Summary
Dit protocol beschrijft een methode voor de grootschalige teelt van Caenorhabditis elegans op solide media. Als alternatief voor vloeibare cultuur kunnen dit protocol verkrijgen van parameters voor verschillende schalen onder plaat gebaseerde teelt. Dit verhoogt de vergelijkbaarheid van de resultaten door het weglaten van de morfologische en metabole verschillen tussen vloeibare en vaste mediacultuur.
Abstract
Kweken van Caenorhabditis elegans (C. elegans) in een grootschalige manier op agar platen kunnen tijdrovend en moeilijk zijn. Dit protocol beschrijft een eenvoudige en goedkope methode voor het verkrijgen van een groot aantal dieren voor de isolatie van proteïnen om door te gaan met een westelijke vlek, massaspectrometrie of verdere proteomics analyses. Een stijging van de nematode nummers voor immunostainings en de integratie van meerdere analyses onder dezelfde voorwaarden kweken kunnen bovendien gemakkelijk worden bereikt. Bovendien is een overdracht tussen platen met verschillende experimentele omstandigheden wordt vergemakkelijkt. Gebruikte technieken in plaat cultuur de overdracht van een enkele C. elegans met behulp van een platina-draad en de overdracht van bevolkte agar brokken met behulp van een scalpel. Met de toenemende nematode nummers, worden deze technieken echter overdreven tijdrovend. Dit protocol beschrijft de grootschalige cultuur van C. elegans met inbegrip van talrijke stappen om te minimaliseren van de impact van de bereiding van de monsters op de Fysiologie van de worm. Vloeistof en shear stress kunnen de levensduur van en metabole processen in C. elegans, waarvoor derhalve een gedetailleerde beschrijving van de kritische stappen om op te halen van betrouwbare en reproduceerbare resultaten wijzigen. C. elegans is een modelorganisme, bestaande uit de neuronale cellen voor maximaal een derde, maar bij gebrek aan bloedvaten, waardoor de mogelijkheid te onderzoeken van uitsluitend neuronale wijzigingen onafhankelijk van vasculaire controle. Vroege neurodegeneratie in diabetische retinopathie bleek onlangs, voorafgaand aan vasculaire wijzigingen. C. elegans is dus van bijzonder belang zijn voor de studie van de algemene mechanismen voor diabetische complicaties. Bijvoorbeeld, een verhoogde vorming van advanced glycation eindproducten (leeftijden) en reactieve zuurstof soorten (ROS) is waargenomen, die reproducibly worden aangetroffen in C. elegans. Protocollen bij het behandelen van monsters van voldoende grootte voor een breder spectrum van de onderzoeken worden hier gepresenteerd wordt geïllustreerd door de studie van diabetes-veroorzaakte biochemische veranderingen. In het algemeen, dit protocol nuttig kan zijn voor studies die vereisen grote C. elegans getallen en in welke vloeibare cultuur niet geschikt is.
Introduction
Eiwit analyses, zoals een westelijke vlek of massaspectrometrie, vereisen milligram van eiwit. Deze opbrengst vereist een grote schaal kweken van honderden C. elegans, die kan worden bereikt door vloeibare cultuur of op solide media overzetten van de nematoden door wassen. Vloeistof en schuifspanning induceert de expressie van epitheliale natrium kanalen (ENaC), die zou kunnen de osmotische stress door middel van een verhoogde opname van natrium vergroten, potentieel veranderen de levensduur van C. elegans en beïnvloeden van metabole analyses1 . Daarom nemen sommige kritische stappen in dit protocol voor de plaat gebaseerde benadering de vermindering van stress op het gebied van experimentele variabiliteit in aanmerking. Vloeibare cultuur, aan de andere kant, van invloed op het fenotype van de nematoden en bemoeilijkt de cultuur en collectie van een exact aantal aaltjes2. Bovendien, reactieve stoffen kunnen worden gewijzigd door de media-onderdelen en ongelijk kunnen verdelen alvorens de nematoden. Met betrekking tot de beperkingen van vloeibare cultuur biedt dit protocol een alternatieve aanpak voor het kweken van grootschalige monsters van C. elegans.
