Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für den großflächigen Anbau von Caenorhabditis Elegans auf festen Medien. Als Alternative zu flüssigen Kultur ermöglicht dieses Protokoll Parameter der verschiedenen Maßstäben Platte-basierte Anbaufläche zu erhalten. Dies erhöht die Vergleichbarkeit der Ergebnisse durch den Verzicht auf die morphologischen und metabolische Unterschiede zwischen flüssigen und festen Medienkultur.
Abstract
Kultivierung von Caenorhabditis Elegans (C. Elegans) in einer großen Weise auf Agarplatten kann zeitraubend und schwierig sein. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und kostengünstige Methode, um eine große Anzahl von Tieren für die Isolierung von Proteinen mit einem western-Blot, Massenspektrometrie oder weitere Proteomics Analysen fortfahren zu erhalten. Darüber hinaus können eine Erhöhung der Nematoden Zahlen für Immunostainings und die Integration von mehreren Analysen unter den gleichen Bedingungen Kultivierung leicht erreicht werden. Darüber hinaus wird eine Übertragung zwischen Platten mit verschiedenen experimentellen Bedingungen erleichtert. Allgemeine Techniken in der Platte Kultur beinhalten den Transfer von einem einzigen C. Elegans mit einem Platindraht und die Übertragung der besiedelten Agar Brocken mit einem Skalpell. Jedoch werden diese Techniken mit immer mehr Nematoden, allzu zeitaufwendig. Dieses Protokoll beschreibt die groß angelegte Kultur von C. Elegans einschließlich zahlreiche Schritte zur Minimierung der Auswirkungen der Probenvorbereitung auf die Physiologie des Wurms. Flüssigkeit und Schubspannung verändern können die Lebensdauer und Stoffwechselprozesse in C. Elegans, erfordern somit eine detaillierte Beschreibung der kritischen Schritte um zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse abzurufen. C. Elegans ist ein Modellorganismus, bestehend aus neuronalen Zellen bis zu ein Drittel, aber fehlen Blutgefäße, wodurch die Möglichkeit, unabhängig von vaskulären Kontrolle ausschließlich neuronale Veränderungen zu untersuchen. Vor kurzem wurde Anfang Neurodegeneration bei diabetischer Retinopathie vor der vaskulären Veränderungen gefunden. C. Elegans ist daher von besonderem Interesse für das Studium allgemeine Mechanismen der diabetischen Komplikationen. Zum Beispiel eine erhöhte Bildung von advanced Glycation Endprodukte (Alter) und reaktive Sauerstoffspezies (ROS) beobachtet, die reproduzierbar in C. Eleganszu finden sind. Protokolle, Proben von ausreichender Größe für ein breiteres Spektrum an Untersuchungen zu behandeln sind hier vorgestellt am Beispiel der Studie von Diabetes-induzierte biochemische Veränderungen. In der Regel dieses Protokolls kann nützlich sein für Studien erfordern große C. Elegans Zahlen und in welcher Flüssigkultur nicht geeignet ist.
Introduction
Protein-Analysen, wie ein western-Blot oder Massenspektrometrie, erfordern Milligramm des Proteins. Diese Ausbeute erfordert eine großflächige Kultivierung von Hunderten von C. Elegans, die Flüssigkultur oder auf festen Medien übertragen die Nematoden durch Waschen erreicht werden kann. Flüssigkeit und Schubspannung induziert die Expression von epithelialen Natriumkanälen (ENaC), die den osmotischen Stress durch eine erhöhte Aufnahme von Natrium, möglicherweise die Lebensdauer von C. Elegans zu verändern und die Auswirkungen auf metabolische Analysen1 erhöhen könnte . Daher nehmen einige wichtige Schritte in diesem Protokoll für die Platte basierenden Ansatz die Reduzierung von Stress Auswirkungen auf experimentelle Variabilität zu berücksichtigen. Flüssigkultur, auf der anderen Seite beeinflusst den Phänotyp der Nematoden und erschwert die Kultur und die Sammlung von eine genaue Anzahl von Nematoden2. Darüber hinaus reaktiven Substanzen von Medienkomponenten veränderbar und können vor Erreichen der Nematodes ungleichmäßig verteilen. Über die Grenzen der Flüssigkultur bietet dieses Protokoll einen alternativen Ansatz zur Kultivierung großer Proben von C. Elegans.
