Summary
Nous présentons ici un protocole pour le dosage in vivo de l’activation des lymphocytes (cellules T) T CD4 naïves, la prolifération et la différenciation Th1 induite par la moelle osseuse de GM-CSF (BM)-dérivé des cellules dendritiques (CD). En outre, ce protocole décrit BM et T-cellule d’isolement, la génération de DC et DC et les cellules T transfert adoptif.
Abstract
Quantification de l’activation des cellules T CD4 naïves, la prolifération et la différenciation de T helper 1 (Th1) cellules est un moyen utile pour évaluer le rôle joué par les cellules T dans une réponse immunitaire. Ce protocole décrit la différenciation in vitro des progéniteurs de la moelle osseuse (BM) afin d’obtenir de granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) dérivés-cellules dendritiques (CD). Le protocole décrit également le transfert adoptif de peptide d’ovalbumine (OVAp)-chargé de DCs dérivés du GM-CSF et cellules T CD4 naïves des souris transgéniques OTII afin d’analyser l’in vivo de l’activation, la prolifération et la différenciation Th1 de la cellules T CD4 transférés. Ce protocole contourne la limitation de purement en vivo méthodes imposées par l’incapacité de manipuler ou de sélectionner la population cellulaire étudié spécifiquement. De plus, ce protocole permet des études dans un environnement en vivo , évitant ainsi les altérations des facteurs fonctionnels qui peuvent se produire in vitro et y compris l’influence des types de cellules et d’autres facteurs que ne se trouves dans les organes intacts. Le protocole est un outil utile pour générer des changements dans les PED et de cellules T qui modifier adaptative des réponses immunitaires, potentiellement fournir des résultats importants pour comprendre l’origine ou le développement de nombreuses maladies associées immunitaires.
Introduction
Lymphocytes t CD4 et antigène présentant des cellules (CPA) tels que les contrôleurs de domaine sont requis de médiateurs de l’immunité contre les agents pathogènes microbiens1,2. Dans les organes lymphoïdes périphériques, les lymphocytes t CD4 est activés dès la reconnaissance des antigènes spécifiques présentés par TTB3,4,5. Les cellules T CD4 activées se multiplient et se différencient en lymphocytes Th effecteurs spécifiques distinctes qui sont nécessaires au développement d’une bonne réponse immunitaire adaptative6,7. Contrôle de ces processus est essentiel pour produire une défense adaptative suffisante qui tue l’agent pathogène sans produire de dommage tissulaire nocifs8. Lymphocytes Th sont définis en fonction de l’expression ou la production de molécules de surface, des facteurs de transcription et cytokines effectrices et d’exercer les fonctions essentielles et précises en réponse aux agents pathogènes1. Cellules du sous-ensemble de cellules Th1 expriment le facteur de transcription T-bet et la cytokine interféron γ (IFNγ) et participent à la défense de l’hôte contre les pathogènes intracellulaires1. Quantification de l’activation des cellules T CD4 naïves, la prolifération et la différenciation Th1 est un moyen utile d’évaluer le jeu de cellules de rôle T dans une réponse immunitaire.
Ce protocole permet in vivo analyse de la capacité de in vitro -généré dérivé de BM DCs pour moduler l’activation, la prolifération et la différenciation des cellules T CD4 naïves Th1. Le protocole sert également à évaluer la capacité des cellules T CD4 naïves d’être activé, induit à proliférer et Th1 différenciées (Figure 1). Ce protocole polyvalent contourne l’incapacité de manipuler ou de sélectionner la population étudiée cellule purement en vivo protocoles spécifiquement. Les effets de diverses molécules et traitements sur les contrôleurs de domaine peuvent être étudiés en utilisant BM de souris génétiquement modifiées5 ou en traitement ou en manipulant génétiquement isolées de cellules BM9. De même, les lymphocytes T peuvent être explorées en obtenant des lymphocytes T pour transfert adoptif provenant de différentes sources ou après plusieurs manipulations3,8,10.
Les principaux avantages du présent protocole sont de deux ordres. Activation des cellules t, la prolifération et la différenciation Th1 sont analysés avec une approche de cytométrie de flux ; et ceci est combiné avec les études in vivo , ainsi éviter des altérations qui peuvent se produire in vitro et y compris les types de cellules et d’autres facteurs ne trouves que dans les organes intacts11.