C. elegans is een model-organisme met een verschillend netwerk van 302 neuronale cellen, die deel uitmaken van een derde van alle haar cellen3. Sinds de invoering ervan in wetenschap, veel homologe en orthologous genen zijn beschreven, zijn waarde als een model voor medisch onderzoek sturen. Onlangs, bewijs voor neurologische stoornis in diabetische retinopathie, voorafgaand aan vasculaire schade, heeft ingediend4. C. elegans ontbreekt bloedvaten, maar bevat een verschillende neuronale netwerk, waardoor het een geschikt model te onderzoeken van neuronale wijzigingen afgezien van vasculaire ones. C. elegans is dus van bijzonder belang zijn voor de studie van de algemene mechanismen voor diabetische complicaties. Biochemische wijzigingen in diabetische complicaties betrekking hebben op de vorming van AGEs, die verder de vorming van ROS in reactie op hyperglycemie5 beïnvloeden. Leeftijden zijn te vinden in C. elegans en bijdragen tot de neuronale schade6. Chronische ziekten worden vaak veroorzaakt door complexe, polygeen processen, die een multiparametric aanpak vereisen voor de beoordeling van hun onderliggende mechanismen, zoals hier wordt geïllustreerd met de beoordeling van diabetische complicaties. Dit protocol kan worden gebruikt voor het verkrijgen van meerdere parameters tegelijk, en vervolgens. Meer vergelijkbaarheid en reproduceerbaarheid van een multiparametric benadering kunnen worden bereikt door het weglaten van de morfologische en metabole verschillen tussen vloeibare en vaste mediacultuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Dit protocol is verdeeld in vijf secties. In de secties 1 – 3: het belangrijkste protocol bij C. elegans cultuur op grote schaal wordt gepresenteerd. Secties 4 en 5 bieden aanvullende protocollen voor de beoordeling van blijkt metabolieten die zich voordoen in diabetische metabolieten. In detail beschrijft sectie 1 een algemene grootschalige cultuur op platen. Deel 2 richt zich op de overdracht van grote hoeveelheden van C. elegans, terwijl sectie 3 wordt uitgelegd het oogsten van een grootschalige steekproef. Sectie 4 legt de isolatie van de eiwit uit de steekproef en sectie 5 beschrijft de bereiding van de monsters voor analyses van de latere vloeibare chromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS).
1. grootschalige cultuur op platen
- In het algemeen, werken onder een steriele kap of naast een open vuur te voorkomen verontreinigingen.
-
Aan cultuur wormen totdat ze de jonge volwassen stadium, volg deze7 van de eerder gepubliceerde protocol met de volgende aanpassingen.
- Het gebruik van levende OP50 van Escherichia coli bacteriën te voeden de nematoden en bereiden van 400 µM fluorodeoxyuridine agar (niet ampicilline/FUdR) voor experimenten.
- Voor de voorbereiding van een synchrone bevolking, gebruik van ongeconcentreerde OP50 en voor het slagen van experimenten met de volwassenen, gebruik 3.3 x geconcentreerd OP50 door het verwijderen van 70% van de bovendrijvende substantie.
- Dagelijkse voeding intervallen worden aanbevolen. Bij de beoordeling van oxidatieve stress, kunnen verschillende intervallen en volumes voor het voederen interfereren met de resultaten.
- Voor enten, neem een plaat met verschillende aaltjes en snijd het in stukjes van ongeveer 0,5 x 1 cm2 met een scalpel. Overdracht van twee tot drie stukken op nematode groei media (NGM) platen van 60 mm in diameter, met niet-geconcentreerd OP50.
- Incubeer de platen bij de temperatuur die geschikt is voor de stam (wild-type N2 moeten worden gekweekt bij 20 ° C) totdat de eieren zijn zichtbaar op de plaat.
- De meeste eieren en volwassen dieren met 2 mL M9 buffer afwassen en verzamelen ze in een tube van 15 mL. Centrifugeer de schorsing bij 800 x g gedurende 2 min. Ondertussen, beginnen met de voorbereiding van de bleken oplossing.
- Neem de gecentrifugeerde buis en verwijderen van de M9 buffer met een pipet 10 mL. Voeg 10 mL van de bleken oplossing en mix op de vortex totdat de volwassen nematoden zijn lysed. Dit duurt meestal ca. 5-7 minuten, maar moet niet langer duren dan 15 min of de eieren niet volledig later op zal ontwikkelen in het experiment.
- Centrifugeer de schorsing bij 800 x g gedurende 2 min. Wash 3 keer met 10 mL M9 buffer wissen de eieren van bleken oplossing.
- Voeg nu 150 µL van de ei-ophanging op OP50 platen. Een dichtheid van 200-300 eieren moet worden bereikt over elke plaat. Wacht tot de nematoden het volwassen stadium bereikt.
Opmerking: De M9 buffer (pH 7.0) gebruikt voor de afgebeelde experimenten bestaat uit de volgende stoffen: 22 mM KH2PO4, 42 mM nb2HPO4en 86 mM NaCl. Na autoclaaf het mengsel, voeg 1 mM MgSO4. De bleken oplossing bevat 0,5 M NaOH, 2,3 mM NaOCl opgelost in gedestilleerd water. - Voorbereiden steriele buffer van de M9, steriele Pipetteer tips met een snee tip afwassen de wormen en 15 mL buizen om ze in te verzamelen.
- Ongeveer 1 mL van de M9 buffer van toepassing op de platen, zachtjes distribueert de buffer swingende en zachtjes Pipetteer de nematoden uit de plaat.
