Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Funksjonell karakteristikk av Carboxylesterases i insektmiddel resistente hus fluer, Musca Domestica

Published: August 23, 2018 doi: 10.3791/58106
Automatic Translation
1, 1
1Department of Entomology and Plant Pathology, Auburn University

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å produsere huset fly carboxylesterase proteiner i vitro med en baculovirus mediert insekt celle uttrykk og senere funksjonelt karakterisere deres roller i metabolizing permethrin, dermed overdragelse pyrethroid motstand ved å gjennomføre cellebasert MTT analysen og i vitro metabolske studier.

Abstract

Carboxylesterase-mediert metabolisme antas å spille en viktig rolle i insektmiddel motstand i ulike insekter. Flere carboxylesterase gener ble funnet opp-regulert i resistente hus fly belastningen, mens deres roller i overdragelse insektmiddel motstand gjensto å bli utforsket. Her utviklet vi en protokoll for funksjonell karakterisering av carboxylesterases. Tre eksempel eksperimenter presenteres: (1) uttrykket og isolasjon av carboxylesterase proteiner gjennom et baculovirus-mediert insekt Spodoptera frugiperda (Sf9) cellen uttrykk systemet. (2) en cellebasert Flerbordsturnering (3-[4, 5-dimethykthiazol-2-yl] -2, 5-diphenyltetrazolium bromide) cytotoksisitet analysen måle toleranse av insekt celler til forskjellige permethrin behandlinger; og (3) i vitro metabolske studier å utforske metabolske funksjonene til carboxylesterases mot permethrin. Carboxylesterase genet MdαE7 ble klonet fra en resistente hus fly belastning ALHF og brukes til å konstruere en rekombinant baculovirus Sf9 celler infisert. I celle viabilities mot ulike permethrin behandlingene ble målt med MTT analysen. Forbedret celle toleranse for forsøksgruppen (MdαE7-rekombinant baculovirus infiserte celler) sammenlignet med de av kontroll grupper (CAT-rekombinant baculovirus infiserte celler og GFP-rekombinant baculovirus infiserte celler) til permethrin behandlinger foreslått egenskapene til MdαE7 i metabolizing insektmidler, og dermed beskytte celler fra kjemisk skade. Bortsett fra det ble carboxylesterase proteiner uttrykt i insekt Sf9 celler og isolert for å gjennomføre en i vitro metabolske studie. Resultatene indikerte en betydelig i vitro metabolsk effektivitet av MdαE7 mot permethrin, indikerer direkte involvering av carboxylesterases i metabolizing insektmidler og dermed overdragelse insektmiddel motstand i huset fluer.

Introduction

Insektmiddel motstand er et stort problem av huset fly kontroll over hele verden1,2. Å bestemme mekanismen av insektmiddel motstand muliggjør bedre forståelse av dette problemet, og dermed gi romanen strategier for å effektivt forhindre eller redusere spredningen av resistens utvikling3. Carboxylesterases, som en av de viktigste avgiftning enzymene, har tiltrukket seg mye oppmerksomhet for sine roller i sequestering og metabolizing insektmidler i ulike insekter4,5,6. Våre tidligere studier har identifisert flere carboxylesterases i huset fluer og uttrykk nivåene var ikke bare constitutively opp-regulert i motstandsdyktig ALHF belastningen, men også kan bli overtalt til høyere nivåer svar permethrin behandlingene7 . Men gjenstår de funksjonell karakteristikkene av disse carboxylesterase gener i metabolizing insektmidler å bli utforsket.

Siden den første rapporten i tidlig 1980-tallet8, har en baculovirus-mediert utenlandske gene expression system vært viden ansatt på grunn av sin høye protein effektivitet og eukaryotic protein behandling evner9. Denne binært system består av to grunnleggende elementer: den konstruert rekombinant baculovirus levere utenlandsk gener i verten cellene, og den store uttrykket for interessert proteiner av celler som er infisert av rekombinant baculovirus. De siste tiårene, baculovirus mediert cellen uttrykk systemet har vært mye brukt til å produsere tusenvis av rekombinante proteiner, alt fra cytosolic enzymer membran-bundet proteiner i insekt og pattedyr cellene10. Vår forrige studie uttrykt ble flere CYP450 enzymer i insekt Sf9 celler med dette systemet11. I denne studien vi bygget en carboxylesterase-rekombinant baculovirus å infisere insekt Sf9 celler, utforsket celle toleransen til forskjellige permethrin behandlingene og store uttrykt carboxylesterase proteiner i vitro for funksjonell leting. I stedet for undersøke flere carboxylesterase isozyme blandinger fra insekt homogenates som ble vedtatt av tidligere studier12,13, baculovirus-mediert insekt celle uttrykk systemet lar bestemt uttrykket og isolering av målrettet proteiner for bedre karakteristikk av biokjemiske og strukturelle egenskapene.

