Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה לגידול בקנה מידה גדול Caenorhabditis elegans במדיה מוצק. כחלופה תרבית נוזלית, פרוטוקול זה מאפשר קבלת הפרמטרים של סולמות שונים המעובדים המבוסס על צלחת. פעולה זו מגדילה את comparability של תוצאות על-ידי השמטת את ההבדלים מטבולית מורפולוגיים בין תרבות המדיה נוזלי ומוצק.
Abstract
Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) בצורה רחבת היקף על פלטות אגר ניתן ולהקשות. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה וזולה כדי לקבל מספר גדול של חיות בשביל הבידוד של חלבונים כדי להמשיך עם אבן חשופה המערבי, ספקטרומטר מסה או ניתוחים פרוטאומיקס נוספות. יתר על כן, עלייה של מספרי נמטודות immunostainings ושילוב של מספר ניתוחים בתנאים culturing אותו בקלות ניתן להשיג. בנוסף, העברה בין לוחות עם תנאים שונים ניסיוני הוא הקל. טכניקות נפוצות בתרבות צלחת לכלול ההעברה של יחיד C. elegans באמצעות חוט פלטינה וגושים בהעברת אגר מיושבים באמצעות אזמל. עם זאת, עם הגדלת מספרים נמטודות, טכניקות אלו הופכים זמן רב יתר על המידה. פרוטוקול זה מתאר את התרבות בקנה מידה גדול של C. elegans כולל מדרגות רבות כדי למזער את ההשפעה של הכנת הדוגמא על הפיזיולוגיה של התולעת. נוזל לבין מאמץ גזירה יכול לשנות את תוחלת החיים של ואת התהליכים המטאבוליים C. elegans, וכך מצריכים תיאור מפורט של השלבים הקריטיים כדי לאחזר תוצאות אמין לשחזור. C. elegans הוא אורגניזם מודל, המורכב תאים עצביים עבור עד שליש, אבל חסר כלי הדם, ובכך מספק את האפשרות לחקור אך ורק שינויים עצביים עצמאית של שליטה בכלי הדם. לאחרונה, הקשורים ניוון מוחיים מוקדם ב רטינופתיה סוכרתית נמצאה לפני שינויים בכלי הדם. לכן, C. elegans הוא עניין מיוחד לימוד מנגנונים כלליים של סיבוכים סוכרתית. לדוגמה, מערך מוגברת של מתקדמת glycation end מוצרים (גילאי), מינים חמצן תגובתי (ROS) נצפית, אשר נמצאים reproducibly C. elegans. פרוטוקולים לטפל בדגימות של גודל מספקת קשת רחבה של חקירות מוצגים כאן, ומעוררות את המחקר של סוכרת-induced שינויים ביוכימיים. באופן כללי, פרוטוקול זה יכול להיות שימושי עבור מחקרים הדורשים גדולה C. elegans מספרים ב תרבות נוזלי אשר אינה מתאימה.
Introduction
ניתוחים חלבון, כגון תספיג או ספקטרומטר מסה, דורשים מיליגרם של חלבון. תשואה זו דורשת culturing בקנה מידה גדול של מאות C. elegans, אשר ניתן לבצע על-ידי תרבית נוזלית או במדיה מוצק נמטודות את מעבירה על ידי שטיפה. נוזל לבין מאמץ גזירה המניע את הביטוי של תעלות נתרן אפיתל (ENaC), אשר יכול להגביר את הלחץ osmotic באמצעות ספיגה מוגברת של נתרן, פוטנציאל לשנות את תוחלת החיים של C. elegans , המשפיעים על חילוף החומרים ניתוחים1 . לכן, כמה צעדים קריטיים פרוטוקול זה הגישה המבוססת על הצלחת לקחת והורדת המתח משפיע על השתנות ניסיוני בחשבון. תרבית נוזלית, מצד שני, השפעות של פנוטיפ של נמטודות, מסבך את התרבות ואת אוסף של מספר מדויק של נמטודות2. יתר על כן, תגובתי חומרים יכולים להשתנות על-ידי רכיבי מדיה ולהפיץ ייתכן לצר לפני הגיעם של נמטודות. לגבי המגבלות של תרבית נוזלית, פרוטוקול זה מספק גישה חלופית culturing דוגמאות בקנה מידה גדול של C. elegans.
