Summary
Bu iletişim kuralı bir yöntem Caenorhabditis elegans büyük ölçekli ekimi için katı medyada açıklar. Sıvı kültür alternatif, bu protokol parametreleri farklı ölçeklerde plaka tabanlı ekilen almak sağlanır. Bu sonuçlar karşılaştırılabilir sıvı ve katı Medya kültürü arasındaki morfolojik ve metabolik farklar ihmal olarak artırır.
Abstract
Ağar kaplamalar üzerinde büyük ölçekli bir şekilde Caenorhabditis elegans (C. elegans) kültür zaman alıcı ve zor olabilir. Bu iletişim kuralı çok sayıda hayvan proteinleri bir western blot, kütle spektrometresi veya daha fazla proteomik analizleri ile devam etmek için yalıtım için elde etmek için basit ve ucuz bir yöntem açıklanır. Ayrıca, immunostainings nematodunun numaralarındaki artış ve aynı kodlamayla koşullar altında birden fazla analizleri entegrasyonu kolayca elde edilebilir. Ayrıca, farklı deneysel koşullar ile plakalar arasında bir transferi kolaylaştırdı. Plaka kültürde yaygın teknikleri bir platin tel kullanarak tek bir C. elegans transferini içerir ve bir neşter kullanarak nüfuslu agar transferini parçalar. Ancak, yuvarlak sayıları artan, bu tekniklerin aşırı zaman alıcı olur. Bu iletişim kuralı solucan numune hazırlama fizyolojisi üzerinde etkisini en aza indirmek için çeşitli adımlar da dahil olmak üzere C. elegans büyük ölçekli kültür açıklar. Sıvı ve yamultma stres ömrü ve böylece güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar almak için kritik adımları ayrıntılı bir açıklama gerektiren C. elegans, metabolik süreçleri değiştirebilir. C. elegans bir model organizma ilâ 1 / 3 için nöronal hücre oluşan, ama kan damarları eksik, böylece yalnızca nöronal değişiklikler vasküler kontrolünü bağımsız araştırmaya imkanı sunmaktadır. Son zamanlarda, diabetik retinopati erken ateş vasküler değişiklikler önce bulundu. Böylece, C. elegans diyabetik komplikasyonların genel mekanizmaları eğitim için özel ilgi olmasıdır. Örneğin, artan bir oluşumu glikasyondan son ürünleri (Yaş) gelişmiş ve reaktif oksijen türlerine (ROS) tekrarlanarak C. elegansiçinde bulunan görülmektedir. Örnekleri soruşturmaların daha geniş bir spektrum için yeterli büyüklükte işlemek için iletişim kuralları burada, biyokimyasal değişiklikler diyabet kaynaklı çalışmayla örneği sunulmuştur. Genel olarak, bu protokolü büyük C. elegans gerektiren çalışmalar için yararlı olabilir numaraları ve hangi sıvı kültürü uygun değildir.
Introduction
Protein analizleri, Batı leke veya kütle spektrometresi, gibi protein miligram gerektirir. Bu verim hangi sıvı kültür veya katı medya nematodlar aktarma yıkama tarafından gerçekleştirilebilir C. elegans, yüzlerce bir büyük ölçekli kültür gerektirir. Sıvı ve yamultma stres indükler ozmotik stres ile artan bir potansiyel C. elegans ömrünü değiştirme ve metabolik analizleri1 etkileyen sodyum alımını artırmak olabilir epitel sodyum kanalları (ENaC), ifade . Bu nedenle, bu iletişim kuralı için plaka dayalı yaklaşım bazı kritik adımları dikkate deneysel değişkenlik etkileyen stres azaltma almak. Sıvı kültür, öte yandan, nematodlar fenotip etkiler ve kültür ve Nematodlar2tam bir sayısını topluluğu olmak zordur. Ayrıca, reaktif maddeler ortam bileşenleri tarafından değiştirilebilir ve düzensiz nematodlar ulaşmadan önce dağıtabilirsiniz. Sıvı kültür sınırlamaları ile ilgili, bu iletişim kuralı C. elegansbüyük ölçekli örnekler kültür için alternatif bir yaklaşım sağlar.
