Summary
Burada, bir protokol saf CD4 T hücre (T hücre) etkinleştirme, yayılması ve GM-CSF kemik iliği (BM) tarafından indüklenen Th1 farklılaşma vivo içinde belirlenmesi için mevcut-dendritik hücreler (DC) türetilmiş. Ayrıca, bu iletişim kuralını BM ve T-hücre izolasyon, DC üretimi ve DC ve T hücreli evlat edinen transfer açıklar.
Abstract
Miktar (Th1) saf CD4 T Hücre aktivasyonu, yayılması ve farklılaşma T yardımcı 1 için hücreleri T hücreleri bir bağışıklık yanıtındaki oynadığı rol değerlendirmek için yararlı bir yoldur. Bu iletişim kuralı granülosit makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) türetilmiş-dendritik hücreler (DC) elde etmek için kemik iliği (BM) ataları vitro farklılaşma açıklar. Protokol ayrıca ovalbumin peptid (OVAp) evlat edinen transferini açıklanır-GM-CSF-türetilmiş DCs ve saf CD4 T hücreleri OTII transgenik fareler vivo içinde harekete geçirmek, yayılması ve Th1 farklılaşma çözümlemek amacıyla yüklü Transfer edilen CD4 T hücreleri. Bu iletişim kuralı tamamen in vivo Yöntemler özellikle işlemek veya okudu hücre nüfus seçmek için yetersizlik tarafından dayatılan sınırlandırılması kaçınmanızı sağlar. Ayrıca, bu protokol çalışmaları böylece değişiklikler vitro oluşabilir fonksiyonel etkenler ve hücre tipleri ve sadece olduğu gibi organlarda bulunan diğer faktörlerin etkisi kaçınarak bir in vivo ortamda olanak sağlar. Protokol değişiklikleri DCs içinde oluşturmak için yararlı bir araçtır ve T hücreleri edinilmiş bağışıklık yanıtı, potansiyel olarak kökenli veya çok sayıda bağışıklık ilişkili hastalıkları gelişimi anlamak için önemli sonuçları sağlamanın değiştirin.
Introduction
CD4 T hücreleri ve antijen sunan hücreler (ZPT) DCs gibi bağışıklık mikrobiyal patojenler1,2için gerekli ortam araçları vardır. Periferik lenfoid organlarda CD4 T hücreleri belirli antijenleri ZPT3,4,5tarafından sunulan tanınması üzerine aktif hale gelir. Aktif CD4 T hücreleri çoğalırlar ve doğru edinilmiş bağışıklık yanıtı6,7gelişimi için gerekli olan farklı belirli efektör Th hücrelerine ayırt etmek. Bu işlemlerin kontrolünü zararlı doku hasarı8üretmeden patojen öldürür yeterli bir adaptif savunma üretmek için önemlidir. İnci hücreleri ifade veya yüzey molekülleri, transkripsiyon faktörleri ve efektör sitokinlerin üretimini göre tanımlanır ve önemli ve hassas fonksiyonları yanıt patojenlerin1. Hücre Th1 hücre alt transkripsiyon faktörü T-bahis ve sitokin interferon γ (IFNγ) hızlı ve intrasellüler patojenlerin1karşı ana savunma katılmak. Miktar saf CD4 T Hücre aktivasyonu, yayılması ve Th1 farklılaşma rol T hücreleri oyunda bir bağışıklık yanıtı değerlendirirken yararlı bir araçtır.
Bu iletişim kuralı sağlar içinde vivo çözümleme kapasiteleri için in vitro -BM kaynaklı DCs harekete geçirmek, yayılması ve saf CD4 T hücrelerinin Th1 farklılaşma modüle oluşturulan. İletişim kuralı da saf CD4 T hücreleri aktive, çoğalırlar indüklenen için kapasitesini değerlendirmek için hizmet vermektedir ve Th1 (Şekil 1) farklı. Bu çok yönlü iletişim kuralı yetersizlik özellikle işlemek veya tamamen vivo içinde iletişim kuralları'nda okudu hücre nüfus seçin kaçınmanızı sağlar. Çeşitli moleküller ve DCs tedavisi etkileri genetiği değiştirilmiş fare5 BM kullanarak veya tedavi ya da genetik olarak izole BM hücreleri9manipüle okudu olabilir. Benzer şekilde, T hücre yanıt-e doğru farklı kaynaklardan veya çeşitli manipülasyonlar3,8,10sonra T hücreleri evlat edinen transfer için alma tarafından keşfedilmeyi olabilir.
İki kat bu protokolü başlıca avantajları şunlardır. T Hücre aktivasyonu, yayılmasını önleme ve Th1 farklılaşma bir akış sitometresi yaklaşımla analiz edilir; ve bu böylece vitro oluşabilecek değişiklikler önlenmesi ve hücre tipleri ve sadece sağlam organları11' de bulunan diğer faktörler de dahil olmak üzere in vivo çalışmalar ile birlikte yürür.
