Summary
이 프로토콜에서는 고체 미디어 꼬마 선 충 의 대규모 재배 하는 방법을 설명합니다. 액체 문화 하는 대신,이 프로토콜 플레이트 기반 재배 아래 다른 비늘의 매개 변수를 얻기 수 있습니다. 액체와 고체 미디어 문화 형태학 및 대사 차이 생략 하 여 결과의 comparability를 늘어납니다.
Abstract
한 천 배지에서 대규모 방식으로 꼬마 선 충 (C. 선 충)을 배양 시간이 많이 걸리는 및 어려운 수 있습니다. 이 프로토콜에는 서쪽 오 점, 질량 분석, 또는 추가 proteomics 분석으로 진행 하는 단백질의 격리에 대 한 동물의 많은 수를 간단 하 고 저렴 한 방법을 설명 합니다. 또한, immunostainings에 대 한 선 충 수의 증가 동일한 자란 조건 하에서 여러 분석을 통합 하 여 쉽게 구현할 수 있습니다. 또한, 여러 가지 실험 상황 판 사이의 전송을 촉진 된다. 플레이트 문화에서 일반적인 기술 백 금 철사를 사용 하 여 단일 C. 선 충 의 전송을 포함 하 고 채워진된 agar의 전송 청크 메스를 사용 하 여. 그러나, 선 충 숫자 증가 함께 이러한 기술을 지나치게 많은 시간이 소요 된다. 이 프로토콜의 선 충 C. 수많은 단계를 포함 하 여 벌레의 생리학에 샘플 준비의 영향을 최소화 하기 위해 대규모 문화를 설명 합니다. 및 전단 응력의 수명 및 C. 선 충, 따라서 안정적이 고 재현 가능한 결과 검색 하기 위해 중요 한 단계에 대 한 자세한 설명을 요구에서 대사 과정을 변경할 수 있습니다. C. 선 충 은 모델 유기 체 최대 1/3, 신경 세포의 구성 가능성을 전적으로 신경 변경 혈관 컨트롤의 독립적인 조사를 제공 따라서 혈관 부족. 최근, 당뇨병 성 망막 증의 초기 neurodegeneration 혈관 변경 전에 발견 되었다. 따라서, 선 충 C. 공부 하는 당뇨병 합병증의 일반적인 메커니즘에 대 한 특별 한 관심의 이다. 예를 들어의 증가 형성 고급 glycation 엔드 제품 (세) 그리고 반응성 산소 종 (선생님) 관찰 reproducibly C. 선 충에서 발견 되는. 프로토콜 처리 조사의 폭넓은 스펙트럼에 대 한 적절 한 크기의 샘플을 여기, 당뇨병 유발 생 화 확 적인 변경의 연구에 의해 exemplified 표시 됩니다. 일반적으로,이 프로토콜 유용할 수 있습니다 큰 C. 선 충 을 요구 하는 연구에 대 한 숫자와 어떤 액체 문화는 적합 하지 않습니다.
Introduction
서쪽 오 점 또는 질량 분석, 단백질 분석, 단백질의 밀리 그램을 해야합니다. 이 항복 C. 선 충, 달성 될 수 있다 액체 문화 또는 고체 미디어 전송 선 충에 세척 하 여는의 수백의 대규모 배양이 필요 합니다. 및 전단 응력 유도 상피 나트륨 채널 (ENaC), 나트륨, 잠재적으로 C. 선 충 의 수명을 변경 하 고 신진 대사 분석1에 영향을 미치는의 증가 된 통풍 관을 통해 삼 투 스트레스 증가 수의 표현 . 따라서, 플레이트-기반 접근 방식에 대 한이 프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계 걸릴 계정에 실험적인 가변성에 영향을 미치는 스트레스의 감소. 액체 문화, 다른 한편으로, 선 충의 표현 형에 영향을 하 고 문화 및 nematodes2의 정확한 수의 컬렉션을 복잡 하 게. 또한, 반응 물질 미디어 구성 요소에 의해 변경 될 수 있습니다 그리고 선 충을 도달 하기 전에 하지 균등 하 게 배포할 수 있습니다. 액체 문화의 제한에 대해이 프로토콜 C. 선 충의 대규모 샘플을 경작 하는 양자 택일 접근을 제공 합니다.