C. elegans 302 nöronal hücre, ayrı bir ağ ile bir model organizma üçte biri kadar tüm onun hücreleri3yapıyor. Bilim, birçok homolog içine yana ve orthologous genler tıbbi araştırma için bir model olarak değerini yükseltecek tarif edilmiştir. Son zamanlarda, diyabetik retinopati, vasküler hasar, önceki nörolojik bozukluğu için kanıt4sundu. C. elegans kan damarları eksik, ama farklı nöronal ağ, nöronal değişiklikler vasküler olanlar dışında araştırmak için uygun bir model yapım içerir. Böylece, C. elegans diyabetik komplikasyonların genel mekanizmaları eğitim için özel ilgi olmasıdır. Diyabetik komplikasyonlar içinde biyokimyasal değişiklikler daha fazla hiperglisemi5yanıt ROS oluşumuna etkisi yaş oluşumu dahil. Yaş C. elegans içinde bulunur ve nöronal hasar6için katkıda bulunmak. Kronik hastalıklar genellikle altta yatan mekanizmaları değerlendirmesi için multiparametric bir yaklaşım gerektiren karmaşık, polygenic işlemler tarafından burada diyabetik komplikasyonların değerlendirilmesi ile olarak meydana gelir. Bu iletişim kuralı birden çok parametre aynı anda, hem de daha sonra elde etmek için kullanım olabilir. Artan karşılaştırılabilir ve multiparametric bir yaklaşım tekrarlanabilirlik sıvı ve katı Medya kültürü arasındaki morfolojik ve metabolik farklar ihmal olarak elde edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Bu protokol beş bölüme ayrılır. Bölüm 1-3, C. elegans büyük ölçekli kültür için ana protokol sunulmuştur. Bölüm 4 ve 5 örneği metabolitleri diyabetik metabolitleri meydana gelen değerlendirilmesi için ek iletişim kuralları sağlar. Ayrıntılı olarak, Bölüm 1 tabaklarda genel bir büyük ölçekli kültür açıklar. Bölüm 3 büyük ölçekli örneği hasat açıklar, ancak bölüm 2 C. elegans, büyük miktarlarda aktarımı üzerinde duruluyor. Bölüm 4 örnek protein izolasyonu açıklar ve Bölüm 5 sonraki sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) analizleri için numune hazırlama açıklar.
1. büyük ölçekli kültür plakaları
- Genel olarak, steril bir başlık altında veya contaminations önlemek için açık alev yanında çalışır.
-
Kültür için Genç Yetişkin sahne ulaşana kadar solucanlar bu daha önce yayımlanan Protokolü7 aşağıdaki uyarlamalar ile izleyin.
- Yaşam Escherichia coli OP50 bakteri nematodlar besleme ve deneyler için 400 µM fluorodeoxyuridine agar (değil ampisilin/FUdR) hazırlamak için kullanın.
- Zaman uyumlu bir nüfus hazırlanması, unconcentrated OP50 kullanın ve yetişkinler ile deneyler başarı için konsantre OP50 x %3.3 70'i süpernatant kaldırarak kullanın.
- Günlük beslenme aralıkları tavsiye edilir. Oksidatif stres değerlendirirken, farklı aralıkları ve beslenme için birimler sonuçları ile etkileşebilir.
- Aşı için bir tabak birkaç nematodlar ile alın ve bir neşter ile yaklaşık2 0.5 x 1 cm parçalara kesti. 60 mm çapında, unconcentrated OP50 içeren iki ya da üç adet nematodunun büyüme medya (NGM) plakalar üzerine aktarın.
- Tabak (vahşi tipi N2 kültürlü 20 ° C'de) zorlanma için uygun sıcaklıkta kuluçkaya yumurta plaka üzerinde görünür hale gelene kadar.
- M9 arabelleğinin 2 mL ile yumurta ve yetişkin hayvanların en kapalı yıkama ve onları bir 15 mL tüp içinde toplamak. Süspansiyon vasıl 800 x g 2 dk santrifüj kapasitesi. Bu arada, beyazlatma çözüm hazırlanmaya başlayın.
- Centrifuged tüpü çıkarmak ve bir 10 mL damlalıklı M9 önbellekle sökün. Yetişkin nematodlar lysed kadar beyazlatma çözüm ve mix 10 mL vortex tarih ekleyin. Bu genellikle yaklaşık 5-7 dakika sürer ama 15dk uzun almamalıdır veya yumurta tam olarak daha sonra üzerinde denemeye geliştirmek değil.
- Vasıl 800 x g 2 dk. yıkama çözüm beyazlatma gelen yumurta temizlemek için 3 kez 10 mL M9 arabelleği ile süspansiyon santrifüj kapasitesi.
- Şimdi yumurta süspansiyon 150 µL OP50 tabaklarda ekleyin. 200 – 300 yumurta yoğunluğu her tabağa erişilmesi gereken. Nematodlar yetişkin aşamaya kadar bekleyin.
Not: görülen denemeleri için M9 (pH 7,0) arabelleği aşağıdaki maddelerden oluşur: 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4ve 86 mM NaCl. Isıyla sonra karışımı, 1 mM MgSO4 ekleyin. Beyazlatma çözüm 0.5 M NaOH, 2.3 mM NaOCl distile suda çözülmüş içerir. - Steril M9 arabellek, bir kesim ile steril pipet ipuçları ipucu solucanlar ve onları toplamak için 15 mL tüpler kapalı yıkamak için hazır olun.
- Yavaşça arabellek sallanan ve damlalıklı tarafından hafifçe plaka kapalı nematodlar dağıtmak, yaklaşık 1 mL M9 arabelleği tabaklarda uygulanır.