Hayati boya kullanımı radyoaktivite kullanımı kaçınırken hücre çoğalması izlemek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Nükleer silahların yayılmasına karşı bu kimyasalları ile ölçüm boya seyreltme hücre bölünmesi sonra temel alır. Ayrıca, bu boyalar birden çok dalga boylarında tespit edilebilir ve kolayca birden çok floresan antikor veya işaretleri ile akış sitometresi tarafından incelenir. Biz bu protokolü yardımcı programını nasıl T Hücre aktivasyonu, yayılmasını önleme ve Th1 farklılaşma akış sitometresi tarafından çözümlenebilir göstererek vurgulayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deneysel prosedürler Fundación Centro Nacional de tarafından onaylanmış Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) ve Comunidad Autonoma de Madrid İspanya ve Avrupa yönergelere uygun olarak. Fare belirli patojen ücretsiz (SPF) koşullarında yetiştirilen ve karbondioksit (CO2) inhalasyon tarafından euthanized.
1. yalıtım yırtılmalarıteşhis ve uyluk fare kemik iliği hücrelerinin
Not: Vahşi tipli C57BL suşlarının CD45.2 veya Ly5.2 olarak bilinen Ptprcb alleli taşıyan ise genellikle CD45.1 veya Ly5.1, olarak tanınan fark lökosit işaretçiyi Ptprcbir, C57BL/6 congenic fare yük taşır. CD45.1 ve CD45.2 türevleri antikorları kullanarak akış sitometresi tarafından ayrılır. CD45.1, CD45.2 ve CD45.1/CD45.2 fareler evlat edinen transfer, farklı hücre popülasyonlarının izlemeyi akış sitometresi tarafından izin için hücre kaynağı olarak ya da alıcı olarak kullanılabilir. Tercihen yaş kullanın- ve seks eşlemeli erkek ya da dişi fareler aşağıda 12 hafta-in yaş.
-
Kalça ve yırtılmalarıteşhis hazırlanması
- Kurumsal hayvan bakımı Komitesi tarafından onaylanmış protokolünü kullanarak fare ötenazi.
- Hind bacaklarda % 70 etanol ile hayvan yüzeye püskürtülerek dezenfekte.
- Steril makas, pens ve neşter kullanın. Bir neşter ile deri bir kesim yapmak ve cilt cilt arka ekstremiteler kapsayan dahil olmak üzere fare distal bölümünden kaldırın. Alt baldır kas çevresindeki deri soyma ve cilt legs--dan tamamen kaldırmak (Şekil 2A, 2B).
- Kuadriseps kas bir neşter kullanarak uyluk ayırın. Kalça eklemi femur başı bozmadan disarticulate. Kasları bir neşter (Şekil 2C, 2D) kullanarak tibia kaldırın. Femur kemik uçları bozmadan tibia ayırın.
- Kemikleri % 10 fetal Sığır serum (FBS) ve % 1 penisilin/streptomisin buz gibi 1 x Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 orta içeren bir petri unutmayın.
-
Hücre izolasyon
Not: Tüm sonraki adımları kirlenmesini önlemek için steril malzeme ile bir kültür başlık altında gerçekleştirilmesi gerekir.- Bir steril Petri dish, dikkatle her kemik bir neşter ile proksimal ve distal ucunun kesti.
- Kemikleri art arda 10 mL sıcak tam RPMI Orta (RPMI + %10 FBS, 2 mM EDTA, % 1 penisilin/streptomisin, 20 mM HEPES, 55 µM 2-mercaptoethanol, 1 mM sodyum pyruvate ve 2 mM L-glutamin) toplam hacmi ile yıkayın. Kemikler için 1 mL şırınga bağlı 25 G iğne kullanarak her iki uçtan sifonu çek.
- Effluate 70 µm naylon web filtre ile donatılmış bir 50 mL konik tüp aktarın. Dikkatli bir şekilde enkaz ve hücre ikinci büyük şirketler nazik karıştırma ve pipetting tarafından çıkarmak.
- Hücre süspansiyon vasıl 250 x g (RT) Oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj kapasitesi.
- Hücre pelet 1 ml soğuk kırmızı kan hücre lizis arabellek (0.15 M NH4Cl + 1 mM KHCO3 + 0,1 mM EDTA, ayarlanan pH 7.2 ile 1 N HCl, filtre ve 4 ° C'de depolanan 0.4 µm steril için) resuspend. Buz 5 min için sallayarak el ile korumak.
- 10 mL soğuk arabellek (fosfat tamponlu tuz (PBS) + 2 mM EDTA + % 2 sığır serum albumin (BSA) x 1) devre dışı bırakın ve kırmızı kan hücre lizis arabellek yıkamak için ekleyin.
- Hücre süspansiyon 250 x g 4 ° C'de 5 min için de santrifüj kapasitesi
- Hücreleri 25 mL tam RPMI orta ve 4 ° C'de 5 min için 250 x g , santrifüj ile yıkayın
- 5 mL tam RPMI orta de hücrelerde resuspend. Mix 50 µL hücre süspansiyon 1: trypan mavi ile 1. Mikroskop altında bir sayım odasında cep numarasını belirleyin. Formülü kullanarak hücre sayıları: hücre/mL = [(sigara lekeli hücre sayısı/4) 2 x 10.000 x]12.