- Nu, verzamelen de aaltjes in de buis. 150 µL van schorsing rechtstreeks op de platen (bezaaid met OP50) met de gesneden Pipetteer tips toepassen en evalueren microscopisch de dichtheid van de nematoden (aanbevolen: 50 – 100 nematoden per 60 mm plaat).
- Als ze te dichte, verdunnen van de vering met de M9 buffer en evalueren het onder de Microscoop totdat de gewenste dichtheid is bereikt. Wanneer het rendement te weinig is, laat de wormen settelen of centrifugeren van de suspensie 10 s 800 x g verwijderen vloeistof.
Opmerking: Een voorbeeld van een voldoende dichtheid is gegeven in figuur 1A (macroscopische) en 1B (microscopische) bij 20 X vergroting. Gaan empirisch zoals beschreven. - Houd in gedachten dat de wormen snel settelen. Omkeren, zodat een gelijke verdeling tussen de platen, de buis na elke stapel platen (4 – 5 platen).
Opmerking: De cut Pipetteer tip, evenals de zachte swingende en wassen van de platen vermindert shear stress.
2. overdracht van grote hoeveelheden Caenorhabditis elegans
- Afwassen de nematoden met ongeveer 500 µL van M9 buffer, afhankelijk van de leeftijd en droogheid van de platen. Gebruikt de zelfde buffer, herhaald losmaken van de nematoden, totdat de meeste dieren worden verzameld in suspensie.
- Langzaam oppakken van de nematoden met een gesneden pipette uiteinde en ze overdragen op een plaat met OP50 bereid. Laat de plaat droog.
Opmerking: Wees voorzichtig niet te veel meer dan het aanbevolen volume van toepassing. Vooral in lange termijn experimenten, de platen kunnen dit niet tolereren en de agar kan breken, waardoor de nematoden te kruipen in de scheuren.
3. de oogst van een groot monster van de Caenorhabditis elegans
- Afhankelijk van de geselecteerde methode, experimenten met een voldoende hoeveelheid C. eleganste beginnen. Voor LC-MS/MS analyses, bereiden 20 platen (60 x 15 mm) per groep, met circa 100 nematoden per plaat om een rendement van ten minste 200 µg eiwit per monster.
Opmerking: Dit deel van het protocol hoeft niet via werken onder steriele omstandigheden meer, zoals de nematoden worden verzameld en ingevroren. - Bereiden op de dag van de sample collectie, vloeibare stikstof aan module-freeze de verzamelde monsters. Houden van niet-steriele buffer van de M9 op ijs te vertragen van de nematode metabolisme.
- Afwassen de C. elegans aan de platen door 1 mL van de M9 buffer toe te passen en de platen voorzichtig te zwenken. Dit voorkomt dat het verzamelen van overleden nematoden en meeste eieren, als er aanwezig zijn, omdat ze aan de bacteriën en de agar vasthouden.
- Neem het volume en het overbrengen in een tube van 15 mL.
- Na de inzameling van het volledige monster, wacht de nematoden te regelen of de buis kort bij 800 x g centrifugeren en verwijderen van de meeste van de M9-buffer. Wassen van het monster 3 x met ongeveer 10 mL M9 (10 x Het monstervolume) te verwijderen van alle bacteriën.
Opmerking: Om ervoor te zorgen dat alle overleden nematoden zijn verwijderd, sacharose Floating is een andere optie. Dit was echter niet geschikt voor de weergegeven experimenten15. Sacharose is gehydrolyseerd in glucose en fructose. In de afgebeelde experimenten, de rol van glucose evalueerden ter bevordering van de biochemische veranderingen gevonden in chronische diabetes. Dus, sacharose Floating kon potentieel verwarren de resultaten. - Een 1,5 mL tube met 1 mL van de M9 buffer en één lege 1,5 mL tube voorbereiden door elke monster. De pellet met een glazen pipet van de tube van 15 mL overbrengen aan de lege 1,5 mL-buis. Deze stap is van cruciaal belang om ervoor te zorgen een kwantitatieve overbrenging.
Opmerking: In tegenstelling tot tijdens de vorige stappen, hier de nematoden zijn meer geconcentreerd. Vanwege een mogelijke naleving van plastic pipet tips, wordt verlies van een groot deel van het monster verwacht. Daarom glas pipetten gebruiken. - Na de overdracht, de glazen pipet te gebruiken tot het nemen van 1 mL van de M9 buffer uit de tweede 1,5 mL-buis te spoelen van de nematoden van de muur van de pipet. Ook het wassen van de resterende nematoden uit de tube van 15 mL en deze overbrengen naar het monsterbuisje.
- Centrifugeer het monsterbuisje bij 19.000 x g gedurende 1 min en zoveel supernatant mogelijk.
- Zegel van de buis met Parafilm en onmiddellijk module-freeze het in vloeibare stikstof. De buis bij-80 ° C bewaren tot de lysate voorbereiding.