C. elegans הוא אורגניזם מודל עם רשת נפרדים של תאים עצביים 302, ממציא שליש כל שלה תאים3. מאז השקתו בקטע של מדעים, רבים הומולוגי orthologous הגנים היו כמתואר לעיל, הגברה ערכו כמודל למחקר רפואי. לאחרונה, ראיות לקות נוירולוגית ב רטינופתיה סוכרתית, שקדמו נזק בכלי הדם, הוצגו4. C. elegans חסר כלי הדם, אך מכילה רשת עצביים שונים, שהופך אותו מודל מתאים לחקור שינויים עצביים מלבד אלה כלי הדם. לכן, C. elegans הוא עניין מיוחד לימוד מנגנונים כלליים של סיבוכים סוכרתית. שינויים ביוכימיים סיבוכים סוכרתית לערב את היווצרות הגילאים, אשר בהמשך להשפיע על היווצרות של ROS בתגובה היפרגליקמיה5. הגילאים נמצאים C . elegans ולתרום נזקים עצביים6. מחלות כרוניות לעיתים קרובות נגרמות על ידי תהליכים מורכבים, בקשתית הדורשות גישה multiparametric להערכה של מנגנונים הבסיסית שלהם, כפי שהודגם כאן עם הצהרתו של סיבוכים סוכרתית. פרוטוקול זה ניתן לשימוש להשגת פרמטרים מרובים בו זמנית, כמו גם לאחר מכן. Comparability מוגברת, הפארמצבטית בגישה multiparametric יכולה להיות מושגת על-ידי השמטת את ההבדלים מטבולית מורפולוגיים בין תרבות המדיה נוזלי ומוצק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: פרוטוקול זה מחולק לחמישה מדורים. בסעיפים 1-3, מוצג הפרוטוקול העיקרי תרבות C. elegans ב בקנה מידה גדול. סעיפים 4 ו-5 מספקים פרוטוקולים נוספים להערכת ביטוי מטבוליטים המתרחשים מטבוליטים סוכרתית. בפירוט, סעיף 1 מתאר תרבות בקנה מידה גדול כללית על צלחות. סעיף 2 מתמקד העברת כמויות גדולות של C. elegans, ואילו בסעיף 3 מסביר קציר של מדגם בקנה מידה גדול. סעיף 4 מסביר את הבידוד חלבון מן המדגם, סעיף 5 מתאר את הכנת הדוגמא עבור ניתוחים שלאחר מכן נוזלי כרומטוגרפיה-טנדם ספקטרומטר מסה (LC-MS/MS).
1. בקנה מידה גדול תרבות על צלחות
- באופן כללי, לעבוד תחת כיסוי סטרילי או ליד להבה פתוחה כדי להימנע contaminations.
-
לתרבות תולעים עד שיגיעו הבמה למבוגרים צעירים, בצע את פרוטוקול שפורסמו בעבר7 עם עיבודים הבאים.
- להשתמש חיידקים החיים Escherichia coli OP50 כדי להאכיל את נמטודות ולהכין מיקרומטר 400 fluorodeoxyuridine אגר (לא אמפיצילין/FUdR) לניסויים.
- עבור הכנת אוכלוסיה סינכרונית, להשתמש unconcentrated OP50 ולהשתמש בשביל להצליח ניסויים עם המבוגרים, 3.3 x OP50 מרוכז על-ידי הסרת 70% תגובת שיקוע.
- מרווחי זמן ההאכלה היומית מומלצים. בעת הערכת סטרס חמצוני, במרווחי זמן שונים ואמצעי אחסון האכלה שעשויות לפגום בתוצאות.
- עבור חיסון לקחת צלחת עם מספר נמטודות, לחתוך אותו לחתיכות של 0.5 x 1 ס מ2 עם אזמל. העברת שלושה חלקים על גבי לוחיות גדילה נמטודות מדיה (NGM) של 60 מ מ קוטר, המכיל unconcentrated OP50.
- דגירה הלוחות בטמפרטורה מתאימה המתח (N2 פראי-סוג צריך להיות תרבותי ב- 20 ° C) עד ביצים גלויים על הצלחת.
- לשטוף את מרבית ביצים עם חיות למבוגרים עם 2 מ של מאגר M9 ולאסוף אותם בצינור 15 מ"ל. Centrifuge את המתלים ב x 800 גרם למשך 2 דקות. בינתיים, מתחילים בהכנת הפתרון הלבנה.
- תוציאי את הצינור centrifuged ולהסיר המאגר M9 עם pipet 10 מ"ל. להוסיף 10 מ של פתרון הלבנת ואת תערובת המערבולת עד נמטודות למבוגרים הם lysed. זה לוקח בדרך כלל כ- 5-7 דקות, אבל לא צריך לקחת יותר מ 15 דקות או הביצים לא יתפתח באופן מלא בהמשך לניסוי.
- Centrifuge את המתלים ב 800 x גרם עבור 2 דק שטיפת 3 פעמים עם 10 מ"ל M9 המאגר כדי לנקות את הביצים של הלבנת פתרון.
- עכשיו להוסיף 150 µL של ההשעיה ביצה על צלחות OP50. צפיפות של 200 – 300 ביצים צריך להגיע על כל צלחת. המתן עד נמטודות הגיע השלב למבוגרים.
הערה: המאגר M9 (pH 7.0) המשמש את הניסויים מתוארים מורכב של החומרים הבאים:2PO 22 מ מ ח'4, 42 מ"מ נה2HPO4ו- 86 מ מ NaCl. לאחר autoclaving התערובת, להוסיף 1 מ"מ MgSO4. הפתרון הלבנת מכיל 0.5 מ' NaOH, 2.3 מ מ NaOCl נפתר במים מזוקקים. - להכין מאגר M9 סטרילי, טיפים פיפטה סטרילי עם חתך עצה כדי לשטוף את התולעים, וצינורות 15 mL כדי לאסוף אותם.