Not: Bu yöntem verimi 40 x 10-6 60 x 106 kemik iliği hücre bulaşmamış 8-12 haftalık C57BL/6 fare başına. - Hücre süspansiyon 250 x g 4 ° C'de 5 min için de santrifüj kapasitesi
2. DC farklılaşma, olgunlaşma ve Antigen yükleme
-
BM hücre hasat
- Ultra düşük 6-şey-ek yüzey plakaları, orta, genellikle iyi başına 5 mL mL başına 106 hücre tam kültür tohum. Farklılaştırılmış makrofajlar kültür plakayı eklemek olacaktır. 12 saat sonra monosit 6-şey kaplamalar, yapıştırılan makrofajlar ile eski 6-şey tabak atarak temizlemek için esas olarak içeren süpernatant, aktarın.
- Yapışık olmayan hücreleri genellikle 5 mL 20 ng/mL rekombinant fare GM-CSF 37 ° C ve %5 karbondioksit (CO2), ticari olarak elde içeren tam RPMI orta kuyu başına mL başına 5 x 105 hücre, hücre farklılaşması teşvik etmek, kültür ve Her gün gözlemlemek.
- 3 günde, askıya alınan hücre aşağı spin ve 5 mM EDTA PBS ile yapışık hücreleri toplamak ve spin aşağı. Birleştirmek ve 5 x 105 hücre/mL taze orta 20 ng/mL rm-GM-CSF içeren, resuspend.
- Günde 8, yukarıdaki gibi yapışık ve müstakil hücreleri toplamak ve bir doku kültürü tedavi steril Petri yüksek MHC-II ikna etmek için tabak, 24 h için 5 x 105 hücre/mL orta içeren 20 ng/ml GM-CSF ve 20 ng/mL lipopolysaccharide (LPS) resuspend , CD80 ve CD86 ifade.
- 2.2. adımda gösterildiği gibi akış sitometresi tarafından onay DC farklılaşma.
-
Akış Sitometresi farklılaşma ve olgunlaşma analizi.
- Hücre süspansiyon 250 x g 4 ° C'de 5 min için de santrifüj kapasitesi Bu iki kez tekrarlayın.
- Resuspended hücre Pelet fare Fc reseptör engelleyici (fare CD16/CD32 IgG2b antikor saf) üretici yönergelerine göre 4 ° C'de 15 dakika içinde kuluçka tarafından blok Fc reseptörleri.
- Hücre süspansiyon 250 x g 4 ° C'de 5 min için de santrifüj kapasitesi
- Akış Sitometresi arabelleği (1 x PBS + 2 mM EDTA + % 2 BSA) 4 ° C'de 300 µL 250.000 hücrelerde her sonda için resuspend
- Hücre çözümü de başına 30 µL bir 96-iyi-tabağa aktarın.
- Hücre süspansiyon 250 x g 4 ° C'de 5 min için de santrifüj kapasitesi
- Süpernatant atmak ve antikor içeren 30 µL eklemek her üreticinin göstergeler iyi takip için arabellek. 4 ° C'de 20 dk antikor hücrelerle kuluçkaya
Not: Genellikle istihdam işaretçileri için DCs, monosit ve makrofajlar CD11b, CD64, CD115, CD11c, MHCII, CD80 ve CD86 vardır (Şekil 3). - 250 x g 4 ° C'de 5 min için de örnekler santrifüj kapasitesi ve ölü hücreleri (Örneğin, propidium iyodür, ' 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) veya bir amin-reaktif boya dışlamak için bir işaretleyici içeren soğuk akış sitometresi arabellek kuyu başına 200 µL resuspend ) üreticinin tavsiye edilen konsantrasyon13.
- Akış Sitometresi tüpler için örnekleri aktarıp, 0, 3, 6 ve 9 gün ölü hücreleri hariç akış sitometresi çözümlemesini hücre farklılaşması izlemek.
-
DC Antigen yükleme.
- 8 günde 250 x g 4 ° C'de 5 min için de örnekler santrifüj kapasitesi ve granül 200 µL orta resuspend (RPMI + % 10 FBS antibiyotikler olmadan). Bu iki kez tekrarlayın.
- DCs 10 µg/mL OVAp (323-339; ile kuluçkaya ISQAVHAAHAEINEAGR) başına 1 x 107 DCs'Orta 1 mL (RMPI + %1 FBS) için en az 30 dk. 37 ° C'de bir plastik tüp DCs sigara OVAp yüklü bir negatif kontrol koşulu olarak kullanın.
- 250 x g 4 ° C'de 5 min için de örnekler santrifüj kapasitesi ve granül 200 µL tam RPMI orta resuspend. Bu iki kez tekrarlayın.
- 250 x g 4 ° C'de 5 min için de örnekler santrifüj kapasitesi ve granül 200 µL orta resuspend (RPMI + % 10 FBS), 2 x 106 hücre/mL.