- Şimdi, nematodlar tüp içinde toplamak. Süspansiyon doğrudan (OP50 ile seribaşı) plakalar üzerinde 150 µL kesme pipet ipuçları ile geçerlidir ve mikroskobik nematod yoğunluğu değerlendirmek (önerilen: 60 mm plaka başına 50-100 nematodlar).
- Çok yoğun bir durumda, M9 arabellek ile süspansiyon sulandırmak ve istenen yoğunluğu ulaşılana kadar mikroskop altında değerlendirmek. Verim çok az ise, sakin veya süspansiyon 10 s sıvı kaldırmak için 800 x g , santrifüj kapasitesi solucan ver.
Not: Bir örnek yeterli yoğunluğu (makroskopik) Şekil 1A ve 1B (mikroskobik) 20 X büyütme, verilir. Ampirik olarak anlatıldığı gibi devam edin. - Solucanlar hızlı bir şekilde sakin unutmayın. Tabakalar arasında eşit bir dağıtım sağlamak için tabaklar (4 – 5 tabaklar) her yığın sonra tüp tersine çevirin.
Not: Kesme hafif sallanan yanı sıra, ipucu pipet ve plakaları, yıkama kesme stresi azaltır.
2. aktarım, büyük miktarda Caenorhabditis elegans
- Kapalı nematodlar M9 arabelleği, yaş ve kuruluk plakaların bağlı olarak yaklaşık 500 µL ile yıkayın. Aynı tampon kullanarak, çoğu hayvan süspansiyon toplanan kadar nematodlar ayırma işlemi yineleyin.
- Yavaş yavaş nematodlar kesme pipet ucu ile kaplar ve OP50 ile hazır bir plaka üzerinde aktarmak. Kuru plaka izin.
Not: daha fazla önerilen birim geçerli değildir dikkatli olun. Özellikle de uzun süreli deneyler, tabakları tolerans değil ve agar nematodlar çatlaklar taramaya izin zarar verebilir.
3. bir büyük hasat Caenorhabditis elegans örnek
- Seçilen yönteme bağlı olarak, deneyler C. elegansyeterli miktarda ile başlayın. LC-MS/MS analizleri için en az 200 µg protein örnek başına verim sağlamak için Grup plaka başına yaklaşık 100 nematodlar ile başına 20 tabaklar (60 mm x 15 mm) hazırlamak.
Not: Bu protokolün bir parçası olarak nematodlar toplanan ve dondurulmuş artık, steril koşullarda çalışma gerektirmez. - Örnek toplama günü, ek-toplanan örnekleri dondurma için sıvı azot hazırlayın. Non-Steril M9 arabellek Yuvarlak solucanlar'ın metabolizma yavaş buzda tut.
- C. elegans plakalar üzerinden kapalı 1 mL M9 arabelleği uygulamak ve yavaşça dönen tabakları yıka. Bu varsa herhangi bir mevcut, bakteri ve agar sopa çünkü ölen nematodlar ve çoğu yumurta toplama önler.
- Sesini almak ve bir 15 mL tüp transferi.
- Tam örnek koleksiyon sonra nematodlar yerleşmek veya kısaca vasıl 800 x g tüp santrifüj kapasitesi ve M9 arabellek çoğunu kaldırmak bekleyin. Örnek 3 yıkama M9 yaklaşık 10 mL ile x (10 x numune hacmi) bakterileri kaldırmak için.
Not: Tüm ölen nematodlar kaldırılır emin olmak için sukroz flotasyon başka bir seçenektir. Ancak, bu görüntülenen deneyler15için uygun değildi. Sükroz glikoz ve fruktoz hidrolize. Görülen denemelerinde glikoz rolü kronik diyabet bulundu biyokimyasal değişiklikler tanıtmak için değerlendirildi. Böylece, sukroz flotasyon potansiyel sonuçları yıkmak. - M9 arabelleği 1 mL ile bir 1,5 mL tüp ve bir boş 1,5 mL tüp her örnek için hazır olun. Pelet cam damlalıklı ile 15 mL tüp sizden boş 1,5 mL tüp aktarın. Kantitatif tayin emin olmak çok önemli bir adımdır.
Not: Aksine önceki adımları sırasında burada nematodlar daha yoğun. Bir olası bağlılığı nedeniyle plastik damlalıklı ipuçları, örnek büyük bir kısmı kaybı bekleniyor. Bu nedenle, Cam pipetler kullanın. - Aktarımdan sonra Cam Pipet pipet duvarından nematodlar durulama için 1 mL M9 arabelleği ikinci 1,5 mL tüp almak için kullanın. Ayrıca, 15 mL tüp kalan nematodlar yıkayın ve örnek tüp aktarabilirsiniz.
- 19.000 x g 1 dk. için de örnek tüp santrifüj kapasitesi ve mümkün olduğu kadar süpernatant kaldır.
- Mühür tüp Parafilm ve hemen ek-bu sıvı azot kıpırdama. Tüp-80 ° C'de lysate hazırlık kadar saklayın.