C. 선 충 의 3 분 1의 모든 셀3의 만드는 302 신경 세포의 고유한 네트워크 모델 생물 이다. 많은 동종 과학에 그것의 소개부터 orthologous 유전자 기술, 의료 연구를 위한 모형으로 그것의 가치를 증폭 되었습니다. 최근, 당뇨병 성 망막 증, 혈관 손상, 앞에서 신경 장애에 대 한 증거4를발표 되었습니다. C. 선 충 혈관, 부족 하지만 뚜렷한 신경 네트워크 포함 한다 혈관 그들 떨어져 신경 변경 조사를 적합 한 모델을 만드는. 따라서, 선 충 C. 공부 하는 당뇨병 합병증의 일반적인 메커니즘에 대 한 특별 한 관심의 이다. 당뇨병 합병증에 생 화 확 적인 변경 추가 혈당5응답에서 선생님의 형성에 영향을 미치는 나가의 형성을 포함 한다. 연령대와 신경 손상6을 C. 선 충 에서 발견 된다. 만성 질환은 당뇨병 합병증의 평가 함께 여기 exemplified 종종 그들의 근본적인 메커니즘의 평가 대 한 multiparametric 접근을 요구 하는 복잡 한, polygenic 프로세스 발생 합니다. 이 프로토콜 이후에 뿐만 아니라 동시에 여러 개의 매개 변수를 얻기 위해 사용 될 수 있습니다. 액체와 고체 미디어 문화 형태학 및 대사 차이 생략 하 여 증가 comparability 및 multiparametric 접근의 재현성을 얻을 수 있습니다.
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Protocol
참고:이 프로토콜 5 개의 섹션으로 나누어져 있습니다. 섹션 1-3, C. 선 충 에 대규모 문화 주요 프로토콜 제공 됩니다. 섹션 4와 5 exemplified metabolites 당뇨병 대사 산물에서 발생의 평가 대 한 추가 프로토콜을 제공 합니다. 자세히 섹션 1 접시에는 일반적인 대규모 문화를 설명합니다. 섹션 2 섹션 3 대규모 샘플의 수확을 설명 하는 반면 C. 선 충, 대용량의 전송에 중점을 둡니다. 제 4 샘플에서 단백질 격리를 설명 하 고 섹션 5 후속 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS) 분석을 위해 견본 준비에 설명 합니다.
1. 대규모 문화 접시에
- 일반적으로, 메 마른 후드 또는 오염 방지 하려면 화로 옆 작동 합니다.
-
문화에 웜 젊은 성인 단계를 도달할 때까지 따라 다음 적응이 이전에 게시 프로토콜7 .
- 생활 OP50 대장균 박테리아를 사용 하 여 선 충을 먹이 400 µ M fluorodeoxyuridine agar (안 암 피 실린/FUdR) 실험에 대 한 준비.
- 동기 인구의 준비를 위해 unconcentrated OP50, 사용 하 고 성인과 실험 성공에 대 한 사용 하 여 3.3 집중된 OP50 x는 상쾌한의 70%를 제거 하 여.
- 매일 먹이 간격으로 것이 좋습니다. 산화 스트레스를 평가할 때는 다른 간격 및 먹이 대 한 볼륨 방해할 수 있습니다 결과.
- 접종, 여러 선 충과 접시를 받아 고 약 0.5 x 1 cm2 메스의 조각으로 잘라. 전송 unconcentrated OP50를 포함 하는 직경이 60 mm의 선 충 성장 미디어 (NGM) 접시에 2 ~ 3 조각.
- (야생-타입 N2 20 ° C에서 경작 한다) 변형에 대 한 적당 한 온도에 번호판을 품 어 계란은 접시에 표시 될 때까지.
- M9 버퍼의 2 mL와 함께 계란과 성인 동물의 대부분 떨어져 세척 하 고 15 mL 튜브에 수집. 2 분 동안 800 x g 에서 정지 원심 한편, 표백 솔루션을 준비 시작 합니다.
- Centrifuged 튜브를 꺼내와 10ml 피펫으로와 M9 버퍼를 제거. 성인 nematodes lysed 때까지 소용돌이에 표백 솔루션 및 믹스의 10 mL를 추가 합니다. 이 일반적으로 약 5-7 분, 하지만 15 분 이상 걸리지 않을 또는 계란 실험에 나중에 완벽 하 게 개발 하지 않습니다.
- 800 x g 2 분 세척 표백 솔루션에서 계란을 취소 10 mL M9 버퍼와 3 번에서 정지 원심
- 이제 OP50 접시에 달걀 서 스 펜 션의 150 µ L를 추가 합니다. 각 접시에 200-300 계란의 밀도 도달 한다. 선 충에 성숙한 단계를 도달할 때까지 기다립니다.