3. yalıtım saf CD4 T hücre OTII fareler
Not: Bu yöntem yaklaşık 100 x 106 spleenocytes bulaşmamış 8 başına 12 haftalık C57BL/6 fare için verir. Kadın ve erkek kullanılabilir. CD4 T hücreleri dalak veya lenf düğümleri ayrılmış olabilir; CD4 T hücreleri sırasıyla yaklaşık % 25 ve % 50'sini bu organlar, hücreler için hesap. Steril koşullarda aşağıdaki adımları.
- Kasık, aksiler, brakiyal, servikal ve mezenterik lenf düğümleri ve dalak OTII transgenik fareler (Şekil 4) dan izole etmek ve plastik bir Petri kabına 10 mL tam RPMI orta içeren aktarabilirsiniz.
- Hücre süzgeç tam RPMI Orta 2 mL ile durulayın ve 50 mL tüp sizden çıkarın. Transfer lenf düğümleri ve dalak bir 70 µm hücre süzgeç için bir 50 mL tüp yerleştirilir. Enjektör pompası (Şekil 5) kullanarak homojenize ve orta eklemek ilâ 15 mL.
- 250 x g 4 ° C'de 5 min için de örnekler santrifüj kapasitesi ve Pelet 15 mL tam RPMI orta resuspend. Bu iki kez tekrarlayın.
- Dalak hücre süspansiyon, hücre Pelet resuspend ve 1.2.5 adımda gösterildiği gibi kırmızı kan hücreleri parçalayıcı.
- Hücre süspansiyon 250 x g 4 ° C'de 5 min için de santrifüj kapasitesi
- Tam RPMI orta ve santrifüj 250 x g , RT, 5 min için 25 mL hücrelerle yıkama
- 5 mL orta de hücrelerde resuspend. Hücre süspansiyon 1:1 50 µL Trypan mavi ile karıştırın. Mikroskop altında bir sayım odası kullanarak cep numarasını belirleyin. Formülü kullanarak hücre sayıları: hücre/mL = [(sigara lekeli hücre sayısı/4) 2 x 10.000 x]12.
- 2.2.2 arasındaki adımları yineleyin.
- Üreticinin yönergeleri izleyerek, 1:800 dilutions için buz CD4 T hücrelerinin daha sonra negatif seçim için 30 dk CD8α, IgM, B220, CD19, MHCII (ı-Ab), CD11b, CD11c, CD44, CD25 ve DX5 biotinylated antikorların hücrelerle kuluçkaya.
- Aşağıdaki prosedürü yerine getirin ve hücre sayısı ve boncuk kapasitesine bağlı olarak, manyetik lastikteki streptavidin kaplı, gerekli miktarı ve izole bir manyetik hücre ayırıcı ve uygun kullanarak CD4 T hücreleri ayrılık sütunlar.
- 5 mL tam RPMI orta de hücrelerde resuspend ve 3.7 adımda anlatıldığı gibi canlı hücre sayım sırasında buz üzerinde tutun.
- 2 x 105 hücreleri ayıklamak için ve saflık CD4, CD3, B220 ve CD8 anti floresan antikor antikor dilutions üretici tavsiye kullanarak akış sitometresi kullanarak toplanan hücre kontrol.
- İzole saf CD4/OTII T hücrelerinin leke için 106 hücre içinde 500 µL tampon (1 x PBS + 2 mM EDTA + % 2 BSA) resuspend. Hazırlamak 500 µL arabellek (1 x PBS + 2 mM EDTA + % 2 BSA) içeren çift son üretici tarafından tavsiye edilen konsantrasyon hayati hücre izleyici boya. Her iki çözüm de yavaş yavaş hücre süspansiyon hücre izleme çözümü ekleyerek karıştırın. 37 ° C'de 5 min için hücreleri kuluçkaya
- 5 mL tam RPMI orta ve 4 ° C'de 5 min için 250 x g, santrifüj hücrelerle yıkama Bu iki kez tekrarlayın. 1 mL 1 x 107hücre/mL, tam RPMI orta hücrelerde resuspend.
4. Vivo içinde harekete geçirmek, yayılmasını önleme ve Th1 farklılaşma tahlil
Not: Hayati hücre izleyici boya carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) ve hangi heyecan ve farklı dalga boylarında, floresans yayarlar, diğer succinimidyl ester-esaslı boya, yaygın olarak lenfosit proliferasyonu değerlendirmek için akış tarafından kullanılmaktadır sitometresi dolay iden onların yüksek floresan yoğunluğu, uzun ömürlü, düşük değişkenliği ve düşük toksisite14.
- Adoptively intravenöz (IV) 1 x 106 canlı hayati hücre izleyici boya lekeli saf CD4/OTII T hücrelerinde PBS 100 µL fare başına aktarın. Etiketli T hücreleri adoptively kuyruk ven veya retro-orbital enjeksiyon15tarafından transfer edilebilir; Her iki durumda da, hücrelerin lenfoid organlara (Şekil 6A) ev.
- Alıcı fareler bir gün sonra adoptively 100.000 LPS olgunlaştı OVAp yüklü DCs Subkutan Enjeksiyon (sı) ayakları (Şekil 6B) tarafından transfer ederek meydan okuyorum.