4. eiwitten isolatie voor massaspectrometrie
Opmerking: De isolatie van de eiwit hier beschreven kan ook worden gebruikt voor andere testen (bijvoorbeeld, westelijke vlek).
- Toevoegen aan het bevroren monster, de dezelfde hoeveelheid 0.5 mm zirkonium oxide kralen en minstens 2 x de hoeveelheid lysate buffer met een cocktail van proteïnase inhibitor van de omwenteling.
Let op: De afgebeelde nematoden-naar-eiwit correlatie analyses werden uitgevoerd met behulp van 100 µL van de buffer. LC-MS/MS monsters werden lysed met 200 µL van buffer. - Start de homogenizer voor 1 min op snelheid 9. Zorg ervoor dat de monsters zijn volledig lysed. Herhaal deze stap als ze zijn niet volledig lysed.
- De monsters gedurende 30 minuten bij 4 ° C bij 19.000 x gcentrifugeren. Het supernatant overbrengen in een nieuwe buis op ijs en opslaan bij-80 ° C tot verdere metingen zullen worden genomen.
Opmerking: De niet-denaturering buffer die wordt gebruikt voor de afgebeelde experimenten bestaat uit de volgende stoffen: 20 mM Tris-HCl (pH 8), 137 mM NaCl, 1% Triton-X en 2 mM EDTA.
Opmerking: Na het volgen van de stappen van dit protocol en de voorgestelde omvang hebben verzocht, moet de opbrengst van een eiwit pellet van ongeveer 1.000 nematoden ongeveer 500 µg. Raadpleeg voor meer vergelijkingen, Figuur 2 en de Resultaten van de vertegenwoordiger.
5. monstervoorbereiding voor vloeibare chromatografie-tandem massaspectrometrie metingen
Opmerking: Afhankelijk van de parameter van belang, de bereiding van de monsters zal verschillen. Dit protocol is gericht op methylglyoxal en leeftijdsbepaling.
-
Het meten van intracellulaire methylglyoxal door bewerking met 1,2-diaminobenzene (DB) als eerder beschreven9.
- Meng de monsters met 20 µL van ijskoude 20% (wt/vol) trichloorazijnzuur in natriumchloride 0,9% (wt/vol) en 80 µL van water in een 1,5 mL-buis.
- De monsters van 5 µL met de interne standaard Spike (13C3-MG; 400 nM), meng ze door vortexing, en hen vervolgens Centrifugeer bij 21.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
- 35 µL van het supernatans dat naar de HPLC monster flacon met een 200 µL Glasfront overbrengen.
- Voeg toe 5 µL van 3% natriumazide (wt/vol) aan elk monster gevolgd door 10 µL van 0.5 mM DB 200 mM HCl met 0,5 mM diethylenetriaminepentaacetic zuur (DETAPAC) in water.
- Incubeer de monsters gedurende 4 uur bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
- Analyseer de monsters door LC-MS/MS, als eerder beschreven9.
Opmerking: Voor het meten van leeftijden, isoleren de eiwitten zoals beschreven in sectie 4 van het protocol.
-
Meet de eiwitconcentratie van de (ontdooide) lysates met behulp van de een Bradford assay10.
- Aliquots van 30 µL voorbereiden op een standaard curve verrijkt met bovien serumalbumine (BSA) opgelost in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) van de volgende concentratie: 0; 0,1; 0,2; 0.3; 0,4; 0.6; 0.8; en 1,0 mg/dL.
Opmerking: Als het monster was voorbereid op de voorgestelde grootte (zie stap 4.1 voor de bereiding van lysate met 200 µL van buffer), moet de geraamde concentratie in het bereik van ongeveer 2 – 7 mg/mL. In dit geval, Verdun de monsters 1:10 met PBS voorafgaand aan de meting.
Opmerking: Voor de eerste experimenten met behulp van deze methode, is het aanbevolen voor het meten van de monsters in verschillende verdunningen (1, 1:10 en 1:100). Aangezien er geen exacte bepaling van het aantal aaltjes, kan het rendement verschillen tussen individuele onderzoekers. - Een transparante 96-wells-plaat (polystyreen) gebruiken en Pipetteer 10 µL van elke standaard concentratie en de monsters in de gekozen verdunningen in duplicaten in de putjes.
- Verdun de eiwit assay kleurstof reagens concentraat 1:5 met gedestilleerd water (aq. dest.) en voeg 200 µL van de verdunning aan elk monster op de plaat. Laat de plaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur inwerken.
- Meet de extinctie binnen 30 min op 595 nm met een afleesapparaat. De monsters kunnen van de berekende standaard kromme worden geïnterpoleerd. Meer details van de methode zijn uitvoerig beschreven in de literatuur10.