C. Elegans ist ein Modellorganismus mit einem deutlichen Netzwerk von 302 Nervenzellen, aus denen ein Drittel aller seiner Zellen3. Seit seiner Einführung in die Wissenschaft, viele homologe und ortholog Gene wurden beschrieben, seinen Wert als Modell für die medizinische Forschung zu verstärken. Vor kurzem präsentierte Beweise für neurologische Beeinträchtigung bei diabetischer Retinopathie, vor Gefäßschädigungen,4. C. Elegans fehlt Blutgefäße, sondern enthält ein unterschiedliches neuronales Netzwerk, so dass es ein geeignetes Modell abgesehen von vaskulären, neuronale Veränderungen zu untersuchen. C. Elegans ist daher von besonderem Interesse für das Studium allgemeine Mechanismen der diabetischen Komplikationen. Biochemische Veränderungen im diabetischen Komplikationen betreffen die Bildung von Altersgruppen, die weiter die Bildung von ROS in Reaktion auf Hyperglykämie5 beeinflussen. Altersgruppen finden sich in C. Elegans und tragen zur neuronalen Schaden6. Chronische Krankheiten entstehen oft durch komplexe, Polygene Prozesse erfordern einen multiparametric Ansatz für die Bewertung ihrer zugrunde liegenden Mechanismen, wie hier bei der Bewertung von diabetischen Komplikationen. Dieses Protokoll kann der Einsatz für den Erhalt mehrerer Parameter gleichzeitig, sowie anschließend sein. Erhöhte Vergleichbarkeit und Reproduzierbarkeit eines multiparametric Ansatzes können durch Weglassen der morphologischen und metabolische Unterschiede zwischen der flüssigen und festen Medienkultur erreicht werden.
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Protocol
Hinweis: Dieses Protokoll ist in fünf Abschnitte unterteilt. In den Abschnitten 1 – 3 ist das wichtigste Protokoll zu C. Elegans auf eine groß angelegte Kultur vorgestellt. Abschnitte 4 und 5 bieten zusätzliche Protokolle für die Beurteilung der beispielhaft Metaboliten in diabetischen Metaboliten auftritt. Abschnitt 1 beschreibt im Detail eine groß angelegte Allgemeinbildung auf Tellern. Abschnitt 2 konzentriert sich auf die Übertragung von großen Mengen von C. Elegans, während Kapitel 3 erklärt die Ernte einer großen Stichprobe. Abschnitt 4 erklärt die Protein-Isolierung aus der Probe und Kapitel 5 beschreibt die Probenvorbereitung für die anschließende flüssige Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) Analysen.
(1) groß angelegte Kultur auf Platten
- Im Allgemeinen arbeiten Sie unter sterilen Haube oder in der Nähe einer offenen Flamme, um Kontaminationen zu vermeiden.
-
Zur Kultur Würmer bis zum jungen Erwachsenen Stadium erreichen Folgen dieser zuvor veröffentlichten Protokoll7 mit den folgenden Anpassungen.
- Verwenden Sie lebende OP50 Escherichia coli Bakterien zu füttern die Nematoden und Experimente 400 µM Fluorodeoxyuridine Agar (nicht Ampicillin/FUdR) vorbereiten.
- Verwenden Sie für die Vorbereitung einer synchronen Bevölkerung unkonzentrierte OP50, und für Experimente mit den Erwachsenen gelingt, verwenden Sie 3.3 x konzentrierte OP50 durch Entfernen von 70 % des Überstands.
- Tägliche Fütterung Intervalle werden empfohlen. Bei der Beurteilung von oxidativen Stress können verschiedene Intervalle und Volumina für die Fütterung die Ergebnisse beeinträchtigen.
- Für die Impfung einen Teller mit verschiedenen Nematoden und schneiden Sie es in Stücke von ca. 0,5 x 1 cm2 mit einem Skalpell. Übertragen Sie zwei bis drei Stücke auf Nematoden Wachstumsfugen Medien (NGM) von 60 mm Durchmesser, mit konzentriertem OP50.
- Inkubieren Sie die Platten bei der Temperatur für die Belastung (Wildtyp N2 sollten bei 20 ° C kultiviert werden) bis die Eier auf der Platte sichtbar werden.
- Die meisten Eier und ausgewachsene Tiere mit 2 mL M9 Puffer waschen Sie ab und sammeln sie in einem 15 mL-Tube. Zentrifugieren Sie die Federung bei 800 X g für 2 min. Unterdessen bereiten Sie Bleichbad.
- Das zentrifugiert Rohr herausnehmen Sie und den M9-Puffer mit einer 10 mL pipettieren. Fügen Sie 10 mL der bleichen Lösung und Mix auf den Wirbel, bis die Erwachsenen Fadenwürmer lysiert werden. Dies dauert in der Regel ca. 5 – 7 min, aber sollte nicht länger als 15 Minuten dauern oder die Eier werden im Experiment nicht voll weiter entwickeln.
- Zentrifugieren Sie die Federung bei 800 X g für 2 min. Waschen 3 Mal mit 10 mL M9 Puffer um die Eier aus bleichen Lösung zu löschen.
- Fügen Sie jetzt 150 µL der Ei-Suspension auf OP50 Platten. Eine Dichte von 200 bis 300 Eier sollte auf jeder Platte erreicht werden. Warten Sie, bis die Nematoden die adult-Stadium erreicht.