- Alıcı fareler popliteal lenf düğümlerinden hasat ve onları tek hücre süspansiyonlar 3.1 ve 3.2 daha önce açıklanan adımları izleyip elde kadar süreç. Bunu CD4/OTII T Hücre aktivasyonu ölçmek için 2 gün sonrası aşılama ve günde 5 nükleer silahların yayılmasına karşı artı Th1 farklılaşma ölçmek için.
- T Hücre aktivasyonu günde 2 analiz etmek, leke CD4, CD69 ve CD25 karşı Floresan antikor içeren hücreleri (isteğe bağlı olarak CD45.1 ve CD45.2) ve C69 yüzdesini belirlemek+CD25+ T hücreleri CD4 nüfus. Akış Sitometresi (Şekil 7) tarafından analiz.
- T hücre çoğalması günde 5 denetlemek için hücreleri CD4 ve isteğe bağlı olarak CD45.1 ve CD45.2 karşı uygun floresan antikor kullanarak leke. Hayati hücre izleyici boya sinyal CD4 nüfus çürüme akış sitometresi (Şekil 8) tarafından analiz. Birkaç parametre hücre hayati hücre izleyici boya, her floresans Peak sayesinde bunun bölünen hücreler yüzdesi ve toplam hücresindeki sayesinde bunun bölünen hücreler yüzdesi ile etiketli hücreleri tarafından geçirmiş bölünmeler sayısı gibi bu çalışmalarda belirlenebilir nüfus.
- Bir 96-şey tabak içinde 200 µL 1 µM ionomycin ve 10 ng/mL phorbol 12 myristate 13 asetat (PMA) için kuluçka 37 ° c 6 h içeren tam RPMI orta kuyu başına plaka 400.000 hücre Th1 farklılaşma günde 5, belirlemek için. Son 4 h için 3-10 µg/mL brefeldin sitokin salgısının orta engellemek için A ekleyin.
- Plakalar için 250 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant 96-şey plaka hızlı INVERSION tarafından atmak.
- 2.2.2 arasındaki adımları yineleyin.
- Hücre zarları 30 µL 4 ° C'de 15 dakika antikorların arabellek (1 x PBS + 2 mM EDTA + % 2 BSA) içeren CD4 ve isteğe bağlı olarak CD45.1 ve CD45.2 için üretici tarafından önerilen dilutions, kuluçka leke. Hücreleri arabelleği (1 x PBS + 2 mM EDTA + % 2 BSA) 150 µL ekleyerek yıkayın ve plakalar için 250 x g 4 ° c de 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
- Hücreleri RT. santrifüj % 2 paraformaldehyde/1% sükroz 20 dk için 100 µL ekleyerek düzeltmek plakalar için 1000 x g de 5 min ve 4 ° c Süpernatant atmak.
- Hücre içi permeabilization arabelleği (1 PBS + %0,1 BSA, 0.01 M HEPES, % 0.3 saponin x) 50 µL ekleyerek hücreleri permeabilize ve 4 ° C'de 30 dk için kuluçkaya
- PBS ve 5 min için santrifüj 150 µL RT. atma süpernatant de 1000 x g ekleyin.
- Hücre içi sitokinler (PBS + %0,1 saponin) bir arabellek fluorophore IFNγ antikor anti Birleşik, 30 µL ekleyerek leke ve RT., 30 dk için kuluçkaya
- Hücreleri arabelleği (PBS + %0,1 saponin) 150 µL ekleyerek yıkayın. Plakayı de RT 1000 x g , 5 min için santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Bu iki kez tekrarlayın.
- Hücre popülasyonlarının akış sitometresi (Şekil 8) tarafından analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 bu protokol için açıklanan adımları gösterilmektedir. Şekil 2 yalıtım ve fare BM hücre kültür gösterilmektedir. GM-CSF ve LPS eklenmesi için bu kültürler vitro üretimi sağlar ve farklılaşma Akış Sitometresi Analizi ve elde edilen DCs. OVAp yüklü GM-CSF BM kaynaklı DCs olgunlaşma DCs. Şekil 3 olgunlaşma gösterilmektedir ve izole hayati hücre izleme boya lekeli CD4/OTII T hücrelerinin adoptively fareler için transfer edilir. Şekil 4 CD4/OTII T hücrelerinin yalıtımı için kullanılan lenf düğümleri konumunu gösterir. Şekil 5 70 µm naylon filtre ile donatılmış bir 50 mL tüp ve dalak ve lenf bezleri homojenize için kullanılan enjektör pompası gösterir. Şekil 6 retro-orbital pleksus içine CD4/OTII T hücrelerinin damardan enjeksiyon ve OVAp yüklü GM-CSF BM kaynaklı DCs SC enjeksiyon footpad içine gösterir. GM-CSF DCs popliteal lenf düğümleri nerede GM-CSF DCs saf CD4/OTII T hücrelerinin OVAp tanıtımı tarafından etkinleştirmek için göç ise CD4/OTII T hücrelerinin farklı lenfoid organlar için dağıtmak. Saf CD4/OTII T hücrelerinin sonra çoğalırlar ve Th1 fenotip doğru ayırt etmek. Şekil 7 saf CD4/OTII T Hücre aktivasyonu membran CD69 analiz miktar ve CD25 ifade göstermektedir. Şekil 8 CD4/OTII T hücre çoğalması miktar gösterir. Şekil 9 CD4/OTII T hücre farklılaşması Th1 fenotip doğru miktar göstermektedir.