- להחיל כ 1 מ"ל של מאגר M9 על הלוחות, פזר בעדינות המאגר על ידי נדנוד בעדינות pipet של נמטודות רלוונטי.
- עכשיו, לאסוף את נמטודות בצינור. החל µL 150 של השעיה ישירות על הלוחות (נזרע עם OP50) עם העצות פיפטה לחתוך ולאחר להעריך ברמה המיקרוסקופית צפיפות נמטודות (מומלץ: 50 – 100 נמטודות לכל צלחת 60 מ מ).
- אם הם יותר מדי צפוף, לדלל את המתלים. באמצעות מאגר M9, להעריך את זה תחת המיקרוסקופ עד הצפיפות הרצויה. אם התשואה הוא קטן מדי, תעזוב את התולעים להתמסד centrifuge ה s ההשעיה 10 ב 800 x גרם כדי להסיר את הנוזלים.
הערה: דוגמה של צפיפות מספיק ניתנת איור 1A (מאקרוסקופית) ו 1B (מיקרוסקופיים)-הגדלת X 20. המשך מדעית כמתואר. - זכור כי תולעים תירגע במהירות. כדי להבטיח חלוקה שוויונית של בין הלוחות, היפוך הצינור לאחר כל ערימת צלחות (4 – 5 צלחות).
הערה: החתך פיפטה עצה, כמו גם את נדנוד עדין ומפחית את הכביסה של הצלחות, גזירה.
2. העברה של כמויות גדולות של Caenorhabditis elegans
- לשטוף את נמטודות עם µL כ-500 מאגר M9, בהתאם לגיל יובש של הלוחות. באמצעות המאגר אותו, חזור על ניתוק של נמטודות עד שרוב החיות נאספים ההשעיה.
- אט-אט תופסים את נמטודות עם טיפ פיפטה לחתוך ולהעביר אותם על צלחת המוכנים OP50. תן את הצלחת לייבש.
הערה: יש להיזהר לא להחיל הרבה יותר מאשר אמצעי האחסון המומלץ. במיוחד בניסויים לטווח ארוך, הלוחות שאולי לא אסבול את זה, אגר יכולה לשבור, המאפשר את נמטודות לזחול לתוך הסדקים.
3. הקציר של גדולים דוגמת Caenorhabditis elegans
- בהתאם לשיטה שנבחרה, להתחיל ניסויים עם כמות מספקת של C. elegans. עבור ניתוחים LC-MS/MS, הכינו צלחות 20 (60 מ"מ x 15 מ"מ) לכל קבוצה כ-100 נמטודות לכל צלחת כדי להבטיח תשואה לפחות 200 µg של חלבון עבור כל דגימה.
הערה: חלק זה של הפרוטוקול אינו דורש עובד בתנאים סטריליים יותר, כמו נמטודות שנגבו, קפוא. - ביום של אוסף דגימה, להכין בחנקן נוזלי snap-להקפיא הדוגמאות שנאספו. לשמור על מאגר שאינו סטרילי M9 על קרח כדי להאט את חילוף החומרים של תולעים נימיות.
- לשטוף את C. elegans של הצלחות על-ידי החלת 1 מ"ל M9 מאגר מתערבל בעדינות את הצלחות. זה מונע איסוף נמטודות המנוח ואת רוב הביצים, אם יש יותר מתנות, כי הם מקל חיידקים ועל אגר.
- קח את עוצמת הקול, להעביר אותו צינור 15 מ"ל.
- אחרי האוסף של המדגם המלא, המתן נמטודות להתפשר או centrifuge את הצינור בקצרה ב x 800 גרם ולהסיר רוב המאגר M9. לשטוף את הדגימה 3 x עם-10 מ"ל של M9 (10 x האחסון מדגם) כדי להסיר את כל החיידקים.
הערה: כדי להבטיח כי כל נמטודות המנוח יוסרו, ציפה סוכרוז הוא אפשרות נוספת. עם זאת, זה לא היה מתאים ניסויים המוצג15. סוכרוז hydrolyzed גלוקוז, פרוקטוז. בניסויים מתוארים, תפקידו של גלוקוז הוערכה על מנת לקדם שינויים ביוכימיים נמצאו סוכרת כרונית. לפיכך, סוכרוז ציפה יכול באופן פוטנציאלי וחיסול את התוצאות. - להכין שפופרת אחת 1.5 mL מ ל 1 M9 מאגר שפופרת ריק mL 1.5 אחת עבור כל דגימה. העברה בגדר עם pipet זכוכית מהצינור 15 מ"ל הצינור mL 1.5 ריק. שלב זה חיוני להבטיח העברה כמותית.
הערה: בניגוד במהלך השלבים הקודמים, כאן נמטודות מרוכזים יותר. בגלל הדבקות אפשרית טיפים pipet פלסטיק, אובדן של חלק גדול מן המדגם צפוי. לכן, השתמש במקום זאת פיפטות זכוכית. - לאחר ההעברה, השתמש על פיפטה מזכוכית לקחת 1 מ"ל M9 מאגר מהצינור 1.5 mL השני לשטוף את נמטודות מהקיר פיפטה. כמו כן, לשטוף את נמטודות הנותרים מהצינור 15 מ"ל ומעבירים אותם אל הצינור מדגם.