Tetrazolium salt-baserte analysen (MTT) er en høy gjennomstrømming kolorimetrisk metode utviklet og optimalisert for å måle celle levedyktighet. Denne analysen er basert på mekanismen som bare levende celler kan metabolizing gul-farget MTT reagensen til en mørk lilla farget formazan bunnfall, som kan analyseres colorimetrically etter oppløst i organiske løsemidler14, 15. Flere mer nøyaktig, men tidkrevende metoder, for eksempel Trypan blå eksklusjon og de thymidine titrering analyse16,17, har blitt utviklet i de senere år. Imidlertid er cellebasert MTT analysen fortsatt anerkjent som den mest rask og lett å bruke metoden å raskt oppdage celle levedyktighet. Her bruker vi MTT analysen for å utforske celle toleransen mot insektmiddel behandlinger. Forbedret toleranse av celler når infisert med carboxylesterase rekombinant baculovirus sterkt støtter metabolske rollene som carboxylesterases til insektmidler som igjen antyder deres engasjement i insektmiddel motstand.

I tillegg ble i vitro metabolske analysen gjennomført i denne studien. Sammenlignet med generelle carboxylesterase analyser som bruker vanlige underlag som α-napthyl acetate (α-NA) og β-naphthyl acetate (β-NA) for å reflektere hydrolytisk aktivitetene til carboxylesterases, regnes i vitro metabolske studien som en nøyaktig måte mål av carboxylesterases mot insektmidler18direkte. Denne metoden har vært vellykket ansatt i ulike insekter som karakteriserer flere cytochrome P450s i samarbeid med insektmiddel motstand11,19,20. Men har denne metoden ikke ennå blitt brukt i carboxylesterase studier. Med anvendeligheten av carboxylesterase proteiner produsert av baculovirus-mediert uttrykk systemet, kan vi utføre en i vitro metabolske studie av carboxylesterases mot permethrin, som kan videre gir sterke bevis på engasjement av carboxylesterases i overdragelse pyrethroid motstand i huset flyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. uttrykk og isolasjon av målet proteiner med en Baculovirus-mediert insekt celle uttrykk