4. protein yalıtım için kütle spektrometresi
Not: burada açıklanan protein yalıtım diğer deneyleri (Örneğin, Batı leke) için kullanılabilir.
- Donmuş örnek için 0,5 mm Zirkonyum oksit boncuk ve en az 2 lysate arabellek İndinavir inhibitörü kokteyl içeren hacmi x aynı miktarda ekleyin.
Not: 100 µL arabelleği kullanarak görülen nematodlar protein korelasyon analizleri yapıldı. LC-MS/MS örnekleri arabellek 200 µL ile lysed. - 1 dk. için homogenizer hız 9 başlatın. Örnekleri tamamen lysed emin olun. Değil tamamen lysed Eğer bu adımı yineleyin.
- Örnekleri için 19.000 x gde 4 ° C'de 30 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant için yeni bir tüp buza aktarın ve daha fazla ölçümleri alınması olacak kadar-80 ° C'de depolayın.
Not: sigara denaturing arabellek görülen denemeleri için kullanılan aşağıdaki maddelerden oluşur: 20 mM Tris HCl (pH 8), 137 mM NaCl, %1 Triton-X ve 2 mM EDTA.
Not: Bu protokol ve önerilen ölçeği uygulanmış adımları takip sonra yaklaşık 1.000 nematodlar üzerinden bir protein Pelet verimi yaklaşık 500 µg olmalıdır. Daha fazla karşılaştırmalar için Temsilcisi sonuçlarıve Şekil 2 bakın.
5. numune hazırlama sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometresi ölçümler için
Not: numune hazırlama faiz parametre bağlı olarak farklı olacaktır. Bu iletişim kuralı methylglyoxal ve yaş belirlenmesi üzerinde duruluyor.
-
Hücre içi methylglyoxal derivatization 1,2-diaminobenzene (DB) ile tarafından yukarıda açıklanan9olarak ölçmek.
- 20 µL buz gibi %20 (wt/vol) trichloroacetic asit (wt/vol) % 0,9 sodyum klorür ve su 1,5 mL tüp içinde 80 µL örnekleriyle lunaparkçı.
- Dahili standart ile 5 µL örnekleri spike (13C3-MG; 400 nM), vortexing tarafından mix onları ve sonra onları 21.000 x g 4 ° C'de 5 min için de santrifüj kapasitesi
- 35 µL süpernatant ile 200 µL cam INSERT içeren HPLC örnek şişe aktarın.
- 0.5 mm DB 200 mM HCl içeren 0,5 mM diethylenetriaminepentaacetic asit (DETAPAC) suda 10 µL ardından her örnek için %3 Sodyum azid (wt/vol) 5 µL ekleyin.
- Örnekleri ışıktan korunan oda sıcaklığında 4 h için kuluçkaya.
- Örnekleri tarafından LC-MS/MS, yukarıda açıklanan9olarak analiz.
Not: Yaş ölçüm için Protokolü'nün 4 bölümde açıklandığı gibi proteinler izole et.
-
Bir Bradford tahlil10kullanarak (çözülmüş) lysates protein konsantrasyonu ölçmek.
- 30 µL aliquots Sığır serum fosfat tamponlu salin aşağıdaki konsantrasyon (PBS) çözüldü albumin (BSA) ile çivili bir standart eğri hazırlamak: 0; 0,1; 0.2; 0.3; 0,4; 0,6; 0,8; ve 1.0 mg/dL.
Not: örnek Önerilen boyutta hazır (bkz. Adım 4.1 lysate hazırlanması ile 200 µL arabelleği için), tahmini konsantrasyonu yaklaşık 2-7 mg/mL aralığında olmalıdır. Bu durumda, örnek 1:10 PBS ile ölçüm önce oranında seyreltin.
Not: Bu yöntemi kullanarak ilk deneyler için farklı dilutions örneklerinde ölçmek için önerilir (1, 1:10 ve 1: 100). Nematod sayısı tam yok belirlenmesi gibi verim bireysel araştırmacılar arasında farklı olabilir. - Şeffaf bir 96-şey plaka (Polistiren) kullanın ve 10 µL her standart konsantrasyon ve çoğaltmaları Wells içinde seçilen dilutions örneklerinde pipet.
- Protein tahlil boya reaktifi konsantre 1:5 (aq. distile suyla seyreltik dest.) ve her örnek plaka üzerinde seyreltme 200 µL ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika plaka kuluçkaya.
- 595, 30 dk içinde absorbans ölçmek nm bir plaka okuyucu ile. Örnekler hesaplanan standart eğri değiştirilmiş. Daha tafsilât-in belgili tanımlık yöntem kapsamlı edebiyat10' anlatmıştık.
- 30 µL aliquots Sığır serum fosfat tamponlu salin aşağıdaki konsantrasyon (PBS) çözüldü albumin (BSA) ile çivili bir standart eğri hazırlamak: 0; 0,1; 0.2; 0.3; 0,4; 0,6; 0,8; ve 1.0 mg/dL.