- Aliquots van 30 µL voorbereiden op een standaard curve verrijkt met bovien serumalbumine (BSA) opgelost in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) van de volgende concentratie: 0; 0,1; 0,2; 0.3; 0,4; 0.6; 0.8; en 1,0 mg/dL.
-
Maatregel de intracellulaire leeftijden zoals eerder beschreven11,12.
- Wassen van de totale eiwithoudende extracten (ongeveer 200 µg) 3 x met water door ultracentrifugatie in 10 kDa centrifugaal filter eenheden.
- 10 µL van 100 mM HCl, 10 µL van pepsine (2 mg/mL in 20 mM HCl) en 10 µL van thymol (2 mg/mL in 20 mM HCl) toevoegen aan de herstelde proteïne (ongeveer 100 µL) en de monsters bij 37 ° C gedurende 24 uur uit te broeden.
- Neutraliseren en de monsters van de buffer met een pH van 7,4 door toevoeging van 12,5 µL van 0.5 M kalium fosfaatbuffer (pH 7.4) en 5 µL van 260 mM KOH.
- Voeg 10 µL van Pronase E [2 mg/mL in 10 mM kalium fosfaatbuffer (pH 7.4)] en 10 µL van een penicilline-streptomycine-oplossing, en de monsters bij 37 ° C gedurende 24 uur uit te broeden.
- Voeg 10 µL van aminopeptidase [2 mg/mL in 10 mM kalium fosfaatbuffer (pH 7.4)] en 10 µL van prolidase [2 mg/mL in 10 mM kalium fosfaatbuffer (pH 7.4)], en de monsters bij 37 ° C gedurende 48 uur uit te broeden.
- Analyseer het resulterende hydrolysaat door LC-MS/MS, als eerder beschreven12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voorbeelden van het maken van een grootschalige C. elegans cultuur hier voor toepassingen in onderzoek naar diabetes worden gepresenteerd. Het is van belang de parameters op een enkel dier betrekking heeft, in plaats van te normaliseren het bij de eiwitconcentratie totaal. In een bepaling waarin een klein aantal aaltjes, kan dit eenvoudig worden bereikt door het tellen van de nematoden. Voor een grootschalige C. elegans cultuur waarbij honderden nematoden per experimentele groep, deze benadering is lastig. In Figuur 2, is de correlatie tussen de hoeveelheid C. elegans en het gehalte aan andere melkeiwitten komt te staan. Zoals hier is aangetoond, kan reproduceerbare kwantitatieve eiwit isolatie gebeuren met behulp van dit protocol.
De Amadori adduct fructosyl-lysine is een van verschillende leeftijd precursoren gevormd tijdens diabetes bij experimentele dierlijke modellen13. Figuur 3 toont LC-MS/MS metingen na een behandeling van de glucose in 12 dagen oude nematoden en leeftijd-matched onbehandelde controles uit drie onafhankelijke experimenten. De aaltjes waren gehomogeniseerd met een toevoeging van 200 µL van lysate buffer. Een verhoogde vorming van fructosyl-lysine nadat de behandeling van hoge-glucose wordt gepresenteerd.
Reactieve metabolieten zoals methylglyoxal zijn fluctuant en eiwitten snel wijzigen14. Daarom blijft de vraag of deze reactieve metabolieten werkelijk zich in het organisme ophopen of worden gewijzigd vóór het bereiken van hun doel. Figuur 4 bevestigt de accumulatie van methylglyoxal in C. elegans na een behandeling met de stof.
Oxidatieve stress is toegenomen, zowel tijdens hyperglycemie6als bij schuifspanning. Figuur 5 bevestigt geen verschil in de vorming van oxidatieve stress tussen de glucose-testgroep, overgedragen zoals in deel 2 van het protocol, en de groep van niet-overgedragen. Vergelijking van beide glucose-behandelde groepen de onbehandelde controlegroep toont een aanzienlijke stijging in oxidatieve stress veroorzaakt door glucose. Daarentegen werd geen significant verschil tussen de twee glucose-behandelde groepen waargenomen. Deze resultaten illustreren dat behandeling van nematoden met behulp van dit protocol er niet aanzienlijk toe brengt de vorming van oxidatieve stress, die als een confounder in onderzoeken van veroudering of metabolisme dienen kan. Bovendien waren de bevindingen in de huidige literatuur gereproduceerd met behulp van dit protocol.
