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Biochemistry

Baseados na placa de cultivo em grande escala de Caenorhabditis elegans: preparação da amostra para o estudo de alterações metabólicas em Diabetes

Published: August 24, 2018 doi: 10.3791/58117
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo descreve um método para o cultivo em grande escala de Caenorhabditis elegans em meios sólidos. Como alternativa à cultura líquida, este protocolo permite a obtenção de parâmetros de diferentes escalas sob cultivo baseado na placa. Isto aumenta a comparabilidade dos resultados, omitindo as diferenças morfológicas e metabólicas entre cultura de meios líquidos e sólidos.

Abstract

Cultivo Caenorhabditis elegans (c. elegans) de uma forma em grande escala em placas de ágar-ágar pode ser demorado e difícil. Este protocolo descreve um método simples e de baixo custo para obter um grande número de animais para o isolamento de proteínas para prosseguir com um western blot, espectrometria de massa ou novas análises proteômica. Além disso, um aumento de números de nematoides para immunostainings e a integração de múltiplas análises sob as mesmas condições de cultivo podem facilmente ser alcançados. Além disso, uma transferência entre placas com diferentes condições experimentais é facilitada. Técnicas comuns na cultura de placa envolvem a transferência de um único c. elegans , usando um fio de platina e a transferência de ágar povoada pedaços usando um bisturi. No entanto, com o aumento do número de nematoides, essas técnicas se tornar excessivamente demoradas. Este protocolo descreve a cultura em grande escala de c. elegans incluindo numerosas medidas para minimizar o impacto da preparação amostra sobre a fisiologia do worm. Fluido e tensão de cisalhamento podem alterar o tempo de vida de e processos metabólicos em c. elegans, exigindo assim uma descrição detalhada das etapas críticas para recuperar resultados confiáveis e reprodutíveis. C. elegans é um organismo modelo, constituído por células neuronais para até um terço, mas falta os vasos sanguíneos, proporcionando assim a possibilidade de investigar unicamente neuronais alterações independentes de controle vascular. Recentemente, descobriu-se cedo neurodegeneração retinopatia diabética antes alterações vasculares. Assim, o c. elegans é de especial interesse para o estudo de mecanismos gerais de complicações do diabético. Por exemplo, uma maior formação de avançados de glicação produtos finais (idades) e espécies reativas de oxigênio (ROS) é observada, que se encontram reproducibly em c. elegans. Protocolos para lidar com amostras de tamanho adequado para um amplo espectro de investigações são aqui apresentados, exemplificado pelo estudo da diabetes induzido por alterações bioquímicas. Em geral, este protocolo pode ser útil para estudos que exigem grande c. elegans números e em qual cultura líquida não é adequada.

Introduction

Análise de proteína, como um borrão ocidental ou espectrometria de massa, exige mg de proteína. Este rendimento requer um cultivo em grande escala de centenas de c. elegans, que pode ser feito por cultura líquida ou em meios sólidos, transferir os nematódeos por lavagem. Fluido e tensão de cisalhamento induz a expressão dos canais de sódio epitelial (ENaC), que poderia aumentar o estresse osmótico através de um aumento da absorção de sódio, potencialmente alterando o tempo de vida de c. elegans e afetando análises metabólicas1 . Portanto, algumas etapas críticas neste protocolo para a abordagem baseada em placa leva a redução de estresse que afetam a variabilidade experimental em conta. Cultura líquida, por outro lado, influencia o fenótipo dos nematódeos e complica a cultura e a coleção de um número exato de nematoides2. Além disso, substâncias reativas podem ser alteradas pelos componentes de mídia e podem distribuir irregularmente antes de atingir os nematoides. Sobre as limitações da cultura líquida, este protocolo fornece uma abordagem alternativa para cultivo em grande escala amostras de c. elegans.

