Summary
Этот протокол описывает метод для крупномасштабного культивирования Caenorhabditis elegans на твердых носителях. Как альтернатива культур в жидкой среде этот протокол позволяет получать параметры различных масштабах культивирования на основе плиты. Это увеличивает сопоставимости результатов, опустив морфологических и метаболические различия между жидких и твердых носителей культуры.
Abstract
Культивирование Caenorhabditis elegans (C. elegans) на плиты агара крупномасштабных образом может быть длительным и трудным. Этот протокол описывает простой и недорогой метод, чтобы получить большое количество животных для изоляции белков приступить к западной помарки, масс-спектрометрии или дальнейшего протеомики анализов. Кроме того увеличение нематоды чисел для immunostainings и интеграции нескольких анализов на тех же условиях культивирования может легко быть достигнуто. Кроме того способствует передаче между пластинами с различных экспериментальных условиях. Общие методы в пластине культуры связаны с передачей одного C. elegans , используя провод платины и передачи населенных агар куски с помощью скальпеля. Однако с увеличением числа нематод, эти методы становятся слишком много времени. Этот протокол описывает крупномасштабных культуры C. elegans , включая многочисленные шаги для сведения к минимуму воздействия подготовки пробы на физиологии червя. Жидкости и касательное напряжение может изменить продолжительность жизни и метаболические процессы в C. elegans, таким образом, требует подробное описание критических шагов для получения надежных и воспроизводимых результатов. C. elegans является модельный организм, состоящий из нейрональных клеток до одной трети, но не хватает кровеносных сосудов, обеспечивая тем самым возможность исследовать исключительно нейрональных изменения независимо от сосудистых управления. Недавно ранние нейродегенеративные в диабетической ретинопатии был найден до сосудистых изменений. Таким образом C. elegans представляет особый интерес для изучения общих механизмов осложнений диабета. Например повышенное образование Расширенный гликирования конечных продуктов (в возрасте), и наблюдается реактивнооксигенных видов (ров), который можно воспроизвести находятся в C. elegans. Протоколы обработки образцов достаточного размера для широкого спектра исследований представлены здесь, подтверждается в исследовании диабета индуцированной биохимические изменения. В общем, этот протокол может быть полезным для исследования, требующие большого C. elegans чисел и в которых жидкость культура не подходит.
Introduction
Анализы белка, как Западная помарка или масс-спектрометрии, требуют миллиграмм белка. Этот выход требует крупномасштабного культивирования сотни C. elegans, которое может быть достигнуто культур в жидкой среде или на твердых носителях, передачи нематод промывкой. Жидкости и касательное напряжение Индуцирует экспрессию эпителиальных натриевых каналов (ENaC), которые могут увеличить осмотического стресса через увеличение поглощения натрия, потенциально изменяя продолжительность жизни C. elegans и затрагивающих Метаболический Анализ1 . Таким образом некоторые важнейшие шаги в этом протоколе для подхода, основанного на пластину принять снижение стресса, затрагивающих экспериментальной изменчивость во внимание. Жидкий культуры, с другой стороны, влияет на фенотип нематод и усложняет культуры и коллекции точное количество нематод2. Кроме того реактивные вещества могут быть изменены компоненты средств массовой информации и могут распространять неравномерно до достижения нематод. Относительно ограничения жидкости культуры этот протокол обеспечивает альтернативный подход к культивирования крупномасштабных образцов C. elegans.