- Centrifuge הצינור מדגם ב x 19,000 g עבור 1 דקות ולאחר מכן להסיר את תגובת שיקוע רב ככל האפשר.
- חותם הצינור עם מצלמות-מיקרוסקופים ומיד snap-להקפיא אותו בחנקן נוזלי. לאחסן את הצינור ב- 80 ° C עד הכנת lysate.
4. חלבון לבידוד ספקטרומטר מסה
הערה: בידוד חלבון המתוארים כאן יכול לשמש גם עבור מבחני אחרים (למשל, תספיג).
- לדגימת קפוא, להוסיף את אמצעי האחסון באותו של חרוזים זירקוניה 0.5 מ מ ולפחות 2 x הנפח של lysate מאגר שמכיל קוקטייל מעכבי proteinase.
הערה: הניתוחים המתאם נמטודות-כדי-חלבון מתוארים בוצעו באמצעות 100 µL של המאגר. LC-MS/MS הדגימות היו lysed עם µL 200 המאגר. - התחל את מהמגן עבור 1 דקות על מהירות 9. ודא כי הדגימות הן לחלוטין lysed. חזור על שלב זה אם הם הם לא לגמרי lysed.
- Centrifuge את הדגימות למשך 30 דקות ב 4 ° C ב 19,000 x g. להעביר את תגובת שיקוע צינור על הקרח ואחסן אותו ב-80 מעלות צלזיוס עד נוסף מדידות עומד להילקח.
הערה: המאגר הלא-denaturing משמש את הניסויים מתוארים מורכב של החומרים הבאים: 20 מ מ טריס HCl (pH 8), 137 מ מ EDTA NaCl, 1% טריטון-X ו- 2 מ מ.
הערה: לאחר השלבים של פרוטוקול זה, שיש להחיל את קנה המידה המוצע, התשואה של גלולה חלבון של נמטודות כ-1,000 צריך להיות כ- 500 µg. להשוואות יותר, להתייעץ עם איור 2 ואת התוצאות נציג.
5. משאבות למדידות ספקטרומטר מסה טנדם-כרומטוגרפיה נוזלית
הערה: בהתאם הפרמטר של עניין, הכנת הדוגמא יהיו שונים. פרוטוקול זה מתמקד methylglyoxal ונחישות גיל.
-
למדוד תאיים methylglyoxal על ידי derivatization עם 1, 2-diaminobenzene (DB) כפי שתואר לעיל9.
- Homogenize את הדגימות עם 20 µL של חומצת חומץ טריכלור הקר של 20% (wt/כרך) ב- 0.9% (wt/כרך) נתרן כלוריד, µL 80 מים צינור 1.5 מ.
- ספייק הדגימות של 5 µL עם תקן פנימי (13C3-MG; 400 ננומטר), לערבב אותם על ידי vortexing ולאחר מכן centrifuge אותם ב x 21,000 g למשך 5 דקות ב 4 º C.
- העברת µL 35 של תגובת שיקוע למבחנה דגימת HPLC המכיל הוספה זכוכית 200 µL.
- להוסיף 5 µL של אזיד הנתרן 3% (wt/כרך) כל מדגם ואחריו 10 µL של 0.5 מ מ DB 200 מ"מ HCl המכילה 0.5 מ מ diethylenetriaminepentaacetic חומצה (DETAPAC) במים.
- דגירה בדגימות במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.
- לנתח את הדגימות מאת LC-MS/MS, כפי שתואר לעיל9.
הערה: עבור המידה הגילאים, לבודד את החלבונים כמתואר בסעיף 4 של הפרוטוקול.
-
מודדים את ריכוז חלבון lysates (המופשרים) שימוש assay ברדפורד10.
- היכונו aliquots של 30 µL עיקול תקן מתובל שור אלבומין (BSA) נפתרה בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) הריכוז הבאים: 0; 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.6; 0.8; 1.0 מ"ג/ד"ל.
הערה: אם המדגם הוכן בגודל המוצע (ראה שלב 4.1 עבור הכנת lysate עם µL 200 המאגר), הריכוז מוערך צריך להיות בטווח של-7-2 מ"ג/מ"ל. במקרה זה, לדלל את דגימות 1:10 עם PBS לפני המדידה.
הערה: עבור הניסויים הראשונים בשיטה זו, מומלץ למדוד את הדגימות ב דילולים שונים (1, 1:10 ו- 1: 100). מאחר אין קביעה מדויקת של המספר של נמטודות, התשואה יכולים להיות שונים בין חוקרים בודדים. - השתמש צלחת 96-ובכן שקוף (פוליסטירן), פיפטה 10 µL של כל ריכוז רגיל ושל הדגימות ב דילולים שבחרת ב כפילויות בהבארות.
- לדלל את החלבון assay לצבוע ריאגנט להתרכז 1:5 עם מים מזוקקים (aq. dest.) ולהוסיף 200 µL של הדילול כל מדגם על הצלחת. דגירה את הצלחת. בשביל 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- למדוד את ספיגת בתוך 30 דקות ב- 595 nm בקורא צלחת. להיות עם אינטרפולציה הדגימות מן העקומה סטנדרטי מחושב. עוד פרטים על השיטה תוארו בהרחבה ב-10ספרות.