  1. Directionally klone blunt endte PCR produkter av målet proteiner fra huse fluene.
    1. Utforme PCR primere grønne fluorescerende protein (GFP) og huset fly MdαE7 genet basert på deres sekvenser og de spesielle kravene til den valgte vektoren (tabell 1).
    2. Bruke en thermostable, korrekturlesing DNA polymerase og primere fra trinn 1.1.1 for å utføre en 150 µL PCR reaksjon (30 µL reaksjon bufferen, 3 µL av 10 mM dNTPs, 1,5 µL av DNA polymerase, 6 µL av huset fly mal DNA, 7,5 µL av fremover primer 7,5 µL av omvendt primer, med vann og en siste bindet 150 µL). Varme PCR reaksjonen til 98 ° C for 30 s, etterfulgt av 35 sykluser av 98 ° C for 10 s, 53 ° C for 30 s og 72 ° C for 60 s, og deretter en endelig utvidelse ved 72 ° C i 2 min).
      1. Kjøre en 1% agarose gel med 150 µL av PCR produkt.
    3. Avgiftsdirektoratet målet DNA fragmenter fra agarose gel med en skarp, ren skalpell: 1317 bp for MdαE7 og 858 bp for GFP. Rense bruke kommersielt tilgjengelige gel utvinning kit etter produsentens protokoll (Tabell for materiale). Oppløse renset DNA i 15 µL destillert vann.
    4. Kjøre en 1% agarose gel med 1 µL av renset DNA å kontrollere integriteten. Bruk en annen 1 µL av renset DNA for å måle konsentrasjoner med spektrofotometeret.
  2. Konstruere en oppføring plasmider for målet proteiner
    1. Definere kloning reaksjonen. Mix nylig renset DNA produkter fra trinn 1.1.3 og kommersielt tilgjengelig oppføring vektorer med attL-områder (Tabell for materiale) i molar forholdet 1:1 (0,5-2 µL av PCR Ferskvare i 70-200 ng/µL konsentrasjoner: 0,5 µL vektor). Deretter legger 1 µL av kommersielt tilgjengelig salt løsning (1,2 M NaCl2 og 0,06 M MgCl2) og legge vann til et endelig antall 6 µL. Bland forsiktig og Inkuber ved romtemperatur 1t.
    2. Overføre 4 µL av kloning reaksjon produkter i trinn 1.2.1 til 50 µL av kjemisk kompetent E. coli celler. Ruge på is 30 min. varme-shock celler for 30 s i et vannbad 42 ° C uten å riste.
    3. Sett røret tilbake i is en 2 min. legge 250 µL av romtemperatur S.O.C. medium (2% tryptone, 0,5% gjærekstrakt, 10 mM NaCl; 2,5 KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glukose). Inkuber ved 37 ° C i 1 time med forsiktig risting.
    4. Spre 50-200 µL av bakteriell kultur i trinn 1.2.3 på selektiv LB plater (1 g tryptone, 1 g NaCl, 0,5 g gjærekstrakt, 1,5 g agar oppløst i 100 mL destillert vann. Autoclave og legge til 0,1% av 50 mg/mL kanamycin). Inkuber LB plater for 16 h på 37 ° C for kolonien vekst.
    5. Velg 5-10 kolonier og å utsette dem individuelt i 5 µL destillert vann.
    6. Utføre PCR ved å legge til 5 µL reaksjon bufferen, 0,5 µL av 10 mM dNTPs, 0,25 µL av DNA polymerase, 1 µL suspendert kolonier, 1,25 µL av 10 µM M13 frem primer, 1,25 µL av 10 µM bakover grunning av målet genet og vann til siste bindet 25 µL. varme PCR reaksjon på 98 ° C for 30 s, etterfulgt av 35 sykluser av 98° C for 10 s, 53 ° C for 30 s og 72 ° C for 60 s, og deretter en endelig utvidelse ved 72 ° C i 2 minutter (tabell 1).
    7. Nytt kultur 3 µL suspendert kolonier fra trinn 1.2.5 i TB media (100 mL fosfat bufferen som inneholder 0,17 M KH2PO4 og 0,72 M K2HPO4 med 450 mL base kjøttkraft medium som inneholder 6 g av tryptone, 12 g gjær og 2 mL glyserol, sterilisert, som inneholder 0,1% 50 mg/mL kanamycin) for 16 h. ekstra ultra ren plasmider DNA etter produsentens protokoll.
    8. Bruk 200 ng/µL ultra ren plasmider fra trinn 1.2.7 for kommersielle Sanger sekvensering med M13 forover og bakover grunning. Kontroller riktig innsetting av målet genet i vektor basert på sekvens kartet levert av produsenten.
    9. Lagre sekvens-verifiserte ultra ren plasmider DNA-prøver av MdαE7 og GFP i 20 ° C.
      Merk: Dette er den posten plasmider DNA av MdαE7 og GFP.
  3. Konstruere en rekombinant baculovirus ved å utføre Lambda rekombinasjon (LR) reaksjon.
    1. Bland henholdsvis 1 µL av 300 ng/µL oppføring plasmider DNA av GFP, MdαE7 fra trinn 1.2.7 eller oppføring plasmider DNA av chloramphenicol acetyltransferase genet (CAT) levert av cellen transfection settet med 5 µL av kommersielt tilgjengelig (med attL nettsteder) C sikt lineær DNA (inneholder attR områder) i 250 µL PCR rør. Legg til TE buffer for å gjøre et totalt volum på 8 µL.
      Merk: Reaksjoner av GFP og katten ble brukt som kontroll grupper.
    2. Legg 2 µL av kommersielt tilgjengelig Lambda rekombinasjon (LR) enzym (Table of Materials) til hver blanding av trinn 1.3.1 å katalysere LR reaksjonen. Forsiktig bland og ruge ved 25 ° C over natten (≈16 h).
      Merk: LR reaksjonen forenkler rekombinasjon av en attL inneholder oppføringen plasmider DNA med en attR-containing C sikt lineær DNA å generere en attB inneholder uttrykke virus. Dette trinnet produserer av rekombinant baculovirus for hvert mål protein.
    3. Fortynne 1 µL av LR reaksjon produkter fra trinn 1.3.2 20 X. Utføre PCR bruker Polyhedrin frem primer og V5 omvendt primer (tabell 1). Bruke 5 µL av PCR produkter for å kjøre en 1% agarose gel for å kontrollere kvaliteten. Figur 1 viser et eksempel på LR reaksjon produktet fra MdαE7 genet.

Figure 1
Figur 1: eksempel resultatene av MdαE7 LR reaksjon av PCR analyse. Fortynne 2 µL av LR reaksjonen 200-fold og bruke 2 µL av fortynning Polyhedrin frem primer og V5 omvendt primer til å utføre en 25 µL PCR. Bruke 5 µL av PCR produkter for å kjøre 1% agarose gel for å sjekke kvaliteten på LR reaksjon. en