Hinweis: Die M9-Puffer (pH 7,0) verwendet für die dargestellten Experimente besteht aus folgenden Substanzen: 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4und 86 mM NaCl. Nach dem Autoklavieren die Mischung fügen Sie 1 mM MgSO4. Bleichbad enthält 0,5 M NaOH, 2,3 mM NaOCl in destilliertem Wasser gelöst. - Bereiten Sie sterile M9 Puffer, sterilen Pipettenspitzen mit einem Schnitt Tipp, waschen Sie die Würmer und 15 mL-Tuben zu sammeln in.
- Etwa 1 mL der M9 Puffer auf die Platten auftragen, sanft Verteilen des Puffers durch Schwenken und sanft pipettieren der Nematodes aus der Platte.
- Jetzt sammeln Sie die Nematoden in die Röhre. 150 µL einer Aussetzung direkt auf die Platten (entkernt mit OP50) mit der geschnittenen Pipettenspitzen auftragen und bewerten mikroskopisch die Dichte der Nematoden (empfohlen: 50 – 100 Nematoden pro 60 mm Platte).
- Wenn sie zu dicht sind, verdünnen Sie das Fahrwerk mit M9 Puffer und unter dem Mikroskop zu bewerten Sie, bis die gewünschte Dichte erreicht ist. Wenn die Ausbeute zu wenig ist, lassen Sie die Würmer niederzulassen oder Zentrifugieren des Aufhängung 10 s bei 800 X g Flüssigkeit zu entfernen.
Hinweis: Ein Beispiel für eine ausreichende Dichte ist in Figur 1A (makroskopische) und 1 b (mikroskopische) bei 20 X Vergrößerung gegeben. Fortfahren Sie empirisch wie beschrieben. - Denken Sie daran, das die Würmer schnell beruhigen. Um eine gleichmäßige Verteilung zwischen den Platten zu gewährleisten, Invertieren Sie die Röhre nach jedem Stapel Platten (4 – 5 Platten).
Hinweis: Der Schnitt pipette Tipp sowie das sanfte schwingen und Waschen der Platten, Schubspannung reduziert.
2. übertragen von großen Datenmengen Caenorhabditis elegans
- Waschen Sie die Nematoden mit ca. 500 µL Puffer M9, je nach Alter und Trockenheit der Platten. Mit dem gleichen Puffer, wiederholen Sie die Nematoden abnehmen, bis die meisten Tiere in der Schwebe gesammelt werden.
- Langsam nehmen Sie die Nematoden mit einer geschnittenen Pipettenspitze und übertragen Sie sie auf einem Teller mit OP50 vorbereitet. Lassen Sie die Platte trocken.
Hinweis: Seien Sie vorsichtig, nicht viel mehr als die empfohlene Menge anzuwenden. Vor allem in Langzeitexperimente die Platten können es nicht tolerieren und Agar kann brechen, so dass die Nematoden in die Ritzen kriechen.
(3) eine große Ernte Caenorhabditis Elegans Probe
- Abhängig von der gewählten Methode beginnen Sie Experimente mit einer ausreichenden Menge von C. Elegans. LC-MS/MS-Analysen Vorbereitung 20 Platten (60 mm x 15 mm) pro Gruppe mit rund 100 Nematoden pro Platte um eine Rendite von mindestens 200 µg Protein pro Probe zu gewährleisten.
Hinweis: Dieser Teil des Protokolls erfordert keine Arbeiten unter sterilen Bedingungen nicht mehr, da die Nematoden gesammelt und eingefroren werden. - Am Tag der Probenentnahme bereiten Sie Flüssigstickstoff, Snap-die gesammelten Proben Einfrieren vor. Halten Sie unsteril M9-Puffer auf dem Eis, um die Nematoden Stoffwechsel zu verlangsamen.
- C. Elegans von den Platten 1 mL der M9 Puffer und sanft wirbeln die Teller abwaschen. Dies vermeidet verstorbenen Nematoden und die meisten Eier sammeln, wenn es vorhanden sind, da sie die Bakterien und Agar verkleben.
- Nehmen Sie die Lautstärke und überträgt es auf eine 15 mL-Tube.
- Warten Sie nach der Sammlung von das vollständige Beispiel die Nematoden zu begleichen oder den Schlauch kurz bei 800 X g Zentrifugieren und entfernen die meisten des Puffers M9. Waschen Sie die Probe 3 X mit etwa 10 mL der M9 (10 x das Probenvolumen) um alle Bakterien zu entfernen.