- היכונו aliquots של 30 µL עיקול תקן מתובל שור אלבומין (BSA) נפתרה בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) הריכוז הבאים: 0; 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.6; 0.8; 1.0 מ"ג/ד"ל.
-
למדוד הדורות תאיים כמו שתואר לעיל11,12.
- לשטוף את תמציות חלבונים הכולל (כ-200 µg) x 3 עם המים על ידי ultracentrifugation ב 10 יחידות צנטריפוגליות מסנן kDa.
- להוסיף החלבון התאושש (כ-100 µL) µL 10 מ"מ HCl 10 µL של פפסין (2 מ"ג/מ"ל ב- 20 מ מ HCl), µL 10 של תימול (2 מ"ג/מ"ל ב- 20 מ מ HCl), דגירה בדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
- לנטרל ואת מאגר הדגימות ב- pH 7.4 על-ידי הוספת µL 12.5 0.5 M אשלגן פוספט מאגר (pH 7.4) ו µL 5 של 260 מ מ KOH.
- להוסיף 10 µL של Pronase E [2 מ"ג/מ"ל במאגר 10 מ מ אשלגן פוספט (pH 7.4)] ו 10 µL של פתרון פניצילין-סטרפטומיצין, דגירה בדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
- להוסיף 10 µL של aminopeptidase [2 מ"ג/מ"ל במאגר 10 מ מ אשלגן פוספט (pH 7.4)] ו 10 µL של prolidase [2 מ"ג/מ"ל במאגר 10 מ מ אשלגן פוספט (pH 7.4)], דגירה בדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
- לנתח את hydrolysate שנוצר על ידי LC-MS/MS, כמו שתואר לעיל12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הנה דוגמאות של יצירת בקנה מידה גדול של C. elegans תרבות עבור יישומים במחקר הסוכרת מוצגים. זה יכול להיות עניין להתייחס הפרמטרים חיה יחידה, יותר מאשר את ההדורים לריכוז החלבון הכולל. ב- assay הדורשות מספר קטן של נמטודות, זו יכולה להיות מושגת בקלות על ידי ספירת של נמטודות. עבור בקנה מידה גדול C. elegans תרבות מעורבים מאות נמטודות לכל קבוצה ניסיונית, גישה זו אינה נוחה. איור 2, הקשר בין מידת C. elegans לבין תכולת החלבון של מוצג. כפי שמתואר כאן, בידוד חלבון כמותי לשחזור יכולה להיות מושגת באמצעות פרוטוקול זה.
Amadori adduct fructosyl-ליזין הוא אחד מספר סימנים מקדימים גיל נוצר במהלך סוכרת של בעל חיים ניסיוני מודלים13. איור 3 מציג LC-MS/MS מדידות לאחר טיפול גלוקוז בן 12 יום נמטודות ופקדי תואם גיל לא מטופל 3 ניסויים עצמאית. נמטודות היו הומוגני עם תוספת של 200 µL מאגר lysate. היווצרות מוגברת fructosyl-ליזין לאחר הטיפול גבוהה-גלוקוז מוצג.
מטבוליטים תגובתי כגון methylglyoxal הם fluctuant ולשנות חלבונים במהירות14. לכן, השאלה נשארת האלה מטבוליטים תגובתי למעשה להצטבר האורגניזם או עוברות שינוי לפני שהגיע המטרה שלהם. איור 4 מאשר ההצטברות של methylglyoxal C . elegans לאחר טיפול עם החומר...
סטרס חמצוני הוא גדל במהלך היפרגליקמיה6, וכן במהלך מאמץ גזירה. איור 5 מאשר אין הבדל היווצרות לחץ חימצוני בין קבוצת שטופלו גלוקוז, הועבר כמו בסעיף 2 של הפרוטוקול, לקבוצת הלא-הועבר... השוואה של שתי הקבוצות שטופלו גלוקוז לקבוצת הבקרה אינו מטופל מציג עלייה משמעותית עקה הנגרמת על ידי גלוקוז. לעומת זאת, נצפתה שום הבדל משמעותי בין שתי הקבוצות שטופלו גלוקוז. תוצאות אלו ממחישים כי טיפול נמטודות באמצעות פרוטוקול זה לא משמעותי לגרום להיווצרות סטרס חמצוני, אשר יכולים לשמש confounder בחקירות של הזדקנות או חילוף החומרים. יתרה מזאת, הממצאים בספרות הנוכחי שוחזר באמצעות פרוטוקול זה.