  1. Transfect insekter Sf9 celler
    1. Kultur, insekt celler Sf9 med 5 mL komplett celle vekst medium (serum-free medium med 10% fosterets bovin serum (FBS)) i T25 behandlet flasker på 27 grader.
    2. Fjern nedbryting og tømme bunnen-tilkoblede cellene med 3 mL frisk komplett celle vekst medium. Overføre 0,5 mL re suspendert celleområde til en ny T25 behandlet kolbe. Legge til 4,5 mL av komplett vekst medium. Inkuber ved 27 ° C i 3-4 dager før neste overføring.
    3. Frø 2 mL Logg-fase vekst insekt Sf9 celler kultur (≈3.0-5.0 × 106 celler) jevnt på cellekultur godt. Lar celler legge minst 3 h ved romtemperatur i panseret.
    4. Sjekk celle vedlegget ved å observere med en invertert fase mikroskopet på 250 X. Fjerne celle kultur medium og erstatte med 2 mL Grace insekt medium.
    5. Forberede transfection blanding A løsning (8 µL av kommersielt tilgjengelig celle infeksjon reagensen (Tabell for materiale) med 100 µL av Grace insekt medium) og hva blanding B løsning av hver målet genet (9 µL av LR reaksjon produkter fra trinn 1.3 med 100 µL unsupplemented Grace insekt middels) i 1,5 mL sentrifuge rør, henholdsvis.
    6. Bland forsiktig hva blanding A og B sammen ved å tappe rørene. Inkuber ved romtemperatur for 35 min i panseret.
    7. Legg blandingen jevnt fra trinn 1.4.6 dropwise på seeded cellene fra trinn 1.4.4. Seal brønner med bånd og ruge ved 27 ° C over natten.
    8. Erstatte 2 mL av Grace insekt medium med 2 mL komplett oppblomstringen medium. Legge til 100 µM ganciclovir i hver brønn negativt velge mot ikke-rekombinant baculovirus. Seal brønner med tape og ruge ved 27 ° C i 72 h.
    9. Samle 72 h innlegget infeksjon celle kultur medium fra hver brønn og overføre til 1,5 mL sentrifuge rør. Sentrifuge 1500 x g i 5 min på 4 ° C fjerne celler eller store rusk.
    10. Overføre nedbryting til nye 1,5 mL sentrifuge rør. Lagre dem på 4 ° C med beskyttelse mot lyset.
      Merk: Dette er P1 virus lager løsninger for hvert mål genet.
    11. Forsterke lav-titer P1 viral lager (1 × 105-1 × 106 pfu/mL) til en høy titer P2 viral lager (5 × 107-1 × 108 pfu/mL).
    12. Frø 2 mL Logg-fase vekst insekt Sf9 celler kultur (≈3.0-5.0 × 106 celler) jevnt på cellekultur godt. Lar celler legge minst 3 h ved romtemperatur i panseret.
    13. Vaksinere 5 µL av P1 virus lager fikk i trinn 1.4.10 i cellen sådd godt av trinn 1.4.12, henholdsvis. Deretter legge til 100 µM ganciclovir i hver brønn. Seal brønner og ruge ved 27 ° C i 72 h.
    14. Samle P2 virus lager løsninger på 72 h innlegget infeksjon. Lagre på 4 ° C med beskyttelse mot lyset.
      Merk: Dette er P2 virus lager løsninger for hvert mål genet.
    15. (Valgfritt) Gjenta trinn 1.4.12-1.4.14 med 5 µL av P2 virus lager å samle P3 virus lager løsninger.
      Merk: Dette er P3 virus lager løsninger for hvert mål genet.
    16. Lagre alle bygget baculovirus på 4 ° C med beskyttelse mot lyset.
      Merk: GFP og katten genet ble servert som kontrollgruppe. Figur 2 viste tegn på celler når infisert av GFP-rekombinant baculovirus på ulike forsterkning stadier.

Figure 2
Figur 2: eksempel på infiserte tegn på Sf9 celler i forskjellige baculovirus forsterkning stadier. Figuren viser GFP-rekombinant baculovirus celler under naturlig lys og fluorescerende lys. På P1 infeksjon scenen er infeksjon lav. På P2 infeksjon scenen, ble infeksjon forholdet betydelig forbedret. På P3 infeksjon scenen, nesten alle cellene viste symptomer på løsgjøring fra celle kultur plate, øker celle diameter, i tillegg til opphør av cellevekst. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Store uttrykk for målet proteiner i insekt Sf9 celler
    1. Kultur 10 mL av Logg fase vekst insekt Sf9 celler med komplett vekstmediet i T25 ikke behandlet flasker.
    2. Legge til 200 µL av P2 virus lager løsning (innhentet i trinn 1.4.14) for å infisere cellekulturer i trinn 1.5.1 72 h.
    3. Samle 72 h innlegget infeksjon celle kultur medium. Sentrifuger 1500 x g i 5 min på 4 ° C.
    4. Forkaste supernatant og vask pellets to ganger med 1 mL av 0.1 M PBS buffer (pH 7.5).
    5. Fullstendig løse opp cellen pellets med 1 mL av insekt celle protein utvinning og lyseringsbuffer (Tabell for materiale). Legge til 10% glyserol i cellen lysis. Umiddelbart lagre på-80 ° C.
    6. Gjenta trinn 1.5.1-1.5.5 med P2 virus lagerløsning CAT proteiner som kontrollgruppen.
      Merk: Gjenta trinn 1,5 i tre eksemplarer for annet protein forberedelser.