C. elegans é um organismo modelo com uma rede distinta de 302 células neuronais, inventando um terço de todas as suas células3. Desde a sua introdução em ciência, muitos homólogas e genes ortólogos têm sido descritos, ampliando seu valor como um modelo para pesquisa médica. Recentemente, evidências de comprometimento neurológico em retinopatia diabética, precedendo a lesão vascular, foi apresentada4. C. elegans é desprovido de vasos sanguíneos, mas contém uma rede neuronal distinta, tornando-se um modelo adequado para investigar alterações neuronais além aqueles vasculares. Assim, o c. elegans é de especial interesse para o estudo de mecanismos gerais de complicações do diabético. As alterações bioquímicas em complicações do diabético envolvem a formação de idades, que mais influenciam a formação de ROS em resposta à hiperglicemia5. As idades encontram-se em c. elegans e contribuam para o dano neuronal6. Doenças crônicas são frequentemente causadas por processos complexos, poligênicos, exigindo uma abordagem Multiparamétrico para a avaliação de seus mecanismos subjacentes, como exemplificado aqui com a avaliação de complicações do diabético. Este protocolo pode ser útil para a obtenção de vários parâmetros simultaneamente, bem como posteriormente. Maior comparabilidade e reprodutibilidade de uma abordagem Multiparamétrico podem ser alcançados, omitindo as diferenças morfológicas e metabólicas entre cultura de meios líquidos e sólidos.

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Protocol

Nota: Este protocolo é dividido em cinco seções. Nas seções 1-3, é apresentado o protocolo principal à cultura de c. elegans em larga escala. Nas secções 4 e 5 fornecem protocolos adicionais para a avaliação dos metabolitos exemplificadas ocorrendo em metabólitos diabéticos. No detalhe, seção 1 descreve uma cultura geral em larga escala em placas. Secção 2 centra-se sobre a transferência de grandes quantidades de c. elegans, Considerando que a seção 3 explica que a colheita de uma amostra de grande escala. Seção 4 explica o isolamento de proteína da amostra e a seção 5 descreve a preparação de amostras para análises subsequentes líquida cromatografia-tandem espectrometria de massas (LC-MS/MS).

1. em grande escala cultura em placas

  1. Em geral, trabalhe sob uma capa estéril ou perto de chamas para evitar contaminações.
  2. A cultura vermes até atingirem a fase adulta jovem, siga este protocolo previamente publicado7 com as seguintes adaptações.
    1. Use vivos OP50 Escherichia coli bactérias para alimentar os nematódeos e preparar ágar de fluorodeoxyuridine 400 µM (não ampicilina/FUdR) para experimentos.
    2. Para a preparação de uma população síncrona, use OP50 não concentrado e para suceder experimentos com os adultos, use 3.3 x OP50 concentrada através da remoção de 70% do líquido sobrenadante.
    3. Recomendam-se intervalos de alimentação diários. Ao avaliar o estresse oxidativo, intervalos diferentes e volumes para a alimentação podem interferir com os resultados.
    4. Para inoculação, levar um prato com diversos nematódeos e corte em pedaços de aproximadamente 0,5 x 1 cm2 com um bisturi. Transferência de duas a três peças nas chapas de mídia (NGM) nematoides crescimento de 60 mm de diâmetro, contendo OP50 não concentrado.
    5. Incubar as placas à temperatura adequada para a tensão (N2 do selvagem-tipo devem ser cultivadas em 20 ° C) até que os ovos são visíveis na placa.
    6. Lave a maioria dos ovos e animais adultos com 2 mL de tampão de M9 e cobrá-los em um tubo de 15 mL. Centrifugar a suspensão de 800 x g por 2 min. Enquanto isso, comece a preparar a solução de branqueamento.
    7. Retire o tubo centrifugado e remover o tampão M9 com uma pipeta de 10 mL. Adicione 10 mL de solução de branqueamento e misture no vórtice até os nematódeos adultos lysed. Isso leva normalmente cerca de 5 – 7 min, mas não deve demorar mais do que 15 min ou os ovos não desenvolverá totalmente adiante no experimento.
    8. Centrifugar a suspensão de 800 x g por 2 min. lavar 3 vezes com 10 mL M9 para limpar os ovos da solução de branqueamento.
    9. Agora adicione 150 µ l de suspensão de ovo em placas OP50. Uma densidade de 200 – 300 ovos deve ser alcançada em cada prato. Espere até nemátodes alcançado o estágio adulto.
      Nota: O buffer de M9 (pH 7.0) usado para as experiências retratadas consiste das seguintes substâncias: 22mm KH2PO4, 42 mM Na2HPO4e 86 mM de NaCl. Após autoclavagem a mistura, adicione 1 mM MgSO4. A branqueamento solução contém 0,5 M NaOH, 2,3 mM NaOCl resolvido em água destilada.
    10. Prepare-se estéril M9 reserva, pontas de pipeta estéril com um corte de ponta para lavar o worms e tubos de 15 mL para coletá-los em.
    11. Aplicar aproximadamente 1 mL de tampão de M9 nas placas, delicadamente distribuir o buffer por balançando e, gentilmente, pipetar os nematódeos no prato.
    12. Agora, recolha os nematódeos no tubo. Aplicar 150 µ l de suspensão diretamente nas placas (semeado com OP50) com as pontas de pipeta corte e avaliar microscopicamente a densidade dos nematódeos (recomendado: 50 – 100 nematoides por placa de 60 mm).
    13. Se são muito densos, diluir a suspensão com buffer M9 e avaliá-lo sob o microscópio até a densidade desejada é atingida. Se o rendimento é muito pequeno, deixa os vermes assentar ou centrifugar a suspensão 10 s a x 800 g para remover o fluido.
      Nota: Um exemplo de uma densidade suficiente é dado em (macroscópicas) a figura 1A e 1B (microscópicos) no aumento de 20 X. Prosseguir empiricamente como descrito.
    14. Tenha em mente que os vermes assentar-se rapidamente. Para garantir uma repartição equitativa entre as placas, inverta o tubo após cada pilha de placas (placas de 4 – 5).
      Nota: O corte pipeta de ponta, bem como o balanço suave e lavagem das placas, reduz a tensão de cisalhamento.