C. elegans является модельный организм с сетью собственный 302 нейрональных клеток, составляющих одну треть всех его ячеек3. С момента ее введения в науку, многие гомологичные и orthologous генов были описаны, усиливая его значение как модель для медицинских исследований. Недавно доказательства для неврологических нарушений в диабетической ретинопатии, предшествующих сосудистых повреждений, была представлена4. C. elegans отсутствуют кровеносные сосуды, но содержит собственный нейронные сети, что делает его подходящей модели расследовать нейрональных изменения помимо сосудов. Таким образом C. elegans представляет особый интерес для изучения общих механизмов осложнений диабета. Биохимические изменения в диабетических осложнений включать формирование возрастов, которые также влияют на формирование ROS в ответ гипергликемии5. Возрастов находятся в C. elegans и способствовать повреждения нейронов6. Хронические заболевания часто бывают вызваны комплекс, polygenic процессы, требующие многопараметрических подхода для оценки их основных механизмов, как свидетельствует здесь с оценкой осложнений диабета. Этот протокол можно использовать для получения нескольких параметров одновременно, а также впоследствии. Повышение сопоставимости и воспроизводимость многопараметрических подхода могут быть достигнуты, опустив морфологических и метаболические различия между жидких и твердых носителей культуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Этот протокол состоит из пяти разделов. В разделах 1 – 3 представлен основной протокол к культуре C. elegans в крупномасштабных. Разделы 4 и 5 предоставляют дополнительные протоколы для оценки свидетельствует метаболитов, происходящих в диабетической метаболитов. В деталях раздел 1 описывает общие крупномасштабные культуры на тарелках. Раздел 2 фокусируется на передаче больших объемов C. elegans, тогда как Секция 3 объясняет уборки крупномасштабных образца. Раздел 4 объясняет белка изоляции из образца и разделе 5 описывает пробоподготовки для анализа последующих жидких масс-спектрометрии хроматографии тандем (LC-MS/MS).
1. крупномасштабные культура на пластины
- В общем работе под капотом стерильной или рядом с открытым пламенем для избежания загрязнений.
-
К культуре червей до тех пор, пока они достигают стадии молодых взрослых, следовать этот ранее опубликованного протокола7 с следующих приспособлений.
- Использование живых ОР50 кишечной палочки бактерий кормить нематод и подготовить 400 мкм fluorodeoxyuridine агар (не ампициллин/FUdR) для экспериментов.
- Для подготовки синхронной населения используйте неконцентрированной ОР50 и для последующих экспериментов с взрослыми, использовать 3.3 x концентрации ОР50, удалив 70% супернатант.
- Рекомендуется ежедневное питание интервалы. При оценке оксидативного стресса, различные интервалы и томов для кормления может вмешиваться в результаты.
- Для прививки Возьмите тарелку с несколькими нематод и разрезать его на кусочки примерно 0,5 х 1 см2 с помощью скальпеля. Передача двух-трех частей на нематод роста СМИ (НГМ) пластины 60 мм в диаметре, содержащий неконцентрированной ОР50.
- Инкубировать пластин при температуре, подходящей для штамма (одичал тип N2 должен быть культивировали при 20 ° C) до тех пор, пока яйца видны на плите.
- Смывают большую часть яйца и взрослых животных с 2 мл буфера M9 и собирать их в 15 мл. Центрифуга для подвески на 800 x g на 2 мин. Тем временем Начните подготовку отбеливающий раствор.
- Вынуть центрифугировали трубки и удалить буфер M9 с 10 мл пипетки. Добавьте 10 мл отбеливающий раствор и микс на vortex до тех пор, пока лизированы взрослых нематод. Это занимает обычно около 5-7 мин, но не следует принимать дольше, чем 15 мин или яйца не будет полностью дальше развиваться в эксперименте.
- Центрифуга для подвески на 800 x g на 2 мин мыть 3 раза с 10 мл M9 буфера очистить яйца от обесцвечивания решение.
- Теперь добавьте 150 мкл суспензии яйцо на ОР50 пластины. На каждой табличке должна быть достигнута плотность 200-300 яиц. Подождите, пока нематод достигли взрослой стадии.
Примечание: M9 буфера (рН 7,0) изображены экспериментов состоит из следующих веществ: 22 мм х2PO4, 42 мм Na2HPO4и 86 мм NaCl. После автоклавирования смесь добавьте 1 мм MgSO4. Отбеливающий раствор содержит 0.5 M NaOH, 2,3 мм, которую NaOCl решена в дистиллированной воде. - Подготовьте, стерильные M9 буфера советы стерильной пипеткой, с разрезом Совет смывают червей и 15 мл пробирок, чтобы собрать их в.
- Применить примерно 1 мл M9 буфера на тарелках, аккуратно распределить буфер размахивая и аккуратно накапайте нематоды у плиты.
- Теперь соберите нематод в трубе. Применить 150 мкл суспензии непосредственно на тарелках (семенами с ОР50) с разреза наконечники и микроскопически оценить плотность нематод (рекомендуется: 50 – 100 нематод в 60 мм).