참고: M9 버퍼 (pH 7.0) 묘사 된 실험에 사용 되는 다음 물질의 구성: 22 mM KH2포4, 42 m m 나2HPO4, 86 mM NaCl. 압력가 마로 소독 혼합물, 1mm MgSO4 추가 합니다. 표백 솔루션 0.5 M NaOH, 2.3 m m NaOCl 증류수에 해결을 포함 합니다. - 준비 살 균 M9 버퍼, 상처로 살 균 피 펫 팁 팁 15 mL 튜브에 그들을 수집 하 고 웜, 씻어.
- 접시에 약 1 mL의 M9 버퍼를 적용, 부드럽게 버퍼 nematodes 접시에서 스윙 하 고 부드럽게 피펫으로 여 배포.
- 이제, 튜브에서 선 충을 수집 합니다. 잘라 피 펫 팁, (OP50와 시드) 접시에 직접 현 탁 액의 150 µ L을 적용 하 고 현미경으로 선 충의 밀도 평가 (권장: 60 m m 당 50-100 nematodes).
- 그들은 너무 조밀한 경우에, M9 버퍼와 현 탁 액을 희석 하 고 원하는 밀도이 때까지 현미경 평가. 수확량은 너무 작은 경우에, 정착 또는 액체를 제거 하려면 800 x g 에서 서 스 펜 션 10 s 원심 벌레를 하자.
참고: 충분 한 밀도의 예 (거시적인) 그림 1A 및 1B (현미경) 20 X 확대에에서 주어진 다. 경험적으로 설명 된 대로 진행 합니다. - 벌레는 신속 하 게 정착 하는 유의 하십시오. 판 사이 동등 하 게 분배 되도록 튜브 번호판 (번호판 4-5)의 모든 스택 후 반전.
참고: 컷 뿐 아니라 부드러운 스윙 팁, 플라스틱 및 전단 응력을 감소, 플레이트의 세척.
2. 전송의 대용량의 꼬마 선 충
- M9 버퍼, 나이 및 플레이트의 건조에 따라의 약 500 µ L와 선 충을 씻어. 동일한 버퍼를 사용 하 여 선 충을 분리 하는 동물의 대부분은에 수집 될 때까지 반복 합니다.
- 천천히 잘라 피 펫 팁 nematodes을 차지 하 고 OP50와 함께 준비 된 접시에 그들을 전송. 접시 건조 하자.
참고: 수 권장된 볼륨 보다는 훨씬 더 적용 하지 않도록 주의 하십시오. 특히 장기 실험 판 그것을 용납 하지 않을 수 있습니다 고 균열에 크롤 링 하는 선 충 수는 agar 끊을 수 있다.
3. 수확 한 대형의 꼬마 선 충 샘플
- 선택한 방법에 따라 C. 선 충의 충분 한 양의 실험을 시작 합니다. LC-MS/MS 분석에 대 한 샘플 당 단백질의 적어도 200 µ g의 수익률을 보장 하기 위해 접시 당 약 100 nematodes 그룹 당 20 접시 (60 m m x 15 m m)를 준비 합니다.
참고: 프로토콜의이 부분은 요구 하지 않습니다 작업 무 균 조건 하에서 더 이상, 선 충을 수집 하 고 고정 됩니다. - 샘플 컬렉션의 날, 스냅-동결 수집한 샘플을 액체 질소를 준비 합니다. 선 충 류의 신진 대사를 느리게 얼음에 비 살 균 M9 버퍼를 유지 합니다.
- M9 버퍼의 1 mL를 적용 하 고 부드럽게 판 소용돌이 격판덮개에서 C. 선 충 을 씻어. 이 고 인된 선 충 및 대부분의 계란을 수집 하는 경우 어떤 존재, 그들은 박테리아와 agar에 충실 하기 때문에 피 한다.
- 볼륨을 고 15 mL 튜브에 그것을 전송.
- 전체 샘플 수집 후 정착 또는 800 x g 에서 짧게 튜브 원심 M9 버퍼의 대부분을 제거 하는 선 충에 대 한 기다립니다. 워시 샘플 3 m 9의 약 10 mL x (샘플 볼륨 x 10) 모든 박테리아를 제거 하.