2. transferência de grandes quantidades de Caenorhabditis elegans

  1. Lave os nematódeos com aproximadamente 500 µ l de tampão de M9, dependendo da idade e ressecamento das placas. Usando a mesma reserva, repita desanexando os nematódeos, até que a maioria dos animais é recolhida em suspensão.
  2. Lentamente, ocupam os nematódeos com uma ponta de pipeta corte e transferi-los em um prato preparado com OP50. Deixe a placa secar.
    Nota: Tenha cuidado para não aplicar muito mais do que o volume recomendado. Especialmente em experiências a longo prazo, as placas não podem tolerá-lo e o ágar-ágar pode quebrar, permitindo que os nematoides que rastejar nas rachaduras.

3. a colheita de uma grande amostra de Caenorhabditis elegans

  1. Dependendo do método selecionado, inicie experiências com uma quantidade suficiente de c. elegans. Para análises de LC-MS/MS, prepare 20 placas (60 x 15 mm) por grupo com aproximadamente 100 nematoides por placa para assegurar um rendimento de pelo menos 200 µ g de proteína por exemplo.
    Nota: Esta parte do protocolo não exige mais, trabalhando em condições estéreis como os nematoides serão coletados e congelados.
  2. No dia da coleta da amostra, prepare nitrogênio líquido para snap-congelar as amostras coletadas. Mantenha não estéreis M9 buffer no gelo para diminuir o metabolismo do nemátodo.
  3. Lave o c. elegans , as chapas, aplicando 1 mL de tampão de M9 e agitando suavemente as placas. Isso evita coletando falecidos nematoides e a maioria dos ovos, se houver qualquer presente, porque eles aparecem para as bactérias e o ágar-ágar.
  4. Ocupam o volume e transferi-lo para um tubo de 15 mL.
  5. Após a coleta da amostra completa, espere que os nematoides resolver ou centrifugar o tubo momentaneamente a 800 x g e remover a maioria do buffer M9. Lavar a amostra 3 x com cerca de 10 mL de M9 (10x o volume da amostra) para remover todas as bactérias.
    Nota: Para garantir que todos os nematoides falecidos são removidos, flutuação de sacarose é outra opção. No entanto, isso não era adequado para os experimentos exibido15. Sacarose é hidrolisado em glicose e frutose. Nas experiências de retratados, o papel da glicose foi avaliado para promover mudanças bioquímicas encontradas em diabetes crônica. Assim, a flutuação de sacarose potencialmente poderia confundir os resultados.
  6. Prepare um tubo de 1,5 mL com 1 mL de tampão de M9 e um tubo vazio de 1,5 mL para cada amostra. Transferi a pelota com uma pipeta de vidro do tubo de 15ml para o tubo vazio 1,5 mL. Esta etapa é essencial para garantir uma transferência quantitativa.
    Nota: Ao contrário durante as etapas anteriores, aqui os nematódeos são mais concentrados. Por causa de uma possível adesão ao pontas de pipeta plástica, perda de grande parte da amostra é esperada. Portanto, use pipetas de vidro em vez disso.
  7. Após a transferência, use a pipeta de vidro para pegar 1 mL de tampão de M9 do segundo tubo de 1,5 mL para enxaguar os nematódeos da parede da pipeta. Além disso, lave os nematódeos restantes do tubo de 15 mL e transferi-los para o tubo de amostra.
  8. Centrifugar o tubo de amostra no 19.000 x g por 1 min e em seguida, remover o sobrenadante possível.
  9. Feche o tubo com Parafilm e imediatamente snap freeze-lo em nitrogênio líquido. Armazene o tubo a-80 ° C até a preparação de lisado.