-
Yukarıda açıklanan11,12olarak hücre içi çağlar ölçmek.
- Toplam proteini özleri (yaklaşık 200 µg) yıkama ultrasantrifüj 10 kDa santrifüj filtre birimleri tarafından su ile 3 x.
- 100 mm HCl 10 µL, pepsin (2 mg/mL 20 mM HCl) 10 µL ve thymol (2 mg/mL 20 mM HCl) 10 µL kurtarılan protein (yaklaşık 100 µL) ekleyin ve örnekleri için 24 h 37 ° C'de kuluçkaya.
- Etkisiz hale getirmek ve 0,5 M potasyum fosfat tampon (pH 7,4) 12.5 µL ekleyerek pH 7.4 örnekleri tampon ve 260 mm KOH 5 µL.
- Pronase e [10 mM potasyum fosfat tampon (pH 7,4) 2 mg/mL] 10 µL ekleyin ve bir penisilin-streptomisin çözümün 10 µL ve örnekleri için 24 h 37 ° C'de kuluçkaya.
- Aminopeptidaz [10 mM potasyum fosfat tampon (pH 7,4) 2 mg/mL] 10 µL ekleyin ve prolidase [10 mM potasyum fosfat tampon (pH 7,4) 2 mg/mL], 10 µL ve örnekleri için 48 h 37 ° C'de kuluçkaya.
- LC-MS/MS tarafından elde edilen hidrolizat yukarıda açıklanan12olarak analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Diyabet araştırma uygulamalarda sunulan için burada, büyük ölçekli C. elegans oluşturma örnekleri kültür. Bu ilgi için tek bir hayvan parametreleri ilişkilendirmek yerine toplam protein konsantrasyonu normalize etmek olabilir. Nematodlar az sayıda gerektiren bir tahlil, bu kolayca nematodlar sayarak gerçekleştirilebilir. İçin büyük ölçekli C. elegans nematodlar deney grubu başına yüzlerce içeren kültür, bu yaklaşım hiç hoş değil. Şekil 2' de, C. elegans miktarı ve protein içeriği arasındaki ilişki gösterilmiştir. Aşağıda gösterildiği gibi tekrarlanabilir nicel protein yalıtım bu protokolü kullanılarak elde edilebilir.
Amadori adduct fructosyl-lizin sırasında oluşan birkaç yaş öncüleri biri deneysel hayvan diyabet modelleri13. Şekil 3 12 bayat nematodlar ve yaş eşlemeli üç bağımsız deneyler tedavi edilmezse denetimlerden bir glikoz tedavi sonrası LC-MS/MS ölçülerini görüntüler. Nematodlar 200 µL lysate arabelleği bir ek ile homojenize. Fructosyl-lizin sonra yüksek glikoz tedavi sunulan artan bir oluşumu.
Methylglyoxal gibi reaktif metabolitleri dalgalanma vardır ve proteinler hızlı bir şekilde değiştirmek14. Bu nedenle, bu reaktif metabolitleri aslında organizmada birikir ya da hedeflerine ulaşmadan önce değiştirilir olup olmadığını soru kalır. Şekil 4 methylglyoxal C. elegans birikimi sonra bir tedavi madde ile onaylar.
Oksidatif stres hiperglisemi6sırasında hem de kesme stres sırasında artar. Şekil 5 protokolünün bölümde olduğu gibi 2 transfer glikoz tedavi grubu ve sigara transfer grubu arasında hiçbir fark-oksidatif stres oluşumunda onaylar. Glikoz tedavi her iki grupta tedavi edilmemiş kontrol grubuna karşılaştırılması glikoz tarafından indüklenen oksidatif stres önemli bir artış gösterir. Buna ek olarak, glikoz tedavi iki grup arasında anlamlı bir fark gözlendi. Bu sonuçlar bu iletişim kuralını kullanan nematodlar işleme önemli ölçüde araştırmalarda yaşlanma veya metabolizma bir confounder olarak hizmet verebilir oksidatif stres oluşumu neden değil göstermektedir. Ayrıca, mevcut literatür bulguları bu iletişim kuralını kullanan çoğaltılamaz.