איור 1: צפיפות נאותה של נמטודות עבור התפלגות נוספת על צלחות. (א) לוח זה מראה תצוגה מאקרוסקופית. (B) לוח זה מראה תצפית מיקרוסקופית, הגדלת X 20. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: תכולת החלבון של פראי-סוג C. elegans N2. זה לוח מראה הקורלציה של המספר של נמטודות התשואה חלבון של lysate, מוכן כמתואר בסעיף פרוטוקול נמטודות בן 12 יום בתוך 5(n = 3 lysate של נמטודות 500; n = 3 lysate של נמטודות 1,000; ו- n = 1 lysate של נמטודות 1,500). קו הרגרסיה מסומן בצבע אדום (r2 = 0.976, y = 0.64). ריכוז החלבון הכולל נמדדה באמצעות שיטת ברדפורד. הנתונים מבוטא הממוצע ± סטיית התקן (SD). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: גדל היווצרות fructosyl-ליזין לאחר טיפול גלוקוז של C. elegans N2. ריכוזי fructosyl-ליזין לאחר טיפול עם גלוקוז בן 12 יום נמטודות ובפקדים לא מטופל נקבע על ידי LC-MS/MS, מנורמל כדי ריכוז חלבון נקבע על ידי שיטת ברדפורד. הנתונים מבוטא זאת אומרת ± SD. P-ערכים נקבעו על ידי הסטודנט t-לבדוק, * *p < 0.01. התוצאות הן מ- 3 ניסויים עצמאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: ריכוזי תאיים methylglyoxal לאחר טיפול methylglyoxal של C. elegans N2. Methylglyoxal ריכוזים נמדדו על ידי LC-MS/MS, נמטודות בן 12 יום שטופלו methylglyoxal. הדגימות נאספו פחות מ 2 h לאחר הטיפול האחרון. הנתונים מבוטא הגרמנים זאת אומרת ± מנורמל למספר של נמטודות. P-ערכים נקבעו על ידי הסטודנט t-לבדוק, * *p < 0.01. התוצאות הן מ- 3 ניסויים עצמאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: סטרס חמצוני נמדד ב- C. elegans CL2166 לאחר טיפול גלוקוז. Transgenic CL2166 (gst4::GFP)8 המכיל גלוטתיון-S-טרנספראז מונחה-4-promotor כתב GFP היו תרבותי על 400 צלחות FUdR של מיקרומטר, המכילה גלוקוז עבור 2 d. קבוצה אחת הועברה ללוחות גלוקוז טרי ביום 1 כמתואר בסעיף 2 של פרוטוקול זה. סטרס חמצוני נמדדה כמו עלייה בזריחה [יחידות קלות יחסית (RLU)] עם קורא צלחת. הנתונים מבוטא זאת אומרת ± SD. P-ערכים נקבעו על ידי ANOVA, *p < 0.05. התוצאות הן מ- 3 ניסויים עצמאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מציג גישה אמין עבור culturing בקנה מידה גדול של C. elegans כדי להשיג תוצאות כמותיות. ממצאים מתוך הספרות יכול לשכפל כמוצג בתיבה על התוצאות נציג. אף-על-פי פרוטוקול זה עבור האוסף של דוגמאות בקנה מידה גדול של C. elegans נראה שיטה ישר קדימה, ישנם החסרונות בטוח לקחת בחשבון. לגבי הסינכרון של האוכלוסייה נמטודות, פרוטוקול זה מתאר גישה זו על ידי הלבנת האוכלוסייה עם נתרן תת-כלורי, סודיום הידרוקסיד כדי להשמיד את נמטודות ולקצור את הביצים אך ורק. יש לקחת בחשבון כי גישה זו עשוי לא להיות מתאים כל הניסויים. בהתאם, היחס בין גודל האוכלוסייה לנפח של הפתרון הלבנת השפעת פגיעה הפתרון הלבנת משפיע על ההתפתחות של עוברי15. במיוחד כאשר לומדים תהליכים התפתחותיים, זה יכול להיות צעד מכריע. בנוגע לטיפול נמטודות, זה הכרחי להחיל כמו כוחות גזירה קטנה ככל האפשר לאורך כל הפרוטוקול. אם הם לא מטופלים עם טיפול, מספר גדול של נמטודות יגוועו. לצורך העניין, חשוב שלא יעלה את המהירות והזמן ספינינג. בעת העברת של נמטודות, טיפ פיפטה לחתוך כדי להפחית את מספר הפצועים נמטודות אמור לשמש. עבור ההעברה של נמטודות, האחסון המומלץ המאגר צריך לא להיות חריגה, כמו אגר לק לכשתהיה לח מדי, נותן נמטודות הזדמנות לחפור לתוך הצלחת. בעת איסוף הדגימות, המאגר M9 חייב להישמר קר כקרח להאט את חילוף החומרים של נמטודות, במיוחד כשאתה עובד עם מטבוליטים או מצעים C. elegans לבזות. חשוב לשטוף את הדגימה ביסודיות כדי למזער את כל זיהום חיידקי האכלה מוקדמת. בעת העברת בגדר, לזכור כי כמות גדולה של תולעים יכולה לדבוק פיפטה פלסטיק טיפים. פיפטה מזכוכית המומלצת צריכה לשמש, טיפים פיפטה אפילו נמוך מחייב יכול לשמר כמות גדולה של המדגם. כחלופה, התוספת של 0.01% טריטון X100 למאגר M9 היה קודם לכן הציע16. כדי להבטיח כי אין המנוח C. elegans או חיידקים להשפיע על התוצאות, ציפה סוכרוז אחרי האוסף של נמטודות ניתן לבצע14. פעולה זו מתבצעת בדרך כלל לאחר culturing נוזלי כדי להסיר את המדיום. בניסוי זה, טיהור זה הושמט, כיוון סוכרוז עובר מטבוליזם גלוקוז, פרוקטוז, ולכן פוטנציאל משתנה מתערב התוצאות שלנו.