4. proteína isolamento por espectrometria de massa

Nota: O isolamento da proteína aqui descrito também pode ser usado para outros ensaios (por exemplo, borrão ocidental).

  1. Para a amostra congelada, adicione os mesmos volumes de grânulos de óxido de zircônio de 0.5 mm e pelo menos 2x o volume de lisado tampão contendo um coquetel de inibidor de protease.
    Nota: As análises de correlação de nematoides-para-proteína retratados foram realizadas usando 100 µ l de tampão. Amostras de LC-MS/MS foram lysed com 200 µ l de tampão.
  2. Inicie o homogeneizador por 1 min na velocidade 9. Certifique-se de que as amostras completamente lysed. Repita essa etapa se eles não lysed totalmente.
  3. Centrifugar as amostras por 30 min a 4 ° C no 19.000 x g. Transferir o sobrenadante para um tubo novo no gelo e armazená-lo a-80 ° C até mais medidas vão ser tomadas.
    Nota: O buffer não-desnaturação usado para experimentos retratados consiste das seguintes substâncias: 20 mM Tris HCl (pH 8), 137 mM NaCl 1% Triton-X e 2 mM de EDTA.
    Nota: Tendo seguido os passos do presente protocolo e tendo aplicado a escala sugerida, o rendimento de uma pelota de proteína de aproximadamente 1.000 nematoides deve ser de aproximadamente 500 µ g. Para mais comparações, consulte a Figura 2 e os Resultados de representante.

5. amostra preparação para medições de espectrometria de massa em tandem-cromatografia líquida

Nota: Dependendo do parâmetro de interesse, a preparação da amostra será diferente. Este protocolo incide sobre metilglioxal e determinação de idade.

