기 위해서 공기의 분배.
- 부드럽게 카 테 터를 제거, 삽 관 법 플랫폼에서 마우스를 제거 하 고 마 취에서 복구 될 때까지 열 패드에 그것을 넣어.
3. 폐 Cytometry에 대 한 준비
- 원하는 실험 끝점에서 케 타 민 (100mg/kg의 몸 무게)와 xylazine (체중의 10mg/kg)의 혼합물의 피하 주사를 하 여 마우스를 진정 하 고 자 궁 경부 전위에 의해 안락사.
- 70% 에탄올에는 시체를 흡수 하 고 테이프를 사용 하 여 해 부 보드에 마우스를 확보.
- 복 부 정중 선 절 개 하 고 흉 벽 근육과 복 부 장기 노출에 피부를 부드럽게 반전. 찔린 격 막 및 늑 골 흉 강 폭로 위로 잘라.
- Perfuse 폐 3 x 6-8 mL를 떠나 혈액 수 있도록 좌 심 실에 있는 작은 개통을 절단 후 27 G 바늘을 사용 하 여 우 심 실을 통해 얼음 처럼 차가운 PBS의. 폐는 혈액과 차례 완전히 흰색의 허가 한다.
- 폐를 꺼내와 위를 사용 하 여 작은 조각으로 돌출부를 말하다. 2 mL microcentrifuge 튜브를 폐 조각을 전송 하 고 폐 소화 버퍼의 1.5 mL에서 품 어 (RPMI, 5% FCS 150 U/mL 콜라, 그리고 50 U/mL DNase I).
- 품 어 폐 조각 30-60 분 37 ° C에서와 지속적인 떨고.
- 50 mL 튜브에 폐 세포 현 탁 액 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 전송. 살 균 10 mL 주사기의 뒤를 가진 스 트 레 하 고 2% fcs PBS의 15 mL와 여과기를 헹 굴.
- 300 x g 4 ° C에서 5 분 동안에 세포를 원심 고는 상쾌한 발음. Resuspend 염화 염화 칼륨 (ACK) lysing 버퍼의 1 mL에 셀 하 고 잔여 적혈구는 세포에 대 한 실 온에서 5 분에 대 한 그들을 품 어.
- 300 x g 4 ° C에서 5 분 동안에 세포를 원심 하 고 2% fcs PBS의 1 mL에 셀 resuspend 흐름 cytometry23원하는 얼룩 프로토콜 진행.
참고: 30 %FCS 10 %DMSO 포함 된 RPMI에 세포를 resuspended 수 있습니다 또는 나중에 분석 냉동 컨테이너를 사용 하 여 냉동 고.
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Representative Results
우리는 종양 microenvironment 자극 PD L1 식 여부를 테스트 하려면 intratracheal 종양 세포 배달을 통해 orthotopic 이식 모델을 사용. 따라서, 우리는 학위 KP 모델 (KP 셀)에서 마우스 폐 AC 셀 Cre recombinase 표현 하는 아 데 노 바이러스 (Ad.Cre) 배달24통해 종양 유도 따라 10 주를 고립. 그 후, 우리는 폐 녹색 형광 단백질 (GFP)를 사용 하 여 AC 셀 표시-intratracheal 배달을 통해 immunocompetent, syngeneic 마우스에 그들을 engrafted lentivirus25 와 orthotopically. 모델의 유효성을 검사 하려면 우리 서로 다른 양의 종양 세포를 이식 하 고 생존 분석을 수행. 받는 사람 마우스의 생존 engrafted 셀 개수에 상관은 예상 했던 대로, 그리고 생존 시간 2 x 106 세포의 받는 사람에 대 한 2 주 및 2.5 x 105 셀 (그림 2A)의 받는 사람에 대 한 약 10 주 사이. 폐 생존 분석에 사용 되는 쥐의 죽음 다음 해 부 했다, 우리는 (그림 2B) 폐의 모든 돌출부에 걸쳐 종양 작은 혹의 동등한 배급을 발견. 종양의 형태에 관한 우리 비교 autochthonous KRAG12D와 이식된 종양-종양7 구동 어떤 확실 한 차이 (그림 2C)을 통보 하지 않았다.