Figuur 1: voldoende dichtheid van nematoden voor een verdere distributie op platen. (A) dit paneel toont een macroscopische weergave. (B) dit paneel toont een microscopische weergave, op 20 X vergroting. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Eiwitgehalte van wild-type C. elegans N2. Dit paneel toont de correlatie van het aantal nematoden aan het rendement van de eiwitten van de lysate, voorbereid zoals beschreven in sectie van protocol 5 in 12 dagen oude nematoden(n = 3 lysate van 500 nematoden; n = 3 lysate van 1.000 nematoden; en n = 1 lysate van 1.500 nematoden). De regressielijn is gemarkeerd in het rood (r2 = 0.976, y = 0.64). De eiwitconcentratie totaal werd gemeten met behulp van de methode Bradford. De gegevens worden uitgedrukt als de gemiddelde ± standaardafwijking (SD). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Verhoogde vorming van fructosyl-lysine na een behandeling van de glucose van C. elegans N2. De concentraties van fructosyl-lysine na een behandeling met glucose in 12 dagen oude nematoden en onbehandelde controles werden bepaald door LC-MS/MS en genormaliseerd naar een eiwitconcentratie bepaald volgens de methode van Bradford. De gegevens worden uitgedrukt als de gemiddelde ± SD. De p-waarden werden bepaald door de Student t-test, **p < 0,01. De resultaten zijn uit drie onafhankelijke experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Intracellulair methylglyoxal concentraties na een methylglyoxal behandeling van C. elegans N2. Methylglyoxal concentraties werden gemeten door LC-MS/MS in 12 dagen oude nematoden methylglyoxal behandeld. De monsters werden verzameld minder dan 2 uur na de laatste behandeling. De gegevens worden uitgedrukt als de gemiddelde ± SD genormaliseerd naar het aantal aaltjes. De p-waarden werden bepaald door de Student t-test, **p < 0,01. De resultaten zijn uit drie onafhankelijke experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Oxidatieve stress gemeten in C. elegans CL2166 na een behandeling van glucose. Transgenic CL2166 (gst4::GFP)8 met een 4-promotor-driven GFP-reporter van glutathion-S-transferase werden gekweekt op 400 µM FUdR platen met glucose voor 2 d. Één groep overgeplaatst naar verse glucose platen op dag 1 zoals beschreven in paragraaf 2 van dit protocol. Oxidatieve stress werd gemeten als een verhoging in fluorescentie [relatieve licht eenheden (RLU)] met een afleesapparaat. De gegevens worden uitgedrukt als de gemiddelde ± SD. De p-waarden werden bepaald door ANOVA, *p < 0.05. De resultaten zijn uit drie onafhankelijke experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol biedt een betrouwbare benadering voor het grootschalig kweken van C. elegans om kwantitatieve resultaten te verkrijgen. Bevindingen uit de literatuur kunnen worden gerepliceerd, zoals wordt weergegeven in de Resultaten van de vertegenwoordiger. Hoewel dit protocol voor grootschalige monsters van C. elegans een rechttoe-rechtaan-methode lijkt, zijn er bepaalde valkuilen rekening te houden. Met betrekking tot de synchronisatie van de nematode bevolking beschrijft dit protocol een aanpak door het bleken van de bevolking met natriumhypochloriet en natriumhydroxide-oplossing om te vernietigen de nematoden en oogst de eieren alleen. Moet rekening worden gehouden met dat deze aanpak niet geschikt voor alle experimenten zou kunnen zijn. Afhankelijk van de verhouding van de grootte van de populatie aan het volume van de bleken oplossing beïnvloedt het ozonvriendelijk effect van de bleken oplossing de ontwikkeling van de embryo's15. Vooral bij de studie van ontwikkelings processen, zou dit een cruciale stap. Met betrekking tot de behandeling van de nematoden is het van cruciaal belang om toe te passen als kleine afschuiving strijdkrachten mogelijk in het gehele protocol. Als niet met zorg behandeld, zal een groot aantal aaltjes vergaan. Wat dat betreft is het belangrijk niet te overschrijden de spinnen tijd en snelheid. Bij het overbrengen van de nematoden, moet een gesneden Pipetteer tip om het aantal gewonde nematoden te verminderen worden gebruikt. Voor de overdracht van de nematoden, mag de aanbevolen hoeveelheid buffer niet worden overschreden, zoals de agar kraken kan zodra het te vochtig, de nematoden de gelegenheid om te graven in de plaat. Terwijl het verzamelen van de monsters, is de M9 buffer moet ijskoud te vertragen de nematoden metabolisme, vooral bij het werken met metabolieten of substraten die C. elegans zal degraderen. Het is belangrijk te wassen het monster grondig om te minimaliseren van eventuele bacteriële besmetting van voorafgaande voeden. Bij het overbrengen van de pellet, vergeet niet dat een groot aantal wormen op plastic pipet tips kon stok. De aanbevolen glazen pipet moet worden gebruikt, zoals zelfs lage-bindende Pipetteer tips een grote hoeveelheid van het monster behouden kon. Als alternatief voorgesteld de toevoeging van 0,01% Triton-X100 aan de M9 buffer eerder was16. Sacharose Floating na het verzamelen van de nematoden kan worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat geen overleden C. elegans of bacteriën invloed op de resultaten hebben zal,14. Dit gebeurt meestal na het kweken van vloeibare als u wilt verwijderen van het medium. In dit experiment, was deze reiniging weggelaten, omdat sacharose wordt gemetaboliseerd in glucose en fructose, dus potentieel verstorende onze resultaten.