  1. Medir o metilglioxal intracelular por derivatização com 1,2-diaminobenzene (DB) como descrito anteriormente,9.
    1. Homogeneizar as amostras com 20 µ l de gelado ácido tricloroacético de 20% (wt/vol) em cloreto de sódio 0,9% (wt/vol) e 80 µ l de água em um tubo de 1,5 mL.
    2. Spike as amostras de 5 µ l com padrão interno (13C3-MG; 400 nM), misturá-los pela utilização do Vortex e centrifugá-los a 21.000 x g por 5 min a 4 ° C.
    3. Transferi 35 µ l do sobrenadante para o frasco de amostra HPLC contendo uma pastilha de vidro de 200 µ l.
    4. Adicione 5 µ l de 3% de azida sódica (wt/vol) para cada amostra, seguida de 10 µ l de 0,5 mM DB em 200mm HCl contendo 0,5 mM diethylenetriaminepentaacetic ácido (DETAPAC) em água.
    5. Incube as amostras para 4 h à temperatura ambiente, protegida da luz.
    6. Analise as amostras por LC-MS/MS, como descrito anteriormente,9.
      Nota: Para a medição de idades, isole as proteínas conforme descrito na seção 4 do protocolo.
  2. Medir a concentração de proteína dos lysates (descongeladas) usando um ensaio de Bradford10.
    1. Preparar alíquotas de 30 µ l para uma curva padrão cravada com albumina de soro bovino (BSA) resolvida em tampão fosfato salino (PBS) da seguinte concentração: 0; 0.1; 0,2; 0.3; 0,4; 0,6; 0,8; e 1,0 mg/dL.
      Nota: Se a amostra foi preparada para o tamanho sugerido (consulte a etapa 4.1 para a preparação de lisado com 200 µ l de tampão), a concentração estimada deve ser no intervalo de aproximadamente 2-7 mg/mL. Neste caso, dilua as amostras 01:10 com PBS antes da medição.
      Nota: Para os primeiros experimentos usando este método, recomenda-se medir as amostras em diferentes diluições (1, 01:10 e 1: 100). Como não há nenhuma determinação exata do número de nematoides, o rendimento pode diferir entre investigadores individuais.
    2. Usar uma placa de 96 poços transparente (poliestireno) e pipetar 10 µ l de cada concentração de padrão e das amostras nas diluições escolhidas em duplicatas em poços.
    3. Diluir a proteína ensaio corante reagente concentrado 1:5 com água destilada (aq. dest.) e adicionar 200 µ l da diluição para cada amostra na placa. Incube a placa por 10 min à temperatura ambiente.
    4. Medir a absorvância dentro de 30 min em 595 nm com um leitor de placa. As amostras podem ser interpoladas a partir da curva padrão calculada. Mais detalhes do método foram descritas extensivamente na literatura10.
  3. Medir as idades intracelulares, como descrito anteriormente,11,12.
    1. Lave os extratos de proteínas totais (aproximadamente 200 µ g) 3x com água por ultracentrifugação em 10 unidades de filtro centrífugo kDa.
    2. Adicionar 10 µ l de HCl a 100 mM, 10 µ l de pepsina (2 mg/mL em 20 mM HCl) e 10 µ l de timol (2 mg/mL em 20 mM HCl) à proteína recuperada (cerca de 100 µ l) e incubar as amostras a 37 ° C por 24 h.
    3. Neutralizar e as amostras do buffer em pH 7,4, adicionando 12,5 µ l de tampão de fosfato de potássio 0,5 M (pH 7,4) e 5 µ l de KOH de 260 mM.
    4. Adicionar 10 µ l de Pronase E [2 mg/mL em tampão de fosfato de potássio 10 mM (pH 7,4)] e 10 µ l de uma solução de penicilina-estreptomicina e incubar as amostras a 37 ° C por 24 h.
    5. Adicionar 10 µ l de aminopeptidase [2 mg/mL em tampão de fosfato de potássio 10 mM (pH 7,4)] e 10 µ l de prolidase [2 mg/mL em tampão de fosfato de potássio 10 mM (pH 7,4)] e incubar as amostras a 37 ° C por 48 h.
    6. Analise o hidrolisado resultante por LC-MS/MS, como descrito anteriormente,12.

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Representative Results

Aqui exemplos de criação de uma grande escala de c. elegans cultura para aplicações em pesquisa do diabetes são apresentadas. Pode ser de interesse para relacionar os parâmetros de um único animal, ao invés de normalizar isso à concentração de proteínas totais. Em um ensaio que exige um pequeno número de nematoides, isso pode ser facilmente realizado pela contagem dos nemátodes. Para uma grande escala de c. elegans cultura envolvendo centenas de nematoides por grupo experimental, esta abordagem é inconveniente. Na Figura 2, é apresentada a correspondência entre a quantidade de c. elegans e o teor de proteína. Como demonstrado aqui, isolamento da proteína quantitativa reprodutíveis pode ser conseguido usando este protocolo.

O Amadori aduto fructosyl-lisina é um dos vários precursores de idade formados durante13modelos de diabetes em animais experimentais. A Figura 3 exibe medições de LC-MS/MS após um tratamento de glicose em nematoides de 12 dias de idade e idade correspondentes controlos de três experimentos independentes. Os nematódeos foram homogeneizados com uma adição de 200 µ l de tampão de lisado. Uma maior formação de fructosyl-lisina após o tratamento de alta-glicose é apresentado.