참고: 모든 고 인된 선 충 제거는 되도록 자당 부양 다른 옵션입니다. 그러나, 이것은 표시 된 실험15적합 이었다. 자당은 포도 당 및과 당을 분해. 묘사 실험에서 포도의 역할 만성 당뇨병에 생 화 확 적인 변화를 촉진에 평가 했다. 따라서, 자당 부양 잠재적으로 결과 혼동 수 있습니다. - 모든 샘플에 대 한 M9 버퍼의 1 mL와 함께 한 1.5 mL 튜브와 하나의 빈 1.5 mL 튜브를 준비 합니다. 15 mL 튜브에서 빈 1.5 mL 튜브 유리 피펫으로와 펠 릿을 전송. 이 단계는 양적 전송을 보장 하기 위해 중요 한.
참고: 달리 이전 단계, 여기는 선 충은 더 집중. 플라스틱 피펫으로 팁을 가능한 준수 때문에 샘플의 큰 부분의 손실 예상 된다. 따라서 유리 펫 대신 사용 합니다. - 송금 후 유리 피 펫을 사용 하 여 두 번째 1.5 mL 튜브에서 M9 버퍼의 1 mL를 피펫으로 벽에서 선 충을 씻어 하 려. 또한, 15 mL 튜브에서 나머지 nematodes을 세척 하 고 샘플 튜브를 그들을 전송.
- 1 분 동안 19000 x g 에서 샘플 튜브를 원심 하 고 가능한 많은 상쾌한 제거.
- 튜브 Parafilm으로 밀봉 하 고 즉시 스냅-동결 그것은 액체 질소. Lysate 준비까지-80 ° C에서 튜브를 저장 합니다.
4. 단백질 질량 분석에 대 한 절연
참고: 여기에 설명 된 단백질 격리 또한 다른 분석 실험 (예를 들면, 서쪽 오 점)에 대 한 사용할 수 있습니다.
- 냉동된 샘플에 0.5 m m 지르코늄 구슬과 lysate 버퍼를 포함 하는 성분을 억제 물 칵테일의 볼륨 x 적어도 2의 동일한 볼륨을 추가 합니다.
참고: 선 충-단백질에 대 한 상관 관계를 묘사 분석 버퍼의 100 µ L를 사용 하 여 수행 했다. LC-MS/MS 샘플 버퍼의 200 µ L로 lysed 했다. - 속도 9에 1 분 동안 균질 화기를 시작 합니다. 샘플은 완전히 lysed 확인 합니다. 완전히 lysed 하지 경우이 단계를 반복 합니다.
- 19000 x g에서 4 ° C에서 30 분 동안 샘플 원심 얼음에는 상쾌한 새로운 튜브를 전송 고 추가 측정 이동 하려고 때까지-80 ° C에서 그것을 저장 합니다.
참고: 묘사 실험을 위해 사용 하는 비 변성 시키기 버퍼 다음 물질의 구성: 20 mM Tris HCl (pH 8), 137 mM NaCl, 1% 트라이 톤-X와 2 mM EDTA.
참고:이 프로토콜을 제안된 규모를 적용 하는 데의 단계를 따라는 데, 약 1, 000 선 충에서 단백질 펠 릿의 수익률 약 500 µ g 이어야 한다. 더 많은 비교, 그림 2 및 대표 결과참조 하십시오.
5. 샘플 준비 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 측정
참고: 관심의 매개 변수에 따라 샘플 준비 달라질 것 이다. 이 프로토콜은 methylglyoxal 및 나이 결정에 초점을 맞추고.
-
앞에서 설명한9로 1, 2-diaminobenzene (DB)와 derivatization에 의해 세포내 methylglyoxal를 측정 합니다.
- 얼음 처럼 차가운 20% (wt/vol) trichloroacetic 산 염화 나트륨 0.9% (wt/집)에서 20 µ L와 1.5 mL 튜브에 물 80 µ L 샘플 균질
- 내부 표준 5 µ L의 샘플을 스파이크 (13C3MG, 400 nM), vortexing에 의해 그들을 혼합 하 고 다음 4 ° c.에서 5 분에 대 한 21000 x g 에서 원심
- HPLC 샘플 유리병 200 µ L 유리 삽입을 포함 하는 상쾌한의 35 µ L를 전송 합니다.
- 각 샘플 뒤에 0.5 m m 200 m m HCl 포함 된 0.5 m m diethylenetriaminepentaacetic (DETAPAC) 물에 있는 산에서에서 DB의 10 µ L를 3% 나트륨 아 지 드 (wt/vol)의 5 µ L를 추가 합니다.
- 빛 으로부터 보호, 실내 온도에 4 h에 대 한 샘플을 품 어.
- 앞에서 설명한9LC-MS/MS에 의해 샘플을 분석 합니다.
참고: 나가의 측정을 위해 분리 단백질 프로토콜의 섹션 4에에서 설명 된 대로.