בדרך כלל, תרבות בקנה מידה גדול של C. elegans מתבצעת באמצעות מדיה נוזלי. Culturing נוזלי, לעומת זאת, אינו מתאים עבור כל ההגדרות ניסיוני, במיוחד בעת שימוש הקריאות הבאות אשר מחייבים מספרים מדוייקים של נמטודות. שינוי של המנגנון Baerman תוארה בעבר כדי למיין ולטהר נמטודות נגזר תרבית נוזלית17. בשיטה זו מאוד מפחית זיהום חיידקי, מסננים נמטודות המבוגר היחיד דרך מערכת סינון רכיבים מרובים. שיטה אלגנטית זו מוגבל בזמן ארוך סינון (2-6 h) בטמפרטורת החדר, אשר יכול לבלבל ניתוחים מטבולית. לגבי הטכניקה סינון, נמטודות ממוינות לפי פעילותם נע. נמטודות צריכה להיות מתאימה מספיק לסרוק באופן עצמאי דרך הנקבוביות של מסננים מחומרים שונים. לפיכך, תוצאות יכולה להתעוות על ידי למעט נמטודות זה נחלשים. מאור טיפולים ניסיוניים.
שילוב תרבויות נוזלי וצלחת עם עיצוב ניסיוני יחיד יכול גם לשמש confounder ב בהמשך מנתח. C. elegans מפתחת הפנוטיפ רזה וארוך בתרבות נוזלית, ולכן קשה להשוות פרמטרים מנורמל ל המוניים, תכולת החלבון, או הגוף אורך ורוחב2. יתר על כן, המחקר של תגובתי חומרים הוא מאתגר בתרבות נוזלי, מאז תגובתי חומרים ככל הנראה לשינוי או מומת על ידי רכיבי התקשורת לפני הגיעם של נמטודות. אף-על-פי דוגמאות בקנה מידה גדול של C. elegans ניתן להשיג עם פרוטוקול זה, צלחת התרבות עצמה היא יותר לתקיפות יותר תרבית נוזלית. עם זאת, ישנן דרכים מסוימות כדי להקל על הטיפול (למשל, עם השימוש של מכונת לחילוק אגר). אפשרות נוספת כדי לקדם את תרבות בקנה מידה גדול ביעילות היא השימוש פטרי בקוטר גדול לייצור פלטות אגר. אפשרות זו עשויה להיות אילוץ על ידי הניתוחים מצליחה. הערכת מיקרוסקופית או הצלחת טיפול באופן כללי, הנוחיות ירידה בקוטר של המנה.
מספר גישות תפוקה גבוהה מתאים להערכת פרמטרים שונים, כגון כימית או והתרופות הקרנה, היה פותח ונחקר18. Microfluidic התקנים מאפשרים לחוקרים ללמוד פרמטרים שונים, כפי שמוצג במודל של סוכרת מסוג 2-19. תוחלת החיים מטבולי, תגובות סטרס חמצוני יכול להיות בו זמנית העריכו במישור חיית-יחיד, חשיפת היתרונות של ההקרנה גבוהה-תוכן, המשלבת פנוטיפי במידע הביוכימי. את ההערכה של אמינות, הפארמצבטית של הספרות הנוכחי כבר הפגינה עידון גדול של טכניקות אלה, מעבר ללימודי הוכחה הרעיון18. מקלחון, במיוחד עבור מעבדות קטנות יותר, עדיין נשאר בעייתי, כמו המכשירים יש לעיתים קרובות להתאמה אישית בהתאם לצרכים ניסיוני, אשר יכולים להוכיח להיות יקר.
כימות של הגילאים C . elegans הוא מסובך את הקוטיקולה אטום של תולעים נימיות. שיטה הנפוצה היא הגילוי של הגילאים ויה immunofluorescent stainings6. בגלל הקוטיקולה, גדלים דגימות גדולה יותר יש צורך להקטין את השונות גבוהה של התוצאות. הדמיה חייב להילקח בחשבון כגורם גוזלת זמן.
פרוטוקול הכנה lysate לכל הגוף המתוארים כאן הופך הגילאים תאיים ורכיבים אחרים של C. elegans לנגישים עבור ניתוחים. LC-MS/MS מדידות של C. elegans דגימות בוצעו לפני14. תנאים נאותים culturing, עם זאת, כדי להשיג מספר מספיק של נמטודות, לא תוארו בפירוט, עדיין.