Metabolitos reativos como metilglioxal são fluctuant e modificar as proteínas rapidamente14. Portanto, resta saber se esses metabólitos reativos na verdade se acumulam no organismo ou são modificados antes de atingir seu alvo. Figura 4 confirma a acumulação de metilglioxal em c. elegans após um tratamento com a substância.

Estresse oxidativo é aumentado durante a hiperglicemia6, bem como durante a tensão de cisalhamento. Figura 5 não confirma nenhuma diferença na formação do estresse oxidativo, entre o grupo tratados com glicose, transferido como na secção 2 do protocolo e o grupo não-transferido. Comparação de ambos os grupos tratados com glicose ao grupo controle não tratado mostra um aumento significativo no estresse oxidativo induzido por glicose. Em contraste, nenhuma diferença significativa entre os dois grupos tratados com glicose foi observada. Esses resultados ilustram que manipulação nemátodes usando este protocolo não induz significativamente a formação de estresse oxidativo, que poderia servir como um confundente em investigações de envelhecimento ou metabolismo. Além disso, achados na literatura atual foram reproduzidos usando este protocolo.

Figure 1
Figura 1: densidade adequada de nematoides para uma distribuição mais placas. (A), este painel mostra uma visão macroscópica. (B), este painel mostra uma visão microscópica, no aumento de 20 X. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Proteica do selvagem-tipo c. elegans N2. Este painel mostra a correlação do número de nematoides para o rendimento de proteína do lisado, preparados conforme descrito na seção de protocolo 5 em 12 dias de idade nematoides(n = 3 lisado de 500 nemátodos; n = 3 lisado de 1.000 nemátodos; e n = 1 lisado de 1.500 nematódeos). A linha de regressão é marcada em vermelho (r2 = 0.976, y = 0,64). A concentração de proteína total foi medida utilizando o método de Bradford. Os dados são expressos como o média ± desvio-padrão (SD). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Aumento da formação de fructosyl-lisina após um tratamento de glicose de c. elegans N2. As concentrações de fructosyl-lisina após tratamento com glicose em nematoides de 12 dias de idade e controlos foram determinadas por LC-MS/MS e normalizadas a uma concentração de proteína, determinada pelo método de Bradford. Os dados são expressos como a média ± DP. Os p-valores foram determinados por Student t-teste, * *p < 0,01. Os resultados são de três experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Concentrações de metilglioxal intracelular após um tratamento de metilglioxal de c. elegans N2. Concentrações de metilglioxal foram medidas por LC-MS/MS em 12 dias de idade nematódeos tratados com metilglioxal. As amostras foram coletadas de menos de 2 h após o último tratamento. Os dados são expressos como média ± SD normalizada para o número de nematoides. Os p-valores foram determinados por Student t-teste, * *p < 0,01. Os resultados são de três experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Estresse oxidativo medido em c. elegans CL2166 após um tratamento de glicose. Transgênico CL2166 (gst4::GFP)8 contendo um repórter GFP 4 promotor-orientado a glutationa S-transferase foram cultivadas em placas de FUdR 400 µM contendo glicose para d 2. Um grupo foi transferido para placas de glicose fresco no dia 1, conforme descrito na secção 2 do presente protocolo. Estresse oxidativo foi medido como um aumento na fluorescência [unidades luz relativas (RLU)] com um leitor de placa. Os dados são expressos como a média ± DP. Os p-valores foram determinados por ANOVA, *p < 0,05. Os resultados são de três experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este protocolo apresenta uma abordagem confiável para o cultivo em grande escala de c. elegans , obter resultados quantitativos. Achados da literatura poderiam ser replicados como mostrado nos Resultados de representante. Mesmo que este protocolo para a recolha de amostras em grande escala de c. elegans parece ser um método direto, há certas armadilhas para ter em conta. Sobre a sincronização da população de nematoides, este protocolo descreve uma abordagem por branqueamento da população com hipoclorito de sódio e hidróxido de sódio para destruir os nematódeos e colher os ovos unicamente. Tem que ter em conta que esta abordagem pode não ser apropriada para todos os experimentos. Dependendo da proporção do tamanho da população para o volume da solução de branqueamento, o efeito prejudicar da solução de branqueamento influencia o desenvolvimento dos embriões15. Especialmente quando estudar processos de desenvolvimento, isto poderia ser um passo crucial. No que diz respeito a manipulação dos nematoides, é fundamental aplicar como forças de tesoura pequena quanto possível em todo o protocolo. Se não tratada com cuidado, um grande número de nematoides perecerá. Por falar nisso, é importante para não exceder o tempo de rotação e velocidade. Ao transferir os nematódeos, uma ponta de pipeta corte para reduzir o número de nematoides lesionados deve ser usada. Para a transferência dos nematoides, o volume recomendado do buffer não deve ser excedido, como o ágar-ágar pode rachar quando torna-se muito úmido, os nematódeos a oportunidade de aprofundar a placa. Ao coletar as amostras, o M9 buffer deve ser mantido gelado para desacelerar o metabolismo dos nematódeos, especialmente quando se trabalha com metabolitos ou substratos que degradará o c. elegans . É importante lavar a amostra cuidadosamente para minimizar qualquer contaminação bacteriana da alimentação prévia. Ao transferir a pelota, lembre-se que um grande número de vermes pode grudar pontas de pipetas de plástico. A pipeta de vidro recomendada deve ser usada, como pontas de pipetas mesmo baixa ligação poderiam reter uma grande quantidade da amostra. Como alternativa, a adição de 0,01% Triton-X100 para o buffer de M9 foi anteriormente sugerido16. Para garantir que nenhum falecido c. elegans ou bactérias irão influenciar os resultados, a flutuação de sacarose após a coleção dos nematódeos pode ser realizada14. Isso geralmente é feito após cultivo líquido para remover o meio. Neste experimento, essa limpeza foi omitido, porque a sacarose é metabolizado em glicose e frutose, confundindo assim potencialmente nossos resultados.