Şekil 1: protokol düzeni. 1) BM hücreleri fare kalça ve yırtılmalarıteşhis izole et. GM-CSF BM oluşturmak için GM-CSF hücrelerle 2) kültür BM türetilen-DCs. 3) onay DC farklılaşma ve olgun GM-CSF BM türetilen-DCs LPS ile. 4) DC olgunlaşma kontrol edin. 5) OVAp ile yük DCs. 6) CD4/OTII T hücreleri formu fare dalak izole et. 7) CD4/OTII T hücreleri hayati hücre izleyici boya leke. 8) yalıtım saflık ve hayati hücre izleyici izole CD4/OTII T hücrelerinin boya boyama kontrol edin. 9) adoptively izole CD4/OTII T hücreleri damardan alıcı fareler için transfer. 10). adoptively OVAp-yüklü ve olgunlaştı DCs SC alıcı fareler için transfer. 11) onay CD4/OTII T Hücre aktivasyonu. 12) CD4/OTII T hücre çoğalması ve farklılaşma kontrol edin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: kemik iliği yalıtım işleminden fare kalça ve yırtılmalarıteşhis. (A)cilt kesi makasla. (B) lime derinin çıkarılması. (C) kas kesi makasla. Kas bir neşter ile lime (D) kaldırma. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Akış Sitometresi Analizi GM-CSF BM kaynaklı DCs olgunlaşma. Yüzey MHCII, CD80 ve CD86 aktive LPS (+ LPS) ifadesi ve sigara-harekete geçirmek (-LPS) GM-CSF BM kaynaklı DCs. numaralarını göster ortalama floresans yoğunluğu rasgele birimlerinde (yapıyordum). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: kasık, aksiler, brakiyal, servikal ve mezenterik lenf düğümleri ve dalak farelerde konumunu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: lenf nodu ve dalak homojenizasyon için deneysel kurmak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: evlat edinen devri CD4/OTII T hücreleri ve OVAp yüklü GM-CSF BM-türetilen-DCs. (A)İntravenöz enjeksiyon CD4/OTII T hücrelerinin retro-orbital pleksus içine. (B) Subkutan Enjeksiyon GM-CSF BM kaynaklı DC'lerin OVAp yüklenen footpad içine. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: T hücre harekete geçirmek içinde vivoQuantification. Akış Sitometresi araziler ve analiz ve CD69 membran ifade miktar CD4 T hücreleri gösteren grafik. CD45.1/CD45.2 fareler fare CD45.1/CD4/OTII ve CD45.1/CD4/OTII hücreleri OVAp yüklü GM-CSF BM SC evlat edinen transferi önce 24 h ile adoptively transfer edilen serum vardı-türetilen-DCs. T Hücre aktivasyonu 2 gün sonrası-DC adlı ölçülen havalesi ile akış sitometresi Floresan öğesini antikorlar belirtilen antijenleri ile boyama sonra. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8: T hücre proliferasyonu içinde vivoQuantification. Akış Sitometresi araziler ve analiz ve Proliferasyona CD4 T hücreleri boyama düşüş hayati hücre izleyici boya miktar gösteren grafikler. CD45.2 fareler fare CD45.1/CD4/OTII hücrelerle GM-CSF BM OVAp dolu SC evlat edinen transferi önce 24 h adoptively transfer edilen serum vardı-türetilen-DCs. T hücre çoğalması 5 gün mesaj-DC adlı ölçülen havalesi ile boyama sonra akış sitometresi ile Floresan antikor belirtti. T hücre çoğalması Proliferasyona hücreleri, hücre her bölümü Peak yüzdesi yüzdesi ölçüm veya grafiklerde gösterildiği gibi bölünme doruklarına sayılması belirlenebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 9: miktar T hücre farklılaşma Th1 fenotip vivo içindedoğru. Akış Sitometresi araziler ve analiz ve miktar IFNγ ifade CD4 T hücreleri yüzdesini gösteren grafikler. CD45.2 fareler fare CD45.1/CD4/OTII hücrelerle GM-CSF BM OVAp dolu SC evlat edinen transferi önce 24 h adoptively transfer edilen serum vardı-türetilen-DCs. T hücre farklılaşması gün sonrası-DC adlı ölçülen havalesi ile boyama sonra akış sitometresi ile Floresan antikor belirtti. T hücre farklılaşması Th1 fenotip doğru toplam CD4 T hücrelerinin ve sadece Proliferasyona CD4 T hücrelerinin yüzde olarak IFNγ ifade hücreler olarak tespit edilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı etkinleştirme, yayılması ve saf CD4 T hücrelerinin farklılaşma modüle için BM kaynaklı DCs kapasitesini karakterizasyonu için izin verir. Ayrıca, aynı zamanda CD4 T hücrelerinin modülasyonu karşı hassasiyeti değerlendirmek için BM kaynaklı DC'ler tarafından kullanılabilmesi için. Bu iletişim kuralı ile ölçülen vivo içindebu olaylar değişimler olabilir.