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Bradford 분석 결과10를 사용 하 여 (해 동된) lysates의 단백질 농도 측정 합니다.
- 30 µ L의 aliquots 표준 곡선 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 다음과 같은 농도의 인산 염 버퍼 염 (PBS)에서 해결 된 아군에 대 한 준비: 0; 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.6. 0.8; 그리고 1.0 mg/dL입니다.
참고: 샘플은 제안 된 크기에서 준비 하는 경우 (버퍼의 200 µ L lysate의 준비에 대 한 단계 4.1 참조), 예상된 농도 약 2-7 mg/mL의 범위에 있어야 한다. 이 경우에 샘플 1: 10와 함께 PBS는 측정 전에 희석.
참고:이 메서드를 사용 하 여 첫 번째 실험에 대 한 것이 좋습니다 다른 희석에 샘플을 측정 (1, 1:10, 그리고 1: 100). 선 충의 수의 아무 정확한 결심으로 수익률은 개별 연구자 사이 달라질 수 있습니다. - 투명 한 96 잘 접시 (폴리스 티 렌)를 사용 하 고 각 표준 농도 우물에 중복에 선택한 희석에 샘플 10 µ L 플라스틱.
- 단백질 분석 결과 염료 시 약 집중 1:5 (aq증류수로 희석. dest.) 그리고 접시에 모든 샘플을 희석의 200 µ L를 추가. 실 온에서 10 분 동안 접시를 품 어.
- 595에서 30 분 이내 흡 광도 측정 플레이트 리더 nm. 예제 계산 된 표준 곡선에서 보간됩니다 될 수 있습니다. 방법의 자세한 내용은 문학10에 광범위 하 게 설명 했습니다.
- 30 µ L의 aliquots 표준 곡선 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 다음과 같은 농도의 인산 염 버퍼 염 (PBS)에서 해결 된 아군에 대 한 준비: 0; 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.6. 0.8; 그리고 1.0 mg/dL입니다.
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앞에서 설명한11,12세포내 연령대를 측정 합니다.
- 총 단백질 추출 물 (약 200 µ g)을 씻어 10 kDa 원심 필터 단위에 ultracentrifugation에 의해 물으로 3 배.
- 복구 된 단백질 (약 100 µ L) 100 mM HCl의 10 µ L, 10 µ L의 펩 신 (2 mg/mL 20 m m HCl에에서), 그리고 티 (20 m m HCl 2 mg/mL)의 10 µ L을 추가 하 고 24 h에 대 한 37 ° C에서 샘플을 품 어.
- 중화 하 고 pH 7.4에 0.5 M 칼륨 인산 염 버퍼 (pH 7.4)의 12.5 µ L을 추가 하 여 버퍼링 하는 샘플 및 5 µ L 260 m m 코의.
- 나 전자 [2 mg/mL 10 mM 칼륨 인산 염 버퍼 (pH 7.4)]의 10 µ L을 추가 및 페니실린 스 솔루션의 10 µ L 24 h에 대 한 37 ° C에서 샘플을 품 어 고.
- Aminopeptidase [2 mg/mL 10 mM 칼륨 인산 염 버퍼 (pH 7.4)]의 10 µ L을 추가 및 10 µ L의 prolidase [2 mg/mL 10 mM 칼륨 인산 염 버퍼 (pH 7.4)에], 및 48 h 동안 37 ° C에서 샘플을 품 어.
- 앞에서 설명한12LC-MS/MS에 의해 결과 분석.
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Representative Results
여기 대규모 C. 선 충 을 만드는 예제 문화 대 당뇨병 연구에 응용 되 게 됩니다. 그것은 관심 총 단백질 농도를 정상화 하기 보다 단일 동물 매개 변수 관련 된 될 수 있습니다. 선 충 수가 적은 요구 분석 결과에이 수행할 수 있습니다 쉽게 선 충을 계산 하 여. 대규모 C. 선 충 에 대 한 문화 관련 된 수백 개의 실험적인 그룹 당 선 충,이 방식은 편리. 그림 2, C. 선 충 의 양과 단백질 콘텐츠 사이 상관 관계가 표시 됩니다. 여기 바와 같이 재현 양적 단백질 격리가이 프로토콜을 사용 하 여 얻을 수 있습니다.
그들 fructosyl lysine adduct 동안 여러 시대 선구자 중 하나는 실험 동물에 있는 당뇨병 모델13. 그림 3 은 12 일 된 선 충 및 3 개의 독립적인 실험에서 치료 컨트롤 일치 하는 나이에 포도 당 처리 후 LC-MS/MS 측정을 표시합니다. 선 충은 lysate 버퍼의 200 µ L의 추가 함께 무 균. Fructosyl-리 신 후 높은 혈당 치료 제시의 증가 형성.