Normalmente, uma cultura em larga escala de c. elegans é executada usando o meio líquido. Líquido de cultivo, no entanto, não é adequado para todas as configurações experimentais, especialmente quando usando leituras que requerem números exatos de nemátodos. Uma modificação do aparelho Baerman foi descrita anteriormente para classificar e purificar nematoides derivados de cultura líquida17. Esse método grandemente reduz a contaminação bacteriana e filtros nematoides adultos somente através de um sistema de filtro múltiplo do componente. Esse método elegante é limitado pelo tempo tempo de filtragem (2-6 h) à temperatura ambiente, que poderia confundir as análises metabólicas. Quanto a técnica de filtragem, nematoides são classificados por suas atividades em movimento. Nematoides tem que ser apto para rastejar independentemente através dos poros de filtros de materiais diferentes. Assim, os resultados poderiam ser distorcidos, excluindo os nematoides que são enfraquecidos pelos tratamentos experimentais.

Combinar as culturas de líquido e placa em um único projeto experimental também poderia servir como um confundente em análises posteriores. C. elegans desenvolve um fenótipo mais fino e mais tempo em cultura líquida, tornando-se difícil comparar parâmetros normalizados para massa, conteúdo de proteína, ou corpo de comprimento e largura2. Além disso, o estudo das substâncias reativas é um desafio em cultura líquida, uma vez que provavelmente serão modificadas ou inactivadas por componentes de mídia antes de atingir os nematódeos substâncias reativas. Apesar de amostras em grande escala de c. elegans podem ser obtidas com este protocolo, cultura de placa em si é mais trabalhosa do que cultura líquida. No entanto, existem certas maneiras de facilitar o tratamento (por exemplo, com o uso de uma máquina de distribuição ágar). Outra opção para promover a cultura em grande escala eficiente é o uso de placas de Petri com um diâmetro maior para a produção de placas de ágar. Esta opção poderá ser a restrição por análises subsequentes. Para avaliação microscópica ou placa de manipulação em geral, as amenidades diminuem com o diâmetro do prato.