Typisch, een grootschalige cultuur van C. elegans wordt uitgevoerd met behulp van vloeibare media. Vloeibare kweken, is echter niet geschikt voor alle experimentele instellingen, vooral bij gebruik van de uitlezingen waarvoor exacte cijfers van nematoden. Een wijziging van de Baerman toestellen werd eerder beschreven om te sorteren en te zuiveren van nematoden afgeleid van vloeibare cultuur17. Deze methode sterk vermindert bacteriële verontreiniging en filters alleen volwassen nematoden door een meerdere component-filtersysteem. Deze elegante methode wordt beperkt door de lange filtering tijd (2-6 h) bij kamertemperatuur, die metabole analyses verwarren kunnen. Wat betreft de filteringtechniek, zijn nematoden gesorteerd op hun bewegende activiteiten. Nematoden moeten fit genoeg om zelfstandig doorzoeken via de poriën van filters van verschillende materialen. Resultaten kunnen dus worden verstoord door nematoden die zijn verzwakt door de experimentele behandelingen uit te sluiten.
Combinatie van vloeistof en plaat culturen in een enkele proefopzet kan ook dienen als een confounder in latere analyses. C. elegans ontwikkelt een dunner en langer fenotype in vloeibare cultuur, waardoor het moeilijk te vergelijken parameters genormaliseerd naar massa, gehalte aan andere melkeiwitten, of de lengte en breedte lichaam2. Bovendien is de studie van reactieve stoffen in vloeibare cultuur, uitdagende aangezien reactieve stoffen zal waarschijnlijk worden gewijzigd of geïnactiveerd door mediacomponenten vóór het bereiken van de nematoden. Hoewel grootschalige monsters van C. elegans kunnen worden verkregen met dit protocol, is de cultuur van de plaat zelf meer arbeidsintensief dan vloeibare cultuur. Echter, er zijn bepaalde manieren ter vergemakkelijking van de behandeling (bijvoorbeeldmet het gebruik van een agar-verstrekking machine). Een andere optie om efficiënt grootschalige cultuur is het gebruik van petrischaaltjes met een grotere diameter voor de productie van agar platen. Deze optie zou beperking door de daaropvolgende analyses. Voor de microscopische beoordeling of plaat behandeling in het algemeen, verlagen de voorzieningen met de diameter van de schotel.
Meerdere high-throughput benaderingen geschikt voor de beoordeling van verschillende parameters, zoals chemische of drug screening, geweest ontwikkeld en onderzocht18. Microfluidic apparaten staan onderzoekers aan het bestuderen van verschillende parameters, zoals in een model van type 2 diabetes19. Levensduur, lipide metabolisme en oxidatieve stress reacties kunnen worden gelijktijdig beoordeeld op een niveau van één enkel dier, de voordelen van hoge-content screening, die fenotypische biochemische informatie integreert onthullen. De beoordeling van de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de huidige literatuur blijkt al een grote verfijning van deze technieken, die verder gaan dan de proof-of-concept studies18. De betaalbaarheid, vooral voor kleinere laboratoria, nog steeds problematisch zijn, zoals de apparaten vaak worden aangepast volgens de experimentele behoeften, die blijken moeten kunnen te zijn kostbaar.
De kwantificering van leeftijden in C. elegans wordt bemoeilijkt door de ondoordringbare schubbenlaag van het dennenaaltje. Een veelgebruikte methode is het opsporen van leeftijden via immunefluorescentie technieken6. Vanwege de cuticle, zijn grotere maten monsters nodig om het verlagen van de hoge variantie van de resultaten. Imaging moet rekening worden gehouden met als een tijdrovende factor.
Het protocol voor gehele lichaam lysate voorbereiding hier beschreven maakt intracellulaire leeftijden en andere onderdelen van C. elegans toegankelijk voor analyses. LC-MS/MS metingen van C. elegans monsters zijn uitgevoerd vóór14. Voldoende kweken voorwaarden, echter zijn om een voldoende aantal aaltjes, niet beschreven in detail, nog.