- Если они слишком густой, разбавленные подвеска с M9 буфера и оценить его под микроскопом, пока не будет достигнут желаемый плотности. Если выход является слишком мало, пусть черви успокоиться или центрифуги подвеска 10 s на 800 x g для удаления жидкости.
Примечание: Пример достаточной плотности приведен Рисунок 1A (макроскопическая) и 1B (микроскопических) на 20 X увеличение. Перейти эмпирически, как описано. - Имейте в виду, что черви быстро успокоиться. Для обеспечения равного распределения между пластинами, переверните трубку после каждого стека пластин (4 – 5 пластины).
Примечание: Вырезать Пипетка Совет, а также нежный размахивая и мытья плит, уменьшает напряжение сдвига.
2. передача больших объемов Caenorhabditis elegans
- Смыть нематод с примерно 500 мкл буфера M9, в зависимости от возраста и сухость плит. Используя тот же буфер, повторите отсоединение нематод, до тех пор, пока большинство животных собираются в суспензии.
- Медленно занимают нематод с наконечником отрезока пипетки и передавать их на тарелку подготовлен с ОР50. Пусть сухой плиты.
Примечание: Будьте осторожны, чтобы не применять гораздо больше, чем рекомендуемый объем. Особенно в ходе долгосрочных экспериментов пластины не может терпеть это и агар могут ломаться, позволяя нематоды для обхода в трещинах.
3. урожай большой Caenorhabditis elegans образца
- В зависимости от выбранного метода Начните эксперименты с достаточным количеством C. elegans. Для анализа LC-MS/MS Подготовьте 20 пластин (60 x 15 мм) на группу с приблизительно 100 нематод на пластину для обеспечения доходности по крайней мере 200 мкг белка на сэмпл.
Примечание: Эта часть протокола не требуют работать в стерильных условиях больше, как нематод будут собраны и заморожены. - На день коллекции образцов готовить жидкого азота для оснастки заморозить собранных образцов. Держите нестерильные M9 буфера на льду замедлить метаболизм нематод.
- Смыть C. elegans от пластин, применяя 1 мл буфера M9 и аккуратно закрученного пластины. Это позволяет избежать сбора умершего нематод и большинство яйца, если там присутствуют любые, потому что они придерживаться бактерий и агар.
- Занимают объем и передача его в 15 мл.
- После сбора полный пример дождитесь нематод урегулировать или центрифуги трубки кратко на 800 x g и удалить большую часть буфера M9. Вымойте образца 3 x с приблизительно 10 мл M9 (10 x объем образца) чтобы удалить бактерии.
Примечание: Для обеспечения удаления всех умерших нематод, другим вариантом является размещение сахарозы. Однако это не подходит для отображаемых эксперименты15. Сахароза гидролизуется до глюкозы и фруктозы. В изображены экспериментах роль глюкозы оценивали содействовать биохимические изменения в хроническим диабетом. Таким образом сахароза размещения потенциально может посрамить результаты. - Подготовьте один 1.5 мл трубки с 1 мл буфера M9 и один пустой 1,5 мл трубки для каждого образца. Передать лепешка с стеклянной пипетки из 15 мл трубки пустой 1,5 мл. Этот шаг имеет решающее значение для обеспечения количественной передачи.
Примечание: В отличие от на предыдущих этапах, здесь нематод являются более концентрированными. Ожидается, что из-за возможного присоединения к Пластиковые пипетки советы, потери значительной части образца. Таким образом вместо этого используйте стеклянные пипетки. - После передачи используйте Пипетки стеклянные для занять 1 мл M9 буфера от второй 1,5 мл трубки для полоскания нематод от пипетки стены. Кроме того мыть оставшиеся нематод из 15 мл трубки и передавать их на образец трубки.
- Центрифуга образец трубки в 19000 x g за 1 мин и затем удалить столько супернатанта как можно скорее.
- Печать трубку с парафина и немедленно оснастки замораживания ее в жидком азоте. Храните трубку-80 ° C до lysate подготовки.
4. белка изоляции для масс-спектрометрия
Примечание: Белка изоляции, описанные здесь также может использоваться для других анализов (например, Западная помарка).