Methylglyoxal 같은 반응성 대사 산물 변동할 고 단백질을 신속 하 게 수정14. 따라서, 질문 그 반응성 대사 산물 실제로 유기 체에 축적 또는 그들의 목표에 도달 하기 전에 수정 여부를 남아 있습니다. 그림 4 는 물질과 치료 후 C. 선 충 에 methylglyoxal의 축적을 확인합니다.
산화 스트레스는 전단 응력 중 뿐만 아니라 혈당6, 동안 증가 된다. 그림 5 전송 프로토콜의 섹션 2에서 포도 당 처리 그룹, 그리고 비 전송 그룹 산화 긴장의 형성에 차이 확인 합니다. 두 포도 당 처리 그룹 치료 제어 그룹의 비교 포도 당에 의해 유도 된 산화 스트레스에 상당한 증가 보여 줍니다. 반면, 두 개의 포도 당 처리 그룹 간에 상당한 차이가 관찰 되었다. 이러한 결과이 프로토콜을 사용 하 여 선 충 처리 크게 노화 또는 물질 대사의 수사에 있는 confounder로 될 수 있는 산화 긴장의 형성 유도 하지 않습니다 설명 합니다. 또한, 현재 문학에서 발견이이 프로토콜을 사용 하 여 재현 했다.
그림 1: 접시에 추가로 배포에 대 한 선 충의 적절 한 밀도. (A)이이 패널은 거시적인 보기를 보여 줍니다. (B)이이 패널 20 X 확대에 미세한 보기를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 단백질 콘텐츠 야생-타입의 선 충 C. N2. 5에서 12 일 된 nematodes 프로토콜 섹션에 설명 된 대로이 준비 패널, lysate의 단백질 수익률에 선 충 수의 상관 관계를 보여 줍니다(n = 500 nematodes;의 lysate 3 n = 3의 1000 nematodes; lysate 그리고 n = 1 1500 선 충의 lysate). 회귀선은 빨간색으로 표시 된 (r2 = 0.976, y = 0.64). 총 단백질 농도 브래드포드 메서드를 사용 하 여 측정 했다. 데이터는 평균 ± 표준 편차 (SD)으로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 선 충 C. n 2의 포도 당 처리 후 fructosyl-신의 형성 증가. 12 일 된 선 충 및 치료 컨트롤에 포도 함께 치료 후 fructosyl-리 신의 농도 LC-MS/MS에 의해 결정 되었고 브래드포드 메서드에 의해 결정 단백질 농도를 정상화. 데이터 평균 ± sd.로 표현 됩니다. P-값은 학생의 t에 의해 결정 되었다-테스트, * *p < 0.01. 결과 3 개의 독립적인 실험에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 세포내 methylglyoxal 농도 C. 선 충 N2의 methylglyoxal 처리 후. Methylglyoxal 농도 methylglyoxal로 치료 하는 12 일 된 선 충에 LC-MS/MS에 의해 측정 되었다. 샘플 마지막 치료 후 2 시간 미만 수집 했다. 데이터는 선 충의 수를 정규화 하는 평균 ± SD로 표현 됩니다. P-값은 학생의 t에 의해 결정 되었다-테스트, * *p < 0.01. 결과 3 개의 독립적인 실험에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 산화 스트레스 측정 C. 선 충 CL2166 혈당 치료 후. Transgenic CL2166 (gst4::GFP)8 티-S-전이 효소 4 promotor 구동 GFP 기자를 포함 하는 2 d 포도 당을 포함 하는 400 µ M FUdR 접시에 경작 했다. 한 그룹이이 프로토콜의 섹션 2에에서 설명 된 대로 1 일 신선한 포도 당 격판덮개로 이송 했다. 산화 스트레스는 플레이트 리더 형광 [상대 빛 단위 (RLU)]에 증가 측정 했다. 데이터 평균 ± sd.로 표현 됩니다. P-값 ANOVA에 의해 결정 되었다 *p < 0.05. 결과 3 개의 독립적인 실험에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜 양적 결과 얻기 위해 C. 