Hinweis: Um sicherzustellen, dass alle verstorbene Nematoden entfernt sind, Saccharose float ist eine weitere Option. Dies war jedoch nicht geeignet für die angezeigten Experimente15. Saccharose ist in Glucose und Fructose hydrolysiert. In den dargestellten Experimenten wurde die Rolle der Glukose bewertet, biochemische Veränderungen gefunden bei chronischen Diabetes zu fördern. So konnte Saccharose float die Ergebnisse möglicherweise verwechseln. - Bereiten Sie ein 1,5 mL Röhrchen mit 1 mL der M9 Puffer und eine leere 1,5 mL Tube für jede Probe. Übertragen Sie die Tablette mit einem Glas pipettieren aus 15 mL Tube auf der leeren 1,5 mL Tube. Dieser Schritt ist entscheidend, um eine quantitative Übertragung zu gewährleisten.
Hinweis: Im Gegensatz zu hier während der vorherigen Schritte die Nematoden konzentrierter. Wegen einer möglichen Einhaltung Kunststoff pipettieren Tipps dürfte der Verlust eines großen Teils der Probe. Verwenden Sie daher stattdessen glaspipetten. - Verwenden Sie nach der Übertragung die Glaspipette 1 mL der M9-Puffer von der zweiten 1,5 mL Tube aufnehmen, um die Nematoden aus der Pipette Wand zu spülen. Auch waschen Sie die restlichen Nematoden aus der 15 mL Tube und übertragen Sie sie auf das Probenröhrchen.
- Zentrifugieren Sie das Probenröhrchen bei 19.000 X g für 1 min und entfernen Sie so viel überstand wie möglich.
- Versiegeln Sie das Rohr mit Parafilm und sofort Snap-Freeze es in flüssigem Stickstoff. Speichern Sie das Rohr bei-80 ° C bis lysate Vorbereitung.
(4) Protein isoliert für Massenspektrometrie
Hinweis: Die hier beschriebenen Protein-Isolation kann auch für andere Assays (z.B. western-Blot) verwendet werden.
- Die gefrorenen Probe fügen Sie die gleichen Volumina von 0,5 mm Zirkonoxid-Perlen und mindestens 2 x die Menge lysate Puffer mit einem Proteinase-Inhibitor-Cocktail hinzu.
Hinweis: Die abgebildeten Nematoden-Protein-Korrelation-Analysen wurden mit 100 µL Puffer durchgeführt. LC-MS/MS-Proben wurden mit 200 µL Puffer lysiert. - Starten Sie den Homogenisator für 1 min auf Geschwindigkeit 9. Stellen Sie sicher, dass die Proben vollständig lysiert werden. Wiederholen Sie diesen Schritt, wenn sie nicht vollständig lysiert werden.
- Zentrifugieren Sie die Proben für 30 min bei 4 ° C bei 19.000 X g. Übertragen Sie den überstand zu einem neuen Schlauch auf dem Eis zu und bei-80 ° C zu speichern Sie, bis weitere Messungen genommen werden sollen.
Hinweis: Die nicht Denaturierung Puffer für die dargestellten Experimente verwendet besteht aus folgenden Substanzen: 20 mM Tris-HCl (pH 8), 137 mM NaCl, 1 % Triton-X und 2 mM EDTA.
Hinweis: Er folgte den Schritten dieses Protokolls und die vorgeschlagenen Skala angewendet haben, sollte die Rendite eines Pellet-Protein von etwa 1.000 Nematoden ca. 500 µg liegen. Mehr Vergleiche finden Sie in Abbildung 2 und die Vertreter Ergebnisse.
(5) Probenvorbereitung für flüssige Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie Messungen
Hinweis: Je nach gewünschten Parameter, wird die Probenvorbereitung unterscheiden. Dieses Protokoll setzt auf Methylglyoxal und Altersbestimmung.
-
Messen Sie intrazelluläre Methylglyoxal Derivatisierung mit 1,2-Diaminobenzene (DB) als zuvor beschriebenen9.
- Die Proben mit 20 µL der eiskalte 20 % (wt/Vol) Trichloressigsäure Säure in Natriumchlorid 0,9 % (wt/Vol) und 80 µL Wasser in einem 1,5 mL Röhrchen zu homogenisieren.
- Spike der Proben von 5 µL mit internem Standard (13C3-MG, 400 nM), durch Vortexen mischen und anschließend Zentrifugieren sie bei 21.000 X g für 5 min bei 4 ° C.
- Die HPLC-Probenfläschchen mit einem Glaseinsatz 200 µL übermitteln Sie 35 µL des Überstands.
- Jede Probe, gefolgt von 10 µL 0,5 mm DB 200 mM HCl mit 0,5 mM Diethylenetriaminepentaacetic Säure (DETAPAC) im Wasser fügen Sie 5 µL 3 % Natriumazid (wt/Vol hinzu).
- Inkubieren Sie die Proben für 4 h bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt werden.
- Analysieren Sie die Proben von LC-MS/MS, wie zuvor beschrieben9.
Hinweis: Für die Messung des Alters, isolieren Sie die Proteine wie in Abschnitt 4 des Protokolls beschrieben.