- На замороженных пример добавьте же объемы 0,5 мм Бусины из оксида циркония и по крайней мере 2 x объем lysate буфер, содержащий ингибитор протеиназ коктейль.
Примечание: Анализ изображены нематод белка корреляции были проведены с использованием 100 мкл буфера. LC-MS/MS образцы были лизированы с 200 мкл буфера. - Запустите гомогенизатор для 1 мин на скорость 9. Убедитесь, что образцы полностью лизированы. Повторите этот шаг, если они не являются полностью лизированы.
- Центрифугуйте образцы на 30 мин при температуре 4 ° C на 19 000 x g. Передать новые трубки супернатант на льду и храните его при температуре-80 ° C до тех пор, пока дальнейшие измерения будет приниматься.
Примечание: Не денатурации буфер, используемый для изображены экспериментов состоит из следующих веществ: 20 мм трис-HCl (рН 8), 137 мм NaCl, 1% тритон-X и 2 мм ЭДТА.
Примечание: Следя за действия настоящего Протокола и применив предлагаемой шкалы, урожайность белка лепешки из примерно 1000 нематод должно быть примерно 500 мкг. Для более сравнений консультироваться Рисунок 2 и Представитель результаты.
5. Пробоподготовка для жидкостной хроматографии тандем масс-спектрометрии измерений
Примечание: В зависимости от параметра интерес, будут отличаться пробоподготовки. Этот протокол посвящен Метилглиоксаль и определения возраста.
-
Измерить внутриклеточных Метилглиоксаль деривации с 1,2-diaminobenzene (DB) как описано9.
- Однородности выборок с 20 мкл ледяной трихлоруксусной кислоты 20% (wt/vol) натрия хлорид 0,9% (wt/vol) и 80 мкл воды в 1,5 мл.
- Спайк образцы 5 мкл с внутренним стандартом (13C3-мг; 400 Нм), смешивать их, vortexing и затем центрифуга их на 21 000 x g 5 мин при 4 ° C.
- Передавать 35 мкл супернатант флакон образца ВЭЖХ, содержащий вставки стекла 200 мкл.
- 5 мкл азид натрия 3% (wt/vol), для каждого образца, затем 10 мкл 0,5 мм DB в 200 мм HCl содержащие 0,5 мм diethylenetriaminepentaacetic кислоты (DETAPAC) в воде.
- Проинкубируйте образцы для 4 ч при комнатной температуре, защищенном от света.
- Анализ образцов на LC-MS/MS, как описано выше9.
Примечание: Для измерения возрастов, изолируйте белки, как описано в разделе 4 протокола.
-
Измерьте концентрацию белка (талой) лизатов, используя assay Брадфорд10.
- Подготовить аликвоты 30 мкл для стандартной кривой с бычьим сывороточным альбумином (БСА) решена в фосфат амортизированное saline (PBS) следующих концентрации шипами: 0; 0.1; 0.2; 0,3; 0,4; 0,6; 0,8; и 1,0 мг/дл.
Примечание: Если образец был подготовлен предлагаемый размер (см. шаг 4.1 для подготовки lysate с 200 мкл буфера), по оценкам концентрация должна быть в диапазоне от приблизительно 2 – 7 мг/мл. В этом случае развести образцы 1:10 с PBS до измерения.
Примечание: Для первых экспериментов с использованием этого метода, он рекомендуется для измерения образцов в различных разведениях (1, 1:10 и 1: 100). Как нет точного определения числа нематод, урожайность может отличаться между отдельными исследователями. - Использовать прозрачный 96-луночных пластины (полистирол) и Пипетка 10 мкл каждого стандартной концентрации и образцов в выбранной разведений в дубликаты в скважинах.
- Разбавить белка пробирного краситель реагента концентрат 1:5 дистиллированной водой (aq. dest.) и 200 мкл разбавлением для каждого образца на плите. Инкубируйте пластину для 10 мин при комнатной температуре.
- Измерение оптической плотности в течение 30 мин в 595 нм с читателем пластины. Образцы можно интерполированный из рассчитанных калибровочной кривой. Подробности метода были подробно описаны в литературе10.