Şekil 1: nematodlar plakalar üzerinde başka bir dağıtım için yeterli yoğunluğu. (A) Bu panel makroskopik görünümü gösterir. (B) Bu panel 20 X büyütme mikroskobik bir görünümü gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Protein içeriği vahşi-türü C. elegans N2. Bu paneli lysate, protein verimini nematod sayısı korelasyon gösterir hazırlanan 5 içinde 12 bayat nematodlar Protokolü bölümünde anlatıldığı gibi(n = 3 500 nematodlar; lysate n = 3 1.000 nematodlar; lysate ve n = 1 1.500 nematodlar lysate). Regresyon çizgisinin kırmızıyla işaretlenen (r2 0.976, y = 0.64 =). Toplam protein konsantrasyonu Bradford yöntemi kullanılarak ölçüldü. Verileri ortalama ± standart sapma (SD) ifade edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Fructosyl-lizin oluşumu C. elegans N2 glikoz tedavisinde sonra arttı. Fructosyl-lizin konsantrasyonda glikoz 12 bayat nematodlar ve tedavi edilmezse denetimleri ile bir tedaviden sonra LC-MS/MS tarafından belirlenen ve Bradford yöntemi tarafından belirlenen bir protein konsantrasyonu için normalleştirilmiş. Verileri ortalama ± SD ifade edilir P-değerleri öğrencinin ttarafından tespit-test, **p < 0,01. Üç bağımsız deneylerden sonuçlarıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Hücre içi methylglyoxal konsantrasyonları C. elegans N2 methylglyoxal tedavisinde sonra. Methylglyoxal konsantrasyonları methylglyoxal ile tedavi 12 bayat nematodlar içinde LC-MS/MS tarafından ölçüldü. Örnekleri daha az 2 h son tedaviden sonra toplanmıştır. Verileri nematod sayısı için normalleştirilmiş ortalama ± SD olarak ifade edilir. P-değerleri öğrencinin ttarafından tespit-test, **p < 0,01. Üç bağımsız deneylerden sonuçlarıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: Oksidatif stres glikoz tedaviden sonra C. elegans CL2166 ölçülür. Transgenic CL2166 (gst4::GFP) glutatyon-S-transferaz 4 promotor uygulamalı GFP muhabir içeren8 2 d için glikoz içeren 400 µM FUdR plakaları kültürlü. Bir grup taze glikoz tabakaları bana gün bu protokolün 2 bölümde açıklandığı gibi 1 transfer edildi. Oksidatif stres floresans [göreli ışık birimleri (RLU)] ile bir plaka okuyucu içinde artış ölçüldü. Verileri ortalama ± SD ifade edilir P-değerleri ANOVA tarafından tespit *p < 0,05. Üç bağımsız deneylerden sonuçlarıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı büyük ölçekli sayısal sonuçlar elde etmek için C. elegans kültür için güvenilir bir yaklaşım sunuyor. Literatür bulguları Temsilcisi sonuçlarıgösterildiği gibi çoğaltılmış. Bu iletişim kuralı C. elegans büyük ölçekli örnekler topluluğu için bir düz ileri yöntem gibi görünüyor olsa da, dikkate almak için bazı tuzaklar vardır. Nematodunun nüfus eşitleme ile ilgili, bu iletişim kuralı nematodlar yok ve sadece yumurta hasat sodyum hipoklorit ve sodyum hidroksit ile nüfus ağartma tarafından bir yaklaşım açıklar. Bu yaklaşım tüm deneyler için uygun olmayabilir dikkate alınması gereken vardır. Popülasyon boyutu beyazlatma çözüm hacmiyle oranı bağlı olarak beyazlatma çözüm öldüme etkisi15embriyo gelişimi etkiler. Özellikle gelişim süreçleri okurken, bu çok önemli bir adım olabilir. Nematodlar işleme ile ilgili protokol boyunca mümkün olduğunca küçük kesme kuvvetleri olarak uygulamak çok önemlidir. Eğer dikkatli değil, çok sayıda nematodlar yok olacak. Hatta, hız ve iplik saati aşmayacak şekilde önemlidir. Nematodlar aktarırken, yaralı nematodlar sayısını azaltmak için bir kesme pipet ucu kullanılmalıdır. Çok rutubetli, nematodlar kalenin kazmak için fırsat veren olduğunda agar çatlamak gibi nematodlar transferi için arabellek önerilen birim, aşılmış değil. Örnekleri toplarken, M9 arabellek özellikle metabolitleri veya yüzeylerde C. elegans düşer çalışırken nematodlar metabolizma yavaş buz gibi tutulmalıdır. İyice önceki besleme üzerinden herhangi bir bakteriyel kirlenme en aza indirmek için örnek yıkamak önemlidir. Pelet aktarırken, solucanlar çok sayıda plastik pipet keyif-e doğru sopa olabilir unutmayın. Hatta düşük bağlayıcı pipet ipuçları örnek büyük miktarda korumak olarak önerilen Cam Pipet kullanılmalıdır. Alternatif olarak, daha önce Triton-X100 M9 arabelleğine oldu % 0,01 ilavesi16. önerdi. Hiç ölen C. elegans veya bakteri sonuçları etkileyecektir emin olmak için14nematodlar topluluğu olabilir sonra sükroz flotasyon gerçekleştirilen. Bu genellikle sıvı orta kültürü çalışmalarının sonra yapılır. Sükroz glikoz ve fruktoz, böylece potansiyel olarak semptomlarıdır sonuçlarımız metabolize çünkü bu deneyde, bu temizlik, ihmal.
