Summary
小鼠闭合性股骨骨折模型是研究骨折愈合的有力平台, 是加速骨再生的新的治疗策略。这项手术的目的是在小鼠中产生单侧闭合性股骨骨折, 用髓内钢棒稳定股骨。
Abstract
骨骨折给病人带来了巨大的社会经济负担, 除了严重影响他们的生活质量。促进有效骨愈合的治疗策略是不存在和高需求的。为了了解与骨再生相关的复杂生物过程, 需要有效和可再生的骨折愈合动物模型。许多动物模型的骨折愈合已经产生了多年;然而, 小鼠骨折模型最近成为研究骨愈合的有力工具。各种开放和封闭的模型已经开发, 但闭合性股骨骨折模型突出作为一个简单的方法, 以产生快速和重现性的结果, 在生理上相关的方式。该手术方案的目的是在小鼠中产生单边闭合性股骨骨折, 并通过插入髓内钢棒促进股骨骨折后稳定。虽然诸如钉子或螺钉等设备提供了更大的轴向和旋转稳定性, 但使用髓内棒可以为一致愈合结果提供足够的稳定, 而不会产生新的骨组织缺陷或损害附近的软组织。影像学是用来监测愈伤组织的形成, 骨愈合, 并随后重塑骨痂的进展。骨愈合的结果通常与愈合的骨强度和测量的扭转试验。然而, 了解骨折修复相关的早期细胞和分子事件是研究骨组织再生的关键。髓内固定小鼠闭合性股骨骨折模型是研究骨折愈合的一个有吸引力的平台, 并对加速愈合的治疗策略进行评价。
Introduction
骨折是肌肉骨骼系统中最常见的损伤之一, 与巨大的社会经济负担有关, 包括预计在美国每年超过250亿美元的治疗费用1, 2。虽然大多数骨折愈合无事故, 愈合与大量停机和生产力损失。大约 5-10% 的骨折导致延迟愈合或不愈合, 由于年龄或其他基本的慢性健康状况, 如骨质疏松症和糖尿病3,4,5。目前尚无 FDA 批准的药理治疗, 可促进有效的骨愈合, 缩短恢复时间。
骨折愈合是一个复杂和高度动态的过程, 涉及多种细胞类型的协调。因此, 全面了解与骨再生相关的细胞和分子事件, 对于确定加速这一过程的治疗目标至关重要。与其他人类疾病一样, 建立一个高度顺从和可再生的动物模型是研究骨愈合的关键。较大的动物, 如绵羊和猪, 有骨重塑的性质和生物力学类似于人类, 但昂贵, 需要大量的愈合时间, 并不容易服从基因操纵6。另一方面, 小动物模型, 如大鼠和小鼠, 提供了许多好处, 包括易于处理, 维护成本低, 繁殖周期短, 愈合时间缩短7。此外, 鼠标基因组是完全有序的, 允许快速操作和生成的遗传变异。因此, 鼠标是一个强大的模型系统, 研究人类疾病, 伤害和修复8。在人类中, 像骨质疏松症和糖尿病这样的并发症增加了延迟愈合的可能性。现有的一些小鼠模型可以用来研究骨质疏松症和糖尿病并发症对骨损伤和愈合的影响。患有骨质疏松症的患者在骨折愈合后的晚期骨形成明显减少9。去卵巢 (OVX) 小鼠表现出快速骨丢失和延迟骨愈合类似于绝经后骨质疏松症10,11。此外, 许多类型的 I 型和 II 型糖尿病的小鼠模型模仿的低骨质量表表和受损骨折愈合在人类看到11。此外, 小鼠骨折模型是研究愈伤组织复杂生物过程的多功能平台, 探索加速骨组织再生的新的治疗策略。
尽管骨结构和新陈代谢有差异, 但在小鼠和人类中, 骨折愈合的整个过程仍然非常相似, 包括软骨和膜内骨化的结合, 然后是骨重塑。软骨骨化包括招募祖细胞到较不机械稳定的区域周围的骨折间隙, 他们分化成软骨细胞, 肥大和矿化软骨产生柔软的愈伤组织。第二波祖细胞浸润愈伤组织, 分化为成熟的成骨细胞, 分泌新的骨基质12,13,14,15。在膜内骨化过程中, 骨膜和骨内表面的祖细胞直接分化为基质, 从而促进骨折间隙9、11、12 的衔接. ,13。在一起, 软骨和膜内血肿骨化相接导致了坚硬愈伤组织的发展, 随着时间的推移进一步改建, 形成一个强大的辅助骨, 能够支持机械负荷13,14 ,15。在健康的人, 愈合过程需要大约3月, 与仅35天在老鼠16。