Soruşturma altında hipotez bağlı olarak, T hücreleri ve DCs çeşitli bileşimleri kullanılabilir. Örneğin, bir de vurma veya belirli genler veya CD4 T Hücre aktivasyonu, nükleer silahların yayılmasına karşı veya Th1 farklılaşma belirli bir uyarıcı verimliliğini knocking sonuçlarını çözümleyebilirsiniz. Bu yordamları DCs veya CD4 T gerçekleştirilen hücreler veya her iki hücre tipleri. Böylece, vahşi-türü ya da genetik olarak değiştirilmiş fare CD4 T hücrelerden vahşi tipi fareler veya tersi türetilmiş DCs ile kombine edilebilir.
Bu iletişim kuralının akış sitometresi ve CD45.1 ve CD45.2 karşı antikor kullanarak farklı hücre popülasyonlarının kökeni ayırt etmek için adapte edilebilir. Gerçekten de, CD45.1/CD45.1 ve CD45.2/CD45.2 fareler kaynağı olarak kullanılan hücre türlerinden herhangi birini veya alıcıları olarak istediğiniz şekilde evlat edinen transfer için kullanılabilir. Örneğin, CD45.2/CD45.2 fareler DC üretimi için BM kökeni olabileceği CD4 T hücreleri CD45.1/CD45.1/OTII fareler elde edilebilir. Bu deneyde, her iki hücre tipleri adoptively CD45.1/CD45.2 fareler için transfer edilebilir. Ayrıca, CD45.1/CD45.1 CD4/OTII T hücrelerden bir fare yazın ve CD45.2/CD45.2 tip iki fare türünün bir davranışını karşılaştırmak ve rekabet içinde iki CD4 T hücre popülasyonlarının yazın aynı veya farklı CD45.1/CD45.2 türü üç alıcı olarak kombine edilebilir ve olmayan rekabet koşulları, anılan sıraya göre.
Bu yöntem GM-CSF BM kaynaklı DCs nesil açıklar. Ancak, DC olgunlaşma, farklılaşma için alternatif protokolleri mevcuttur. Örneğin, papain LPS veya fms ile ilgili Tirozin kinaz 3 ligand (Flt3-L) GM-CSF, CD4 T hücre edinilmiş bağışıklığın etkinleştirmek için phenotypically farklı DCs kapasitesini çalışma izin yerine yerine kullanılabilir. Aynı niyeti ile DCs antigen yükleme ve sunum için olabilir doğrudan fareler izole. Birlikte bu protokol ile diğer9 saf manipülasyon CD4/OTII T hücreleri viral enfeksiyon16 önce alıcı farelere evlat edinen transfer sağlar. BM de kullanımları protokolündeki önce DCs üzerinde kontrollü hücre değişiklikleri etkisini incelemeye retrovirüsler9 ile transduced.
Ayrıca, bu iletişim kuralını floresan hücreleri protein ifade kullanarak intravital mikroskopisi çalışmaları17 için adapte edilebilir. Örneğin, CD4/OTII fareler fare ile GFP veya kiraz ifade GFP veya kiraz/OTII CD4 fare almak için geçti. Bu fareler daha sonra CD4 T hücreleri kaynağı olarak kullanılabilir ve in vivo deneyler BM kaynaklı DCs gelen fare, gerektiğinde, kiraz veya GFP ifade ile kombine edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa yoktur
Acknowledgments
Dr. Simon Bartlett İngilizce düzenleme için teşekkür ediyoruz. Bu çalışmada: Instituto de hibe tarafından desteklenmiştir Salud Carlos III (ISCIII) (PI14/00526; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), Miguel Servet Program ve Fundación Ramón Areces; Fondo Europeo de Desarrollo bölgesel (FEDER) ortak fon ile. CNIC Ekonomi Bakanlığı, sanayi ve rekabet (MEIC) ve Pro CNIC Foundation tarafından desteklenen ve bir Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505) olduğunu. RTF Fundación Ramón Areces ve CNIC, VZG ISCIII, Instituto de birimi BHF tarafından kurulan Investigación Sanitaria hastane 12 de Octubre (imas12) ve JMG-G ISCIII Miguel Servet Program ve imas12.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20,824,365 | 5 L |
| Scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14001-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11000-13 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11253-20 | |
| Scalpel | Fine Science Tools (F.S.T.) | 10020-00 | Box of 100 blades |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA | F7524 | |
| Penicillin/streptomycin | LONZA | DE17-602E | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | GIBCO | 21875-034 | |
| Sterile Petri dishes | Falcon | 353003 | |
| 25-gauge needle | BD Microlance 3 | 300600 | |
| 1 ml syringe | Novico | N15663 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 70 μm nylon web filter | BD Falcon | 352350 | |
| Red blood lysis buffer | SIGMA | R7757 | 100 Ml |
| EDTA | SIGMA | ED2SS-250 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | 100 g |
| Trypan blue | SIGMA | 302643-25G | |
| Culture-plates | Falcon | 353003 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Cambrex | BE17-737E | |
| Beta-mercaptoethanol | Merck | 8-05740-0250 | |
| Sodium pyruvate | LONZA | BE13-115E | |
| L-glutamine | LONZA | BE17-605E | |
| Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) | Prepotech | 315-03 | |
| lipopolysaccharide (LPS) | SIGMA-ALDRICH | L2018 | |
| 96-well-plate | Costar | 3799 | |
| v450 anti-mouse CD11b antibody | BD Biosciences | 560455 | |
| PE anti-mouse CD64 antibody | BioLegend | 139303 | |
| PE anti-mouse CD115 antibody | BioLegend | 135505 | |
| FITC anti-mouse CD11c antibody | BioLegend | 117305 | |
| FITC anti-mouse MHCII antibody | BioLegend | 125507 | |
| APC anti-mouse CD86 antibody | BioLegend | 105011 | |