L’utilisation de colorants vitaux est une technique largement utilisée pour suivre la prolifération cellulaire tout en évitant l’utilisation de la radioactivité. La mesure de la prolifération avec ces réactifs est issue d’une dilution de la teinture après division cellulaire. En outre, ces colorants peuvent être détectés à plusieurs longueurs d’onde et sont facilement analysés par cytométrie en combinaison avec des anticorps fluorescents ou les marqueurs multiples. Nous mettons en évidence l’utilité de ce protocole en montrant comment l’activation des cellules T, la prolifération et la différenciation Th1 peuvent être analysés par cytométrie en flux.
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Protocol
Des procédures expérimentales ont été approuvées par la Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) et la communauté autonome de Madrid, conformément aux directives européennes et espagnoles. Les souris ont été élevés dans des conditions (SPF) libres de pathogènes spécifiques et ont été euthanasiés par inhalation de dioxyde de carbone (CO2).
1. isolement des cellules de moelle osseuse de souris de Tibias et fémurs
Remarque : La souche de souris C57BL/6 congéniques porte le marqueur de leucocyte différentiel Ptprcune, généralement reconnu comme CD45.1 ou Ly5.1, alors que les souches de C57BL sauvage porteuses de l’allèle Ptprcb , connu comme CD45.2 ou Ly5.2. On peuvent distinguer les variantes CD45.1 et CD45.2 par cytométrie en flux, en utilisant des anticorps. Souris CD45.1, CD45.2 et CD45.1/CD45.2 peuvent être utilisés comme sources de cellules ou comme bénéficiaires pour transfert adoptif, permettant le suivi des populations cellulaires distincts par cytométrie en flux. Servir de préférence l’âge- et même sexe mâles ou femelles souris au-dessous de 12 semaines d’âge.
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Préparation des fémurs et Tibias
- Euthanasier la souris en utilisant le protocole approuvé par le Comité institutionnel de soins aux animaux.
- Désinfecter les membres postérieurs en vaporisant sur la surface des animale avec l’éthanol à 70 %.
- Utiliser des scalpels, pinces et ciseaux stériles. Avec un scalpel, faire une incision dans la peau et retirer la peau de la partie distale de la souris, y compris la peau recouvrant l’extrémité postérieure. Peler la peau autour du muscle du mollet inférieure et enlever la peau des pieds entièrement (Figure 2 a, 2 b).
- Séparer le muscle quadriceps fémoral à l’aide d’un scalpel. Équipe l’articulation de la hanche sans casser la tête du fémur. Retirez les muscles du tibia à l’aide d’un scalpel (Figure 2, 2D). Séparer le fémur du tibia sans casser les extrémités des os.
- Garder les os dans une boîte de Pétri contenant 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 % la pénicilline/streptomycine dans un milieu de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 glacée 1 x.
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Isolement de cellules
Remarque : Toutes les étapes subséquentes doivent être exécutés sous un capot de la culture et avec du matériel stérile pour éviter toute contamination.- Dans une boîte de Petri stérile, découpez soigneusement les extrémités proximales et distales de chaque os avec un scalpel.
- Rincer les os à plusieurs reprises avec un volume total de 10 mL de chaleureux milieu RPMI complet (RPMI + 10 % FBS, 2 mM EDTA, 1 % pénicilline/streptomycine, 20 mM HEPES, 55 µM 2-mercaptoéthanol, pyruvate de sodium 1 mM et 2 mM de L-glutamine). Rincer les os des deux extrémités à l’aide d’une aiguille 25 G attachée à une seringue de 1 mL.
- Transférer l’effluate dans un tube conique de 50 mL, équipé d’un filtre web en nylon 70 µm. Soigneusement déloger les conglomérats de débris et de la cellule par doux en remuant et pipetage.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 10 min à température ambiante (RT).
- Resuspendre le culot dans 1 mL de tampon de lyse de rouge-sang-cellule froide (0,15 M NH4Cl + 1 mM KHCO3 + 0,1 mM EDTA, pH ajusté à 7,2 avec 1 N HCl, 0,4 µm stérile filtrée et stockés à 4 ° C). Maintenir sur la glace pendant 5 min avec le manuel secouant.
- Ajouter 10 mL de tampon de froid (1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) + 2 mM EDTA + 2 % d’albumine sérique bovine (BSA)) pour inactiver et lavent le tampon de lyse des globules rouges.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C.
- Laver les cellules avec 25 mL de milieu RPMI complet et centrifuger à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C.
- Remettre en suspension les cellules dans 5 mL de milieu RPMI complet. Mélanger 50 µL de la suspension cellulaire de 1:1 avec le bleu trypan. Déterminer le nombre de cellules dans une chambre de comptage au microscope. Calculer le nombre de cellules à l’aide de la formule : cellules/mL = [(cellule non teinté comte/4) x 2 x 10 000]12.