2. en cellebasert MTT cytotoksisitet analysen

  1. Kultur 5 mL av Logg fase vekst (1.5-2.5 × 106 celler/mL) insekt Sf9 celler med komplett vekstmediet i T25 ikke behandlet flasker.
  2. Legg til 25 µL av P1 virus lager løsning (innhentet i trinn 1.4.14) for å infisere cellekulturer i trinn 2.1 48 h med mild rister på 27 grader.
  3. Forberede 100 mM permethrin standard lager løsninger i acetonitrile. Bruk acetonitrile å fortynne 50 mM, 25 mM, 12.5 mM og 6,25 mM ved å legge 500 µL, 250 µL, 125 µL og 62.5 µL permethrin lagerløsning i et totalt volum på 1000 µL, henholdsvis.
  4. Jevnt frø 200 µL av infiserte cellekulturer fra trinn 2.2 supplert med 300 µL av komplett vekstmediet i 24-vel plate på en tetthet av 2 × 105 celler/mL.
  5. Legge til 4 µL av permethrin standard løsninger (6,25 mM, 12.5 mM, 25 mM og 50 mM) inn i hver brønn å gjøre en siste konsentrasjon 50 µM, 100 µM, 200 µM og 400 µM, henholdsvis. Bare legge til 4 µL av acetonitrile i brønner for cellen levedyktighet beregninger (Figur 3).
  6. Seal plater med bånd og ruge ved 27 ° C i 48 timer med beskyttelse mot lyset.
  7. Forberede 5 mg/mL MTT (Thiazolyl blå Tetrazolium Bromide) reagens oppløst i bufferen (2.0 g NaCl, 0,05 g KCl, 0.36 g NaH2PO4∙2H2O, 0,28 g NaH2PO4, 0,05 g av KH2PO4 oppløst i 200 mL destillert vann pH 7.5).
  8. Fjerne celle kultur medium fra trinn 2.6 etter 48t inkubasjon uten å berøre bunnen tilknyttet celle laget. Legge til 200 µL av MTT reagensen i trinn 2.7 i hver brønn. Ruge på 37 ° C 4 h til mørk lilla formazan precipitates dannet i hver brønn (Figur 3).
  9. Ruge på 37 ° C 4 h til mørk lilla formazan precipitates skjemaet i hver brønn. Legg til 500 µL av DMSO å fullt oppløse precipitates (Figur 3).

Figure 3
Figur 3: eksempel på MTT resultater. Etter 48 timer stolpe infeksjon med P1 virus lager løsning av katten rekombinant baculovirus løsning, jevnt frø 500 µL celler uttrykke CAT genet i en 24-vel celle kultur plate. Henholdsvis, Legg 4 µL permethrin på en annen dose (6,25 mM, 12.5 mM, 25 mM og 50 mM) i hver rad til å endelig konsentrasjonen 50 µM, 100 µM, 200 µM og 400 µM. Raden kontroll ble behandlet med acetonitrile bare og merket som CK i platen. (A) etter 48 timer med inkubering ved 27 ° C, forkaste celle kultur medium på øvre laget og erstatte med 200 µL gul farget MTT reagenser. Deretter ruge ved 37 ° C i 48 h. mørk lilla farget reduksjon precipitates skjemaet i hver godt indikerer at overlevelse cellene er i stand til metabolizing den gule fargen MTT reagenser i den mørke lilla farget utløse. (B) 500 µL DMSO løsemiddel ble lagt i hver brønn å oppløse den dannet utløse. Absorbansen verdien av hver vel ble oppdaget av spektrofotometer på 540 nm. Permethrin konsentrasjoner øker, endres fargen gradvis fra mørk rød til lys rød, tyder på at cellen viabilities ble gradvis redusert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Overføre 200 µL av oppløst løsning i 96-brønnen plate. Måle absorbansen verdier på 540 nm bruker en microplate reader (Tabell for materiale).
  2. Beregne celle levedyktighet ved å sammenligne absorbansen verdiene av permethrin behandlet celler med de bare acetonitrile behandlet celler.
  3. For kontrollgruppen, gjentar du alle trinnene med P2 virus lager løsning av chloramphenicol acetyltransferase (CAT) rekombinant baculovirus fikk i trinn 1.4.
  4. Gjenta 4 ganger for forskjellige virus forberedelser.