-
Messen Sie die Konzentration des Proteins von dem (aufgetauten) Lysates mit einem Bradford-Test10.
- Eine Standardkurve gespickt mit Rinderserumalbumin (BSA) gelöst in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) der folgenden Konzentration Aliquote von 30 µL vorbereiten: 0; 0.1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,6; 0,8; und 1,0 mg/dL.
Hinweis: Wenn die Probe auf die vorgeschlagene Größe vorbereitet wurde (siehe Schritt 4.1 für die Vorbereitung der lysate mit 200 µL Puffer), die geschätzte Konzentration sollte im Bereich von ca. 2 – 7 mg/mL. In diesem Fall verdünnen Sie die Proben 01:10 mit PBS vor der Messung.
Hinweis: Für die ersten Versuche mit dieser Methode, es empfiehlt sich, die Proben in verschiedenen Verdünnungen zu messen (1, 01:10 und 1: 100). Da gibt es keine genaue Bestimmung der Anzahl von Nematoden, kann einzelne Forscher die Ausbeute unterscheiden. - Verwenden Sie eine transparente 96-Well-Platte (Polystyrol) und pipette 10 µL jeder standard Konzentration und der Proben in die gewählten Verdünnungen Duplikate in den Brunnen.
- Verdünnen Sie das Protein Assay Farbstoff Reagenz Konzentrat 1:5 mit destilliertem Wasser (Aq. Dest.) und jede Probe auf dem Teller 200 µL der Verdünnung hinzu. Inkubieren Sie die Platte für 10 min bei Raumtemperatur.
- Messen Sie die Absorption innerhalb von 30 min bei 595 nm mit einem Teller-Lesegerät. Die Proben können von der berechneten Standardkurve interpoliert werden. Weitere Einzelheiten des Verfahrens wurden in der Literatur10ausführlich beschrieben.
- Eine Standardkurve gespickt mit Rinderserumalbumin (BSA) gelöst in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) der folgenden Konzentration Aliquote von 30 µL vorbereiten: 0; 0.1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,6; 0,8; und 1,0 mg/dL.
-
Maßnahme im intrazellulären Alter wie oben beschrieben11,12.
- Waschen Sie die Gesamt-Protein-Extrakte (ca. 200 µg) 3 X mit Wasser durch Ultrazentrifugation in 10 kDa zentrifugale Filtereinheiten.
- Das wiederhergestellte Protein (ca. 100 µL) 10 µL 100 mm HCl und Pepsin (2 mg/mL in 20 mM HCl) 10 µL 10 µL von Thymol (2 mg/mL in 20 mM HCl) hinzu und inkubieren Sie die Proben bei 37 ° C für 24 h.
- Neutralisieren und Puffern die Proben bei pH 7,4 durch Zugabe von 12,5 µL 0,5 M Kalium Phosphatpuffer (pH 7,4) und 5 µL von 260 mM KOH.
- Fügen Sie 10 µL Pronase E [2 mg/mL in 10 mM-Kalium-Phosphat-Puffer (pH 7,4)] und 10 µL einer Lösung Penicillin-Streptomycin und inkubieren Sie die Proben bei 37 ° C für 24 h.
- Fügen Sie 10 µL Aminopeptidase [2 mg/mL in 10 mM-Kalium-Phosphat-Puffer (pH 7,4)] und Prolidase [2 mg/mL in 10 mM-Kalium-Phosphat-Puffer (pH 7,4)], 10 µL und inkubieren Sie die Proben bei 37 ° C für 48 h.
- Analysieren Sie die resultierende Hydrolysat von LC-MS/MS, wie zuvor beschrieben12.
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Representative Results
Hier Kultur Beispiele der Schaffung eines groß angelegten C. Elegans für Anwendungen in der Diabetes-Forschung präsentiert werden. Es ist von Interesse, die Parameter beziehen sich auf ein einziges Tier, anstatt auf die Gesamt-Protein-Konzentration zu normalisieren. In einer Probe, eine kleine Anzahl von Nematoden erfordert kann dies leicht durch zählen der Nematodes erfolgen. Für eine groß angelegte C. Elegans Kultur mit Hunderten von Nematoden pro Versuchsgruppe, dieser Ansatz ist unbequem. In Abbildung 2zeigt die Korrelation zwischen der Menge von C. Elegans und der Proteingehalt. Wie hier gezeigt, kann reproduzierbare quantitative Protein isoliert unter Verwendung dieses Protokolls erreicht werden.
Die Amadori Addukt Fructosyl-Lysin ist eine von mehreren Alter Vorstufen gebildet während Diabetes in Versuchstier Modelle13. Abbildung 3 zeigt LC-MS/MS-Messungen nach einer Glukose-Behandlung in 12 Tage alte Nematoden und Alter abgestimmt unbehandelten Kontrollen von drei unabhängigen Experimenten. Die Nematoden wurden mit einer Zugabe von 200 µL lysate Puffer homogenisiert. Eine erhöhte Bildung von Fructosyl-Lysin nach die hoch-Glukose-Behandlung vorgelegt wird.