- Подготовить аликвоты 30 мкл для стандартной кривой с бычьим сывороточным альбумином (БСА) решена в фосфат амортизированное saline (PBS) следующих концентрации шипами: 0; 0.1; 0.2; 0,3; 0,4; 0,6; 0,8; и 1,0 мг/дл.
-
Измерьте внутриклеточных возрастов как описано11,12.
- Мыть экстракты общего белка (около 200 мкг) 3 x с водой, ultracentrifugation в 10 кДа центробежного фильтра единиц.
- Добавить 10 µL 100 мм HCl, 10 мкл пепсин (2 мг/мл в 20 мм HCl) и 10 мкл тимол (2 мг/мл в 20 мм HCl) Восстановленные белка (около 100 мкл) и Проинкубируйте образцы при 37 ° C в течение 24 ч.
- Нейтрализовать и буфера образцы рН 7,4, добавив 12,5 мкл буфера фосфат калия 0,5 М (рН 7,4) и 5 мкл 260 мм Кох.
- 10 мкл Проназа E [2 мг/мл в 10 мм калия фосфат буфере (рН 7,4)] и 10 мкл раствора пенициллина и стрептомицина и Проинкубируйте образцы при 37 ° C в течение 24 ч.
- 10 мкл aminopeptidase [2 мг/мл в 10 мм калия фосфат буфере (рН 7,4)] и 10 мкл prolidase [2 мг/мл в 10 мм калия фосфат буфере (рН 7,4)] и Проинкубируйте образцы при 37 ° C в течение 48 часов.
- Анализировать результирующие гидролизат, LC-MS/MS, как описано выше12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь примеры создания крупномасштабных C. elegans культуры для приложений в Диабет исследований представлены. Это может быть интерес связать параметры с одного животного, а не нормализации концентрации общего белка. В assay требует небольшое количество нематод это легко достигается путем подсчета нематод. Для крупномасштабных C. elegans культуры с участием сотен нематод в экспериментальной группе, этот подход является неудобным. Рисунок 2показано соотношение количество C. elegans и содержание белка. Как показано здесь, воспроизводимые количественных белка изоляции может быть достигнуто с помощью этого протокола.
Amadori аддукт fructosyl лизин является одним из нескольких лет прекурсоров, сформированные во время диабет в экспериментальных животных моделей13. Рисунок 3 показывает LC-MS/MS измерений после лечения глюкозы в 12-дневных нематод и соответствует возрасту необработанные элементы из трех независимых экспериментов. С добавлением 200 мкл lysate буфера были гомогенизированные нематод. Повышенное образование fructosyl лизин после лечения высокого глюкозы.
Реактивных метаболитов например Метилглиоксаль являются флюктуация и быстро изменить белки14. Таким образом вопрос остается ли этим реактивного метаболитов на самом деле накапливаются в организме или изменяются до достижения их цели. Рисунок 4 подтверждает накопление Метилглиоксаль в C. elegans после лечения с веществом.
Окислительный стресс увеличивается при гипергликемии6, а также при сдвиге. Рисунок 5 подтверждает никакой разницы в формировании оксидативного стресса между группе глюкозы лечение, переданных в раздел 2 протокола и не переданных группой. Сравнение обеих групп глюкозы лечение для без лечения контрольной группе показывает значительное увеличение окислительного стресса, вызванного глюкозы. В отличие от этого было отмечено никакого существенного различия между этими двумя группами глюкозы лечение. Эти результаты показывают, которые обработки нематод, используя этот протокол существенно не вызывают формирование окислительного стресса, который мог бы служить confounder расследований старения или метаболизм. Кроме того результаты в современной литературе были воспроизведены, используя этот протокол.