3. i Vitro metabolske analysen

  1. Forberede 100 mM permethrin standard lager løsninger i acetonitrile. Bruk acetonitrile for å fortynne 50 mM, 25 mM, 12.5 mM og 6,25 mM. Oppdage tilsvarende peak området under hver konsentrasjon bruker mye HPLC. Opprett og beregne standardkurven av permethrin basert på topp området med ulike permethrin konsentrasjoner.
  2. Måle protein konsentrasjonen i takt 1.5 med Bradford metoder21.
  3. Forbered 700 µL av metabolske reaksjon med 40 µM permethrin standard og 1 mg av proteiner fikk i trinn 1.5 oppløst i 0,2 M Tris-HCl buffer (pH 7.4). Ruge på 30 ° C i 2 timer med mild risting. Beskytte mot lyset.
  4. Slukke reaksjonen ved å legge til 700 µL av iskalde acetonitrile. Ruge på 30 grader for en annen 30 min med mild risting. Beskytte mot lyset.
  5. Sentrifuge reaksjonsblandingen 16.000 x g i 2 minutter ved romtemperatur. Samle nedbryting og filteret gjennom en 0,45 µm membran. Overføre for filtrering i ultraclean brun hetteglass for såkalt HPLC-analyse.
  6. Kjøre HPLC under optimale brukt kromatografiske forhold (Mobile fase A: 90% acetonitrile og 10% vann. Mobile fase B: 5% acetonitrile justert til pH 2.3 med 85% fosforsyre). Gradert elute med en strømningshastighet på 1 mL/min og mål på en bølgelengde på 232 nm.
  7. Beregning uttømming av permethrin ved å sammenligne med reaksjoner uten protein eksempel lagt.
  8. Bruk katten protein fikk i trinn 1.5.6 som kontrollen.
  9. Gjenta alle trinnene med annet protein forberedelser i trinn 1.5.7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cellen levedyktigheten mot ulike permethrin behandlingene (MTT analysen)

Cytotoksisitet av permethrin ble undersøkt i MdαE7-rekombinant baculovirus infisert Sf9 cellene (forsøksgruppen) og katten-rekombinant baculovirus (leveres av baculovirus infisert) infisert (kontroll grupper). Forbedret celle toleransen til permethrin i MdαE7 uttrykker celler sterkt støtte metabolske rollene som denne carboxylesterase mot insektmidler og dermed beskytte celler fra kjemiske skader. I vår studie, celle levedyktigheten mot ulike permethrin konsentrasjoner (50, 100, 200 og 400 µM) ble beregnet med-cellene behandles med acetonitrile alene. Resultatene viste at levedyktigheten til MdαE7 uttrykke celler var betydelig høyere (alt fra 86.00% til 101.92%) (Figur 4B) enn kontroll celler (alt fra 67.59% til 81.43%) (Figur 4A) når de utsettes for permethrin i ulike konsentrasjoner, som angir viktige rollene som MdαE7 i metabolizing permethrin i insekt celler.

Figure 4
Figur 4: viabilities av insekt Sf9 celler under forskjellige permethrin behandlingene. (A) levedyktigheten til kontroll celler infisert av katten rekombinant baculovirus (B) levedyktigheten til eksperimentelle celler av MdαE7 rekombinant baculovirus. Fire replikeringer ble utført for hver permethrin konsentrasjon. Dataene ble vist som gjennomsnittlig ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

In vitro metabolismen av permethrin av MdαE7

Permethrin stoffskifte var assayed av rugende en 40 µM permethrin standard løsning med MdαE7 proteiner utvunnet fra infiserte Sf9 celler. Reaksjoner med katten proteiner som kontroller. Uttømming andelen permethrin ble beregnet med reaksjoner uten enzym lagt. Reaksjoner ble overvåket av reverse-fase HPLC etter en 120 min inkubasjonstid. Siden permethrin standard er faktisk en blanding av cis - og trans-isomerene, to toppene ble observert i HPLC brukt kromatografiske profiler, elueringsrør ganger 10.67 min og 10.87 min trans-permethrin og cis-permethrin, henholdsvis (figur 5). Uttømming andelen permethrin ved MdαE7 proteiner (39.18±3.78%) var signifikant høyere enn katten proteiner (7.29±0.81%) (Figur 6), som er ikke bare være i samsvar med MTT resultater, men også direkte demonstrerer mulighetene med MdαE7 i metabolizing permethrin i vitro.

