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Biology

Aislamiento y la proyección de imagen de fluorescencia para la reconstrucción de la solo-partícula de Chlamydomonas centriolos

Published: September 21, 2018 doi: 10.3791/58109
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Cell Biology, Sciences III, University of Geneva
* These authors contributed equally

Summary

Hemos desarrollado una estrategia para purificar y un gran número de centriolos en susceptibles para la microscopía de superresolución y solo-partícula promedio de diferentes orientaciones de la imagen.

Abstract

Centriolos son grandes ensamblajes macromoleculares importantes para la correcta ejecución de los procesos biológicos fundamentales de la célula como división celular, la motilidad celular señalización celular. El alga verde Chlamydomonas reinhardtii ha demostrado para ser un modelo profundo en el estudio de arquitectura del centriolo, función y composición proteica. A pesar de grandes avances hacia la arquitectura centriolar comprensión, uno de los retos actuales es determinar la localización exacta de componentes centriolar dentro de las regiones estructurales del centriolo con el fin de entender mejor su papel en la Biogénesis del centriolo. Una limitación importante se encuentra en la resolución de la microscopía de fluorescencia, lo que complica la interpretación de la localización de la proteína en este organelo con dimensiones cerca del límite de difracción. Para abordar esta cuestión, estamos proporcionando un método para purificar e imagen de un gran número de C. reinhardtii centriolos con orientaciones diferentes usando microscopia de la estupendo-resolución. Esta técnica permite el posterior procesamiento de datos a través de fluorescentes solo-partícula promedio (Fluo-SPA) debido a la gran cantidad de centriolos adquirido. Fluo-SPA genera promedios de manchado C. reinhardtii centriolos en diferentes orientaciones, facilitando así la localización de distintas proteínas en subregiones centriolar. Lo importante, este método puede aplicarse a centriolos imagen de otras especies o de otros grandes ensamblajes macromoleculares.

Introduction

El centriolo es un orgánulo evolutivamente conservado que se encuentra en el centro del centrosoma en células animales y puede actuar como un cuerpo basal (denominado centriolos en adelante) cilios de plantilla o flagelos en muchos eucariotas1,2. Como tal, centríolos son críticos para los procesos biológicos que van desde el montaje del huso a la célula de señalización célula fundamental. Por lo tanto, defectos en la Asamblea de centriolo o función han sido asociados con varias patologías humanas, incluyendo cáncer y ciliopathies3.

Centriolos son nueve veces, simétrico, estructuras cilíndricas que basado en tripletes de microtúbulos son, típicamente, ~ 450 nm de largo y 250 nm ancho4,5,6,7. La microscopia electrónica convencional y tomografía del cryo-electrón de centriolos de diferentes especies han revelado que los centriolos están polarizados a lo largo de su eje largo con tres regiones distintas: una región proximal, un núcleo central y una región distal5 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. lo importante es que, cada una de estas regiones muestra características estructurales específicas. En primer lugar, la luz de la región proximal de 100 nm de largo contiene la estructura de cartwheel conectada a la tripleta de microtúbulos a través de la cabeza de alfiler elemento12. En segundo lugar, la región central de 300-400 nm de largo contiene densidades fibrosas en el lumen y características estructurales a lo largo de la cara interior de los microtúbulos: el vinculador en forma de Y, la cola de C túbulo y el túbulo A tropiezan9. Por último, la región distal de 50 – 100 nm exhibe el distales y distales apéndices que rodean la parte distal del centriolo5,13.

Las dos últimas décadas se han caracterizado por el descubrimiento de un número creciente de proteínas centriolar, conduce a una estimación actual de cerca de 100 proteínas distintas, siendo parte del centriolo14,15,16, 17. a pesar de estos avances, la localización precisa de estas proteínas en el centriolo sigue siendo evasiva, particularmente dentro de las subregiones estructurales. Lo importante, asignar una localización precisa a regiones estructurales del centriolo es crucial para una mejor comprensión de su función. En este sentido, C. reinhardtii centriolos han sido instrumentales en ambos aspectos por primera permitiendo delimitar las características estructurales diferentes a lo largo del cilindro9,18,19, que permitió investigadores establecer una correlación entre la localización de un subconjunto de proteínas usando microscopia fluorescente a una región sub-estructurales. Esto incluye, por ejemplo, las proteínas Bld12p y Bld10p, que se localiza en la región proximal y en la estructura del cartwheel en particular20,21,22,23. La lista de las proteínas estructura localizada también incluye POB15 y POC16, dos nuevas proteínas identificadas por espectrometría de masas que adornan la región núcleo central interno de C. reinhardtii centriolos17.

Este documento proporciona una descripción completa del método desarrollado para aislar y la imagen de C. reinhardtii centríolos para la posterior super-resolución microscopía y con un promedio de la solo-partícula. Para lograr este objetivo, es importante delimitar las limitaciones técnicas que deben ser superados. En primer lugar, purificación del centriolo puede afectar la estructura general, con la estructura de la voltereta a menudo se pierden durante las diferentes etapas de aislamiento9. En segundo lugar, las dimensiones de lo centriolo son muy cerca del límite de difracción en microscopía óptica. De hecho, la resolución lateral que se puede obtener en la microscopía confocal es alrededor de 200 nm24, similar al diámetro del centriolo y la resolución en el z-eje es acerca de 2 – 3 x menor, llevando a un volumen anisotrópico. En tercer lugar, la heterogeneidad del anticuerpo etiquetado y centriolo orientación podría limitar la interpretación necesaria para localizar una proteína en una específica región centriolar. Finalmente, en sólo dos copias por célula, lo que hace difícil adquirir un gran número de imágenes y encontrar una orientación inequívoca centriolo existen centríolos. Para evitar estos problemas técnicos, hemos desarrollado un método que se basa en la aplicación de la microscopia de la estupendo-resolución en gran número de aislada centríolos que adoptar varias orientaciones. Primero vamos a describir un protocolo para purificar C. reinhardtii centriolos que permite la purificación de centriolos estructuralmente intactos y procentrioles que contiene el cartwheel. A continuación, describimos un protocolo paso a paso para concentrarse los centriolos de cubreobjetos para la proyección de imagen por convencional o microscopia fluorescente súper resolución. Este paso importante permite aumentar el número de imágenes en múltiples orientaciones de centriolos. Por último, describiremos un procedimiento para realizar la solo-partícula promedio en los datos adquiridos en microscopios fluorescentes que facilita la detección de centriolos en diferentes orientaciones. En conjunto, este método puede aplicarse a centriolos imagen de varias especies u otros grandes ensamblajes macromoleculares.

Protocol

1. medios de preparación para la cultura de C. reinhardtii y aislamiento de centriolo

  1. Preparación de medios de comunicación a las células de C. reinhardtii de cultura
    Nota: Siguientes pasos describen la preparación de soluciones stock para 1 x medio TAP (fosfato de Tris acetato).
    1. Preparar un tampón de fosfato (pH 7), mediante la mezcla de 250 mL 1 M K2HPO4 (174,2 g de K2HPO4 complementada a 1 L con agua destilada) con ~ 170 mL de 1 M KH2PO4 (136,09 g de KH2PO4 en 1 L). Ajustar la mezcla para llegar a pH 7.
    2. Preparar la solución (x 40) mezclando 96,8 g de Tris, 40 mL de tampón fosfato (pH 7) y 40 mL de ácido acético y ajustar la solución a 1 L con agua destilada.
    3. Preparar la solución B (40 x) con 16 g de NH4Cl, 2 g de CaCl2y 4 g de MgSO4. Tenga cuidado de CaCl2 en agua destilada se disuelven por separado antes de agregar a los otros componentes. Ajustar la solución a 1 L con agua destilada.
    4. Preparar oligoelementos buffer25 de Hutner como sigue.
      1. Para 1 L de tampón, disolver cada compuesto en el volumen indicado de agua: EDTA disódico sal (50 g en 250 mL), ZnSO4.7H2O 22 g en 100 mL, H3BO3 (11,4 g en 200 mL), MnCl2.4H2O (5,06 g en 50 mL) , CoCl2.6H2O (1,61 g en 50 mL), CuSO4.5h2O (1,57 g en 50 mL), (NH4) 6Mo7O24.4H2O (1,10 g en 50 mL) y FeSO4.7H2O (4,99 g en 50 mL).
        Nota: EDTA debe ser disuelta en agua hirviendo y FeSO4 se preparara última para evitar la oxidación.
      2. Mezclar todas las soluciones excepto el EDTA y lleve a ebullición. Luego agregar el EDTA y la solución debe resultar verde. Después de todo, disolver, enfriar la solución hasta 70 ° C. A esta temperatura, añadir 85 mL de solución KOH 20% caliente (20 g en 100 mL). Ajustar la solución a 1 L con agua destilada a temperatura ambiente (RT).
      3. Añadir un tapón de algodón en el matraz y dejar la solución reposar 1 o 2 semanas, sacudiéndolo 1 x al día. La solución debe inicialmente verde y girar a la púrpura, dejando un precipitado de óxido marrón; eliminar el precipitado usando papel de filtro hasta que la solución es clara. Las alícuotas de congelar y almacenar a-20 ° C.
    5. Preparación 1 x grifo medio para cultivar células de C. reinhardtii mediante la mezcla de los siguientes componentes: 25 mL de solución (x 40) y 25 mL de solución B (40 x) con 1 mL de oligoelementos de Hutner25del almacenador intermediario y ajustar la mezcla a 1 L con agua destilada. Esterilizar la mezcla utilizando un filtro de 0,4 μm.
  2. Preparación de medios para la purificación del centriolo
    1. Preparar un buffer de deflagellation con 5% de sacarosa en 10 mM HEPES (pH 7) en un volumen final de 500 mL ajustado con agua destilada.
    2. Preparar 250 mL de ácido acético de 0,5 M.
    3. Preparar 250 mL de una solución stock de tubos K M 1 (pH 7.2) por primer agregar 50 mL de H2O para disolver el polvo de tubos, luego agregar 10 N KOH hasta que la solución empieza a ser claro. Valorar a pH 7,2 con 10 N y 1 N KOH y ajustar la solución hasta un volumen final de 250 mL con H2O.
    4. Preparar 5 soluciones de sacarosa (w/w) como sigue.
      Nota: Todas las soluciones de sacarosa necesitan ser filtrada después de solubilización mediante un filtro de 0,4 μm conectado a una jeringa. Tenga en cuenta que las soluciones de sacarosa % y 70% 60 son difíciles de solubilizar y deben ser colocadas en un baño de agua previamente calentado a 60 ° C para facilitar la solubilización. Mezcla cada 10 minutos hasta que se disuelva completamente la sacarosa.
      1. A preparar 25% sacarosa, pesar 25 g de sacarosa y ajustar el peso a 100 g agregando 10 mM K-tubos (pH 7.2).
      2. Para preparar el 60% de sacarosa, pesar 60 g de sacarosa y ajustar el peso a 100 g con 10 mM K-tubos (pH 7.2).
      3. Preparar soluciones de sacarosa para el gradiente de sacarosa. Preparar 40% sacarosa pesa 40 g de sacarosa y ajustando la solución a 100 g con 10 mM K-tubos (pH 7.2). Asimismo, preparar 50% (w/w) y 70% (p/p) de sucrosa.
      4. Almacenar las soluciones a-20 ° C. Tenga cuidado de volver a suspender las soluciones de sacarosa correctamente después de descongelar.
    5. Preparar 100 mL de tampón de lisis mezcla 1 mm HEPES (pH 7), 0,5 mM MgCl2y 1% NP-40 y guardar a 4 ° C. Siempre prepare este almacenador intermediario fresco en el día del experimento. Añadir anti-proteasas tabletas en el día del aislamiento del centriolo.
    6. Preparar 1 x solución salina buffer fosfato (PBS) (pH 7.4) mezclando 8 g de NaCl, 2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4y 0.24 g de KH2PO4 en 800 mL de agua destilada H2O. ajustar pH a 7.4 con HCl. traer el volumen de la mezcla a 1 L con agua destilada H2O.

2. aislamiento de C. reinhardtii centriolos

Nota: Vea la figura 1.

  1. Cultura y extensión de las células de C. reinhardtii
    1. Por la tarde el día 1, inocular una cepa cw15 - de una placa sólida en una cultura matraz Erlenmeyer que contenía 10 mL de 1 x grifo. Crecen las células bajo luces fluorescentes blancas (60 µE/m2s) 2 – 3 días a 23 ° C.
    2. El día 3, diluir la cultura 10 x (100 mL) en 1 x grifo y crecen las células bajo la luz de 2 – 3 días a 23 ° C.
    3. El día 6, diluir la cultura 10 x en 1 x grifo para obtener 1 L de la cultura. Crecen las células bajo la luz a 23 ° C hasta que la cultura llegue a un color verde oscuro que indica una densidad celular aproximada de ~ 1 x 107 células/mL26 (día 9-10).
  2. Purificación de C. reinhardtii centriolos
    1. Centrifugar las células cw15 - a 600 x g por 10 min en tubos cónicos de 50 mL. Lavar el pellet de células 1 x con 50 mL de PBS 1 x y centrifugado a 600 x g durante 10 minutos Resuspender el pellet en 100 mL de solución tampón de deflagellation de temperatura con una pipeta.
    2. Deflagellate las células con un shock de pH añadiendo lentamente gotas de ácido acético de 0,5 M a un pH final de 4.5 – 4.7 en un agitador magnético e incubar las células por 2 minutos poco a poco añada gotas de 1 N KOH para restaurar el pH a 7.0.
    3. Centrifugar las células a 600 x g por 10 min eliminar cualquier flagelo separado. Quite el sobrenadante y almacenar el pellet en el hielo. Lavar el precipitado 2 x con 50 mL de PBS 1 x preenfriado a 4 ° C. Luego, girar el diábolo a 600 x g por 10 min a 4 ° C.
    4. Resuspender el precipitado en 30 mL de PBS 1 x y cargar lentamente la suspensión sobre un colchón de sacarosa al 25% de 20 mL sin mezcla (figura 1B).
    5. Centrifugado a 600 x g durante 15 min a 4 ° C para eliminar los flagelos quedan en el sobrenadante; las células se separan en el 25% de sacarosa (figura 1C). Mantener sólo los más 20 mL (flecha roja figura 1C) aspirando cuidadosamente el sobrenadante utilizando un aspirador.
    6. Lave los restantes 20 mL mediante la adición de 20 mL de PBS 1 x fría. Girar la muestra a 600 x g por 10 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado en 10 mL de PBS 1 x frío (a 4 ° C). Asegúrese que no estén grumos para que la lisis siguiente golpea todas las celdas a la vez.
    7. Transferencia resuspendido en una nueva botella de 250 mL. Añadir 100 mL del buffer de lisis con 5.000 unidades de la ADNsa a las células. Es importante añadir el tampón de lisis a las células y no al revés. Incubar la mezcla por 1 h a 4 ° C y mezclar cuidadosamente por inversión la botella cada 15 min sin formar burbujas.
    8. Centrifugar las células sometidas a lisis a 600 x g por 10 min a 4 ° C en un tubo cónico de 50 mL para eliminar cualquier residuo de células. Si la lisis se ha realizado correctamente, el precipitado de células debe ser blanco (figura 1D). Recoger el sobrenadante con una pipeta y cargarlo en un tubo de fondo redondo de 30 mL que contiene un colchón de sacarosa al 60%, a hielo. Luego, girar el tubo a 10.000 x g por 30 min a 4 ° C.
      Nota: Varios tubos de fondo redondo (Tabla de materiales) pueden ser necesaria, según el volumen del sobrenadante.
    9. Aspirar el sobrenadante hasta 1 mL del amortiguador de la sacarosa. Nota la interfaz de amarillo entre 1 mL del sobrenadante restante y 2 mL de amortiguador de la sacarosa. Mezclar suavemente la sacarosa y el sobrenadante restante con la punta cortada P1000. Hacer no agitar con vortex en este paso; de lo contrario, el procentrioles puede perder en esta etapa. Todos los almohadones de sacarosa de la piscina y guardarlos en hielo.
    10. Preparar un gradiente de sacarosa % a 70% 40 en un tubo de paredes delgadas 38,5 mL polipropileno suavemente, añadir 3 mL de 70% de sacarosa (a 4 ° C), seguido de 3 mL de 50% y finalmente, 3 mL de sacarosa al 40%. Cargar las interfaces combinadas en el 40% - 70% sacarosa gradiente; hacerlo lentamente, porque la sacarosa fría es muy viscosa. Equilibrar los tubos con el K-tubos de 10 mM de tampón (pH 7.2) y centrifugar a 68.320 x g (p. ej., con un rotor de SW32Ti) durante 1 h y 15 min a 4 ° C.
    11. Recoger fracciones de 12 x 500 μl a 4 ° C haciendo un agujero en la parte inferior del tubo con una aguja de 0.8 mm sin alterar las capas diferentes de la sacarosa. Con una pipeta de P200 corte, preparar adicional alícuotas de 10 μl de cada fracción que se utilizará para el siguiente de la inmunofluorescencia. Las fracciones de complemento-congelación en nitrógeno líquido.
      Nota: Pueden analizarse aisladas centríolos por microscopía electrónica para asegurar que se preserve la ultraestructura general de los centríolos.

3. cuantificación de aislada centríolos en cubreobjetos: centrifugación y la inmunofluorescencia

Nota: Véase la figura 2.

  1. Preparación de los tubos y cubreobjetos
    1. Utilice tubo de fondo redondo de cristal 1 (15 mL) por fracción a analizar las fracciones centriolar (12 tubos en total).
    2. Poner un cubreobjetos personalizado soporte adaptador (llamado adaptador de aquí en adelante) en el tubo de fondo redondo. Colocar un cubreobjetos estéril 12 mm en el tubo de fondo redondo.
      Nota: Aquí hemos utilizado cubreobjetos de 12 mm, pero el protocolo puede ser adaptado para 18 mm cubreobjetos usando tubos de fondo redondo de 30 ml.
    3. Añadir 5 ml de pre-enfriado 10 mM (pH 7.2) K-tubos a 4 º C. Asegúrese de que el cubreobjetos no es flotante y se queda abajo en el adaptador. Coloque los tubos en hielo.
  2. Centrifugación de los centriolos
    1. Diluir cada fracción μl 10 con 100 μl de frío 10 mM K-tubos (pH 7.2). Resuspender la dilución hasta la completa desaparición de la sacarosa (figura 2A). Cargar cada fracción diluida en un tubo de fondo redondo.
    2. Girar el tubo a 10.000 x g por 10 min (por ejemplo, con un rotor oscilante de cubo de JS-13.1) a 4 ° C.
    3. Recuperar el cubreobjetos introduciendo un dispositivo enganchado a mano en el agujero presente en el borde ranurado del adaptador y levántela suavemente.
      Nota: El dispositivo de gancho a mano puede hacerse con jeringa aguja manualmente enganchado y moldeado a un stick casero (figuras 2B-2D).
    4. Al llegar a la parte superior del tubo de fondo redondo, atrapar el borde del adaptador con un dedo enguantado y quitar el cubreobjetos con la pinza. Tenga cuidado de recordar que el lado del cubreobjetos contiene los centríolos. Proceder a tratar el cubreobjetos para inmunofluorescencia.
  3. Inmunofluorescencia, tinción y proyección de imagen de aislada centríolos de C. reinhardtii
    Nota: Véase la figura 2.
    1. Preparar el material para la inmunofluorescencia que manchaba como sigue.
      1. Prepare una parrilla tinción vidrio de cubierta en una caja de laboratorio de transmisión poliestireno cristal (60 mm de longitud por 50 mm de ancho por 43 mm de altura). Llene con metanol al 100% y almacenar a-20 ° C.
      2. Preparar una cámara húmeda. Para esto, montar la cámara húmeda colocando un pañuelo de papel humedecido en agua junto con el interior los bordes de un cuadrado de Petri (figura 2E). Añadir una pieza de abrigo de laboratorio (véase Tabla de materiales) en el centro de la placa de Petri en la que se colocará la mezcla de anticuerpos durante el procedimiento de inmunofluorescencia (medidas 3.3.2–3.3.3). Cubrir la tapa y la cámara húmeda con papel de aluminio para protegerlo de la luz.
    2. Immunostain los aislada centríolos como sigue.
      1. Fijar el cubreobjetos con los centriolos directamente después de la centrifugación (paso 3.2.4) por incubación durante 5 minutos en el cuadro lleno de metanol de-20 ° C (paso 3.3.1.1).
      2. Quite el cubreobjetos con pinzas y en una caja transparente de laboratorio (véase Tabla de materiales) lleno de 50 mL de PBS 1 x y lavar por 5 min a temperatura ambiente.
      3. Con una pipeta 60 μL de mezcla de anticuerpo primario [anticuerpos primarios diluidos en 1% de albúmina sérica bovina (BSA) y 0.05% Tween-20 en PBS] en la pieza de laboratorio envolver en la cámara húmeda. Coloque cuidadosamente el cubreobjetos encima de la mezcla de anticuerpos con los centriolos directamente frente a la caída. Incubar el cubre-objetos durante 45 minutos con anticuerpos primarios.
        Nota: Los anticuerpos primarios utilizados para generar resultados representativos son conejo policlonales Bld12 (1:300) y α-tubulina de ratón (DM1A) (1:300).
      4. Quite el cubreobjetos y lávelos durante 5 minutos en PBS 1 x, como se describe en el paso 3.3.2.2. Incubar el cubre-objetos durante 45 minutos con los anticuerpos secundarios en PBS con 1% BSA y 0.05% Tween-20.
        Nota: Los anticuerpos secundarios que se utilizaron para generar resultados representativos son cabra anti-ratón juntada a Alexa 488 (1:1, 000) y cabra anti-conejo juntada a Alexa 568 (1:1, 000).
      5. Quite el cubreobjetos y lávelos durante 5 minutos en PBS 1 x, como se describe en el paso 3.3.2.2.
    3. Monte el cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio agregar 3 μl de medio de montaje en el deslizamiento y colocar cuidadosamente el cubreobjetos encima (centríolos hacia el medio de montaje). Selle el borde del cubreobjetos con esmalte de uñas.
    4. Los aislada centríolos en un microscopio confocal 63 X objetivo de aceite con un N.A. de 1.4 la imagen mientras se aplica la deconvolución27 (véase Tabla de materiales).
      Nota: Aquí, se utilizaron los siguientes valores: 500, 545 nm para Alexa 488 y 580-635 nm para Alexa 568.

4. concentración de centríolos en el centro del cubreobjetos

Nota: Consulte la figura 3.

  1. Preparación material
    1. Preparar un tubo de fondo redondo de vidrio de 15 mL en hielo, un adaptador de soporte personalizado cubreobjetos (llamado adaptador de ahora en adelante, fichero .stl siempre como complementario 1 de archivo), un concentrador personalizado (fichero .stl como archivo adicional 2) y 10 mM K-tubos (pH 7.2) a 4 ° C.
    2. Preparar poly-D-lisina (PDL)-cubierto cubreobjetos. Diluir 10 veces la solución stock de 1 mg/mL PDL con H2O. En primer lugar, lavar los cubreobjetos con 70% EtOH, eliminar el etanol y dejar que secar el cubreobjetos. Cubrir el cubreobjetos con el PDL e incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Lavar los cubreobjetos 3 x con agua y deje secar.
      Nota: Cubrir el cubreobjetos con el PDL para aumentar el número de aislada centríolos conectados al cubreobjetos.
  2. Centrifugación
    1. Extremo inferior del concentrador, manteniendo el PDL capa boca abajo y colocar un cubreobjetos estéril 12 mm en el empotrado. Tapa cubreobjetos colocando el adaptador directamente en la parte superior. Invierta el tubo de fondo redondo y coloque sobre el concentrador, cubreobjetos y el adaptador.
    2. Suavemente empuje el conjunto con pinzas hasta que alcance la parte inferior del tubo de fondo redondo e invierta el tubo. Añadir K tubos de 10 mM de tampón (pH 7.2) para el tubo de fondo redondo hasta la parte superior del concentrador. Asegúrese de que no quedan burbujas en el cilindro central del concentrador.
    3. Suavemente agregar 100 μl de tampón 10 mM K-tubos (pH 7.2) a una alícuota que contenga fracción enriquecida centriolo y mezclar completamente el volumen.
    4. Saque 100 μl de tampón de K-tubos de 10 mM (pH 7.2) el centro hueco de la concentradora y añadir 100 μl de la fracción enriquecida centriolar en K-tubos de 10 mM de tampón (pH 7.2) para el centro hueco de la concentradora, teniendo cuidado de que los contenidos permanezcan en el centro hueco.
    5. Centrifugar a 10.000 x g durante 10 min (por ejemplo, con un rotor oscilante de cubo de JS-13.1) en una centrífuga previamente enfriada a 4 ° C.
    6. Retirar el concentrador con pinzas.
    7. Recuperar el cubreobjetos introduciendo un dispositivo enganchado a mano en el agujero presente en el borde ranurado del adaptador y levántela suavemente. Al llegar a la parte superior del tubo de fondo redondo, atrapar el borde del adaptador con un dedo enguantado y quitar el cubreobjetos con la pinza. Tenga cuidado de recordar que el lado del cubreobjetos contiene centríolos. Proceder a tratar el cubreobjetos para inmunofluorescencia.
      Nota: El dispositivo de gancho a mano puede hacerse con una aguja de jeringa manual enganchado y moldeado a un stick casero (Figuras 2B-D).
    8. Realizar la fijación y la inmunofluorescencia coloración de centriolos concentrados como hecho en el paso 3.3.2–3.3.4.

5. solo-partícula promedio

Nota: Consulte la figura 4.

  1. Imagen para el promedio de la solo-partícula
    1. Monte el cubreobjetos sobre un portaobjetos utilizando un medio de montaje antidecoloración regular. Realizar la proyección de imagen de microscopia (SIM 2D) iluminación estructurada con un objetivo CFI Apochromat TIRF (100 X, NA 1.49, WD 0.12 mm) y una parte trasera iluminada cámara CCD EM.
      Nota: El tiempo de la adquisición se estableció en 100 ms en una cámara de lectura de 3 MHz. Se utiliza un objetivo de X 2,5 para la proyección de imagen de SIM.
      Nota: El conjunto de datos presentado aquí fue adquirido en un microscopio SIM 3-d (véase Tabla de materiales).
    2. Imagen de señal de los centriolos por adquirir una pila grande de imágenes que comprende el centriolo total, estableciendo la posición superior e inferior de la pila de Z por encima y por debajo de la señal del centriolo, respectivamente. Proceder a la pila del proyecto y realizar un promedio de solo-partícula según pasos 5.2 y 5.3.
  2. Proyección de una pila
    1. Abra la pila imagen con ImageJ. Haga clic en 'imagen pilas → → proyecto Z'. Establecer el tipo de proyección comoMax intensidad'.
    2. Invierta la imagen haciendo clic en 'Editar → invertir'. Guarde la proyección que se genera (en formato .tif).
  3. Alineación de la solo-partícula con Scipion
    1. Cree un nuevo proyecto en Scipion presionando el rojo ' botónCrear proyecto' en la parte superior de la página. En el panel izquierdo, haga doble clic en 'micrografías de importación → Import'.
    2. Llenar el 'Directorio de archivosde' y 'patrón ' campos según el directorio de datos y nombres. Mantener los parámetros por defecto. Haga clic en 'Ejecutar'.
    3. Haga doble clic en 'Partículas → Picking → xmipp3 - manual de recolección (paso 1)'. Haga clic en el icono de la lupa cerca del campo de 'Micrografías de entrada' y seleccione las imágenes importadas de paso 5.3.1. Haga clic en 'Ejecutar'.
    4. En la ventana recién abierta, seleccione las partículas de los diferentes micrografías haciendo clic en ellos. Cuando haya terminado cada micrografía, haga clic en el botón rojo '+ coordina'.
    5. Haga doble clic en 'Partículas → extracto → xmipp3 - Extracto de partículas'. Haga clic en el icono de la lupa cerca del campo de 'Coordenadas de entrada' y seleccione las coordenadas escogidas de paso 5.3.4. Llenar el 'Tamaño (px) de la caja de la partícula' según las dimensiones de las partículas. En la ficha 'Preprocess' , defina eliminación de polvo: No (puede generar artefactos); Invierta el contraste: No (fondo de partículas negras, blancas); Fase los bancos: No (vinculada a la corrección de CTF); Normalizar: sí.
    6. A continuación, haga clic en 'Ejecutar'. Cuando se hace el trabajo, comprobar las partículas extraídas del trabajo (las fronteras se convierten en la más gruesas) y haga clic en la casilla "analizar resultados (parte inferior izquierda del menú principal).
    7. Haga doble clic en '2D → → xmipp3 de alinear - align con cl2d'. Haga clic en el icono de la lupa cerca del campo de 'Partículas de entrada' y seleccionar las partículas extraídas del paso 5.3.5. No utilice una imagen de referencia. Haga clic en 'Ejecutar'.
    8. Haga doble clic en ' 2D → alinear → más → xmipp3 - aplicar alineación 2d'. Haga clic en el icono de la lupa cerca del campo de 'Partículas de entrada' y seleccionar las partículas alineadas de paso 5.3.7.
    9. Haga clic en 'Ejecutar' como en el paso 5.3.6. Los resultados pueden comprobarse haciendo clic en 'Analizar resultados' después de la selección de la caja de trabajo.
    10. Haga doble clic en 'Partículas → máscara → xmipp3 - aplicar máscara 2d'.
    11. Haga clic en el icono de la lupa cerca del campo de 'Partículas de entrada' y seleccionar las partículas alineadas de paso 5.3.9. La 'Fuente de la máscara' se encuentra a la 'Geometría'. A continuación, establezca los parámetros de la máscara como tipo de mascarilla: Circular; Radio (px): en busca de una partícula (un centriolo) sin nada alrededor de él, haga clic en el 'varita mágica ' icono de la izquierda que se abre una ventana para ayudar a encontrar el perfecto valor; Centro de cambio: No (si la partícula está perfectamente centrada) o sí (si se desplaza la partícula); Offset X-center: según la posición de la partícula; Desplazamiento del centro: según la posición de la partícula. Haga clic en 'Ejecutar'.
    12. Utilice el botón ' analizar resultados ' para comprobar si la máscara se aplica correctamente. Si no, haga clic derecho en el trabajo de 'Aplicar máscara 2d' y seleccione 'Edit'. Modificar los parámetros de la máscara (tamaño o turnos) y ejecutar otra vez con el 'Execute' botón.
    13. Haga doble clic en '2D → clasificar → xmipp3 - cl2d'.
    14. Haga clic en el icono de la lupa cerca del campo de 'Partículas de entrada' y seleccionar las partículas enmascaradas de paso 5.3.11. El número de clases debe obtener aproximadamente 50 partículas por clase. Haga clic en 'Ejecutar'.
    15. Comprobar los resultados haciendo clic en el botón ' analizar resultados ' . En la ventana abierta, pinche en el icono de 'ojo' junto a "Qué ver".
    16. La nueva ventana permite la inspección de las clases generadas mediante la selección de 'Classes2D' en el menú de 'Bloque' . Compruebe el contenido de cada clase seleccionando 'Class00N_Particles' en el mismo menú. Inspeccione cada clase para identificar cuáles contienen partículas único malas. Volver a la vista 'Classes2D' y seleccione las clases con buen partículas haciendo clic en cada uno. Es posible seleccionar varias categorías manteniendo la tecla 'Ctrl' pulsada durante la selección.
    17. Cuando todas las clases con buen partículas han sido seleccionadas, haga clic en '+ partículas' para crear un subconjunto con estas partículas.
    18. En la misma ventana, seleccione unos conjuntos de clases que representan diferentes orientaciones de las partículas. Crear un subconjunto nuevo haciendo clic en '+ medias'.
    19. Para cada orientación/promedio seleccionado, haga lo siguiente.
      1. Haga doble clic en '2D → → xmipp3 de alinear - align con cl2d'.
      2. Haga clic en el icono de la lupa cerca del campo de 'Partículas de entrada' y seleccionar las partículas buena de paso 5.3.17. Establezca 'Uso una imagen de referencia' 'Sí'. Haga clic en el icono de la lupa cerca del campo de la 'Imagen de referencia' y haga clic en la izquierda de la flecha blanca para el trabajo 'Crear subconjunto' de paso 5.3.18 y seleccionar la imagen a usar como referencia. Haga doble clic en un objeto para abrir en una ventana independiente y comprobar qué objeto es. Haga clic en 'Ejecutar'.
      3. Haga doble clic en ' 2D → alinear → más → xmipp3 - aplicar alineación 2d'. Haga clic en el icono de la lupa cerca del campo de 'Partículas de entrada' y seleccionar las partículas alineadas del paso 5.3.19.2.
      4. Haga clic en 'Ejecutar'.
      5. Compruebe el resultado de la alineación ('Analizar resultados); mostrará las partículas alineadas y el promedio de estas partículas.
      6. Si la media es buena y las partículas se orientan en la misma forma, excepto la media haciendo clic en ' Advanced → ImageJ' y guardar la imagen con ImageJ.
      7. Si la media puede ser mejorada, seleccione todas las imágenes bien orientadas y crear un subconjunto nuevo con el botón '+ partículas' . Repetir pasos 5.3.19.1–5.3.19.4 hasta que el subconjunto se limpia (todas las malas partículas quitadas). Cada vez que la alineación realiza (paso 5.3.19.2), la referencia se establece en la última media generada (de iteración a iteración, los aumentos de calidad media).

Representative Results

C. reinhardtii centriolo aislamiento:
Para aislar centriolos, cw15- C. reinhardtii células fueron cultivadas en cultivo líquido durante varios días bajo luz y peleteadas posteriormente por centrifugación a 600 x g por 10 min pellet las células fueron lavadas 1 x con PBS y resuspendidos en un deflagellation antes de búfer deflagellation realizando un shock de pH con ácido acético de 0,5 M a un pH final de 4.5 – 4.7 por 2 min(figura 1). Una adición de 1 KOH de N se utilizó para restaurar el pH a 7.0. Para separar flagelos separadas de cuerpos de la célula, las células deflagellated primero se centrifugaron para eliminar la mayor parte de los flagelos. El pellet fue lavado x 2 con PBS y resuspendió en 30 mL de PBS antes de cargar lentamente sobre un colchón de sacarosa al 25% (figura 1B). El tubo fue hecho girar a 600 x g durante 15 min a 4 ° C para eliminar la mayor parte de los flagelos separadas. Después de la centrifugación, los cuerpos celulares en el cojín de sacarosa (figura 1C) y recuperados por quitando los aproximadamente 30 mL de sobrenadante (hasta la flecha roja en la figura 1C). La resultante 20 mL de células lavadas luego se resuspendió en 20 mL de PBS frío y centrifugar a 600 x g por 10 min. A continuación, se descartó el sobrenadante y las células completamente se resuspendió en 10 mL de PBS. Las células se transfirieron a un frasco de 250 mL y el tampón de lisis se añadió a las células resuspendidas a la vez. DNasa fue agregado a la lisis y se incubó por 1 h a 4 ° C. Después de un paso de centrifugación para eliminar restos celulares (véase la pelotilla blanca en figura 1D), el sobrenadante fue recogido y cargado con cuidado sobre un colchón de sacarosa al 60% de 2 mL antes de centrifugar a 10.000 x g por 30 min a 4 ° C. Tenga en cuenta que para 100 mL de lisis, 8 tubos de 15 mL se usa para realizar este paso, correspondiente a 12,5 mL de tampón de lisis en 2 mL de sacarosa por el tubo. Después de la centrifugación, se eliminó la mayor parte del sobrenadante a 1 mL por encima del cojín. 1 mL de sobrenadante restante fue recogido con el cojín de 2 mL y luego mezclado y agrupada para obtener un volumen final de 24 mL. La piscina entonces fue cargada en un 40%, 50%, 70%-sacarosa degradado y centrifugada a 68.320 x g durante 1 h y 15 min a 4 ° C. Finalmente, se recolectaron los aislada centríolos haciendo un agujero en la parte inferior del tubo de centrifugación con una aguja y las gotas fueron recolectadas en fracciones de 12 x 500 μl. Debido a la alta densidad de la sacarosa diferentes, la gota formada muy lentamente al principio (70% de sacarosa) y luego más rápidamente (40% de sacarosa).

Inmunofluorescencia de aislada centríolos
Para evaluar la calidad del procedimiento de aislamiento, 10 μl de cada fracción recogida de gradiente se centrifugó entonces en un cubreobjetos usando un cubreobjetos soporte adaptador (figura 2A-2D). Importante, para quitar con seguridad el cubreobjetos, diseñó un dispositivo gancho personalizado (figura 2B). A continuación, los cubreobjetos se analizaron por inmunofluorescencia. En este estudio se utilizaron anticuerpos contra CrSAS-6(Bld12p) para indicar la presencia de la estructura de cartwheel y α-tubulina (DMA1) para destacar la pared centriolar. Contando el número de centriolos que eran positivas para CrSAS-6 y α-tubulina por campo de visión y luego calculando el número total de centriolos por fracciones, fue posible determinar qué fracciones se enriquecieron para aislada centríolos ( Figura 2F-2 H). Curiosamente, 6 fracciones se enriquecieron de centriolos (figura 2F y 2 G, fracciones #1 – 6), con un pico de fracción #3, mientras que las últimas fracciones no eran, lo que indica que la purificación trabajado. Tenga en cuenta que en este experimento particular, 95% de los centríolos total eran positivo para CrSAS-6 y α-tubulina en fracción #3. Esto indica que más aisladas centríolos conservan sus volteretas. Si no hay enriquecimiento de centriolos se observa en la primera fracción, el procedimiento de aislamiento no funciona y debe repetirse. Tenga en cuenta que algunas piezas flagelares pueden observarse principalmente en las fracciones carece de centriolos.

A continuación, para calcular el número total de centriolos por μl, el número de centriolo por campo de visión debe ser multiplicado por la relación que se presenta en la figura 2H. Entonces, el número resultante se debe dividir por el volumen de la fracción se usa para la inmunofluorescencia para obtener el número de centriolos por μl. En este procedimiento de aislamiento especial, la fracción más enriquecida contiene centriolos cerca de 37 para un área de 0,00846 mm2 (con un campo de visión de 92 x 92 μm2). La superficie de la sección del tubo era 7,5 mm de radio con una superficie total de 176 mm2. La proporción correspondiente fue entonces 176/0.00846 = 20,803.8, hasta un total de 769.740 centriolos (37 x 20, 803.8) en 10 μl. Por lo tanto, el número de centriolos en 1 μl fue 76.974.

Concentración de aislada centríolos en cubreobjetos:
Aumentar el número de centriolos por campo aumenta la posibilidad de detectar orientación inequívoca centriolo, así como aumentando la posibilidad de detectar orientaciones similares que pueden ser utilizados para otros procedimientos promedio de partícula. Centriolos de las fracciones concentradas son aún escasos en el cubreobjetos, desarrollamos un accesorio de centrifugación para concentrar centríolos en el cubreobjetos (figura 3A) nombrada de un concentrador. Tenga en cuenta que un archivo .stl con las medidas precisas para la impresión 3D está provisto de este manuscrito.

En primer lugar, un cubreobjetos de 12 mm se montó en el concentrador (figura 3B). El adaptador se coloca encima el cubreobjetos y el tubo de fondo redondo fue invertido y coloca sobre el adaptador montado y concentrador. El tubo de fondo redondo fue entonces ligeramente invertido, permitiendo la carga de la muestra (Protocolo paso 4.2). Los centriolos luego se centrifugaron a 10.000 x g por 10 min a 4 ° C. Después de eso, los centríolos fueron sometidos a inmunofluorescencia y manchados de CrSAS-6/Bld12p y α-tubulina (figura 3-3E). Lo importante, sin concentrador, centriolos cerca de 30 fueron considerados por el campo visual (figura 3C), mientras que 183 centríolos fueron vistos por campo de visión cuando el concentrador fue utilizado (figura 3D-3F). Tenga en cuenta que los centríolos cubrieron sólo un disco de 4 mm de diámetro en el centro del cubreobjetos. Este resultado demuestra que el paso de la concentración funciona y permite un 6-fold enriquecimiento de centriolos en una región definida de cubreobjetos, así facilitando su detección y proyección de imagen.

Solo-partícula fluorescente promedio de aislados C. reinhardtii centriolos:
Aquí, usando microscopía SIM que puede llegar a una resolución de cerca de 120 nm, centríolos manchados para la tubulina de monoglutamylated (GT335, figura 4), una modificación de la tubulina en microtúbulos centriolar, fueron imagen24. C. reinhardtii centriolos son alrededor de 500 nm largo, siempre en pares y a menudo encontrado con asociados, recientemente duplicar órganos probasal (denominados procentrioles en adelante) y estriado de las fibras de microtúbulos asociados19. Por lo tanto, esta Asamblea final era grande cerca de 1 μm. Por esta razón y para los centriolos en su totalidad la imagen, recomendamos adquirir un Z-stack en los aislada centríolos.

Aquí, después de la adquisición, se genera una imagen final mediante la realización de una proyección de intensidad máxima con ImageJ28 (proyección de la intensidad del proyecto imagen/pilas/Z/max, figura 4B). De este tipo de imágenes, se realizó un análisis de la solo-partícula utilizando el software de la microscopia del cryo-electrón para hacer clases de centriolos con orientaciones similares, y luego un promedio fue realizado. Para ello, el color de la imagen primero fue invertido con el fin de visualizar mejor los objetos (figura 4C). Centríolos fueron seleccionadas manualmente en una caja centrada sobre cada partícula usando el libremente disponible de software Scipion29 que integra varios programas microscopia electrónica tales como Xmipp3 (figura 4D). Tenga en cuenta que el tamaño de la caja tiene que ser definido por el usuario. Aquí, en cajas de 50 x 50 píxeles para un tamaño de píxel de 31.84 nm fueron utilizados. A continuación, todas las partículas fueron extraídos (figura 4E) y alineado con Xmipp3 (figura 4F). A continuación, se aplicó una máscara circular de 12 píxeles de radio para aislar cada centriolo del par centriolar (figura 4G). Las partículas entonces se clasificaron, usando Xmipp3, para generar varios promedios. Sólo se mantuvieron promedios de clase homogénea, lo que significa que las partículas que difieren de los promedios de la clase fueron excluidas manualmente. Este paso se repitió con el fin de generar un promedio casi perfecto para cada orientación solicitada. Después de cinco iteraciones, se generaron dos tipos de medias: una vista superior de 63 objetos (figura 4H) y una cara visión desde 98 partículas (figura 4) de monoglutamylated centriolos. Se determinaron las dimensiones del objeto por medir la distancia entre picos del perfil del terreno de intensidad a lo largo de la señal de monoglutamylation.

Importante, la longitud de la media de la clase de vista lateral es de 260 nm con un diámetro de 250 nm, comparable a la señal de la tubulina de monoglutamylated medida que fue demostrada para localizar a una región de 286 ± 33 nm de longitud dentro de la base del centriolo17.

Figure 1
Figura 1 : Purificación de la C. reinhardtii centriolos. (A) es una representación esquemática de cada paso que conduce al aislamiento de C. reinhardtii centriolos. Incluye pasos representativos del Protocolo (B) antes y (C) después de la centrifugación en gradiente de sacarosa al 25%. La flecha roja en el panel C indica el volumen mínimo para mantener después de la centrifugación. (D) este panel muestra la pelotilla blanca de las células sometidas a lisis después de la centrifugación. La flecha negra indica la pelotilla. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 2
Figura 2 : Instalación de centrifugación para realizar inmunofluorescencia en aislada centríolos. (A) 10 μl de cada fracción recogida se diluye primero en 100 μl de K-tubos de 10 mM (pH 7.2). (B) es una representación esquemática de los dispositivos de centrifugación, que comprende un tubo de 15 mL fondo redondo, un cubreobjetos de 12 mm, un adaptador para el cubreobjetos y un dispositivo enganchado a la medida para recuperar el cubreobjetos después de la centrifugación. Los paneles C y D muestran dibujos explicando cómo recuperar el cubreobjetos después de la centrifugación. (C) Coloque la herramienta de forma de gancho en el agujero presente en el borde ranurado del adaptador y (D) Tire suavemente. (E) estas son fotos de la cámara húmeda necesitado para realizar la proyección de imagen de la inmunofluorescencia. La flecha indica el cubreobjetos de 12 mm. (F) Estos son representativas imágenes confocales 63 X (zoom 2) fracciones degradados #1-8, recogidos durante el proceso de purificación y mancharon para CrSAS-6 (rojo) y la α-tubulina (verde). Los márgenes corresponden a la región indicada por un cuadro blanco en las vistas de ampliación más bajos. Barra de escala = 10 μm. (G) este es un gráfico que representa el número de positivos de centriolos CrSAS-6 y α-tubulina por campo de visión en cada fracción. Tenga en cuenta el enriquecimiento en fracciones #1-6. El número promedio de centriolos por campo en cada fracción: #1 = 16,3 ± 4.7, #2 = 24.0 ± 4.6, #3 = 37.0 ± 17.0, #4 = 23,3 ± 11.4, #5 = 14.3 ± 2.1, #6 = ± 13.7 9.3, #7 = 2.7 ± 1.2, #8 = 1,0 ± 0.0, #9 = 1,0 ± 0.0, #10 = ± 0.0 0.0, #11 = 0,3 ± 0,6, #12 = ± 0.0 0.0. Para cada fracción, 3 campos al azar fueron reflejados. Tenga en cuenta que, cuando cuenta la fracción más enriquecida #3, encontramos que el 95% de los centriolos son positivo para CrSAS-6 y α-tubulina (n = 205 centriolos). (H) A proporción del número de centríolos presentes en el área de medición de las micrografías se utiliza para calcular el número total de centríolos presentes en la zona del tubo. El número de centriolo por μl puede calcularse de las fracciones μl originalmente se centrifugó 10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 3
Figura 3 : Aisladas centríolos son centrifugadas utilizando concentradores de. (A) este panel muestra los dispositivos de centrifugación necesarios concentrar centriolos en cubreobjetos antes de inmunofluorescencia, incluyendo un tubo de 15 mL fondo redondo, un concentrador, un cubreobjetos de 12 mm y un aparato adaptador de soporte. (B) este panel muestra los pasos para montar el aparato de centrifugación. C-E los paneles muestran imágenes confocales de teñido para CrSAS-6 (rojo) o α-tubulina (verde) (C) sin (D-E) con el concentrador de centriolos. Los márgenes corresponden a la región indicada por un cuadro blanco en las vistas de ampliación más bajos. La barra de escala es 10 μm. Nota que centriolos están enriquecidos en el centro del cubreobjetos (la línea punteada representa la frontera de la zona concentrada). (F) esta gráfica representa el número de centriolos por campo de visión sin y con el concentrador. Se analizaron al azar cinco campos de vista. Es el número promedio de centriolos, sin concentrador, 29,8 ± 2.9 y con el concentrador, 182.6 ± 11.5, P < 0.0001. La significación estadística fue determinada por un impar t-test. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Promedio de la solo-partícula en aislados C. reinhardtii centriolos. (A) este panel muestra Z pila imágenes de centriolos teñidas con GT335 y adquirido utilizando un microscopio SIM. (B) estos paneles muestran una proyección de intensidad máxima Z de las imágenes apiladas. Barra de escala = 1 μm. (C) estos paneles muestran una imagen representativa con un contraste invertido. El recuadro representa un zoom-in para visualizar los centriolos mejor. (D) estas partículas de Mostrar paneles de recolección. El recuadro indica cómo fueron seleccionadas las partículas. (E) son ejemplos de 5 extraídas las partículas. (F) este panel muestra las partículas después de la alineación. (G) este panel muestra las partículas después de aplicar una mascarilla. Paneles de H y muestran dos medias de la clase: (H) una tapa vista (partículas de 63) y () una vista lateral (98 partículas). Las dobles flechas indican las dimensiones de la señal GT335. Barra de escala = 250 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

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Discussion

Uno de los retos en biología es descifrar la localización precisa de las proteínas en un contexto arquitectónico. El centriolo es una estructura ideal para aplicar estos métodos, ya que su arquitectura ha sido estudiada usando la tomografía del cryo-electrón, revelando características ultraestructurales interesantes a lo largo de su longitud. Sin embargo, debido a sus dimensiones cerca del límite de resolución en microscopía óptica, es difícil localizar precisamente una proteína por inmunofluorescencia en una región estructural del centriolo usando microscopios convencionales30.

La resolución en microscopía óptica está limitada por la difracción de la luz que da, aproximadamente, una resolución lateral máxima de 200 nm en microscopía óptica24. Sin embargo, este límite ha sido desviado por uno de los principales avances de los últimos 20 años en microscopía óptica: la invención de los métodos de súper resolución. Estos enfoques pueden obtener imágenes más allá de los límites de la difracción en diferentes resoluciones: 120 nm para SIM, alrededor de 50 nm para agotamiento estimulante de la emisión (STED) y 20 – 40 nm para la localización de una sola molécula de microscopía (SMLM)24. Con estos nuevos desarrollos de la microscopía de superresolución, las subregiones estructurales del centriolo son alcanzables. Sin embargo, en la práctica, es todavía difícil determinar con precisión la localización de una proteína a un elemento estructural para la razón principal que los centríolos madurados existen sólo 2 copias por célula y orientaciones al azar, que hace que la interpretación de localización difícil. Por esta razón, un protocolo se estableció que permite a los investigadores a la imagen de súper-resolución un gran número de centriolos, aumentando la posibilidad de observar orientaciones no ambigua. Lo importante es que, como este método se basa en el uso de aislada centríolos, nos proporciona un método para purificar intacto C. reinhardtii centriolos que contienen centriolos madurados y procentrioles.

Finalmente, debido a la gama de orientaciones centriolo que puede ser reflejada con este protocolo, análisis de la solo-partícula pueden ser aplicado usando microscopia electrónica software. Esto resulta en la generación de clases promedio de centriolos en una orientación particular. Lo importante, entonces pueden utilizarse estas imágenes 2-D para evaluar la localización de una proteína específica en el centriolo. De hecho, este método puede aplicarse a imágenes de resolución súper doble color y un color puede usarse para revelar el esqueleto de centriolo (p. ej., tubulina), mientras que el otro color puede ser atribuido a una proteína específica de centriolar. Restando los promedios obtenidos con un color o dos colores, es más fácil registrar una proteína en el centriolo (proximal, central y distal). Tenga en cuenta que los dos canales deben estar alineados con precisión para evitar cualquier interpretación equívoca. Por otra parte, promedios de vistas superior ayudará a descifrar si una proteína se localiza dentro del lumen centriolar, a lo largo de la pared del microtúbulo, o fuera del centriolo.

Este método tiene la ventaja de determinar la localización de proteínas específicas que puede ser difícil de localizar lo contrario debido a la heterogénea de etiquetado. Tenga en cuenta que otros métodos para asignar las proteínas dentro de los centriolos se han descrito en correlativo 3D SIM/SMLM con, por ejemplo, evaluar las orientaciones específicas de los centríolos determinando el perfil elíptico de un marcador formando un toro alrededor de la centriolo por proyección de imagen de SIM. Utilizando este parámetro, es posible localizar la proteína con una precisión de 4 – 5 nm30. Observe también que el método descrito aquí utiliza aisladas centríolos con procentrioles intacta, una señal de que la arquitectura del centriolo es probablemente en gran parte conservado. Sin embargo, no podemos excluir que algunas de las características arquitectónicas son alterados durante la purificación, como el diámetro del centriolo que varían con la concentración de cationes divalentes como amplificado con el aislamiento del centrosoma humano5.

Uno de los pasos críticos del protocolo presentado aquí es obtener lo suficientemente concentrados aisladas centríolos en diferentes orientaciones susceptibles de Fluo-SPA. Para ello, primero asegurar la pureza y la eficacia del procedimiento de aislamiento de centriolo. Una baja concentración de aislada centríolos evitará la proyección de imagen adecuada y más procesamiento de imágenes. Para ello, nos proporciona un método para enriquecer el número de centriolos por campo de visión. Dependiendo del número de centríolos en la fracción que se usa, debe ajustarse el volumen cargado en el concentrador de oxígeno, con un volumen máximo de 250 μl.

Lo importante, este método ha sido desarrollado para una pared de célula menos células cw15 C. reinhardtii . En esta variedad, la fragilidad de la pared celular permite una adecuada lisis de las células y, por tanto, la liberación de su contenido. Este protocolo no es eficaz para el tipo salvaje C. reinhardtii de las células, como la pared celular previene una lisis adecuada. Estrategias alternativas como sonicación o preincubación de las células con AUTOLISINA, una enzima que puede degradar la pared celular31, tendría que poner en marcha para alterar la pared celular antes de aplicar el protocolo de aislamiento presentado aquí.

Esta configuración puede utilizarse con diferentes tipos de microscopios, desde microscopios confocales convencionales para microscopios de súper resolución de alto rendimiento dedicado. Tenga en cuenta que al hacer el SMLM, un buffer especial se requiere para la adecuada proyección de imagen y, por lo tanto, debe utilizarse una cámara adaptada a un cubreobjetos de 12 mm con el tampón sobre el cubreobjetos. La proyección de imagen posterior se realizará con microscopios invertidos. Si la configuración del microscopio no permite un cubreobjetos de 12 mm, el protocolo presentado aquí puede aplicarse a 18 mm cubreobjetos usando un tubo de fondo redondo de 30 mL y un adaptador modificado y concentrador. También es importante a la nota que la calidad de la reconstrucción final en SMLM dependerá de la calidad de la tinción y el anticuerpo primario utilizado, así como el método de fijación.

En Resumen, estamos proporcionando un método que puede aplicarse a la imagen numerosos centriolos seguidos por Fluo-SPA que generará promedios de centriolos en diversas orientaciones, lo que ayuda a localizar la proteína centriolar con precisión. Lo importante, este método puede aplicarse más generalmente aisladas centríolos de otras especies, a otros orgánulos o grandes asambleas macromoleculares. Por último, el enfoque de preparación de la muestra presentó aquí, combinado con el reciente desarrollo de algoritmo para el análisis de la solo-partícula fluorescente SMLM datos32, podría abrir aún más mejoría en la cartografía molecular de grandes macromoléculas Asambleas.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Pierre Gönczy Bioimagen y plataforma óptica (BIOP) en el École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), Lausana, Suiza, donde se adquirieron las imágenes SIM de los centríolos. Nikolai Klena y Davide Gambarotto cuentan con la beca a partir de Consejo Europeo de investigación (CEI) (StG) 715289 (acento) y Maeva Le Guennec, Paul Guichard y Virginie Hamel por la PP00P3_157517 de la Fundación de ciencia nacional suizo (FNS). Susanne Borgers es apoyado por la Universidad de Ginebra.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse monoclonal anti-apha tubulin (clone DM1A) Abcam ab7291  dilution 1:300
DNaseI Roche 10104159001
12 mm coverslips Roth YX03.1
18 mm coverslips Roth LH23.1
K2HPO4 Fluka 60355
KH2PO4 Fluka 60230
Tris base Biosolve Chimie SARL 0020092391BS
acetic acid Carlo Erba Reagents 524520
NH4Cl Sigma A-4514
CaCl2 Sigma C-7902
MgSO4 Sigma 63140-500G-F
steritop filter Millipore SCGPT05RE
sucrose Sigma S7903-1KG
HEPES AppliChem PanReac A3724,0250
PIPES Sigma P6757-500G
MgCl2 ACROS ORGANICS 197530010
NP-40 AppliChem PanReac A1694,0250
Round-bottom (Kimble) tubes 15 mL Fisherscientific 09-500-34
Round-bottom (Kimble) tubes 30 mL Fisherscientific 09-500-37
cover glass staining rack Thomas scientific 8542E40
crystal polystyrene transmission lab box FISHERS 11712944
Methanol VWR 20864.32
BSA Roche 10735086001
Triton X100 Roth 3051.3
goat anti-mouse coupled to Alexa 488  invitrogen A11029 dilution 1:1,000
goat anti-rabbit coupled to Alexa 568 invitrogen A11036 dilution 1:1,000
mounting medium abcam ab188804
Tube, thinwall polypropylene Beckman Coulter 326823
Poly-D-Lysine 1 mg/mL SIGMA  A-003-E
Mouse monoclonal anti-Polyglutamylation modification mAb (GT335) Adipogen AG-20B-0020 dilution 1:1,000
glycerol mounting medium with DAPI and DABCO Abcam ab188804
50 mL conical tubes Falcon 14-432-22
Eppendorf 5810R centrifuge Eppendorf 5811000622
Beckman JS-13.1 swinging bucket rotor Beckman Coulter 346963
Beckman SW 32Ti rotor Beckman Coulter 369694
parafilm Bemis  13-374-10
Leica TCS SP8 with Hyvolution mode Leica 
OSRAM L18W/954 LUMILUX  Luxe Daylight/ OSRAM
Whatman filter paper Sigma  WHA1001325
CrSAS-6/Bld12 antibody dilution 1:300 (Hamel el al., 2014)
Scipion http://scipion.i2pc.es/
EM CCD camera (Andor iXON DU897) Andor

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Aislamiento y la proyección de imagen de fluorescencia para la reconstrucción de la solo-partícula de <em>Chlamydomonas</em> centriolos
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Klena, N., Gambarotto, D., Le… More

Klena, N., Gambarotto, D., Le Guennec, M., Borgers, S., Guichard, P., Hamel, V. Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles. J. Vis. Exp. (139), e58109, doi:10.3791/58109 (2018).

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