선 충 의 대규모 경작에 대 한 신뢰할 수 있는 방법을 제공 합니다. 문학에서 발견 대표 결과같이 복제 될 수 있습니다. C. 선 충 의 대규모 샘플의 컬렉션에 대 한이 정서의 똑 바른 앞으로 방법 같이 보인다, 비록 특정 함정을 계정에 걸릴 있다. 선 충 인구의 동기화에 대해이 프로토콜 선 충을 파괴 하 고 전적으로 계란을 수확 하는 염소와 수산화 나트륨 인구가 표백 여 접근을 설명 합니다. 그것은 고려이 접근은 모든 실험에 대 한 적합 하지 않을 수도 있다. 표백 솔루션의 볼륨에 인구 크기의 비율에 따라 표백 솔루션의 손상 효과15태아 개발에 영향을. 발달 과정을 공부 하는 경우에 특히 중요 한 단계 수 있습니다. 선 충의 처리에 관한 프로토콜에 걸쳐 가능한 작은 전단 세력으로 적용할 결정적 이다. 신중 하 게 처리 하지, 선 충의 많은 멸망 합니다. 그 문제에 대 한 회전 시간과 속도 초과할 수 없습니다 중요 하다. 선 충을 전송할 때 부상된 선 충의 수를 줄이기 위해 잘라 피 펫 팁을 사용 해야 합니다. 선 충의 전송에 대 한 버퍼의 권장된 볼륨 해야 하지 초과 될,으로 agar 너무 젖은, 선 충에 게 접시에 파고 기회 되 면 균열 수 있습니다. 샘플을 수집 하는 동안 M9 버퍼 유지 되어야 한다 C. 선 충 떨어집니다 대사 산물 또는 기판 작업 하는 경우에 특히 선 충의 신진 대사, 천천히 얼음. 그것은 철저 하 게 사전 먹이에서 어떤 세균 오염을 최소화 하기 위해 샘플을 세척 하는 것이 중요입니다. 펠 릿을 전송할 때 벌레의 많은 플라스틱 피 펫 팁에 충실 수 있습니다 기억 하십시오. 심지어 낮은 바인딩 피 펫 팁 샘플의 큰 금액을 유지 수로 권장된 유리 피 펫을 사용 되어야 한다. 대신, 트리톤 X100 M9 버퍼에 이전 했다 0.01%의 추가 제안16. 고 인된 C. 선 충 또는 박테리아는 결과 좌우할 것 이다 있도록 자당 부양 선 충의 컬렉션 수 후14수행. 이것은 일반적으로 액체 배양 매체를 제거 후 이루어집니다. 이 실험에서 클렌징이 생략 되었다, 자당은 포도 당과 당, 따라서 잠재적으로 우리의 결과 혼동으로 물질 대사로 변화 때문에.
일반적으로, C. 선 충 의 대규모 문화 액체 매체를 사용 하 여 수행 됩니다. 그러나 액체 배양,, 아니다 모든 실험 설정에 대 한 적합 한 선 충의 정확한 숫자를 요구 하는 정보를 사용 하는 경우에 특히. Baerman 장치의 이전 정렬 정화 액체 문화17에서 파생 하는 선 충을 설명 했다. 이 메서드는 크게 세균성 오염 감소 하 고 필터링 하는 여러 구성 요소 필터 시스템을 통해만 성인 선 충. 이 우아한 방법은 실내 온도에, 대사 분석을 혼동 수 있는 긴 필터링 시간 (2-6 h)에 의해 제한 됩니다. 필터링 기술에 관해서는 nematodes 움직이는 그들의 활동에 의해 정렬 됩니다. 선 충 해야 크롤 링 하지 독립적으로 필터의 숨 구멍을 통해 다른 자료에서 충분히 적합. 따라서, 결과 실험적 치료에 의해 약화는 선 충을 제외 하 여 왜곡 될 수 있습니다.
결합 한 실험적인 디자인에 액체 및 접시 문화 나중 분석에서 confounder 또한 될 수 있습니다. C. 선 충 대량, 단백질 콘텐츠, 또는 몸 길이 너비2로 표준화 하는 매개 변수를 비교 하 고 어려운 액체 문화에서 얇고 긴 표현 형을 개발 한다. 또한, 반응 물질의 연구 이후 반응 물질 또는 수정 될 가능성이 선 충을 도달 하기 전에 미디어 구성 요소에 의해 inactivated 액체 문화에서 도전 이다. C. 선 충 의 대규모 샘플이이 프로토콜 얻어질 수 있다, 비록 격판덮개 문화 자체 액체 문화 보다 더 노동 집약 이다. 그러나, 특정 방법 (예를 들어, agar 분배 기계를 사용 하 여) 처리를 촉진 하기 위하여 있다. 효율적으로 대규모 문화를 홍보 하는 또 다른 옵션은 한 천 격판덮개의 생산에 대 한 더 큰 직경을 가진 접시를 사용 하 여. 이 옵션은 성공 분석에 의해 제약 될 수도 있습니다. 미세한 평가 또는 접시 일반적 처리, 시설 접시의 직경 감소.