Figure 5
Figur 5: The HPLC profil av permethrin standard. Permethrin standard brukt i denne studien er en blanding av trans-permethrin og cis-permethrin isomerene. Røde piler indikerer toppene for trans-permethrin isomer og cis-permethrin isomer, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: In vitro metabolismen av permethrin av MdαE7 og katten rekombinante proteinene. Uttømming prosenter av permethrin ved MdαE7 og katten proteiner ble beregnet. Tre gjennomkjøringer var gjennomført for hver permethrin konsentrasjon. Dataene ble vist som gjennomsnittlig ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I de siste tiårene, har heterologous uttrykk systemer vært mye brukt til å uttrykke og isolere store mengder proteiner, slik at biokjemiske og funksjonelle besluttsomhet og karakterisering av enzymer i vitro. Hittil har flere forskjellige modellsystemer inkludert Escherichia coli, Pichia pastoris, Sacccharomyces cerevisiaeog Spodoptera frugiperda har blitt tilpasset for rekombinant protein uttrykk, og valget av den i vitro system er avgjørende for storskala generasjon interessert proteiner22,23,24,25. I vår studie, ble baculovirus-mediert insekt celle uttrykk systemet generere huset fly carboxylesterases valgt fordi det gir en lignende intracellulær miljø insekt celler og vedlikeholder noen viktige eukaryote bildebehandlingsfunksjonene 9. tross fordelene baculovirus-mediert uttrykke systemet, begrensninger skal også rettes. Baculovirus-mediert insekt cellen uttrykk systemet kan produsere målet proteiner bare hvis insekt cellene var infisert med konstruert rekombinant baculovirus. Gjeldende utvikling for å skape stabilt transformert insekt cellelinjer har gjort det mulig ikke bare å produsere constitutively interessert proteiner i fravær av baculovirus infeksjon, men også å forbedre celle funksjonene for glycosylating og folding generert proteiner til tekniske endringer9.

Bedre undersøke rollene til carboxylesterases i metabolizing insektmidler i celler, og dermed beskytte celler fra kjemiske skader, ble MTT analysen gjennomført for å måle celle cytotoksisitet mot ulike permethrin behandlingene. Under denne prosessen kan mange eksperimentelle parametere knyttet til celle metabolisme, som cellen middels komposisjoner, celle vekst, konsentrasjon og forbruk av energi forsyning metabolitter, påvirke MTT reduksjon og dermed føre til unøyaktig resultater. Å minimere over / undervurdering av MTT analysen, holde celle kultur medium, celle vekst stat og inkubasjon betingelsene konsekvent blant forskjellige eksperimentelle behandlinger26. For å bestemme cellen levedyktighet effekten forårsaket av baculovirus infeksjon i stedet for permethrin, vi viste at infeksjon prosessen med GFP-rekombinant baculovirus insekt Sf9 celler, og fant at på P2 infeksjon scenen, cellene har det høyeste infeksjon forholdet med lavest celle død forhold sammenlignet med andre infeksjon stadier (figur 2). Dette kan bedre forklare grunnen til å velge celler P2 infeksjon scenen å gjennomføre MTT analysen.

Ved å sammenligne viabilities av celler når infisert av MdαE7 - og katten-rekombinant baculovirus i en Flerbordsturnering studie, fant vi en forbedret levedyktighet av celler når uttrykke MdαE7 proteiner, som kan bedre støtte carboxylesterases til permethrin metabolske rollene i insekt celler og beskytte celler fra kjemiske skader (Figur 4). I vitro metabolske studien, som er anerkjent som en direkte metode å reflektere metabolske funksjonene til carboxylesterases mot insektmidler, bør også blitt utforsket å kompensere begrensningene for MTT analysen bedre karakteriserer protein metabolske funksjoner.

I denne studien, heterologous uttrykk for carboxylesterases i insekt Sf9 celler med en baculovirus-mediert uttrykk system, måling av celle viabilities mot ulike permethrin behandlinger av MTT analysen og karakterisering av carboxylesterases gjennom en i vitro metabolisme analysen alle arbeide sammen for å gi en systematisk, vitenskapelige og nøyaktig strategi for å undersøke rollene avgiftning enzymer i insekter, dermed tilrettelegge en bedre forståelse av insektmiddel resistens og dermed utvikle innovative strategier for pest management.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs inc. M0491L
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704
pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli Invitrogen by life technology K240020 S.O.C medium and universal M13 sequence primers were included in this kit.
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen by life technology K210002
Gateway LR Clonase II Enzyme mix for BaculoDirectTM Kits Invitrogen by life technology 11791-023
BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit Invitrogen by life technology 12562-019 Cellfectin transfection reagent and ganciclovir were included in this kit
pENTR-CAT plasmid Invitrogen by life technology Included in BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit, concentration: 0.5 ug/uL
Heat inactivated Fetal Bovine Serum, Certified Gibco by Life Technologies 10082-139
Sf9 cells in Sf-900 III SFM Gibco by Life Technologies 12659017
Insect Cell-PE LB Insect Cell Protein Extraction & Lysis Buffer G Biosciences by A Geno Technology Inc 786-411
Sf-900 III SFM (1×) Serum Free Medium Complete Gibco by Life Technologies 12658-019
Grace's Insect Medium, unsupplemented Gibco by Life Technologies 11595030
Permethrin (isomers) analytical standard SUPELCO by Solutions WithinTM 442748
Methanol (analytical graded) Sigma-Aldrich 67-56-1
Acetonitrile (analytical graded) Sigma-Aldrich 75-05-8
GHP Acrodisc 25 mm Syringe Filters with 0.45 μm GHP Membrane (HPLC Certified) Pall Life Sciences 21890388
Alliance Waters 2695 HPLC System Waters
T100 Thermal Cycle Bio-Rad Laboratories Inc. 1861096
Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometers ThermoFisher Scientific ND2000CLAPTOP
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader BioTek