Reaktive Metaboliten wie Methylglyoxal sind Fluctuant und Proteine schnell ändern14. Daher bleibt die Frage, ob diese reaktive Metaboliten tatsächlich im Organismus ansammeln oder geändert werden, bevor Sie ihr Ziel erreichen. Abbildung 4 bestätigt die Anhäufung von Methylglyoxal in C. Elegans nach einer Behandlung mit der Substanz.
Oxidativer Stress wird erhöht, während der Hyperglykämie6, sowie während der Schubspannung. Abbildung 5 bestätigt keinen Unterschied bei der Bildung von oxidativem Stress zwischen der Glukose-behandelten Gruppe, wie in Abschnitt 2 des Protokolls übertragen und die Gruppe nicht übertragen. Vergleich beider Glukose-behandelten Gruppen zur unbehandelten Kontrollgruppe zeigt eine deutliche Steigerung in oxidativen Stress induziert durch Glukose. Im Gegensatz dazu wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Glucose-behandelten Gruppen beobachtet. Diese Ergebnisse verdeutlichen, die Umgang mit Nematoden unter Verwendung dieses Protokolls nicht deutlich die Entstehung von oxidativem Stress auslösen die als Confounder in Untersuchungen von Alterung oder Stoffwechsel dienen könnten. Darüber hinaus wurden die Ergebnisse in der aktuellen Literatur wiedergegeben unter Verwendung dieses Protokolls.
Abbildung 1: ausreichende Dichte der Nematoden für eine weitere Verbreitung auf Tellern. (A) dieses Panel zeigt eine makroskopische Ansicht. (B) dieses Panel zeigt einen mikroskopischen Blick auf 20 X Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Protein-Inhalt von Wildtyp C. Elegans N2. Das Bedienfeld zeigt die Korrelation der Anzahl der Nematoden zu den Eiweiß-Ertrag der lysate, vorbereitet wie im Protokoll Abschnitt 5 in 12 Tage alte Nematoden beschrieben(n = 3 lysate von 500 Nematoden; n = 3 lysate von 1.000 Nematoden; und n = 1 lysate von 1.500 Nematoden). Die Regressionslinie ist rot markiert (R2 = 0.976, y = 0,64). Die Gesamt-Protein-Konzentration wurde gemessen unter Verwendung der Methode von Bradford. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Erhöhte Bildung von Fructosyl-Lysin nach einer Glukose-Behandlung von C. Elegans N2. Die Konzentrationen von Fructosyl-Lysin nach einer Behandlung mit Glukose in 12 Tage alte Nematoden und unbehandelten Kontrollen wurden von LC-MS/MS festgelegt und normiert auf eine Proteinkonzentration bestimmt nach der Methode von Bradford. Die Daten sind als Mittelwert ± SD ausgedrückt Die p-Zeitwerte wurden von der Student t-test, **p < 0,01. Die Ergebnisse stammen aus drei unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Intrazelluläre Methylglyoxal Konzentrationen nach einer Methylglyoxal Behandlung von C. Elegans N2. Methylglyoxal Konzentrationen wurden in 12 Tage alte Nematoden behandelt mit Methylglyoxal LC-MS/MS gemessen. Die Proben wurden weniger als 2 h nach der letzten Behandlung gesammelt. Die Daten sind als Mittelwert ± SD normiert auf die Anzahl der Nematoden ausgedrückt. Die p-Zeitwerte wurden von der Student t-test, **p < 0,01. Die Ergebnisse stammen aus drei unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Oxidativer Stress in C. Elegans CL2166 nach einer Glukose-Behandlung gemessen. Transgenic CL2166 (gst4::GFP)8 mit Glutathion-S-Transferase 4-Promotor-orientierte GFP Reporter auf 400 µM FUdR Platten mit Glukose für 2 d kultiviert wurden. Eine Gruppe war frische Glukose Platten am Tag 1 wie beschrieben in Abschnitt 2 dieses Protokolls übertragen. Oxidativer Stress wurde als Erhöhung in Fluoreszenz [relative light Units (RLU)] mit einem Lesegerät Platte gemessen. Die Daten sind als Mittelwert ± SD ausgedrückt Die p-Werte wurden ermittelt durch ANOVA, *p < 0,05. Die Ergebnisse stammen aus drei unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Dieses Protokoll stellt einen zuverlässige Ansatz für die großflächige Kultivierung von C. Elegans , quantitative Ergebnisse zu erzielen. Erkenntnisse aus der Literatur konnte repliziert werden, wie in den Vertreter Ergebnissegezeigt. Obwohl dieses Protokoll für die Sammlung von großen Proben von C. Elegans wie eine unkomplizierte Methode scheint, gibt es einige Fallstricke zu berücksichtigen. Über die Synchronisation der Nematoden Bevölkerung beschreibt dieses Protokoll einen Ansatz durch Bleichung der Bevölkerung mit Natriumhypochlorit und Natriumhydroxid zu zerstören die