Múltiplas abordagens de alto rendimento adequadas para a avaliação de parâmetros diferentes, tais como a química ou a triagem de drogas, tem sido desenvolvido e investigado18. Dispositivos microfluídicos permitem aos pesquisadores estudar vários parâmetros, como mostrado em um modelo de tipo 2 diabetes19. Expectativa de vida, metabolismo lipídico e estresse oxidativo respostas podem ser simultaneamente avaliadas em um nível único-animal, revelando as vantagens do rastreio de alto teor, que integra fenotípica com informações bioquímicas. A avaliação da confiabilidade e reprodutibilidade da literatura atual já mostrou um grande refinamento destas técnicas, indo além da prova de conceito estudos18. A acessibilidade, especialmente para os laboratórios menores, continua a ser problemática, como os dispositivos muitas vezes têm de ser personalizados de acordo com necessidades experimentais, que podem para ser caro.

A quantificação de idades em c. elegans é complicada pela cutícula impermeável do nemátodo. Um método comumente usado é a detecção de idades através de imunofluorescência citológicas6. Por causa da cutícula, tamanhos de amostras maiores são necessários para diminuir a alta variação dos resultados. Imagem tem que ser levado em conta como um fator demorada.

O protocolo para a preparação de lisado de todo o organismo descrito aqui faz as idades intracelulares e outros componentes de c. elegans acessível para análises. LC-MS/MS medições de amostras de c. elegans foram realizadas antes de14. Condições adequadas de cultivo, no entanto, para alcançar um número suficiente de nematoides, não esteja descritas em detalhe, ainda.

O método descrito neste protocolo é útil para leituras que requerem um em grande escala, homogénea cultivados população de c. elegans, ou para a combinação de várias leituras por experiência. Isto é particularmente conveniente para estudar doenças multifatoriais complexas tais como a diabetes e suas complicações. Abordagens alternativas, tais como alta produtividade e alto teor de rastreio usando sistemas microfluídicos, são tecnologicamente mais avançadas e são capazes de fornecer dados de maior tamanho. Sua principal aplicação atualmente pode ser vista em química e rastreio de drogas ou rastreio genético para responder aos tratamentos experimentais de mutantes. Esse protocolo ajuda a pesquisadores de forma fácil e barata upscale do tamanho de seus projetos atuais ou futuros sem a necessidade de um ajustamento das leituras experimentais atuais e, assim minimizar qualquer perda de tempo associado com o estabelecimento de novas métodos.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este estudo foi suportado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) dentro a 1874 IRTG "Complicações microvasculares diabéticas" e CRC 1118 "Metabólitos reativos como causa para complicações tardias diabéticas". Cepas de c. elegans N2 e CL2166 foram fornecidas pelo CGC, que é financiado pelo NIH escritório de programas de infra-estrutura de pesquisa (OD010440 P40).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E. coli OP50 CGC n/a
C. elegans N2 CGC n/a
C. elegans CL2166 CGC n/a
Petri dish, 60 mm x 15 mm Greiner One 628161
Volumetric pipet, glas, 10 mL Neolab E-0413
Proteinase inhibitor cocktail tablets Roche 04693124001
Non-denaturing lysate buffer:
Tris-HCl, pH 8 Sigma T3253
Sodiumchloride (NaCl) Sigma S7653
Triton X-100 Sigma X-100
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma E5391
96-well plates, transparent bottom Brand 781611
Infinite M200, plate reader Tecan 30017581
Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm Next advance ZROB05-RNA
Bullet Blender, homogenizer Next advance BBX24
Pepsin from porcine gastric mucosa Sigma P6887
Thymol Sigma T0501
Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus Sigma P6911
Penicillin-Streptomycin solution Sigma P43339
Prolidase from Porcine Kidney Sigma P6675
Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica Sigma A8200
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Merckmillipore UFC501096
Basic Materials for plate culture are described in Reference 6.

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References

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Bioquímica edição 138 c. elegans cultura em grande escala massa de metabólitos reativos avançados produtos finais de glicação espécies reativas de oxigênio extrato de proteína lisado de corpo inteiro cultura de placa lavando o protocolo espectrometria diabética complicações
Baseados na placa de cultivo em grande escala de <em>Caenorhabditis elegans</em>: preparação da amostra para o estudo de alterações metabólicas em Diabetes
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Kohl, K., Fleming, T., Acunman, K.,More

Kohl, K., Fleming, T., Acunman, K., Hammes, H. P., Morcos, M., Schlotterer, A. Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes. J. Vis. Exp. (138), e58117, doi:10.3791/58117 (2018).

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