화학 또는 약물 검사 같은 다른 매개 변수를 평가 대 한 적합 한 여러 높은 처리량 방법 되었습니다 개발 하 고18조사. 미세 소자 타입-2 당뇨병19의 모델에서와 같이 다양 한 매개 변수를 연구 하는 연구자를 수 있습니다. 수명, 지질 대사 및 산화 긴장 응답 수 있습니다 동시에 부과 단일 동물 수준에 높은 콘텐츠 심사, 생화학 정보 phenotypic 통합의 장점을 드러내는. 현재 문학의 재현성 및 신뢰성 평가 이미 개념 증명 연구18넘어 이러한 기술의 훌륭한 교양을 보여주었다. 장치는 종종 비싼 증명할 수 있는 실험 필요에 따라 사용자 정의할 수 있다 특히 더 작은 실험실에 대 한 경제성은 여전히 문제가 남아 있습니다.
C. 선 충 에서 연령대의 정량화는 선 충 류의 불 침투성 표 피에 의해 복잡 합니다. 일반적으로 사용 되는 방법은 immunofluorescent stainings6 통해 연령대의 탐지 이다. 표 피, 때문에 더 큰 샘플 크기는 결과의 높은 분산을 줄일 필요 합니다. 영상은 시간이 걸리는 요인으로 고려 될 수 있다.
전신 lysate 준비 여기 설명에 대 한 프로토콜 C. 선 충 의 다른 구성 요소와 세포내 나 분석에 대 한 접근은. C. 선 충 샘플의 LC-MS/MS 측정14전에 수행 되었습니다. 그러나 적절 한 자란 조건,, 선 충, 충분 한 숫자를 달성 하는 하지 설명 자세히, 아직.
이 프로토콜에서 설명 하는 방법을 대규모 homogenously C. 선 충, 또는 실험 당 여러 판독의 조합에 대 한 인구 성장 요구 하는 정보에 대 한 유용 합니다. 이 특히 당뇨병과 그 합병증 같은 복잡 한 multifactorial 질병을 공부 하 고 편리 합니다. 미세 시스템을 사용 하 여 높은 처리량과 높은 콘텐츠 심사 등 대체 방법을 더 고급 기술적으로 하 고 큰 크기의 데이터를 제공할 수 있습니다. 그들의 주요 응용 프로그램은 현재 화학 및 의약품 심사 또는 돌연변이 실험 치료에 응답에 대 한 유전자 검사에서 볼 수 있습니다. 이 프로토콜 수 쉽고 저렴 하 게 고급 현재 실험적인 판독의 조정에 대 한 필요 없이 그들의 현재 또는 미래의 프로젝트의 크기를 연구 하 고, 따라서, 시간 손해를 최소화 하기 위해 관련 된의 설립과 새로운 방법입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 도이치 가운데 (DFG) IRTG 1874 "당뇨병 microvascular 합병증" 내에서 CRC 1118 "후반 당뇨 합병증에 대 한 원인으로 반응성 대사 산물"에 의해 지원 되었다. C. 선 충 종자 N2 및 CL2166 CGC, 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 NIH 사무실에 의해 자금에 의해 제공 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli OP50 | CGC | n/a | |
| C. elegans N2 | CGC | n/a | |
| C. elegans CL2166 | CGC | n/a | |
| Petri dish, 60 mm x 15 mm | Greiner One | 628161 | |
| Volumetric pipet, glas, 10 mL | Neolab | E-0413 | |
| Proteinase inhibitor cocktail tablets | Roche | 04693124001 | |
| Non-denaturing lysate buffer: | |||
| Tris-HCl, pH 8 | Sigma | T3253 | |
| Sodiumchloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E5391 | |
| 96-well plates, transparent bottom | Brand | 781611 | |
| Infinite M200, plate reader | Tecan | 30017581 | |
| Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm | Next advance | ZROB05-RNA | |
| Bullet Blender, homogenizer | Next advance | BBX24 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P6887 | |
| Thymol | Sigma | T0501 | |
| Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P6911 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P43339 | |
| Prolidase from Porcine Kidney | Sigma | P6675 | |
| Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica | Sigma | A8200 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Merckmillipore | UFC501096 | |
| Basic Materials for plate culture are described in Reference 6. |
References
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