Nematoden und die Eier ausschließlich zu ernten. Es muss berücksichtigt werden, dass dieser Ansatz nicht für alle Experimente geeignet sein könnten. Je nach Verhältnis der Einwohnerzahl auf das Volumen der Bleichbad beeinflusst der Schaden Effekt Bleichbad die Entwicklung der Embryonen15. Vor allem, wenn Entwicklungsprozesse zu studieren, könnte dies ein entscheidender Schritt. Bezug auf den Umgang mit den Nematoden ist es entscheidend, als wenig Scherkräften wie möglich im gesamten Protokoll anwenden. Wenn nicht pfleglich behandelt, wird eine große Anzahl von Nematoden untergehen. Für diese Angelegenheit ist es wichtig, nicht die Spinnerei Zeit und Geschwindigkeit zu überschreiten. Bei der Übertragung der Nematodes sollte eine Schnitt PIPETTENSPITZE Verringerung die Zahl der verletzten Nematoden verwendet werden. Für den Transfer von den Fadenwürmern sollte die empfohlene Menge Puffer nicht überschritten werden, da Agar knacken kann, wenn es zu feucht, den Nematoden die Gelegenheit geben, in der Platte zu graben wird. Während der Proben zu sammeln, muss der M9-Puffer gehalten werden eiskalt bis die Nematoden Stoffwechsel verlangsamen, vor allem bei der Arbeit mit Metaboliten oder Substrate, die C. Elegans abgebaut wird. Es ist wichtig, waschen Sie die Probe sorgfältig, um eine bakterielle Kontamination von vorheriger Fütterung zu minimieren. Bei der Übertragung der Pellet denken Sie daran, dass eine große Anzahl von Würmern an Kunststoff Pipettenspitzen halten könnte. Die empfohlene Glaspipette sollte verwendet werden, als auch Low-Bindung Pipettenspitzen eine große Menge der Probe behalten konnte. Als Alternative schlug der Zusatz von 0,01 % Triton-X100 auf den Puffer, M9 war zuvor16. Saccharose float nach der Sammlung von den Fadenwürmern kann durchgeführt um sicherzustellen, dass keine verstorbenen C. Elegans oder Bakterien die Ergebnisse beeinflussen,14. Dies geschieht in der Regel nach flüssigem züchten um das Medium zu entfernen. In diesem Experiment wurde diese Reinigung weggelassen, weil Saccharose in Glucose und Fructose, also potenziell verwirrende unsere Ergebnisse verstoffwechselt wird.
In der Regel wird eine groß angelegte Kultur von C. Elegans mit flüssigen Medien durchgeführt. Flüssige Kultivierung, eignet sich jedoch nicht für alle experimentellen Einstellungen, vor allem bei anzeigen Verwendung die genaue Zahl der Nematoden. Eine Modifikation des Baerman Apparates wurde zuvor beschrieben, um zu sortieren und reinigen Nematoden Flüssigkultur17abgeleitet. Diese Methode reduziert bakterielle Kontamination und filtert nur Erwachsene Nematoden durch ein mehrere Komponente-Filter-System. Diese elegante Methode ist durch die lange Filter Zeit (2-6 h) bei Raumtemperatur begrenzt, die metabolische Analysen verwirren könnte. Nematoden sind für die Filter-Technik ihre bewegenden Aktivitäten sortiert. Nematoden müssen fit genug, um selbstständig durch die Poren der Filter aus verschiedenen Materialien zu kriechen. So könnten Ergebnisse verzerrt werden, durch den Ausschluss von Nematoden, die durch die experimentellen Behandlungen geschwächt sind.
Kombination aus Flüssigkeit und Platte Kulturen in einem einzigen experimentellen Design könnte auch als ein Confounder in späteren Analysen dienen. C. Elegans entwickelt einen dünneren und längeren Phänotyp in Flüssigkultur, erschweren die Parameter normiert auf Masse, Proteingehalt oder Körper Länge und Breite2vergleichen. Darüber hinaus ist das Studium der reaktiven Substanzen in Flüssigkultur, anspruchsvoll, da reaktive Substanzen werden wahrscheinlich geändert oder durch Medienkomponenten vor Erreichen der Nematodes inaktiviert. Obwohl große Proben von C. Elegans mit diesem Protokoll abgerufen werden können, ist Platte Kultur selbst arbeitsintensiver als Flüssigkultur. Allerdings gibt es bestimmte Möglichkeiten, die Handhabung (z. B.mit dem Einsatz einer Agar-Abgabe Maschine) zu erleichtern. Eine weitere Möglichkeit, groß angelegte Kultur effizient zu fördern ist die Verwendung von Petrischalen mit einem größeren Durchmesser für die Herstellung von Agarplatten. Diese Option möglicherweise Einschränkung durch die nachfolgenden Analysen. Für mikroskopische Beurteilung oder im allgemeinen Umgang mit Platte verringern die Ausstattung mit dem Durchmesser des Tellers.