Genellikle, C. elegans , büyük ölçekli bir kültür sıvı medya kullanılarak gerçekleştirilir. Sıvı kültürü, ancak, özellikle nematodlar tam sayıda gerektiren dökümanları kullanırken tüm deneysel ayarları için uygun değildir. Bir değişiklik Baerman aparatı, sıralamak ve sıvı kültür17türetilmiş nematodlar arındırmak için önceden tanımlanmıştır. Bu yöntem büyük ölçüde bakteriyel kirlenme azaltır ve sadece yetişkin nematodlar birden çok bileşen filtre sistemi aracılığıyla filtre uygular. Bu zarif Yöntem oda sıcaklığında metabolik analizleri yıkmak uzun filtreleme zaman (2-6 h) ile sınırlıdır. Filtre uygulama tekniği gelince nematodlar hareketli faaliyetlerini tarafından sıralanır. Nematodlar olmak zorunda yeterli bağımsız olarak farklı malzemelerden filtreleri gözenekler taramaya uygun. Bu nedenle, sonuçlar deneysel tedaviler tarafından zayıflamış nematodlar hariç tutarak bozuk.
Tek bir deneysel tasarım sıvı ve plaka kültürleri birleştirerek da bir confounder daha sonra analizlerde olarak hizmet verebilir. C. elegans sıvı kültüründe daha ince ve daha uzun fenotip kitle için protein içeriği veya vücut uzunluğu ve genişliği2normalleştirilmiş parametreleri karşılaştırmak üzere geliştirir. Reaktif maddeler büyük olasılıkla değiştirilmiş veya nematodlar ulaşmadan önce ortam bileşenleri tarafından inaktive beri Ayrıca, reaktif maddeler sıvı kültüründe zorlu çalışmadır. C. elegans büyük ölçekli örnekler bu iletişim kuralı ile elde edilebilir olsa da, plaka kendisi sıvı kültür daha emek yoğun kültürdür. Ancak, (Örneğin, bir agar dağıtımı makine kullanımı ile) işleme kolaylaştırmak için bazı yolları vardır. Büyük ölçekli kültür verimli bir şekilde tanıtmak için başka bir seçenek agar plakaların üretimi için Petri yemekler daha büyük çaplı kullanımıdır. Bu seçenek sınırlama izleyen analizleri ile olabilir. Mikroskobik değerlendirme veya genel olarak işleme plaka için olanaklar çanak çapı ile azaltın.
Birden çok yüksek üretilen iş yaklaşımlar kimyasal ya da uyuşturucu tarama, gibi farklı parametreleri değerlendirilmesi için uygun olmuştur geliştirilen ve18araştırıldı. Mikrosıvısal aygıtları tip-2 diyabet19modelinde gösterildiği gibi araştırmacılar çeşitli parametreler, çalışmaya izin verir. Ömrü, lipid metabolizması ve oksidatif stres yanıt aynı anda bir tek hayvan düzeyde fenotipik biyokimyasal bilgilerini ile entegre yüksek içerik tarama avantajları ortaya tespit edilebilir. Zaten güvenilirlik değerlendirmesi ve tekrarlanabilirlik geçerli edebiyatının büyük bir arıtma kanıtı-of-concept çalışmaları18gidiyor bu tekniklerin gösterdi. Gibi aygıtları genellikle pahalı olmak kanıtlayabilirim deneysel ihtiyaçlarına göre özelleştirilmiş olması daha küçük laboratuarlar için özellikle uygun fiyatta hala sorunlu, kalır.
C. elegans çağlarda miktar Yuvarlak solucanlar geçirimsiz kütikül tarafından karmaşıktır. Yaş via immünfloresan stainings6tespiti yaygın olarak kullanılan yöntemdir. Manikür nedeniyle büyük örnekleri boyutları sonuçları yüksek farkı azaltmak için ihtiyaç vardır. Görüntüleme zaman alıcı bir faktör olarak dikkate alınması gerekiyor.
Burada açıklanan tüm vücut lysate hazırlık için protokol C. elegans diğer bileşenleri ve hücre içi yaş analizleri için erişilebilir yapar. C. elegans örnekleri LC-MS/MS ölçümleri14daha önce gerçekleştirilmiş. Yeterli kodlamayla koşulları, ancak, nematod, yeterli sayıda ulaşmak için ayrıntılı olarak henüz tarif edilmistir değil.