Рисунок 1: адекватной плотности нематод для дальнейшего распространения на тарелках. (A) Эта группа показывает макроскопическое представление. (B) Эта группа показывает вид микроскопических, на 20 X увеличение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Содержание белка одичал типа C. elegans N2. Это группа показывает соотношение числа нематод на урожайность белка lysate, подготовлен, как описано в разделе протокол 5 в 12-дневных нематод(n = 3 lysate 500 нематод; n = 3 lysate 1000 нематод; и n = 1 lysate 1500 нематод). Линия регрессии помечен красным (r2 = 0.976, y = 0,64). Содержание общего белка была измерена с помощью метода Брэдфорд. Данные выражаются как среднее ± стандартное отклонение (SD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Увеличение формирование fructosyl лизин после лечения глюкозы C. elegans N2. Концентрации fructosyl лизин после лечения с глюкозой в 12-дневных нематод и необработанные элементы были определяется LC-MS/MS и нормализуется к концентрации белков методом Брэдфорд. Данные выражаются как среднее ± SD. P-значения были определены студента t-теста, **p < 0.01. Результаты являются от трех независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Концентрации внутриклеточного Метилглиоксаль после лечения Метилглиоксаль C. elegans N2. Метилглиоксаль концентрации были измерены LC-MS/MS в 12-дневных нематод, получавших Метилглиоксаль. Образцы были собраны менее 2 ч после последнего обращения. Данные выражаются в виде среднего SD ± нормализуется на количество нематод. P-значения были определены студента t-теста, **p < 0.01. Результаты являются от трех независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Окислительном стрессе измеряется в C. elegans CL2166 после лечения глюкозы. Transgenic CL2166 (gst4::GFP)8 , содержащие глутатион S-трансферазы 4-promotor-driven GFP репортер были культивированный на 400 мкм FUdR пластины, содержащие глюкозу для 2 d. Одна группа была переведена свежие глюкозы пластины на день 1, как описано в разделе 2 настоящего Протокола. Окислительный стресс измерялась как увеличение в флуоресцировании [относительных единицах света (RLU)] с читателем пластины. Данные выражаются как среднее ± SD. P-значения были определены ANOVA, *p < 0,05. Результаты являются от трех независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол представляет собой надежный подход для крупномасштабного культивирования C. elegans для получения количественных результатов. Выводы из литературы может быть реплицированы, как показано в Представитель результаты. Даже несмотря на то, что этот протокол для коллекции крупномасштабных образцов C. elegans кажется как прямой вперед метод, есть определенные ловушки, чтобы принимать во внимание. Что касается синхронизации нематоды населения этот протокол описывает подход путем отбеливания населения гипохлорита натрия и гидроксид натрия уничтожить нематод и собирать яйца исключительно. Она должна приниматься во внимание, что этот подход может не подходить для всех экспериментов. В зависимости от отношение численности населения к объему отбеливающий раствор вредя эффект отбеливания решение влияет на развитие эмбрионов15. Особенно при изучении процессов развития, это может быть важным шагом. Относительно обработки нематод, важно применять как мало сдвига как можно на протяжении всего протокола. Если не подходить с осторожностью, большое количество нематод погибнет. По этому вопросу важно, чтобы не превышать скорость и время спиннинг. При передаче нематод, следует использовать кончик отрезока пипетку для уменьшения числа раненых нематод. Для передачи нематод рекомендуемый объем буфера не должен быть превышен, как агар может трещины, когда она становится слишком влажной, давая возможность погрузиться в пластину нематод. Во время сбора образцов, M9 буфера должны храниться ледяной замедлить метаболизм нематод, особенно при работе с метаболитов или подложек которые C. elegans будет деградировать. Важно мыть образец тщательно, чтобы свести к минимуму любые бактериальное загрязнение от до кормления. При передаче гранулы, помните, что большое количество червей могут придерживаться пластиковые наконечники. Следует использовать рекомендуемый стеклянные пипетки, как даже низким привязки наконечники могут сохранять большое количество образца. В качестве альтернативы помимо 0,01%, Тритон-X100 M9 буфер был ранее предложил16. Чтобы гарантировать, что не покойного C. elegans или бактерии будет влиять на результаты, сахароза размещения после того, как коллекция нематод может быть выполнено14. Обычно это делается после жидкого культивирования для удаления среды. В этом эксперименте этой чистки был опущен, потому что сахароза метаболизируется в глюкозу и фруктозу, тем самым потенциально смешанные результаты.