骨折愈合通常被研究使用开放或闭合的外科模型17。开放性手术方法, 如产生严重的缺陷或完整的截骨, 规范损伤位置和几何, 以减少粉碎性骨折造成的偏差。截骨术作为一个优秀的模型来研究不愈合背后的基础机制, 因为愈合往往延迟比较闭合性骨折。此外, 需要硬外固定, 以稳定 osteotomized 骨, 这意味着再生将主要依赖于膜内骨化。开放式手术方法使用的设备, 如锁定钉, 别针夹子, 锁定板, 以提供轴向和旋转稳定性的骨折肢体;然而, 这些设备是昂贵的, 需要大量的时间在手术18,19,20,21。另一方面, 闭合模型是稳定的一个简单的髓内固定装置, 允许足够的不稳定, 以刺激软骨愈合。因此, 闭合断裂模型不容易模仿非联合的条件。内固定技术, 如髓内针, 指甲, 和加压螺钉, 是有利的, 因为他们便宜, 易于使用, 并尽量减少手术时间21,22,23。在某些情况下, 在骨折前插入髓内针, 但是髓内针的弯曲会导致股骨骨折的角或移位, 从而造成变的愈伤组织大小和愈合。在闭合模型中, 断裂位置和几何更难标准化, 因为它们是使用三点弯曲装置产生的, 其中骨干的重量被丢弃。然而, 用适当的技术, 这种手术方法提供了快速和一致的结果。此外, 闭合性骨折模型作为临床相关工具, 用于研究由高强度撞击或机械应力引起的骨折22。
这项手术协议是根据以前描述的方法, 使用髓内针稳定骨折股骨大鼠和小鼠22,24,25。首先, 通过髁间凹槽插入一个小直径的髓内针, 以建立一个入口点, 并在使用重力依赖性三点的股骨中段上产生横向骨折之前引入导丝。弯曲装置。在成功地产生闭合性股骨骨折后, 将一条直径较大的髓内棒结合在导丝上, 以稳定股骨骨折。这种方法避免了骨折时髓内针角引起的延迟愈合的风险, 因为在骨折后放置杆后, 可以重新定位和优化股骨损伤的稳定性。
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Protocol
以下程序是由印第安纳大学医学院的动物保育和使用委员会 (IACUC) 批准的。所有的生存手术都是在无菌条件下进行的, 如 NIH 指南所述。疼痛和感染的风险管理与适当的止痛药和抗生素, 以确保成功的结果。
1. 麻醉和准备
- 用腹腔 (ip) 路线对老鼠进行称量, 并麻醉氯胺酮 (100 毫克/千克) 和甲苯噻嗪 (10 毫克/千克) 的混合物。将鼠标放在一个空笼子里并监视它, 直到它完全镇静下来。
- 使用脚趾捏反射确保鼠标镇静。将眼膏涂抹在眼睛上, 防止其干燥。
- 从右肢上取出皮毛。用碘基擦洗和70% 乙醇擦拭手术部位。从膝盖中心开始擦洗手术部位, 并向外进行环形清扫。重复这3x 与新鲜的磨砂, 结束70% 乙醇。
- 术前剂量盐酸丁丙诺啡镇痛 (0.03 毫克/千克) 皮下即刻疼痛管理。
- 将鼠标放在无菌手术垫覆盖的加热垫上。
2. 手术方法
注: 骨折前, 应在手术前对小鼠的特定应变、年龄和性别进行经验性测定。这种手术方法是为 C57BJ6 雄性小鼠在10周的年龄进行优化。
- 将鼠标放在背部, 弯曲手术腿的膝盖。使用手术刀刀片, 使一个1.5 厘米的切口集中在膝关节。
- 用镊子将髌骨侧向移位以暴露股骨远端。在滑车槽的中心插入一个1.5 长25口径不锈钢皮下注射针, 沿着髓质管的长度逆行, 并通过股骨的近端。采取 X 射线, 以确保正确放置 pin。