Wurden mehrere Hochdurchsatz-Verfahren für die Beurteilung verschiedener Parameter, wie z. B. chemische oder Drogen-Screening entwickelt und untersucht18. Mikrofluidische Geräte erlauben Forschern, verschiedene Parameter zu studieren wie in ein Modell von Typ-2-Diabetes19gezeigt. Lebensdauer, Fettstoffwechsel und oxidativen Stress-Reaktionen können gleichzeitig beurteilt werden auf einer Single-Tier-Ebene offenbart die Vorteile des High-Content-Screening, die phänotypische mit biochemischen Informationen integriert. Die Beurteilung der Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der aktuellen Literatur hat bereits eine große Weiterentwicklung dieser Techniken, Proof-of-Concept-Studien18hinausgehen gezeigt. Die Erschwinglichkeit, vor allem für kleinere Labore bleibt problematisch, da die Geräte oft experimentelle Bedürfnissen angepasst werden, die sich als kostspielig erweisen.
Die Quantifizierung des Alters in C. Elegans ist durch die undurchlässigen Kutikula der Fadenwurm erschwert. Eine häufig verwendete Methode ist der Nachweis des Alters über immunofluorescent Färbungen6. Wegen der Kutikula sind größere Proben erforderlich, um die hohe Varianz der Ergebnisse zu verringern. Bildgebung muss als zeitraubende Faktor berücksichtigt werden.
Das Protokoll für Ganzkörper-lysate Vorbereitung hier beschriebenen macht intrazellulären Alter und andere Komponenten von C. Elegans für Analysen zugänglich. LC-MS/MS-Messungen von C. Elegans Proben wurden vor14durchgeführt. Angemessene Kultivierung Bedingungen, wurden jedoch zur Erreichung einer ausreichenden Zahl von Nematoden, nicht im einzelnen noch beschrieben.
In diesem Protokoll beschriebene Methode eignet sich für anzeigen erfordern eine große Bevölkerung von C. Elegans, oder für die Kombination von mehreren Anzeigen pro Experiment homogen gewachsen. Dies ist besonders praktisch für die Untersuchung von komplexen multifaktoriellen Erkrankungen wie Diabetes und seiner Komplikationen. Alternative Ansätze wie Hochdurchsatz- und High-Content Screening mit mikrofluidischen Systemen sind technologisch ausgereifter und sind in der Lage, größere Daten bereitzustellen. Ihre Hauptanwendung ist in Chemie und Drogen-Screening oder genetisches Screening für Mutanten, die Reaktion auf die experimentellen Behandlungen derzeit zu sehen. Dieses Protokoll hilft den Forschern, einfach und kostengünstig die Größe ihrer aktuellen oder zukünftigen Projekte ohne die Notwendigkeit einer Anpassung der aktuellen experimentellen Messwerte gehobenen und somit Zeitverlust zu minimieren verbunden mit der Einrichtung des neu Methoden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde unterstützt durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen des KOLLEGS 1874 "Diabetische mikrovaskulärer Komplikationen" und CRC 1118 "Reaktive Metaboliten als Ursache für diabetischen Spätkomplikationen". C. Elegans Stämme N2 und CL2166 lieferte der CGC, die durch das NIH Büro Infrastruktur Forschungsprogramme (P40 OD010440) finanziert wird.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli OP50 | CGC | n/a | |
| C. elegans N2 | CGC | n/a | |
| C. elegans CL2166 | CGC | n/a | |
| Petri dish, 60 mm x 15 mm | Greiner One | 628161 | |
| Volumetric pipet, glas, 10 mL | Neolab | E-0413 | |
| Proteinase inhibitor cocktail tablets | Roche | 04693124001 | |
| Non-denaturing lysate buffer: | |||
| Tris-HCl, pH 8 | Sigma | T3253 | |
| Sodiumchloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E5391 | |
| 96-well plates, transparent bottom | Brand | 781611 | |
| Infinite M200, plate reader | Tecan | 30017581 | |
| Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm | Next advance | ZROB05-RNA | |
| Bullet Blender, homogenizer | Next advance | BBX24 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P6887 | |
| Thymol | Sigma | T0501 | |
| Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P6911 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P43339 | |
| Prolidase from Porcine Kidney | Sigma | P6675 | |
| Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica | Sigma | A8200 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Merckmillipore | UFC501096 | |
| Basic Materials for plate culture are described in Reference 6. |
References
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