Bu protokol için açıklanan yöntemi bir büyük ölçekli, homojen nüfus C. elegans, veya deneme başına birden çok güzel birleşimi için yetiştirilen gerektiren çıktıları için kullanışlıdır. Bu karmaşık multifaktöriyel hastalıklar diyabet ve onun komplikasyonları gibi çalışmak için özellikle uygundur. Alternatif yaklaşımlar, yüksek performans ve yüksek-içerik filtreleme mikrosıvısal sistemlerde'ı gibi daha ileri teknolojiye sahip ve daha büyük ölçekli veri sağlamak mümkün. Onların ana uygulama kimya ve ilaç tarama veya deneysel tedavilere yanıt mutantlar için genetik tarama şu anda görülebilir. Bu iletişim kuralı araştırmacılar kolay ve ucuz bir ayarlama geçerli deneysel veriler için gerek kalmadan mevcut ya da gelecekteki projeleri boyutunu upscale için yardımcı olur ve böylece, herhangi bir zaman kaybı en aza indirmek için kurulması ile yeni ilişkili yöntemleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu çalışmada Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) IRTG 1874 "Diyabetik mikrovasküler komplikasyonlar" içinde ve CRC 1118 "Reaktif metabolitleri diyabetik geç komplikasyonlar nedeni olarak" tarafından desteklendi. C. elegans suşları N2 ve CL2166 araştırma altyapı programları (P40 OD010440) NIH ofisi tarafından finanse edilen CGC tarafından temin edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli OP50 | CGC | n/a | |
| C. elegans N2 | CGC | n/a | |
| C. elegans CL2166 | CGC | n/a | |
| Petri dish, 60 mm x 15 mm | Greiner One | 628161 | |
| Volumetric pipet, glas, 10 mL | Neolab | E-0413 | |
| Proteinase inhibitor cocktail tablets | Roche | 04693124001 | |
| Non-denaturing lysate buffer: | |||
| Tris-HCl, pH 8 | Sigma | T3253 | |
| Sodiumchloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E5391 | |
| 96-well plates, transparent bottom | Brand | 781611 | |
| Infinite M200, plate reader | Tecan | 30017581 | |
| Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm | Next advance | ZROB05-RNA | |
| Bullet Blender, homogenizer | Next advance | BBX24 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P6887 | |
| Thymol | Sigma | T0501 | |
| Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P6911 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P43339 | |
| Prolidase from Porcine Kidney | Sigma | P6675 | |
| Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica | Sigma | A8200 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Merckmillipore | UFC501096 | |
| Basic Materials for plate culture are described in Reference 6. |
References
- Fronius, M., Clauss, W. G. Mechano-sensitivity of ENaC: may the (shear) force be with you. Pflügers Archiv. 455 (5), 775-785 (2008).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html (2006).
- Altun, Z. F., Hall, D. H. Nervous system, general description. WormAtlas. , Available from: http://www.wormatlas.org/hermaphrodite/nervous/Neuroframeset.html (2011).
- Sohn, E. H., et al. Retinal neurodegeneration may precede microvascular changes characteristic of diabetic retinopathy in diabetes mellitus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (19), E2655-E2664 (2016).
- Chilelli, N. C., Burlina, S., Lapolla, A. AGEs, rather than hyperglycemia, are responsible for microvascular complications in diabetes: a "glycoxidation-centric" point of view. Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Diseases. 23 (10), 913-919 (2013).
- Schlotterer, A., et al. C. elegans as model for the study of high glucose- mediated life span reduction. Diabetes. 58 (11), 2450-2456 (2009).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Leiers, B., et al. A stress-responsive glutathione S-transferase confers resistance to oxidative stress in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 34 (11), 1405-1415 (2003).
- Rabbani, N., Thornalley, P. J. Measurement of methylglyoxal by stable isotopic dilution analysis LC-MS/MS with corroborative prediction in physiological samples. Nature Protocols. 9 (8), 1969-1979 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 7 (72), 248-254 (1976).
- Ahmed, N., Argirov, O. K., Minhas, H. S., Cordeiro, C. A., Thornalley, P. J. Assay of advanced glycation endproducts (AGEs): surveying AGEs by chromatographic assay with derivatization by 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamate and application to Nepsilon-carboxymethyl-lysine- and Nepsilon-(1-carboxyethyl)lysine-modified albumin. Biochemical Journal. 364 (Pt 1), 1-14 (2002).
- Thornalley, P. J., et al. Quantitative screening of advanced glycation endproducts in cellular and extracellular proteins by tandem mass spectrometry. Biochemical Journal. 375 (Pt 3), 581-592 (2003).
- Karachalias, N., Babaei-Jadidi, R., Ahmed, N., Thornalley, P. Accumulation of fructosyllysine and advanced glycation end products in the kidney, retina and peripheral nerve of streptozotocin-induced diabetic rats. Biochemical Society Transactions. 31, 1423-1425 (2003).
- Morcos, M., et al. Glyoxalase-1 prevents mitochondrial protein modification and enhances lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 7 (2), 260-269 (2008).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Lagido, C., McLaggan, D., Glover, L. A. A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (105), e53083 (2015).
- Takamiya, S., Mita, T. Large-scale purification of active liquid-cultured Caenorhabditis elegans using a modified Baermann apparatus. Parasitology International. 65 (5 Pt B), 580-583 (2016).
- Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. Microfluidic systems for high-throughput and high-content screening using the nematode Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 17 (22), 3736-3759 (2017).
- Zhu, G., Yin, F., Wang, L., Wei, W., Jiang, L., Qin, J. Modeling type 2 diabetes-like hyperglycemia in C. elegans on a microdevice. Integrative Biology. 8 (1), 30-38 (2016).