Remarque : Cette méthode rendements 40 x 106 à 60 x 106 OS de cellules de la moelle par 8 non infectés à 12 souris de C57BL/6 semaines. - Centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C.
2. DC différenciation, de Maturation et de chargement de l’antigène
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Cellule de BM récolte
- Amorcer la culture complète sur 6 puits ultra-low-attachment marbres à 106 cellules / mL de milieu, généralement en 5 mL par puits. Macrophages différenciés seront fixe sur la plaque de culture. Après 12 h, transférer le surnageant, qui contient principalement des monocytes, pour nettoyer les plaques 6 puits, jeter les vieilles plaques 6 puits avec les macrophages collés.
- Afin de promouvoir la différenciation cellulaire, de la culture les cellules non adhérentes à 5 x 105 cellules / mL en général de 5 mL par puits du milieu RPMI complet contenant 20 ng/mL obtenues dans le commerce recombinante murine GM-CSF à 37 ° C et 5 % de dioxyde de carbone (CO2) et observer tous les jours.
- Tous les 3 jours, faire tourner les cellules suspendues et recueillir les cellules adhérentes avec 5 mM EDTA dans du PBS et tournez en bas. Mélanger et remettre en suspension à 5 x 105 cellules/mL dans un milieu frais contenant 20 ng/mL rm-GM-CSF.
- Le jour 8, prélever des cellules adhérentes et détachés comme ci-dessus et remettre en suspension à 5 x 105 cellules/mL en moyenne contenant 20 ng/mL GM-CSF et 20 ng/mL lipopolysaccharide (LPS) pendant 24 h dans une culture de tissus non traitées boîte de Petri stérile pour induire la haute MHC-II , Expression CD80 et CD86.
- Différenciation de cocher DC par cytométrie en flux comme indiqué dans l’étape 2.2.
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Différenciation de cytométrie de flux et de l’analyse de la Maturation.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C. Répéter cette étape deux fois.
- Récepteurs Fc de bloc en incubant le culot resuspendues dans souris Fc bloqueur des récepteurs (purifiée anti IgG CD16/CD322 b anticorps de souris) pendant 15 min à 4 ° C selon les instructions du fabricant.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C.
- Pour chaque sonde, remettre en suspension les cellules 250 000 à 300 µL de tampon de cytométrie de flux (1 x PBS + 2 mM EDTA + 2 % de BSA) à 4 ° C.
- Transférer 30 µL de solution de cellules / puits d’une plaque à 96 puits.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C.
- Jeter le surnageant et ajouter 30 µL de contenant des anticorps tampon pour chaque bien suivant les indications du fabricant. Incuber les cellules avec des anticorps pendant 20 min à 4 ° C.
Remarque : Généralement employées des marqueurs pour les contrôleurs de domaine, les monocytes et les macrophages sont CD11b CD64, CD115, CD11c, MHCII, CD80 et CD86 (Figure 3). - Centrifuger les échantillons à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C et remettre en suspension dans 200 µL / puits de tampon de cytométrie en flux froid contenant un marqueur pour exclure les cellules mortes (p. ex., l’iodure de propidium, 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) ou un colorant réactif amine ) de concentration recommandée par le fabricant13.
- Contrôler la différenciation cellulaire en transférant les échantillons aux tubes de cytométrie en flux et en effectuant l’analyse de cytométrie de flux à l’exclusion des cellules mortes aux jours 0, 3, 6 et 9.
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Chargement de l’antigène de DC.
- Jour 8, centrifuger les échantillons à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C et remettre en suspension les pellets dans 200 µL de milieu (RPMI + 10 % FBS sans antibiotiques). Répéter cette étape deux fois.
- Incuber les contrôleurs de domaine avec 10 µg/mL OVAp (323-339 ; ISQAVHAAHAEINEAGR) par 1 x 107 DCs dans 1 mL de milieu (IPMB + 1 % FBS) dans un tube en plastique pendant au moins 30 min à 37 ° C. Utiliser DCs OVAp-chargé non comme une condition de contrôle négatif.
- Centrifuger les échantillons à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C et remettre en suspension les pellets dans 200 µL de milieu RPMI complet. Répéter cette étape deux fois.
- Centrifuger les échantillons à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C et remettre en suspension les pellets dans 200 µL de milieu (RPMI + 10 % FBS) à 2 x 106 cellules/mL.