De in dit protocol beschreven methode is nuttig voor uitlezingen vereisen een grootschalige, homogeen gegroeid bevolking van C. elegans, of voor de combinatie van meerdere uitlezingen per experiment. Dit is met name handig voor het bestuderen van complexe multifactoriële ziekten zoals diabetes en de complicaties. Alternatieve benaderingen, zoals hoge-doorvoer en hoge-content screening met behulp van microfluidic systemen, technologisch meest geavanceerde en zijn in staat om grotere en middelgrote gegevens te verstrekken. Hun belangrijkste toepassing te momenteel zien in de chemische en drug screening of genetische screening voor mutanten reageren op de experimentele behandelingen. Dit protocol helpt onderzoekers te gemakkelijk en goedkoop upscale de grootte van hun huidige of toekomstige projecten zonder de behoefte aan een aanpassing van de huidige experimentele uitlezingen en, dus, om te minimaliseren van de schade van de tijd die is gekoppeld aan de oprichting van nieuwe methoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) binnen de IRTG 1874 "Diabetische microvasculaire complicaties" en CRC 1118 "Reactieve metabolieten als een reden tot diabetische late complicaties". C. elegans stammen N2 en CL2166 werden verstrekt door de CGC, die wordt gefinancierd door het Bureau van de NIH onderzoek infrastructuur programma's (P40 OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli OP50 | CGC | n/a | |
| C. elegans N2 | CGC | n/a | |
| C. elegans CL2166 | CGC | n/a | |
| Petri dish, 60 mm x 15 mm | Greiner One | 628161 | |
| Volumetric pipet, glas, 10 mL | Neolab | E-0413 | |
| Proteinase inhibitor cocktail tablets | Roche | 04693124001 | |
| Non-denaturing lysate buffer: | |||
| Tris-HCl, pH 8 | Sigma | T3253 | |
| Sodiumchloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E5391 | |
| 96-well plates, transparent bottom | Brand | 781611 | |
| Infinite M200, plate reader | Tecan | 30017581 | |
| Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm | Next advance | ZROB05-RNA | |
| Bullet Blender, homogenizer | Next advance | BBX24 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P6887 | |
| Thymol | Sigma | T0501 | |
| Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P6911 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P43339 | |
| Prolidase from Porcine Kidney | Sigma | P6675 | |
| Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica | Sigma | A8200 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Merckmillipore | UFC501096 | |
| Basic Materials for plate culture are described in Reference 6. |
References
- Fronius, M., Clauss, W. G. Mechano-sensitivity of ENaC: may the (shear) force be with you. Pflügers Archiv. 455 (5), 775-785 (2008).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html (2006).
- Altun, Z. F., Hall, D. H. Nervous system, general description. WormAtlas. , Available from: http://www.wormatlas.org/hermaphrodite/nervous/Neuroframeset.html (2011).
- Sohn, E. H., et al. Retinal neurodegeneration may precede microvascular changes characteristic of diabetic retinopathy in diabetes mellitus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (19), E2655-E2664 (2016).
- Chilelli, N. C., Burlina, S., Lapolla, A. AGEs, rather than hyperglycemia, are responsible for microvascular complications in diabetes: a "glycoxidation-centric" point of view. Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Diseases. 23 (10), 913-919 (2013).
- Schlotterer, A., et al. C. elegans as model for the study of high glucose- mediated life span reduction. Diabetes. 58 (11), 2450-2456 (2009).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Leiers, B., et al. A stress-responsive glutathione S-transferase confers resistance to oxidative stress in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 34 (11), 1405-1415 (2003).
- Rabbani, N., Thornalley, P. J. Measurement of methylglyoxal by stable isotopic dilution analysis LC-MS/MS with corroborative prediction in physiological samples. Nature Protocols. 9 (8), 1969-1979 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 7 (72), 248-254 (1976).
- Ahmed, N., Argirov, O. K., Minhas, H. S., Cordeiro, C. A., Thornalley, P. J. Assay of advanced glycation endproducts (AGEs): surveying AGEs by chromatographic assay with derivatization by 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamate and application to Nepsilon-carboxymethyl-lysine- and Nepsilon-(1-carboxyethyl)lysine-modified albumin. Biochemical Journal. 364 (Pt 1), 1-14 (2002).
- Thornalley, P. J., et al. Quantitative screening of advanced glycation endproducts in cellular and extracellular proteins by tandem mass spectrometry. Biochemical Journal. 375 (Pt 3), 581-592 (2003).
- Karachalias, N., Babaei-Jadidi, R., Ahmed, N., Thornalley, P. Accumulation of fructosyllysine and advanced glycation end products in the kidney, retina and peripheral nerve of streptozotocin-induced diabetic rats. Biochemical Society Transactions. 31, 1423-1425 (2003).
- Morcos, M., et al. Glyoxalase-1 prevents mitochondrial protein modification and enhances lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 7 (2), 260-269 (2008).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Lagido, C., McLaggan, D., Glover, L. A. A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (105), e53083 (2015).
- Takamiya, S., Mita, T. Large-scale purification of active liquid-cultured Caenorhabditis elegans using a modified Baermann apparatus. Parasitology International. 65 (5 Pt B), 580-583 (2016).
- Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. Microfluidic systems for high-throughput and high-content screening using the nematode Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 17 (22), 3736-3759 (2017).
- Zhu, G., Yin, F., Wang, L., Wei, W., Jiang, L., Qin, J. Modeling type 2 diabetes-like hyperglycemia in C. elegans on a microdevice. Integrative Biology. 8 (1), 30-38 (2016).