| APC anti-mouse CD80 antibody | BioLegend | 104713 | |
| Flow Cytometry tubes | Zelian | 300800-1 | PS 12X75 5mL |
| OTII Ovoalbumine peptide | InvivoGen | 323-339 | |
| anti-mouse biotinylated CD8α antibody | Tonbo Biosciences | 30-0081-U500 | |
| anti-mouse biotinylated IgM antibody | BioLegend | 406503 | |
| anti-mouse biotinylated B220 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0452-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD19 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0193-U500 | |
| anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody | BioLegend | 115302 | |
| anti-mouse biotinylated CD11b antibody | Tonbo Biosciences | 30-0112-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD11c antibody | BioLegend | 117303 | |
| anti-mouse biotinylated CD44 antibody | BioLegend | 103003 | |
| anti-mouse biotinylated CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0251-U100 | |
| anti-mouse biotinylated DX5 antibody | BioLegend | 108903 | |
| streptavidin-coated magnetic microbeads | MACS Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| Magnetic cell separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-090-976 | QuadroMACS Separator |
| Separation columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| PE anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100408 | |
| APC anti-mouse CD3 antibody | BioLegend | 100235 | |
| FITC anti-mouse CD8 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0081-U025 | |
| Cell Violet Tracer | Thermofisher | C34557 | |
| APC anti-mouse CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0251-U100 | |
| Alexa647 anti-mouse CD69 antibody | BioLegend | 104518 | |
| PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 65-0453 | |
| APC anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0453 | |
| PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 60-0453 | |
| FITC anti-mouse CD45.2 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0454 | |
| Ionomycin | SIGMA-ALDRICH | I0634 | |
| Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) | SIGMA | P8139 | |
| Brefeldin A (BD GolgiPlug) | BD | 555029 | |
| Paraformaldehyde | Millipore | 8-18715-02100 | |
| Intracellular permeabilization buffer | eBioscience | 00-8333 | |
| APC anti-mouse IFNg antibody | Tonbo Biosciences | 20-7311-U100 | |
| Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161-U100 | |
| B6.SJL CD45.1 mice | The Jackson Laboratory | 002014 | |
| BD LSRFortessa™ Cell Analyzer | BD Biosciences | 649225 | |
| DAPI Solution | Thermofisher | 62248 |
References
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).
- Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. Orchestrating Lymphocyte Polarity in Cognate Immune Cell-Cell Interactions. International Review of Cell and Molecular Biology. 327, 195-261 (2016).
- Gonzalez-Granado, J. M., et al. Nuclear envelope lamin-A couples actin dynamics with immunological synapse architecture and T cell activation. Science Signaling. 7 (322), ra37 (2014).
- Rocha-Perugini, V., Gonzalez-Granado, J. M. Nuclear envelope lamin-A as a coordinator of T cell activation. Nucleus. 5 (5), 396-401 (2014).
- Rocha-Perugini, V., et al. CD9 Regulates Major Histocompatibility Complex Class II Trafficking in Monocyte-Derived Dendritic Cells. Molecular and Cellular Biology. 37 (15), (2017).
- Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nature Reviews Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).
- Iborra, S., Gonzalez-Granado, J. M. In Vitro Differentiation of Naive CD4(+) T Cells: A Tool for Understanding the Development of Atherosclerosis. Methods in Molecular Biology. 1339, 177-189 (2015).
- Toribio-Fernandez, R., et al. Lamin A/C augments Th1 differentiation and response against vaccinia virus and Leishmania major. Cell Death & Disease. 9 (1), 9 (2018).
- Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. Journal of Visualized Experiments. (113), (2016).
- Cruz-Adalia, A., et al. Conventional CD4(+) T cells present bacterial antigens to induce cytotoxic and memory CD8(+) T cell responses. Nature Communications. 8 (1), 1591 (2017).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of Visualized Experiments. (88), e51627 (2014).
- Cruz-Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., Torres-Torresano, M., Garcia-Ferreras, R., Veiga Chacon, E. T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells. Journal of Visualized Experiments. (107), e52976 (2016).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584-1797 (2017).
- Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. Journal of Immunological Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animals (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
- Warth, S. C., Heissmeyer, V. Adenoviral transduction of naive CD4 T cells to study Treg differentiation. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Liou, H. L., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