이식된 종양 세포의 PD L1 식 공부, 우리는 안락사 받는 사람 마우스 1 x 106 세포의 이식 후 3 주 하 고 흐름 cytometric 분석에 대 한 폐를 준비. PD L1 식 대와 GFP+ 셀 게이팅, 우리 PD L1+ 세포 배양에 비해 긍정적인 세포에 상당한 변화 확인 체 외 (그림 2D). 따라서, 우리 생리 조건, 예를 들어, 유전 변경 또는 PD L1에 약물 치료의 효과 조사 하기 위해 사용 될 수 있는 종양 세포에 유전자 표현 변경에 대 한 테스트를 시간 절약형 모델이이 모델 확인 폐 AC 셀에 식입니다.
그림 1 : Intratracheal 폐 종양 세포 이식. (A) 패널 쇼 집에서 만든 삽 관 법이 플랫폼 폴리스 티 렌 뚜껑, 두 15 mL 튜브 6.0 실크 봉합 사를 사용 하 여. (B) 섬유 광섬유 와이어는 부드럽게 혀를 꺼내 후 마우스 및 (C)의 가슴에 지시 된다, 기도의 오프닝에서 나오는 하얀 빛을 볼 수 있다. 마우스의 적절 한 배치 (D 및 E) 카 테 터를 통해 빛나는 빛에 의해 표시 되 고 1 mL 주사기에 확인된 (F) 물의 위아래 움직임에 의해 배치 될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 마우스 폐 syngeneic, 다음 폐 AC 셀의 intratracheal 이식의 형태. (A)이이 패널 다음 다른 양의 종양 세포의 orthotopic 이식 받는 사람 마우스의 카 플 란 Meier 분석을 보여줍니다. Intratracheal 전달에 사용 하는 종양 세포의 양은범례에 표시 됩니다. (B) 이것은 종양 세포 받는 사람 마우스의 폐의 대표 사진입니다. 표시 하는 것은 5 x 105 셀을 받은 고 고 인 43 일 이식 마우스의 폐입니다. (C)이이 패널 표시 되며 고 오신 얼룩 autochthonous 종양의 폐 섹션의 Ad.Cre 배달 (왼쪽된 패널)와 6 주 5 x 105 종양 세포 (오른쪽 패널)의 orthotopic 이식 다음 다음 10 주 지정 된 영역 (아래)의 더 높은 확대를 포함 하 여. (D)는 PD-L1 식 cytometry GFP+ KP에에서 의해 측정 되었다 재배 (이식, 빨간색)을 사용 하기 전에 표준 조건 하에서 생체 외에서 다음 세포 orthotopic 이식 및 절연 마우스 폐 3 주 후 (이식, 블루) 후 다음 engraftment입니다. 쥐 IgG2a PE-Cyanine7 isotype 컨트롤로 사용 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
공부 하 고 폐에서 폐 생리 및 pathologic 행사, 다양 한 시 약의 문제에 대 한 침략과 비-침략 적 intratracheal 삽 관 법 메서드는 널리26,,2728,29 ,30,,3132. 암 분야에서 연구자는 intratracheal 사용 (및 intranasal) 폐 상피 세포에 체세포 돌연변이 소개 하 Cre recombinase 표현 하는 바이러스의 주입. Ad.Cre 또는 lentivirus 관리 하면 종양 K-ras의 조건부 활성화 불리고 세포에서 p53 녹아웃으로 수반 KRA-LSL-G12D 마우스에 마우스 p53-floxed 마우스7사육 된다. 마우스 종양과 인간의 종양 사이 높은 유사성 뿐 아니라 동물의 죽음까지 초기 단계에서 폐 tumorigenesis 연구 가능성 매우 인기 이러한 모델을 만든다. 그러나, 실용적인 관점에서이 모델에서는 다른 genotypes 공부 광범위 한 마우스 사육 하 고 일부 genotypes에서 실험까지 걸릴 수 있습니다 1 년 실험 끝점까지 종양 유도에서 키를 누릅니다. 이 증가 마우스 공간을 필요로 하 고, 따라서, 비용에 대 한 마우스 주택.