3. isolement des cellules T CD4 naïves de OTII souris
Remarque : Cette méthode donne environ 100 x 106 spleenocytes par 8 non infectés à 12 souris de C57BL/6 semaines. Les mâles et les femelles peuvent être utilisées. Lymphocytes t CD4 peut être isolés dans la rate ou les ganglions lymphatiques ; Lymphocytes t CD4 compte pour environ 25 % et 50 % des cellules de ces organes, respectivement. Effectuez les opérations suivantes dans des conditions stériles.
- Isoler inguinales, axillaires, brachiales, du col utérin et mésentériques ganglions lymphatiques et la rate des souris transgéniques OTII (Figure 4) et les transférer sur un plat de Pétri contenant 10 mL de milieu RPMI complet de plastique.
- Rincer la crépine de la cellule avec 2 mL de milieu RPMI complet et retirez-la du tube de 50 mL. Transfert de ganglions lymphatiques et la rate à une crépine de cellule de 70 µm placée dans un tube de 50 mL. Homogénéiser à l’aide d’un piston de la seringue (Figure 5) et ajouter moyen à 15 mL.
- Centrifuger les échantillons à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C et Resuspendre le culot dans 15 mL de milieu RPMI complet. Répéter cette étape deux fois.
- Pour suspension de cellules de rate, resuspendre le culot cellulaire et lyser les globules rouges, comme il est indiqué dans l’étape 1.2.5.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C.
- Laver les cellules avec 25 mL de milieu RPMI complet et centrifuger à 250 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Remettre en suspension les cellules dans 5 mL de milieu. Mélanger 50 µL de la suspension cellulaire de 1:1 avec le bleu Trypan. Déterminer le nombre de cellules à l’aide d’une chambre de comptage au microscope. Calculer le nombre de cellules à l’aide de la formule : cellules/mL = [(cellule non teinté comte/4) x 2 x 10 000]12.
- Répétez l’étape 2.2.2.
- Suivant les instructions du fabricant, incuber les cellules avec des dilutions de 1:800 d’anticorps biotinylé CD8α, IgM, B220, CD19, MHCII (I-Ab), CD11b, CD11c, CD44, CD25 et DX5 pendant 30 minutes sur la glace pour plus tard une sélection négative des cellules T CD4.
- Suivant les instructions du fabricant et selon le nombre de cellules et la capacité des perles, calculer la quantité nécessaire de microbilles magnétiques-streptavidine et isoler les cellules CD4 T à l’aide d’un séparateur de cellule magnétique et le cas échéant colonnes de séparation.
- Remettre en suspension les cellules dans 5 mL de milieu RPMI complet et les garder sur la glace lors du décompte des cellules vivantes, comme indiqué au point 3.7.
- Extrait 2 x 105 cellules et vérifier la pureté des cellules recueillies à l’aide d’anticorps fluorescents dans un cytomètre en flux à l’aide de fabricant-recommandant des dilutions d’anticorps anti-CD3, CD4 et CD8 de B220.
- Pour souiller les cellules T CD4/OTII naïf isolé, resuspendre 106 cellules de 500 µL de tampon (1 x PBS + 2 mM EDTA + 2 % de BSA). Préparer 500 µL de tampon (1 x PBS + 2 mM EDTA + 2 % de BSA) contenant double la concentration finale de fabricant-recommandé de colorant traceur cellule vitale. Mélanger les deux solutions en ajoutant lentement la solution de traceur cellulaire à la suspension cellulaire. Incuber les cellules pendant 5 min à 37 ° C.
- Laver les cellules avec 5 mL de milieu RPMI complet et centrifuger à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C. Répéter cette étape deux fois. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de milieu RPMI complet à 1 x 107cellules/mL.
4. in Vivo de l’Activation, la prolifération et dosage de différenciation Th1
Remarque : La cellule vitale traceur colorant carboxyfluorescéine diacétate succinimidyl ester (CFSE) et autres colorants succinimidyl ester-basée, qui sont excités et émettent de fluorescence à différentes longueurs d’onde, sont largement utilisés pour évaluer la prolifération des lymphocytes par flux cytométrie en flux, en raison de leur intensité de fluorescence élevée, longue durée de vie, faible variabilité et une toxicité faible14.
- Moutschen cellules de transfert par voie intraveineuse (i.v.) 1 x 106 cellules vitales vivantes traceur naïf de colorant coloré T CD4/OTII dans 100 µL de PBS par souris. Les cellules T marquées peuvent être transférées Moutschen par veine caudale ou rétro-orbitaire injection15; dans les deux cas, les cellules seront abrite les organes lymphoïdes (Figure 6 a).