Как правило крупномасштабные культуры C. elegans выполняется с использованием жидких сред. Жидкий культивирования, однако, не подходит для всех экспериментальных установок, особенно при использовании показаний, которые требуют точного числа нематод. Модификация аппарата Baerman ранее был описан для сортировки и очистки нематод, производный от жидких культуры17. Этот метод значительно уменьшает бактериальное загрязнение и фильтров только Взрослый нематод через систему фильтрации нескольких компонентов. Этот элегантный метод ограничено время долго фильтрации (2-6 h) при комнатной температуре, которая может сбить с толку метаболический анализ. Что касается метода фильтрации нематоды сортируются по их перемещение деятельности. Струнцы имеют будет соответствовать достаточно, чтобы обход самостоятельно через поры фильтров из различных материалов. Таким образом результаты могут быть искажены, исключив нематод, которые ослаблены экспериментальное лечение.
Сочетая культур жидкости и пластины в один экспериментальный дизайн могут также служить confounder в более поздних анализов. C. elegans развивает тоньше и длиннее фенотип в жидком культуры, что делает его трудно сравнить параметры нормализовано к массе, содержание белка, или тела длины и ширины2. Кроме того Исследование реактивных веществ является сложной задачей в жидком культуры, так как реактивные вещества вероятно быть изменены или инактивированная компонентами СМИ до достижения нематод. Даже несмотря на то, что крупномасштабные образцов C. elegans могут быть получены с настоящим Протоколом, сама культура пластины более трудоемкий, чем жидкие культуры. Однако есть определенные пути для облегчения обработки (например, с использованием агар дозирование машины). Еще один вариант для развития крупномасштабных культуры эффективно используется Петри с большего диаметра для производства агар плит. Этот параметр может быть ограничение последующие анализы. Для микроскопической оценке или пластины, обработка в целом удобства уменьшаться с диаметром блюдо.
Несколько высок объём подходы для оценки различных параметров, таких как химические или скрининга наркотиков, были разработаны и исследованы18. Microfluidic приборы позволяют исследователям изучить различные параметры, как показано в модели диабет 2 типа19. Продолжительность жизни, метаболизм липидов и окислительного стресса ответы можно одновременно оценить на уровне одного животного, раскрывая преимущества высоким содержанием скрининга, которая интегрирует фенотипические с биохимическими информацией. Оценка надежности и воспроизводимости результатов текущей литературы уже показал большое уточнение этих методов, выходящих за рамки доказательства в концепция исследования18. Доступности, особенно для небольших лабораторий, по-прежнему остается проблематичным, как эти устройства часто должны быть настроены согласно экспериментальной потребности, которые могут оказаться дорогостоящими.
Количественная оценка возрастов в C. elegans осложняется непроницаемой кутикулы нематода. Часто используемым методом является определение возраста через immunofluorescent stainings6. Ввиду кутикулу большие размеры образцов необходимы для уменьшения высокая дисперсия результатов. Изображения должна приниматься во внимание как фактор времени.
Протокол для всего тела lysate подготовки, описанные здесь делает доступными для анализа внутриклеточных возрастов и другие компоненты C. elegans . LC-MS/MS измерения образцов C. elegans были выполнены до14. Надлежащих условий культивирования, однако, обеспечить достаточное количество нематод, не были описаны в деталях, пока.