השיטה המתוארת ב פרוטוקול זה שימושי המפרט המחייב בקנה מידה גדול, למשל גדלה האוכלוסייה של C. elegans, או השילוב של מספר הקריאות הבאות לכל ניסוי. זה נוח במיוחד עבור לימוד מורכבים multifactorial מחלות כגון סוכרת וסיבוכים שלה. גישות אלטרנטיביות, כגון הקרנה תפוקה גבוהה, גבוהה-תוכן באמצעות מערכות microfluidic, מבחינה טכנולוגית מתקדמים יותר, והם מסוגלים לספק נתונים גדולה. היישום העיקרי שלהם ניתן לראות כיום כימי, והתרופות הקרנה או הקרנה גנטי למוטאנטים להגיב על הטיפולים ניסיוני. פרוטוקול זה מסייעת לחוקרים בקלות ובזול בקמות הגודל של הפרויקטים הנוכחי או העתידי שלהם ללא צורך התאמת הקריאות הניסיונית הנוכחית ומשויכים, לפיכך, כדי למזער את אובדן זמן הקמת חדש שיטות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי דויטשה פתוח (DFG) בתוך 1874 IRTG "סיבוכים microvascular סוכרתית" CRC 1118 "תגובתי מטבוליטים כגורם סוכרתית סיבוכים מאוחר". זנים של C. elegans N2 ו CL2166 נמסרו בידי CGC, אשר ממומן על ידי המשרד NIH של תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli OP50 | CGC | n/a | |
| C. elegans N2 | CGC | n/a | |
| C. elegans CL2166 | CGC | n/a | |
| Petri dish, 60 mm x 15 mm | Greiner One | 628161 | |
| Volumetric pipet, glas, 10 mL | Neolab | E-0413 | |
| Proteinase inhibitor cocktail tablets | Roche | 04693124001 | |
| Non-denaturing lysate buffer: | |||
| Tris-HCl, pH 8 | Sigma | T3253 | |
| Sodiumchloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E5391 | |
| 96-well plates, transparent bottom | Brand | 781611 | |
| Infinite M200, plate reader | Tecan | 30017581 | |
| Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm | Next advance | ZROB05-RNA | |
| Bullet Blender, homogenizer | Next advance | BBX24 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P6887 | |
| Thymol | Sigma | T0501 | |
| Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P6911 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P43339 | |
| Prolidase from Porcine Kidney | Sigma | P6675 | |
| Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica | Sigma | A8200 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Merckmillipore | UFC501096 | |
| Basic Materials for plate culture are described in Reference 6. |
References
- Fronius, M., Clauss, W. G. Mechano-sensitivity of ENaC: may the (shear) force be with you. Pflügers Archiv. 455 (5), 775-785 (2008).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html (2006).
- Altun, Z. F., Hall, D. H. Nervous system, general description. WormAtlas. , Available from: http://www.wormatlas.org/hermaphrodite/nervous/Neuroframeset.html (2011).
- Sohn, E. H., et al. Retinal neurodegeneration may precede microvascular changes characteristic of diabetic retinopathy in diabetes mellitus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (19), E2655-E2664 (2016).
- Chilelli, N. C., Burlina, S., Lapolla, A. AGEs, rather than hyperglycemia, are responsible for microvascular complications in diabetes: a "glycoxidation-centric" point of view. Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Diseases. 23 (10), 913-919 (2013).
- Schlotterer, A., et al. C. elegans as model for the study of high glucose- mediated life span reduction. Diabetes. 58 (11), 2450-2456 (2009).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Leiers, B., et al. A stress-responsive glutathione S-transferase confers resistance to oxidative stress in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 34 (11), 1405-1415 (2003).
- Rabbani, N., Thornalley, P. J. Measurement of methylglyoxal by stable isotopic dilution analysis LC-MS/MS with corroborative prediction in physiological samples. Nature Protocols. 9 (8), 1969-1979 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 7 (72), 248-254 (1976).
- Ahmed, N., Argirov, O. K., Minhas, H. S., Cordeiro, C. A., Thornalley, P. J. Assay of advanced glycation endproducts (AGEs): surveying AGEs by chromatographic assay with derivatization by 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamate and application to Nepsilon-carboxymethyl-lysine- and Nepsilon-(1-carboxyethyl)lysine-modified albumin. Biochemical Journal. 364 (Pt 1), 1-14 (2002).
- Thornalley, P. J., et al. Quantitative screening of advanced glycation endproducts in cellular and extracellular proteins by tandem mass spectrometry. Biochemical Journal. 375 (Pt 3), 581-592 (2003).
- Karachalias, N., Babaei-Jadidi, R., Ahmed, N., Thornalley, P. Accumulation of fructosyllysine and advanced glycation end products in the kidney, retina and peripheral nerve of streptozotocin-induced diabetic rats. Biochemical Society Transactions. 31, 1423-1425 (2003).
- Morcos, M., et al. Glyoxalase-1 prevents mitochondrial protein modification and enhances lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 7 (2), 260-269 (2008).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Lagido, C., McLaggan, D., Glover, L. A. A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (105), e53083 (2015).
- Takamiya, S., Mita, T. Large-scale purification of active liquid-cultured Caenorhabditis elegans using a modified Baermann apparatus. Parasitology International. 65 (5 Pt B), 580-583 (2016).
- Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. Microfluidic systems for high-throughput and high-content screening using the nematode Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 17 (22), 3736-3759 (2017).
- Zhu, G., Yin, F., Wang, L., Wei, W., Jiang, L., Qin, J. Modeling type 2 diabetes-like hyperglycemia in C. elegans on a microdevice. Integrative Biology. 8 (1), 30-38 (2016).