- Contester les souris destinataires un jour plus tard en transférant Moutschen 100 000 DCs de chargement OVAp LPS-mûri par voie sous-cutanée (s.c.) dans les pattes (Figure 6 b).
- Récolter poplitée les ganglions lymphatiques des souris bénéficiaires et les mélanger jusqu'à l’obtention de suspensions de cellules du même suivant les mêmes étapes comme décrits aux points 3.1 et 3.2. Cela après l’immunisation de mesurer l’activation des lymphocytes T CD4/OTII jour 2 et le jour 5 pour mesurer la prolifération et la différenciation Th1.
- Pour analyser l’activation des cellules T au jour 2, détachant les cellules avec des anticorps fluorescents contre CD4 et CD25 CD69 (éventuellement CD45.1 et CD45.2) et détermine le pourcentage de C69+CD25+ T cells dans la population CD4. Analyse par cytométrie en flux (Figure 7).
- Pour contrôler la prolifération des cellules T au jour 5, tacher les cellules en utilisant des anticorps fluorescents appropriés contre CD4 et éventuellement les CD45.1 et les CD45.2. Analyser la décroissance du signal colorant traceur cellule vitale dans la population CD4 par cytométrie en flux (Figure 8). Plusieurs paramètres peuvent être déterminées dans ces études, telles que le nombre de divisions cellulaires subi par les cellules marquées avec le colorant traceur de cellule vitale, le pourcentage de cellules en Division à chaque pic de fluorescence et le pourcentage de cellules en division dans la cellule opération population.
- Pour déterminer la différenciation Th1 au jour 5, 400 000 cellules de plaque / puits d’une plaque 96 puits dans 200 µL de milieu RPMI complet contenant 1 µM ionomycine et 10 ng/mL phorbol 12 myristate 13 acétate (PMA) pendant 6 h à 37 ° C dans l’incubateur. Pour les dernier 4 h, ajouter 3 à 10 µg/mL bréfeldine A pour bloquer la sécrétion de cytokines au milieu.
- Centrifuger les plaques pendant 5 min à 250 x g à 4 ° C. Jeter le surnageant par retournement de la plaque à 96 puits.
- Répétez l’étape 2.2.2.
- Tacher les membranes cellulaires en incubant pendant 15 min à 4 ° C pour 30 µL de tampon (1 x PBS + 2 mM EDTA + 2 % de BSA) contenant des anticorps de CD4 et éventuellement de CD45.1 et CD45.2 à des dilutions de fabricant-recommandé. Laver les cellules en ajoutant 150 µL de tampon (1 x PBS + 2 mM EDTA + 2 % de BSA) et centrifuger les plaques pendant 5 min à 250 x g à 4 ° C et jeter le surnageant.
- Fixer les cellules en ajoutant 100 µL de saccharose paraformaldehyde/1% 2 % pendant 20 min à RT. centrifuger les plaques pendant 5 min à 1 000 x g et 4 ° C. Jeter le surnageant.
- Permeabilize des cellules en ajoutant 50 µL de tampon de perméabilisation intracellulaire (1 x PBS + 0,1 % de BSA, 0,01 M HEPES, 0,3 % de saponines) et incuber 30 min à 4 ° C.
- Ajouter 150 µL de PBS et centrifuger pendant 5 min à 1 000 x g à RT. jeter le surnageant.
- Détachant des cytokines intracellulaires en ajoutant 30 µL du fluorophore conjugué anti anticorps IFNγ dans un tampon (PBS + 0,1 % de saponines) et incuber 30 min à température ambiante.
- Laver les cellules en ajoutant 150 µL de tampon (PBS + 0,1 % de saponines). Centrifuger les plaques pendant 5 min à 1 000 x g à RT et éliminer le surnageant. Répéter cette étape deux fois.
- Analyser les populations de cellules par cytométrie en flux (Figure 8).
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Representative Results
La figure 1 illustre les étapes décrites dans le présent protocole. La figure 2 illustre l’isolement et la culture de cellules de souris BM. L’ajout de GM-CSF et de LPS à ces cultures permet la génération in vitro et de maturation des DCs. Figure 3 illustre l’analyse de cytométrie en flux de la différenciation et la maturation de la MDD obtenus dérivé de GM-CSF BM de DCs. OVAp-chargé et isolé vital trace colorant coloré T CD4/OTII cellules sont Moutschen transférés à des souris. La figure 4 montre l’emplacement des ganglions lymphatiques utilisé pour l’isolement des cellules T CD4/OTII. La figure 5 montre un tube de 50 mL équipé du filtre de nylon 70 µm et un piston de la seringue utilisée pour homogénéiser les ganglions lymphatiques et la rate. La figure 6 montre l’injection i.v. des cellules T CD4/OTII dans le plexus rétro-orbitaire et injection s.c. de la DCs dérivé de GM-CSF BM OVAp-chargé dans le coussinet plantaire. Les lymphocytes T CD4/OTII distribuent aux différents organes lymphoïdes, tandis que GM-CSF DCs migrent vers les ganglions lymphatiques poplités, où GM-CSF DCs activer des cellules T CD4/OTII naïf par la présentation de OVAp. Les cellules T CD4/OTII naïfs puis prolifèrent et se différencient vers le phénotype Th1. La figure 7 illustre la quantification des naïfs activation des lymphocytes T CD4/OTII de l’analyse de membrane CD69 et l’expression de CD25. La figure 8 montre la quantification de la prolifération des cellules T CD4/OTII. La figure 9 illustre la quantification de la différenciation des cellules T CD4/OTII vers le phénotype Th1.
Figure 1 : schéma de protocole. 1) isoler les cellules BM et souris fémur et le tibia. Dérivées des cellules avec le GM-CSF pour générer le GM-CSF BM BM 2) culture-DCs. 3) différenciation cocher DC et mature GM-CSF BM dérivé-DCs avec LPS. 4) vérifier la maturation des DC. 5) charge DCs avec OVAp. 6) les cellules T CD4/OTII isolats forment la rate de souris. 7) tacher les cellules T CD4/OTII avec colorant traceur cellule vitale. 8) vérifier la pureté d’isolement et la cellule vitale traceur coloration de cellules T CD4/OTII isolées. 9) transfert Moutschen i.v. de cellules T CD4/OTII isolé bénéficiaire chez la souris. 10). Moutschen transfert s.c. DCs OVAp-chargé et ayant subi une maturation à des souris destinataires. 11) vérifier l’activation des lymphocytes T CD4/OTII. 12) vérifier la différenciation et la prolifération des cellules T CD4/OTII. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : processus d’isolement la moelle osseuse du fémur de souris et tibias. (A) incision de la peau avec des ciseaux. (B) retrait de la peau de la branche. (C) musculaire incision avec des ciseaux. (D) enlèvement du muscle de la branche avec un scalpel. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : analyse d’écoulement cytometry de la maturation des DCs dérivé de GM-CSF BM. Expression de MHCII, CD80 et CD86 LPS activés (+ LPS) de la surface et non-activé (-LPS) dérivé de GM-CSF BM DCs. nombres montrent l’intensité de la fluorescence moyenne en unités arbitraires (u.a.). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : emplacement du inguinales, axillaires, brachiales, du col utérin et mésentériques ganglions lymphatiques et la rate des souris. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : expérimentale mise en place de ganglion lymphatique et homogénéisation de la rate. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : transfert adoptif de lymphocytes T CD4/OTII et OVAp-chargé de GM-CSF BM-dérivés-DCs. (A) une injection intraveineuse de cellules T CD4/OTII dans le plexus rétro-orbitaire. (B) une injection sous-cutanée de chargement OVAp dérivé de GM-CSF BM DCs dans le coussinet plantaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Quantification des lymphocytes T activation in vivo. Flow cytometry parcelles et graphique montrant l’analyse et la quantification de l’expression membranaire des CD69 dans les cellules T CD4. CD45.1/CD45.2 souris étaient transférés Moutschen i.v. avec souris CD45.1/CD4/OTII et CD45.1/CD4/OTII des cellules 24h avant le transfert adoptif de l.c. de BM de GM-CSF OVAp-chargé-dérivés-activation des cellules T DCs. a été mesuré à 2 jours post-DC transfert par cytométrie en flux après le marquage avec des anticorps aux antigènes indiquées fluorescentes-tag. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Quantification de prolifération de cellules T in vivo. Flow cytometry parcelles et graphiques montrant l’analyse et la quantification du colorant traceur cellule vitale baisse de coloration dans la prolifération des cellules T CD4. CD45.2 souris étaient i.v. Moutschen transféré avec des cellules de souris CD45.1/CD4/OTII 24h avant le transfert adoptif de l.c. de chargement OVAp GM-CSF BM-dérivés-la prolifération des cellules T DCs. a été mesurée à 5 jours post-DC transfert par cytométrie en flux après coloration avec le indique des anticorps fluorescents. La prolifération des lymphocytes t peut être déterminée en mesurant le pourcentage de cellules en prolifération, le pourcentage de cellules à l’aigle de chaque division, ou en comptant le nombre de pics de division comme indiqué dans les graphiques. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 9 : Quantification de la différenciation des lymphocytes T vers le phénotype Th1 dans vivo. Parcelles de cytométrie en flux et graphiques montrant l’analyse et la quantification du pourcentage de lymphocytes t CD4 exprimant l’IFNγ. CD45.2 souris étaient i.v. Moutschen transféré avec des cellules de souris CD45.1/CD4/OTII 24h avant le transfert adoptif de l.c. de chargement OVAp GM-CSF BM-dérivés-la différenciation des cellules T DCs. a été mesurée à jours post-DC transfert par cytométrie en flux après coloration avec le indique des anticorps fluorescents. La différenciation des cellules t vers le phénotype Th1 a été déterminée que les cellules exprimant l’IFNγ en pourcentage du totales cellules CD4 T et des cellules CD4 T seulement prolifèrent. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce protocole permet la caractérisation de la capacité des dérivés BM DCs pour moduler l’activation, la prolifération et la différenciation des cellules T CD4 naïves. Par ailleurs, également utilisable pour évaluer la sensibilité des cellules T CD4 à modulation par DCs dérivé de BM. Avec ce protocole, les changements dans ces événements peuvent être mesurées en vivo.
Selon l’hypothèse examinée, plusieurs combinaisons de lymphocytes T et les contrôleurs de domaine peuvent être utilisés. Par exemple, on peut analyser les conséquences de frappant dans ou en assommant de gènes spécifiques ou l’efficacité d’un stimulus spécifique d’activation des lymphocytes T CD4, la prolifération ou la différenciation Th1. Ces procédures peuvent être exécutées sur les contrôleurs de domaine ou des lymphocytes T CD4 des cellules ou sur les deux types de cellules. Ainsi, les cellules T CD4 chez des souris de type sauvage ou génétiquement modifiées combinable avec DCs provenant de souris de type sauvage et vice versa.
Ce protocole peut être adapté à distinguer l’origine des populations cellulaires à l’aide de la cytométrie en flux et anticorps anti-CD45.1 et CD45.2. En effet, souris CD45.1/CD45.1 et CD45.2/CD45.2 peuvent être utilisés comme source de tous les types de cellules utilisées ou comme bénéficiaires pour transfert adoptif dans n’importe quelle combinaison. Par exemple, les cellules T CD4 peuvent être obtenues CD45.1/CD45.1/OTII souris tandis que CD45.2/CD45.2 souris peuvent être l’origine de la BM pour la génération de DC. Dans cette expérience, les deux types de cellules peuvent être transférées Moutschen CD45.1/CD45.2 chez la souris. En outre, les cellules T CD4/OTII de CD45.1/CD45.1 tapez une souris et souris de type deux CD45.2/CD45.2 peuvent être combinés chez les receveurs de type trois de CD45.1/CD45.2 identiques ou différents pour comparer le comportement de type un et tapez deux populations de cellules T CD4 pour soutenir la concurrence et non concurrentes des conditions, respectivement.
Cette méthode décrit la génération de MDD dérivé de GM-CSF BM. Cependant, les protocoles alternatifs sont disponibles pour la maturation des DC et différenciation ; par exemple, papaïne peut être utilisée au lieu de LPS ou ligand de kinase 3 de tyrosine axés sur le fms (Flt3-L) au lieu de GM-CSF, permettant l’étude de la capacité des contrôleurs de domaine phénotypiquement distinctes pour activer l’immunité adaptative lymphocytes T CD4 cell. Avec la même intention, DCs pour chargement de l’antigène et la présentation peuvent être directement isolés de souris. Combinaison du présent protocole avec d’autres9 permet de manipuler des naïfs les lymphocytes T CD4/OTII par infection virale16 avant leur transfert adoptif destinataire chez la souris. BM peut être également transduite avec rétrovirus9 pour étudier l’effet des modifications cellulaires contrôlées sur les contrôleurs de domaine avant leur utilisation dans le protocole.
En outre, le présent protocole peut être adapté pour la microscopie intravitale études17 à l’aide de cellules exprimant des protéines fluorescentes. Par exemple, les souris CD4/OTII peuvent être croisés avec souris cherry-exprimant le GFP ou d’obtenir des souris GFP ou cerise/OTII CD4. Ces souris puis peuvent être utilisés comme source de lymphocytes t CD4 et peuvent être combinées avec DCs BM-dérivé de souris GFP-exprimant le cerise ou, au besoin, des expériences in vivo .
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Simon Bartlett pour l’édition anglaise. Cette étude a été financée par des subventions de l’Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (IP14/00526 ; PI17/01395 ; CP11/00145 ; CPII16/00022), le programme de Miguel Servet et la Fundación Ramon Areces ; avec un cofinancement de l’Europeo de Fondo de Desarrollo Regional (FEDER). Le CNIC est pris en charge par le ministère de l’économie, industrie et compétitivité (MEIC) et la Fondation CNIC Pro et est un Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). RTF est fondée par la Fundación Ramon Areces et CNIC, VZG par ISCIII, BHF par Instituto de Investigación Sanitaria hôpital 12 de Octubre (imas12) et JMG-G ISCIII Miguel Servet programme et imas12.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20,824,365 | 5 L |
| Scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14001-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11000-13 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11253-20 | |
| Scalpel | Fine Science Tools (F.S.T.) | 10020-00 | Box of 100 blades |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA | F7524 | |
| Penicillin/streptomycin | LONZA | DE17-602E | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | GIBCO | 21875-034 | |
| Sterile Petri dishes | Falcon | 353003 | |
| 25-gauge needle | BD Microlance 3 | 300600 | |
| 1 ml syringe | Novico | N15663 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 70 μm nylon web filter | BD Falcon | 352350 | |
| Red blood lysis buffer | SIGMA | R7757 | 100 Ml |
| EDTA | SIGMA | ED2SS-250 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | 100 g |
| Trypan blue | SIGMA | 302643-25G | |
| Culture-plates | Falcon | 353003 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Cambrex | BE17-737E | |
| Beta-mercaptoethanol | Merck | 8-05740-0250 | |
| Sodium pyruvate | LONZA | BE13-115E | |
| L-glutamine | LONZA | BE17-605E | |
| Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) | Prepotech | 315-03 | |
| lipopolysaccharide (LPS) | SIGMA-ALDRICH | L2018 | |
| 96-well-plate | Costar | 3799 | |
| v450 anti-mouse CD11b antibody | BD Biosciences | 560455 | |
| PE anti-mouse CD64 antibody | BioLegend | 139303 | |
| PE anti-mouse CD115 antibody | BioLegend | 135505 | |
| FITC anti-mouse CD11c antibody | BioLegend | 117305 | |
| FITC anti-mouse MHCII antibody | BioLegend | 125507 | |
| APC anti-mouse CD86 antibody | BioLegend | 105011 | |
| APC anti-mouse CD80 antibody | BioLegend | 104713 | |
| Flow Cytometry tubes | Zelian | 300800-1 | PS 12X75 5mL |
| OTII Ovoalbumine peptide | InvivoGen | 323-339 | |
| anti-mouse biotinylated CD8α antibody | Tonbo Biosciences | 30-0081-U500 | |
| anti-mouse biotinylated IgM antibody | BioLegend | 406503 | |
| anti-mouse biotinylated B220 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0452-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD19 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0193-U500 | |
| anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody | BioLegend | 115302 | |
| anti-mouse biotinylated CD11b antibody | Tonbo Biosciences | 30-0112-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD11c antibody | BioLegend | 117303 | |
| anti-mouse biotinylated CD44 antibody | BioLegend | 103003 | |
| anti-mouse biotinylated CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0251-U100 | |
| anti-mouse biotinylated DX5 antibody | BioLegend | 108903 | |
| streptavidin-coated magnetic microbeads | MACS Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| Magnetic cell separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-090-976 | QuadroMACS Separator |
| Separation columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| PE anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100408 | |
| APC anti-mouse CD3 antibody | BioLegend | 100235 | |
| FITC anti-mouse CD8 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0081-U025 | |
| Cell Violet Tracer | Thermofisher | C34557 | |
| APC anti-mouse CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0251-U100 | |
| Alexa647 anti-mouse CD69 antibody | BioLegend | 104518 | |
| PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 65-0453 | |
| APC anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0453 | |
| PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 60-0453 | |
| FITC anti-mouse CD45.2 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0454 | |
| Ionomycin | SIGMA-ALDRICH | I0634 | |
| Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) | SIGMA | P8139 | |
| Brefeldin A (BD GolgiPlug) | BD | 555029 | |
| Paraformaldehyde | Millipore | 8-18715-02100 | |
| Intracellular permeabilization buffer | eBioscience | 00-8333 | |
| APC anti-mouse IFNg antibody | Tonbo Biosciences | 20-7311-U100 | |
| Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161-U100 | |
| B6.SJL CD45.1 mice | The Jackson Laboratory | 002014 | |
| BD LSRFortessa™ Cell Analyzer | BD Biosciences | 649225 | |
| DAPI Solution | Thermofisher | 62248 |
References
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