Метод, описанный в настоящем Протоколе полезен для устройства индикации, требующих крупномасштабных, содержанием однородно растет население C. elegans, или для комбинации нескольких показаний за эксперимент. Это особенно удобно для изучения сложных многофакторных заболеваний, например диабета и его осложнений. Альтернативные подходы, такие как высокой пропускной способностью и высоким содержанием скрининга, используя microfluidic систем, более технологически и способны обеспечить данных большего размера. В настоящее время их главного приложения можно увидеть в химической и наркотиков скрининг или генетического скрининга для мутантов, отвечая на экспериментальное лечение. Этот протокол помогает исследователям легко и недорого высококлассные размер их текущих или будущих проектов без необходимости для корректировки текущей экспериментальной показаний и, таким образом, чтобы свести к минимуму любые потери времени связанные с созданием новых методы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) в пределах IRTG 1874 «Микрососудистых осложнений диабета» и CRC 1118 «Реактивных метаболитов как повод для диабетической поздних осложнений». C. elegans штаммов N2 и CL2166 были предоставлены CGC, которая финансируется Управлением NIH инфраструктуры научно-исследовательских программ (P40 OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli OP50 | CGC | n/a | |
| C. elegans N2 | CGC | n/a | |
| C. elegans CL2166 | CGC | n/a | |
| Petri dish, 60 mm x 15 mm | Greiner One | 628161 | |
| Volumetric pipet, glas, 10 mL | Neolab | E-0413 | |
| Proteinase inhibitor cocktail tablets | Roche | 04693124001 | |
| Non-denaturing lysate buffer: | |||
| Tris-HCl, pH 8 | Sigma | T3253 | |
| Sodiumchloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E5391 | |
| 96-well plates, transparent bottom | Brand | 781611 | |
| Infinite M200, plate reader | Tecan | 30017581 | |
| Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm | Next advance | ZROB05-RNA | |
| Bullet Blender, homogenizer | Next advance | BBX24 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P6887 | |
| Thymol | Sigma | T0501 | |
| Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P6911 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P43339 | |
| Prolidase from Porcine Kidney | Sigma | P6675 | |
| Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica | Sigma | A8200 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Merckmillipore | UFC501096 | |
| Basic Materials for plate culture are described in Reference 6. |
References
- Fronius, M., Clauss, W. G. Mechano-sensitivity of ENaC: may the (shear) force be with you. Pflügers Archiv. 455 (5), 775-785 (2008).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html (2006).
- Altun, Z. F., Hall, D. H. Nervous system, general description. WormAtlas. , Available from: http://www.wormatlas.org/hermaphrodite/nervous/Neuroframeset.html (2011).
- Sohn, E. H., et al. Retinal neurodegeneration may precede microvascular changes characteristic of diabetic retinopathy in diabetes mellitus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (19), E2655-E2664 (2016).
- Chilelli, N. C., Burlina, S., Lapolla, A. AGEs, rather than hyperglycemia, are responsible for microvascular complications in diabetes: a "glycoxidation-centric" point of view. Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Diseases. 23 (10), 913-919 (2013).
- Schlotterer, A., et al. C. elegans as model for the study of high glucose- mediated life span reduction. Diabetes. 58 (11), 2450-2456 (2009).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Leiers, B., et al. A stress-responsive glutathione S-transferase confers resistance to oxidative stress in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 34 (11), 1405-1415 (2003).
- Rabbani, N., Thornalley, P. J. Measurement of methylglyoxal by stable isotopic dilution analysis LC-MS/MS with corroborative prediction in physiological samples. Nature Protocols. 9 (8), 1969-1979 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 7 (72), 248-254 (1976).
- Ahmed, N., Argirov, O. K., Minhas, H. S., Cordeiro, C. A., Thornalley, P. J. Assay of advanced glycation endproducts (AGEs): surveying AGEs by chromatographic assay with derivatization by 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamate and application to Nepsilon-carboxymethyl-lysine- and Nepsilon-(1-carboxyethyl)lysine-modified albumin. Biochemical Journal. 364 (Pt 1), 1-14 (2002).
- Thornalley, P. J., et al. Quantitative screening of advanced glycation endproducts in cellular and extracellular proteins by tandem mass spectrometry. Biochemical Journal. 375 (Pt 3), 581-592 (2003).
- Karachalias, N., Babaei-Jadidi, R., Ahmed, N., Thornalley, P. Accumulation of fructosyllysine and advanced glycation end products in the kidney, retina and peripheral nerve of streptozotocin-induced diabetic rats. Biochemical Society Transactions. 31, 1423-1425 (2003).
- Morcos, M., et al. Glyoxalase-1 prevents mitochondrial protein modification and enhances lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 7 (2), 260-269 (2008).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Lagido, C., McLaggan, D., Glover, L. A. A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (105), e53083 (2015).
- Takamiya, S., Mita, T. Large-scale purification of active liquid-cultured Caenorhabditis elegans using a modified Baermann apparatus. Parasitology International. 65 (5 Pt B), 580-583 (2016).
- Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. Microfluidic systems for high-throughput and high-content screening using the nematode Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 17 (22), 3736-3759 (2017).
- Zhu, G., Yin, F., Wang, L., Wei, W., Jiang, L., Qin, J. Modeling type 2 diabetes-like hyperglycemia in C. elegans on a microdevice. Integrative Biology. 8 (1), 30-38 (2016).