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scott, J. G., et al. Insecticide resistance in house flies from the United States: Resistance levels and frequency of pyrethroid resistance alleles. Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 377-384 (2013).
  2. Li, M., et al. A whole transcriptomal linkage analysis of gene co-regulation in insecticide resistant house flies, Musca domestica. BMC Genomics. 14, 803 (2013).
  3. Liu, N. Insecticide resistance in mosquitoes: impact, mechanisms, and research directions. Annual Review of Entomology. 60, 537-559 (2015).
  4. Grigoraki, L., et al. Transcriptome profiling and genetic study reveal amplified carboxylesterase genes implicated in temephos resistance, in the Asian tiger mosquito Aedes albopictus. e0003771. 9, e0003771 (2015).
  5. Grigoraki, L., et al. Carboxylesterase gene amplifications associated with insecticide resistance in Aedes albopictus: Geographical distribution and evolutionary origin. PLOS Neglected Tropical Diseases. 11, e0005533 (2017).
  6. Wheelock, C., Shan, G., Ottea, J. Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides. Journal of Pesticide Science. 30, 75-83 (2005).
  7. Feng, X., Li, M., Liu, N. Carboxylesterase genes in pyrethroid resistant house flies, Musca domestica. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 30-39 (2018).
  8. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  9. Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).
  10. Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nature Biotechnology. 22 (12), 1583 (2004).
  11. Gong, Y., Li, T., Feng, Y., Liu, N. The function of two P450s, CYP9M10 and CYP6AA7, in the permethrin resistance of Culex quinquefasciatus. Scientific Reports. 7 (1), 587 (2017).
  12. Cao, C. W., Zhang, J., Gao, X. W., Liang, P., Guo, H. L. Overexpression of carboxylesterase gene associated with organophosphorous insecticide resistance in cotton aphids, Aphis gossypii (Glover). Pesticide Biochemistry and Physiology. 90 (3), 175-180 (2008).
  13. Zhang, L., Gao, X., Liang, P. Beta-cypermethrin resistance associated with high carboxylesterase activities in a strain of house fly, Musca domestica (Diptera: Muscidae). Pesticide Biochemistry and Physiology. 89, 65-72 (2007).
  14. Van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: the MTT assay. Cancer cell culture. , Humana Press. 237-245 (2011).
  15. Stockert, J. C., Blázquez-Castro, A., Cañete, M., Horobin, R. W., Villanueva, Á MTT assay for cell viability: Intracellular localization of the formazan product is in lipid droplets. Acta Histochemica. 114 (8), 785-796 (2012).
  16. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. , A3-B (2001).
  17. Riss, T. L., Moravec, R. A., Niles, A. L., Duellman, S., Benink, H. A., Worzella, T. J., Minor, L. Cell viability assays. Assay Guidance Manual. , (2013).
  18. Wheelock, C. E., Shan, G., Ottea, J. Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides. Journal of Pesticide Science. 30 (2), 75-83 (2005).
  19. Li, X., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Molecular mechanisms of metabolic resistance to synthetic and natural xenobiotics. Annual Review of Entomology. 52, 231-253 (2007).
  20. Nakamura, Y., et al. The in vitro metabolism of a pyrethroid insecticide, permethrin, and its hydrolysis products in rats. Toxicology. 235 (3), 176-184 (2007).
  21. Kruger, N. J. The Bradford method for protein quantitation. The protein protocols handbook. , Humana Press. 15-21 (2002).
  22. Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
  23. Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nature Biotechnology. 22 (12), 1583 (2004).
  24. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211 (2006).
  25. Bulter, T., et al. Functional expression of a fungal laccase in Saccharomyces cerevisiae by directed evolution. Applied Microbiology and Biotechnology. 69 (2), 987-995 (2003).
  26. Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).

Tags

Biokjemi problemet 138 insektmiddel motstand carboxylesterases baculovirus-mediert insekt celle uttrykk systemet cytotoksisitet analysen i vitro metabolisme analysen
Funksjonell karakteristikk av Carboxylesterases i insektmiddel resistente hus fluer, <em>Musca Domestica</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feng, X., Liu, N. Functional… More

Feng, X., Liu, N. Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica. J. Vis. Exp. (138), e58106, doi:10.3791/58106 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter