Summary
تبادل شاردة الأسلوب القائم على راتنج، تتكيف مع سائل يدل بيوايروسول المستندة إلى اصطدام لأخذ العينات من الفيروسات. عندما يقترن مع الكشف الجزيئي المصب، الأسلوب يسمح للكشف عن الفيروسات من بيوايروسولس سهلة وحساسة.
Abstract
هذا البروتوكول يوضح أسلوب أخذ عينات بيوايروسول مخصصة للبحث عن الفيروسات. في هذا النظام، مقرونة بأجهزة جمع العينات السائلة الهواء المستندة إلى اصطدام لتركيز فعال من الفيروسات مشحونة سلبا على راتنج تبادل شاردة من بيوايروسولس. وهكذا، الراتنج بمثابة خطوة إضافية تركز في سير العمل بيوايروسول أخذ العينات. ثم يتم استخراج الحمض النووي من الجسيمات الفيروسية مباشرة من راتنج تبادل شاردة، مع مناسبة للتحليلات الجزيئية العينة الناتجة عن ذلك. علاوة على ذلك، يصف هذا البروتوكول غرفة بيوايروسول المواصفات قادرة على توليد بيوايروسولس محملة بالفيروس ضمن مجموعة متنوعة من الظروف البيئية، والسماح للرصد المستمر للمتغيرات البيئية مثل درجة الحرارة والرطوبة، سرعة الرياح، وتركيز الهباء الجوي الشامل. والميزة الرئيسية لاستخدام هذا البروتوكول هو زيادة الحساسية للكشف عن الفيروس، حسب تقييمها عن طريق مقارنة مباشرة إلى مرطام سائلة تقليدية غير معدلة. وتشمل المزايا الأخرى القدرة على التركيز الفيروسات مشحونة سلبا المتنوعة، منخفضة التكلفة من راتنج تبادل شاردة (~$0.14 كل عينة)، وسهولة الاستخدام. عجز هذا البروتوكول لتقييم العدوى جسيمات الفيروسية تمتز الراتنج من عيوبها، ويحتمل أن تكون الحاجة إلى الاستفادة المثلى من المخزن المؤقت العينات السائلة المستخدمة داخل مرطام.
Introduction
والغرض من هذا الأسلوب توفير منبر أخذ عينات بيوايروسول حساسة للغاية لتسهيل الكشف الجزيئي للفيروسات مشحونة سلبا من بيوايروسولس. الكائنات الحية الدقيقة، بما في ذلك الجسيمات الفيروسية، يمكن أن يعيش في بيوايروسولس لفترات طويلة من الزمن1. بيوايروسولس يمكن السفر عبر مسافات طويلة نسبيا والحفاظ على الاستمرارية والعدوى، كما يدل على ذلك تفشي المرض المهلك التي نشأت من أبراج تقع على بعد 6 كم من الأفراد المتضررين التبريد الصناعي و أسفرت عن وفاة 182. يمكن أن يحدث في إعدادات متعددة الإرسال غير المباشر للفيروسات إلى البشر بوساطة من بيوايروسولس ولقد أظهر تفشي نوروفيروس في المدارس والمطاعم3،4. وبالمثل، يمكن أن يحدث انتقال بيوايروسول من الفيروسات في إعدادات الزراعية كما هو الحال في مزارع الدواجن والخنازير، مع هذا الطريق انتقال حيث تعتبر عاملاً رئيسيا في انتقال الفيروسات بين مرافق الإنتاج5، 6 , 7 , 8 , 9.
فعالة لأخذ العينات من بيوايروسولس محملة بالفيروس يسمح للتحسين في التشخيص السريع والتأهب لمنع اندلاع، كما هو مبين في المظاهرات في أي إتش 5 أسواق الإنفلونزا تم الكشف عن فيروسات من بيوايروسولس في الحيوانات الحية في الصين الولايات المتحدة10،11. تقنيات أخذ العينات بيوايروسول الحالية تنطوي على عدد من المبادئ التقاط الجسيمات مختلفة، ويمكن تصنيف على نطاق واسع في إيمبينجيرس، والأعاصير، والرواطم، والمرشحات12. وخارج نطاق هذا البروتوكول استفاضة وتغطي جميع مزايا وعيوب هذه المنابر لأخذ عينات فيروسات من بيوايروسولس؛ ومع ذلك، يمكن القول بأن غالبية هذه الأجهزة أخذ العينات لا يكون قد تم تحسين المجموعة من الفيروسات و bacteriophages13. وعلاوة على ذلك، العدوى الفيروسية الجسيمات تتأثر سلبيا غالباً، مع السائل إيمبينجيرس نظرت إلى الحفاظ على العدوى الفيروسية أكثر فعالية من أخذ عينات من الأجهزة مثل الرواطم أو مرشحات الصلبة14. ومع ذلك، عيب واحد من اصطدام السائل هو تأثير تمييع الهدف، الذي يحدث بسبب فيروسات يتم جمعها بكميات كبيرة نسبيا (عادة مل إيه تو زيرو) من السائل في وعاء جمع. عيب هام آخر ينطوي على كفاءة دون المستوى الأمثل من إيمبينجيرس السائلة تركيز جسيمات < 0.5 ميكرومتر في الحجم15. ومع ذلك، يمكن تحسين القبض على كفاءة هذه الأجهزة قبل التثبيت في مصفوفات الصلبة، التثبيت يمكن أن يعزز الحفاظ على الأحماض النووية الفيروسية والعدوى الفيروسية16،17.
وقد أثبتنا سابقا أن راتنج تبادل شاردة أداة فعالة لالتقاط وتركيز للفيروسات من مصفوفات السائل، بما في ذلك bacteriophages والجيش الملكي النيبالي وفيروس التهاب الكبد الوبائي أ، إتش البشري وفيروس الروتا18،19 ،20. كما حددتها الشركة المصنعة، راتنج تبادل شاردة المستخدمة في هذا العمل راتنج تبادل البوليستيرين شاردة قاعدة قوية ماكروريتيكولار فيها أمين رباعي فونكتيوناليزيد المجموعات جاذبية التوسط والقبض على الأنيونات في متوسط سائل21 . ونتيجة لذلك، يتوقع راتنج تبادل شاردة التقاط الفيروسات مع رسوم السطحية الصافية سلبية، بما في ذلك العديد من الفيروسات المعوية، وفيروسات الإنفلونزا وفيروسات أخرى ذات صلة بالصحة العامة والحيوانية.
البروتوكول الحالي ينطوي على إضافة راتنج تبادل شاردة إلى مرطام سائلة. في هذا النظام، الراتنج بمثابة خطوة تركز ثانوي للجسيمات الفيروسية في السائل مرطام. يمكن ثم التيد الأحماض النووية مباشرة بكميات صغيرة، توفير عينة مركزة للتحليلات الجزيئية. وهكذا، والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو التحسن الذي طرأ على حساسية الكشف عن الفيروس، أساسا من خلال تخفيض حجم العينة. بالإضافة إلى ذلك، بسبب الاستيلاء غير محدد الأصيل المشحون سلبا على فيروسات، الأسلوب المرجح المطبقة للكشف عن عدد كبير من الفيروسات للفائدة. ويتجلى الأسلوب هنا، لسلالات لقاح من نوع A وفيروسات الإنفلونزا نوع B و coliphage فرنا MS2 (MS2). بعد اكتشاف هذه الفيروسات باستخدام فحوصات بكر qRT القياسية كما هو موضح سابقا22. لا ينبغي أن تتوقع المستخدم نقطة النهاية تواجه صعوبات في أداء هذا الأسلوب، لأن إدخال تعديلات على القائمة حاليا لا تشكل معدات اختلالات كبيرة في تدفق التقليدية بيوايروسول أخذ العينات والتحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-الإعداد لقاعة بيوايروسول (انظر الشكل 2)
-
قبل تحميل إيمبينجيرس السائل مع 20 مل من 0.01 م الفوسفات مخزنة المالحة، درجة الحموضة 7.5 (PBS).
- إضافة 0.5 غ راتنج تبادل شاردة وتعليق ضمن برنامج تلفزيوني واحد من إيمبينجيرس السائلة، مع مرطام سائل آخر كعنصر تحكم.
- موقف إيمبينجيرس السائلة بالتوازي داخل الدائرة بيوايروسول باستخدام المشبك تقف مع مداخل الأيروسول التي تواجه البخاخات.
ملاحظة: انظر الشكل 2 لمزيد من التفاصيل. - شارك موقع رصد الهباء الجوي المباشر-قراءة قرب إيمبينجيرس السائلة لقياس تركيز الشامل (مغ/م3) بيوايروسول.
- مواقع مشتركة إضافية مباشرة-قراءة الأجهزة (جودة الهواء في الأماكن المغلقة مراقب والحرارية شدة الريح) قرب إيمبينجيرس السائلة لرصد المتغيرات البيئية، مثل درجة الحرارة والرطوبة النسبية والرياح بسرعة، داخل قاعة بيوايروسول.
- تشغيل مراوح محورية في زوايا قاعة بيوايروسول لتسهيل خلط من الهباء الجوي.
ملاحظة: مراوح محورية تشغيل بسرعة ثابتة وغير قابلة للتعديل.
2-نموذج "تجارب بيوايروسوليزيشن" (انظر الشكل 3)
- أداء تسلسلي، تخفيف إذ لقاح MS2 عاثية والإنفلونزا للتركيزات المطلوبة في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS).
ملاحظة: تستخدم لإظهار الأسلوب هنا، 103.5 فو/مل من نوع A و B الإنفلونزا فيروس اللقاح السلالات و 105 بفو/مل عاثية MS2. لتحديد التتر لقاح، نشر في الإشريكيّة القولونية HS (بفامب) R bacteriophages وتعداد كما هو موضح سابقا20. اللقاح التجاري يحتوي على كميات معروفة من أربع سلالات فيروس الإنفلونزا الموهنة الحية، وهما نوع من فيروسات إنفلونزا وفيروسات الإنفلونزا نوع B اثنين، المعرب عنها في وحدات التركيز الفلورسنت أو فو. - إعداد لقاح داخل الوعاء الزجاج للبخاخات اصطدام طائرة 6 عن طريق إنشاء المعلقات المطلوب تركيزات الجسيمات الفيروسية في 100 مل من برنامج تلفزيوني وتثبيت داخل قاعة مخصصة بيوايروسول.
- بدء القياس لقياس المتغيرات داخل قاعة بيوايروسول، مثل درجة الحرارة والرطوبة النسبية %، تركيز ثاني أكسيد الكربون، والرياح والسرعة (تم إنشاؤها باستخدام مروحة محورية). استخدام جهاز عرض الهباء الجوي المباشر للقراءة لتعقب التركيز الشامل داخل الدائرة بيوايروسول وتحقيق الاتساق داخل وبين المحاكمات.
- ختم الدائرة بيوايروسول وتطهير لمدة 10 دقيقة مع تصفية هيبا الهواء.
- تسليم الجوية التي تمت تصفيتها، والمجففة للبخاخات العاملة على 6.9 الجيش الشعبي الكوري.
- توليد تركيز هدف من بيوايروسولس الفيروسية (عن طريق البخاخات) في كل دائرة بيوايروسول للمحاكمة. لهذه التظاهرة، يتم إنشاء بيوايروسولس بتركيز من 5 مغ/م3 .
- متى تم التوصل إلى تركيز الهدف الشامل للأيروسول، وقف نيبوليزاتيون.
- تعمل مضخة هواء لأخذ عينات لكل مرطام السائلة التي قد تم معايرة إلى معدل تدفق من 12.5 لتر/دقيقة معايرة سلوك استخدام معيار تدفق أساسي قبل وبعد كل حدث أخذ العينات لضمان الاتساق في أخذ عينات من وحدة التخزين. تمييع إمدادات الهواء استخدام خط هيبا تصفيتها يقع بالقرب من البخاخات والإبقاء على الضغط المستمر في الدائرة.
- نشاط عينة جو الغرفة بيوايروسول لمدة 40 دقيقة لتحقيق وحدة تخزين عينات من 500 لتر كل عينة.
ملاحظة: أخذ العينات لمدة 40 دقيقة في 12.5 لتر في الدقيقة مع مضخات اثنين في نفس الوقت يسمح لأخذ العينات من 1,000 L بيوايروسول. وهكذا، عند الانتهاء من هذه التجربة، يتوقع أن غالبية الهواء الموجودة في قاعة بيوايروسول تم أخذ عينات وتطلق في البيئة عن طريق نظام HEPA تصفيتها. ويدل على ذلك الانخفاض في تركيز الجسيمات. تجربة ما بعد، وهي تطهير الأسطح مع 10% إيثانول التبييض و 70% الأسر المعيشية. تستخدم المؤشرات في هذه المظاهرة؛ ومع ذلك، إذا معروفة تستخدم الكائنات المسببة للأمراض في هذا النظام، قد تنفيذ تدابير السلامة البيولوجية الإضافية حسب الحاجة.
3. استخراج الحمض النووي وكشف قرت-بكر
-
عزل الأحماض النووية مباشرة من راتنج تبادل شاردة، والقيام، لأغراض المقارنة، من السائل المستخدمة داخل إيمبينجيرس السائلة. في هذا المثال، يتم وصف إجراء عزل الحمض النووي الريبي، ولكن يمكن أن تستخدم بروتوكول مماثل لفيروسات الحمض النووي.
- عزل الحمض النووي من راتنج تبادل شاردة.
- نقل جميع السائلة المحتوية على راتنج تبادل شاردة من مرطام السائل إلى أنبوب مخروطي عقيمة 50 مل.
- تسمح الراتنج لتسوية، وصب العينة السائلة من راتنج تبادل شاردة ببطء. استخدام تلميح ماصة 1 مل إلى إزالة كل من السائل المتبقي من راتنج تبادل شاردة.
- من مجموعة مواد عزل الحمض النووي الريبي فيروسية، إضافة ميليلتر 560 من تحلل الفيروسية مخزن يحتوي على الناقل الجيش الملكي النيبالي مباشرة إلى راتنج تبادل شاردة واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع خلط الدوري.
- استخدام تلميح ماصة 1 مل، نقل الفيروسية ليستي (المخزن المؤقت تحلل الفيروسية) معقم 1.5 مل مخروطية أنبوب والمضي قدما في الجيش الملكي النيبالي عزلة من عزل الحمض النووي الريبي فيروسية باستخدام كيت (انظر الجدول للمواد) وفقا لإرشادات الشركة المصنعة، باستثناء هو التيد أن الجيش الملكي النيبالي في إجمالي حجم 60 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت.
- عزل الحمض النووي من إيمبينجيرس السائلة.
- "الماصة؛" ميليلتر 140 عينة السائل في أنبوب معقم 1.5 مل مخروطية وأداء عزل الحمض النووي الريبي باستخدام طقم عزل الحمض النووي الريبي الفيروسية وفقا لإرشادات الشركة المصنعة، باستثناء التينج الجيش الملكي النيبالي في إجمالي حجم 60 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت.
ملاحظة: ميليلتر 140 هو حجم العينة الحد الأقصى الذي يمكن معالجته مع عدة عزل الحمض النووي الريبي الفيروسية المحددة المستخدمة هنا في تحضير خطوة واحدة.
- "الماصة؛" ميليلتر 140 عينة السائل في أنبوب معقم 1.5 مل مخروطية وأداء عزل الحمض النووي الريبي باستخدام طقم عزل الحمض النووي الريبي الفيروسية وفقا لإرشادات الشركة المصنعة، باستثناء التينج الجيش الملكي النيبالي في إجمالي حجم 60 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت.
- عزل الحمض النووي من راتنج تبادل شاردة.
- أداء qRT-PCR للكشف عن MS2 والإنفلونزا والفيروسات ب كما هو موضح سابقا23،24. في هذا العرض التوضيحي، تستخدم 5 ميليلتر من الحمض النووي الواتس qRT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح الشكل 1 المبدأ الكامن وراء القبض على أساس التهمة من الفيروسات من بيوايروسولس عن طريق إدراج راتنج في إيمبينجيرس على أساس سائل. ويبين الشكل 2 إعداد قاعة بيوايروسول المواصفات. الشكل 3 يوضح الخطوات المتبعة في إعداد التجربة هباء واتخاذ تدابير لضمان مراقبة الجودة. ويبين الشكل 4 منحنيات التضخيم بكر qRT الكشف عن الفيروسات مشحونة سلبا على القبض على من بيوايروسولس. ويبين الجدول 1 كبسولة تفجير والمجسات المستخدمة لبكر قرة للفيروسات المثال المستخدمة في هذه الدراسة.
استخدام MS2 والإنفلونزا من الفيروسات الواردة ضمن لقاح الإنفلونزا كنماذج في قاعة بيوايروسول مخصصة، تعديل إيمبينجيرس السائل مع راتنج تبادل شاردة سمح لحوالي 3 x 9 x تحسين الكشف الفيروسية، اعتماداً على المحددة الفيروس، مقارنة بالتجارب المباشرة لاصطدام السائل22. الكشف عن نوع فيروسات إنفلونزا يمكن أن يتحقق حتى 3.26 كما هو موضح في المنحنيات التضخيم بكر qRT الممثل (الشكل 4)، دورات عاجلاً عندما كان يستخدم راتنج تبادل شاردة مقارنة باختبار السائل اصطدام مباشر. إذ ترى أن مكسب قيراط واحد يتوافق مع قرة-PCR التي تتسم بالكفاءة بنسبة 100%، إلى إضعاف زيادة في تركيز الهدف، يكافئ هذا الاختلاف إلى تحسن 9.58 x في الكشف عن.
رقم 1: اصطدام السائل مقترنة مع راتنج تبادل شاردة. كل من أجهزة أخذ العينات بيوايروسول تم التعديل ودمج راتنج تبادل شاردة تصميمها. كل حبة الراتنج هو ميدان 0.5 إلى 1.0 مم مع سطح مسامية، سمة التي تزيد من مساحة السطح تبادل شاردة. تسمح المجموعات الوظيفية أمونيوم رباعي للقبض على أيونات في وسائل الإعلام السائلة، التوسط لالتقاط الفيروسات مع رسوم السطحية الصافية سلبية، بما في ذلك الفيروسات MS2 coliphages والإنفلونزا، التي تستخدم في هذا البروتوكول كنموذج الكائنات الحية (الذيل ويوجه عاثية هنا كمثال للقبض على الفيروسات). ثم يتم عزل الحمض النووي مباشرة من الراتنج (باستخدام أدوات متوفرة تجارياً)، مع نموذج مناسب الجزيئية الأكثر الكشف عن استراتيجيات (قرة-PCR المستخدمة هنا). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: مخصص بيوايروسول الدائرة التخطيطي. ج: 6-جت البخاخات المتوفرة مع الهواء التي تمت تصفيتها والمجفف في توليد ضغط 6.9 الجيش الشعبي الكوري؛ باء: مراوح محورية تيسيرا لخلط بيوايروسول موحدة؛ C: الهباء الجوي رصد لتحديد تركيزات بيوايروسول النسبية؛ D: مرطام السائل مع الراتنج؛ هاء: السائل مرطام دون راتنج؛ F: مقياس شدة الريح الحرارية لقياس سرعة الرياح؛ G: رصد نوعية الهواء لقياس المتغيرات البيئية الأخرى بما في ذلك درجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون، ونسبة الرطوبة النسبية؛ H: مضخات العينات النشطة معايرة إلى 12.5 لتر في الدقيقة؛ أولاً: برج مختومة القفازات المنافذ لتحديد المواقع معدات أخذ العينات داخل قاعة بيوايروسول؛ ياء: نافذة المراقبة. تم إعادة استخدام هذا الشكل من العمل السابق بإذن من الناشر22. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: سير العمل للتجربة بيوايروسوليزيشن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: راتنج تبادل شاردة يحسن qRT-بكر على أساس الكشف عن الفيروسات مشحونة سلبا في بيوايروسولس- في هذا المثال، نوع فيروسات الإنفلونزا A بتركيز العدوى من 103.5 فو/مل كانت الضبوبيه في قاعة بيوايروسول مخصصة حتى التوصل إلى تركيز الشامل بيوايروسول 5 مغ/م3. إيمبينجيرس السائل مع أو بدون راتنج يشتركون في نفس الوقت لكل عينة (500 لتر) بيوايروسول. حصل من راتنج تبادل شاردة أو من السائل مرطام الرنا الفيروسي وجزيئي ببكر قرة. وتكررت هذه التجربة في ثلاث نسخ. تم الكشف عن الأحماض النووية التي تم الحصول عليها من عينات الراتنج في Ct متوسط من 26.76، بينما تم اكتشاف مرطام العينات السائلة في Ct متوسط من 30.02 (ΔCt 3.26). يكافئ هذا الفرق في التصوير المقطعي إلى تحسن 9.58 x في الكشف عن استخدام راتنج تبادل شاردة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| فيروسات | اسم الدليل | تسلسل التمهيدي | مرجع | |
| MS2 | إعادة توجيه معهد جوته | --أتككاتتتجتاكجككج 5 '-3' | 23 | |
| التحقيق معهد جوته | 5'-(6-FAM)-TAGGCATCTACGGGGACGA-(BBQ)-3 ' | |||
| القس معهد جوته | --تجكاتكتكاكتججاكاتات 5 '-3' | |||
| شركة الخطوط الجوية العراقية إعادة توجيه (46F) | --جاكاتكجاتاتججتجككج 5 '-3' | |||
| التحقيق الإداري | 5 '--(Cy5)-كاكاتكاككاججاجاكجكاتجاجا-(للشواء)-3' | |||
| شركة الخطوط الجوية العراقية Rev (186R) | --كجاجاكجاتجكاجككاتك 5 '-3' | |||
| فيروسات الإنفلونزا من النوع | مركز السيطرة على الأمراض فيروس الإنفلونزا العالمي A التمهيدي إلى الأمام | 5-GAC CRA TCC TGT CAC لجنة مكافحة الإرهاب TGA C-3 ' | 24 | |
| مركز السيطرة على الأمراض الإنفلونزا العالمي فيروس عكس التمهيدي | 5-AGG الائتلاف تج TTY هيئة مكافحة الفساد احتفظا CGT كبار المستشارين التقنيين-3 ' | |||
| مركز السيطرة على الأمراض مسبار فيروس الإنفلونزا العالمي A | 5 '-(الاتحاد الماليزي)-TGC AGT CCT كجك TCA CTG السواقين ACG-(BHQ1)-3' | |||
| فيروسات الإنفلونزا نوع B | مركز السيطرة على الأمراض فيروس الإنفلونزا العالمي ب التمهيدي إلى الأمام | --تككتكاكتكاكتكتكجاجكج 5 '-3' | 24 | |
| مركز السيطرة على الأمراض فيروس الإنفلونزا العالمي ب عكس التمهيدي | --كجتجكتكتجاككااتج 5 '-3' | |||
| مسبار فيروس الإنفلونزا العالمي ب مركز السيطرة على الأمراض | 5 '-(جو)--ككاتكجاجكاجكتجااكتجكجتج-(BHQ1)-3' | |||
الجدول 1: الإشعال والمجسات المستخدمة في هذه الدراسة. وكان جميع أجهزة الإشعال والمسابير من فريدمان وآخرون 201123 و سيلفاراجو و 2010 سيلفارانجان24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويحدد هذا البروتوكول طريقة لالتقاط الفيروسية حساسة من بيوايروسولس باستخدام إيمبينجيرس السائلة المعدلة. هو الأسلوب الأمثل للكشف والتحديد الكمي للحمل الفيروسي في بيوايروسولس. تعديل محددة أثبتت هنا ينطوي على إضافة راتنج تبادل شاردة للسائل الواردة ضمن مرطام سائلة مشتركة. تم تطوير هذا الأسلوب لبساطته في تجهيز عينات المصب، بينما تقنيات تجهيز عينة أخرى مثل الطرد المركزي والترشيح، والأساليب المستندة إلى هطول الأمطار لا توفر مثل هذه ميزة. يتم استخراج أحماض النووية مباشرة من الراتنج، تنتفي الحاجة إلى التيونس كبيرة الحجم ومتعددة الخطوات إعداد عينة، المساهمة في نهاية المطاف إلى تحسين الكشف عن حساسية الأسلوب عن طريق تخفيض في العينة الفعالة وحدة التخزين. وعلاوة على ذلك، فقد ثبت أن التثبيت من الجسيمات الفيروسية في صلب السطوح يمكن أن تسهم في زيادة الاستقرار من الحمض النووي الفيروسي أو الاحتفاظ بالعدوى الفيروسية17،25. التثبيت قد يسهم أيضا القبض على زيادة الكفاءة بالحد من الخسائر الناجمة عن رييروسوليزيشن16. يمكن أن يقترن الأسلوب بسهولة مع التحليلات الجزيئية المصب (قرة-PCR أثبت هنا). يمكن استخراج الحقل راتنج تبادل شاردة وشحنها إلى معمل للتحليل، في حين يمكن أن يبقى معدات أخذ عينات الهواء مكرسة للرصد في مجال أخذ العينات. كما ينطوي المبدأ الكامن وراء الإجراء القبض غير محددة على فيروسات تحمل شحنة سطح الصافية السلبية، يتوقع الأسلوب قابلة للكشف عن الفيروسات المسببة للأمراض متعددة من أهمية بالنسبة لصحة الإنسان والطب البيطري. كما استعرضها مكين وجراولي26، لدى عدد كبير من الفيروسات الهامة للصحة العامة والحيوانية التهم السطحية الصافية السلبية، مع بعض الاستثناءات المعروفة، مثل بعض سلالات روتافيروسيس وبوليوفيروسيس.
هذا البروتوكول غير مباشرة إلى تقييم تأثير الظروف البيئية على حساسية الكشف؛ عند أخذ عينات الهواء يجري في إعدادات الحقل، غير المتصور أن المتغيرات مثل درجة الحرارة والرطوبة النسبية قد تؤثر على كفاءة جمع عبر أنواع متعددة من العينات الجوية12. وهكذا، يمكن تعديل الأوضاع داخل قاعة بيوايروسول لتتناسب مع هذه البارامترات البيئية حسب الحاجة. الأسلوب راتنج تبادل شاردة قد ثبت فعالية التركيز فيروسات متعددة من عينات المياه مع مجموعة واسعة من الخصائص الفيزيائية الكيميائية، مشيراً إلى أن التدخل من الجسيمات، والبكتيريا، والاتفاقيات البيئية الأخرى، ومن المتوقع أن يكون الحد الأدنى18الملوثات. بالإضافة إلى ذلك، قد تتطلب جمع المخازن المؤقتة الأمثل لفيروسات محددة، كما هو الحال في بعض الحالات قد ثبت الاستفادة المثلى من مجموعة المخزن المؤقت يمكن أن تؤدي إلى تحسين الاحتفاظ بالاستقرار الفيروسية27. عيب الرئيسي للأسلوب كما قدم هو حقيقة أنه لا يمكن تحديد العدوى الفيروسية. وثمة عيب آخر من هذا البروتوكول هو عدم القدرة على تقييم الآثار السلبية المحتملة نيبوليزيشن والهواء أخذ العينات على استقرار الفيروسية، بما في ذلك جفاف، والقص، والامتزاز غير محددة إلى بيوايروسول غرفة السطوح22.
الأجهزة بيوايروسول تعديل أخذ العينات يمكن أن تكون قابلة لأخذ العينات الميدانية في إعدادات متعددة، بما في ذلك المستشفيات والمدارس، والعمليات الزراعية، وأماكن أخرى. لأنه يتم إجراء تعديلات على معدات أخذ العينات الموجودة في الهواء، فمن المتوقع أن تكون الأجهزة المعدلة بسهولة تبني المشغلين حاليا أخذ عينات بيوايروسولس للبحث عن الفيروسات. البروتوكول ويتجلى هنا في دائرة بيوايروسول مبنية خصيصا باستخدام فيروسات MS2 والإنفلونزا، وأهداف مفيدة لتطوير أسلوب يرجع ذلك إلى حقيقة أن تمثل أمثلة على الفيروسات المغلفة وغير المغلفة، ويعتبر MS2 مركب من الفيروسات المعوية، وهي عادة تستخدم في التقييم من إيمبينجيرس22،،من2627،،من2829.
وسيشمل العمل المستقبلي الأمثل لظروف أخذ العينات (أي الهواء أخذ العينات السرعة، جمع المخازن المؤقتة) وإدراج من الفيروسات ذات الصلة إضافية في اختبار بروتوكولات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
كان يؤيد هذا العمل بتمويل من مركز السيطرة على الأمراض/هي مركز Intermountain سهول عالية للصحة الزراعية والسلامة (5U54OH008085) وبرنامج كولورادو اكتشاف منح تقييم العلوم البيولوجية (14BGF-16).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Escherichia coli bacteriophage MS2 (ATCC 15597-B1) | American Type Culture Collection | ATCC 15597-B1 | |
| FluMist Quadrivalent | AstraZeneca | Contact manufacturer | Viral constitutents of this vaccine are subject to change on an annual basis |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
| Primers and probes | Integrated DNA Technologies | NA | |
| 0.2 µM sterile filter | NA | NA | |
| 1 L pyrex bottles or equivalent | NA | NA | |
| 1 mL pipet tips | NA | NA | |
| 1 mL pipettor | NA | NA | |
| 50 mL serological pipet | NA | NA | |
| PCR tubes | NA | NA | |
| Pipet-aid or equivalent | NA | NA | |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| QuantiTect Probe RT-PCR Kit | Qiagen | 204443 | |
| Amberlite IRA-900 chloride form | Sigma-Aldrich | 216585-500G | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Water (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Eppendorf DNA LoBind Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher | 13-698-791 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 14-432-22 | |
| Falcon Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 05-538-62 | |
| SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit w/ROX | ThermoFisher | 11745100 | |
| SKC Biosampler 20 mL, 3-piece glass set | SKC Inc. | 225-9593 | |
| Vac-u-Go sample pumps | SKC Inc. | 228-9695 | |
| Collison nebulizer (6-jet) | BGI Inc. | NA | |
| HEPA capsule | PALL | 12144 | |
| Q-TRAK indoor air quality monitor 8554 | TSI Inc. | NA | |
| Alnor velometer thermal anemometer AVM440-A | TSI Inc. | NA | |
| SidePak AM510 personal aerosol monitor | TSI Inc. | NA | |
| Bioaerosol chamber | NA | NA |
References
- Pirtle, E. C., Beran, G. W. Virus survival in the environment. Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics). 10 (3), 733-748 (1991).
- Nguyen, T. M., et al. A community-wide outbreak of legionnaires disease linked to industrial cooling towers--how far can contaminated aerosols spread? The Journal of Infectious Diseases. 193 (1), 102-111 (2006).
- Marks, P. J., et al. Evidence for airborne transmission of Norwalk-like virus (NLV) in a hotel restaurant. Epidemiology and Infection. 124 (3), 481-487 (2000).
- Marks, P. J., et al. A school outbreak of Norwalk-like virus: Evidence for airborne transmission. Epidemiology and Infection. 131 (1), 727-736 (2003).
- Corzo, C. A., Culhane, M., Dee, S., Morrison, R. B., Torremorell, M. Airborne detection and quantification of swine influenza a virus in air samples collected inside, outside and downwind from swine barns. PLoS One. 8 (8), e71444 (2013).
- Anderson, B. D., et al. Bioaerosol sampling in modern agriculture: A novel approach for emerging pathogen surveillance. The Journal of Infectious Diseases. 214 (4), 537-545 (2016).
- Hietala, S. K., Hullinger, P. J., Crossley, B. M., Kinde, H., Ardans, A. A. Environmental air sampling to detect exotic Newcastle disease virus in two California commercial poultry flocks. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 17 (2), 198-200 (2005).
- Jonges, M., et al. Wind-mediated spread of low-pathogenic avian influenza virus into the environment during outbreaks at commercial poultry farms. PLoS One. 10 (5), e0125401 (2015).
- Otake, S., Dee, S. A., Jacobson, L., Torremorell, M., Pijoan, C. Evaluation of aerosol transmission of porcine reproductive and respiratory syndrome virus under controlled field conditions. The Veterinary Record. 150 (26), 804-808 (2002).
- Wu, Y., et al. Aerosolized avian influenza A (H5N6) virus isolated from a live poultry market, China. The Journal of Infection. 74 (1), 89-91 (2017).
- Choi, M. J., et al. Live animal markets in Minnesota: A potential source for emergence of novel influenza A viruses and interspecies transmission. Clinical Infectious Diseases. 61 (9), 1355-1362 (2015).
- Haig, C. W., Mackay, W. G., Walker, J. T., Williams, C. Bioaerosol sampling: Sampling mechanisms, bioefficiency and field studies. The Journal of Hospical Infection. 93 (3), 242-255 (2016).
- Anderson, B. D., Lednicky, J. A., Torremorell, M., Gray, G. C. The use of bioaerosol aampling for airborne virus surveillance in swine production facilities: A mini review. Frontiers in Veterinary Science. 4, 121 (2017).
- Verreault, D., Moineau, S., Duchaine, C. Methods for sampling of airborne viruses. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 413-444 (2008).
- Hogan, C. J. Jr Sampling methodologies and dosage assessment techniques for submicrometre and ultrafine virus aerosol particles. Journal of Applied Microbiology. 99 (6), 1422-1434 (2005).
- Yu, K. -P., Chen, Y. -P., Gong, J. -Y., Chen, Y. -C., Cheng, C. -C. Improving the collection efficiency of the liquid impinger for ultrafine particles and viral aerosols by applying granular bed filtration. Journal of Aerosol Science. 101, 133-143 (2016).
- Perez-Mendez, A., et al. Evaluation of a simple and cost effective filter paper-based shipping and storage medium for environmental sampling of F-RNA coliphages. J Virol Methods. 194 (1-2), 60-66 (2013).
- Chandler, J. C., et al. Field-based evaluation of a male-specific (F+) RNA coliphage concentration method. Journal of Virological Methods. 239, 9-16 (2017).
- Perez-Mendez, A., Chandler, J. C., Bisha, B., Goodridge, L. D. Concentration of enteric viruses from tap water using an anion exchange resin-based method. Journal of Virological Methods. 206, 95-98 (2014).
- Perez-Mendez, A., Chandler, J. C., Bisha, B., Goodridge, L. D. Evaluation of an anion exchange resin-based method for concentration of F-RNA coliphages (enteric virus indicators) from water samples. Journal of Virological Methods. 204, 109-115 (2014).
- Kammerer, J., Carle, R., Kammerer, D. R. Adsorption and ion exchange: Basic principles and their application in food processing. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59 (1), 22-42 (2011).
- Chandler, J. C., et al. A method for the improved detection of aerosolized influenza viruses and the male-specific (F+) RNA coliphage MS2. Journal of Virological Methods. 246, 38-41 (2017).
- Friedman, S. D., Cooper, E. M., Calci, K. R., Genthner, F. J. Design and assessment of a real time reverse transcription-PCR method to genotype single-stranded RNA male-specific coliphages (Family Leviviridae). Journal of Virological Methods. 173 (2), 196-202 (2011).
- Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. Evaluation of three influenza A and B real-time reverse transcription-PCR assays and a new 2009 H1N1 assay for detection of influenza viruses. Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 3870-3875 (2010).
- Cademartiri, R., et al. Immobilization of bacteriophages on modified silica particles. Biomaterials. 31 (7), 1904-1910 (2010).
- Michen, B., Graule, T. Isoelectric points of viruses. Journal of Appled Microbiology. 109 (2), 388-397 (2010).
- Turgeon, N., Toulouse, M. J., Martel, B., Moineau, S., Duchaine, C. Comparison of five bacteriophages as models for viral aerosol studies. Applied and Environmental Microbiology. 80 (14), 4242-4250 (2014).
- Vergara, G. G., et al. Evaluation of FRNA coliphages as indicators of human enteric viruses in a tropical urban freshwater catchment. Water Research. 79, 39-47 (2015).
- Tung-Thompson, G., Libera, D. A., Koch, K. L., de Los Reyes, F. L. 3rd, Jaykus, L. A. Aerosolization of a human norovirus surrogate, bacteriophage MS2, during simulated vomiting. PLoS One. 10 (8), e0134277 (2015).