쉽게 CRISPR Cas9 기술22 를 사용 하 여 종양 세포를 체 외 조작 가능성 orthotopic 이식 모델 빠른 대안 종양 성장과 종양 식 프로필에 선택 된 유전자의 영향을 공부 하 게. 종양 세포의 태그 라이브 셀 감시를 사용 하 여 종양의 성장 또는 종양 세포 그들의 태그에 따라 정렬 하려면 실시간 모니터링에 사용할 수 있습니다. 이 또한 그들의 상표에 따라 종양 세포 (즉, 종양 짐)의 쉬운 정량화에 대 한 수 있습니다. 일단 설립,이 종양 세포 전달 방법은 매우 재현입니다. 꼬리를 통해 orthotopic 이식에 비해 배달 정 맥, 혈액 및 그 구성 요소에 노출 종양 셀 속성을 변경할 수 있습니다 반면 종양 세포 폐, 그들의 자연적인 환경에 직접 전달 합니다. 또한, 종양은 혈 류와 폐에 넘쳐 흐름에 세포 생존에 조작된 유전자의 효과 명확 하지 않다 고 폐에 전달 하는 셀의 수량에 유전자 형에 따라 변경 될 수 있습니다.
여기서 설명 하는 모델에서 종양 대칭으로 폐에 걸쳐 확산. 그러면 별도 수확 및 다른 장애의 분석, 예를 들어, 한 엽 대상이 될 수 있는 교류 cytometry 분석 immunohistochemical 분석, 폐 lysate 준비, 다른 엽을 사용할 수 있지만 위에서 설명한 대로 등. 사용 하는 셀의 수에 따라 받는 사람 마우스의 죽음 다음 intratracheal 납품, 3-10 주 이내에 종양 결과 성장. 그러면 개별 요구에 이식된 세포의 수를 적응 시켜야 연구원 그리고 작은 셀 숫자 허용 더 이상 종양 성장과 종양 세포 노출 하는 microenvironment. 다른 한편으로, 약물 전달의 기간 단축을 약리학 적인 연구에 대 한 높은 셀 수를 원하는 수 있습니다.
일단 설립, 종양 세포의 intratracheal 관리는 높은 재현. 그러나, 몇 가지 중요 한 포인트는이 절차를 수행할 때 고려해 야 할 있다. 첫째, 주의 카 테 터를 삽입 하는 경우는 집게와, 특히, 혀를 전치 하는 때 조직 손상을 피하기 위하여 취해야 한다. 카 테 터의 위치에 대 한 연구원 분명 기도의 열기를 찾으려고 하얀 빛을 볼 수 있습니다 필수적 이다. 그럼에도 불구 하 고, 실수로, 테 수 쉽게 삽입 될 juxtaposed 식도. 따라서, 항상 위에서 설명한 대로 기도에 카 테 터의 정확한 위치를 확인 하는 것이 좋습니다. 또한 깊은 카 테 터를 배치 하지 않으려면 필수적 이다 (즉, 테 하지 두어야 한다 기관지 분기점 아래). 이 폐 세포의 동등한 배급을 보장 하 고, 따라서, 폐에 걸쳐 종양.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 Safia Zahma 그녀의 조직 단면도의 준비에 대 한 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mouse lung adenocarcinoma cell line | isolated in house | ||
| C57Bl/6 mice | F1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks) | ||
| 129S mice | |||
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11544446 | |
| Fetal Calf Serum | Life Technologies | 11573397 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Life Technologies | 11548876 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 11539876 | |
| Trypsin, 0.25% (1x) with EDTA | Life Technologies | 11560626 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| Ketasol (100 mg/mL Ketamine) | Ogris Pharma | 8-00173 | |
| Xylasol (20 mg/mL Xylazine) | Ogris Pharma | 8-00178 | |
| BD Insyste (22 GA 1.00 IN) | BD | 381223 | |
| Blunt forceps | Roboz | RS8260 | |
| Leica CLS150 LED | Leica | 30250004 | Fibre Light Illuminator |
| Student Iris Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| DNase I (RNase-Free) | New England Biolabs | M0303S | |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100017 | |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5982-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-82 |
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