注: 针应从鼠标的背侧离开以创建导丝的路径。 - 通过针的轴, 通过4长36口径的钨导丝, 进入中心的股骨远端和退出的斜角在鼠标的背侧。
- 在成功放置导丝后, 小心地取出25口径的针, 轻轻地拉在轮毂上, 同时保持四肢和导丝到位。通过 x 射线确认导丝的位置。
- 从撞击盘上方34.6 厘米的高度保持391克重量 (图 1A)。将股骨横放在两个支撑点上, 使股骨的股骨粗隆间和髁上区域在支撑铁砧 (图 1B) 和肢体的侧边上, 面对加载点 (图1C).放下重量, 并小心地从设备上取出鼠标后立即断开。
- 用 X 射线确认骨折位置。
- 在导丝上插入24口径不锈钢皮下导管, 以稳定股骨骨折。
注: 此应用程序可能需要一些力, 因为进入点是使用一个较小的直径针产生。这种直径的差异有效地防止了24尺杆通过股骨近端的潜在迁移。插入深度可以手动感觉, 因为钝管满足较大的转子皮质骨。 - 在去除导丝前, 用 X 射线确定钢棒的位置和股骨骨折的稳定性。
- 用钢丝钳切开股骨远端的多余油管。用镊子将暴露的油管埋在髁表面下, 用钳子轻轻向下用力, 小心不要使膝关节脱臼。
- 用镊子重新定位髌骨。用5-0 可吸收缝线关闭切口部位。
3. 术后管理
- 手术后, 小鼠可通过ip 路线注射多达500µL 的无菌生理盐水, 以帮助他们在术后恢复。
- 在加热的恢复床上监视动物, 直到他们从手术中醒来。一旦走动, 把他们送回笼子里去。
- 在手术后的几天里, 继续密切监视老鼠, 以确保他们恢复正常, 恢复机动性。管理盐酸丁丙诺啡镇痛 (0.03 毫克/千克) 皮下每6小时皮下手术后3天, 并根据需要此后。避免使用非甾体抗炎药物, 因为它们已经被证明会损害手术后的骨愈合。
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Representative Results
通过影像学检查, 对手术过程的成功实施进行了监测。关键步骤包括插入髓内针, 放置导丝, 在股骨中段诱导横断, 并与髓内杆适当稳定 (图 2Ai - 2Aiv)。在手术后28天内用每周影像影像监测骨折愈伤组织的愈合进展 (图 2B)。10-16 天骨折后, 软骨细胞发生肥厚, 产生矿化软骨, 形成突出的柔软愈伤组织。
了解软骨和膜内血肿骨化相接所涉及的早期细胞和分子事件是研究骨折愈合的重要因素。股骨在骨折后7和14天染色甲苯胺蓝, 以可视化骨折间隙软骨基质的形成 (图 3A)。软骨形成可检测7天后骨折, 并与骨折间隙的14天后骨折。
随着软愈伤组织的形成, 破骨细胞吸收钙化软骨, 成熟的骨原体合成新的骨基质。最初, 愈伤组织内的骨基质沉积在空间上是非特异的, 但随着时间的推移, 钙化软骨的重塑, 在骨折愈伤组织的中心区和外围产生了更明确的结构。1型胶原 (COL1) 是骨基质的主要成分, 其表达表现为骨折后14天的骨基质的空间组织和相对量 (图 3B)。这些数据表明, 在软骨愈合过程中, 软骨和原骨基质的协调生产。
此后, 在 17-35 天的骨折后, 原骨逐渐改建为形成一个强大的次生骨类似的皮质中段12。Microcomputed 层析成像 (显微 CT) 分析显示, 愈伤组织体积下降约50% 天14和28后骨折, 表明有效重塑的愈伤组织 (图 4A - 4B)。尽管射线成像技术对骨含量和微结构进行了有价值的评估, 但应进行扭转试验, 以正确评估相对于无损伤的对侧股骨的骨强度。
图 1: 断裂装置的示意图和在断裂产生过程中鼠标的位置.(a) 本小组显示用于产生裂缝的器具的示意图和部件的识别: (1) 撞击盘, (2) 螺母和螺纹杆, (3) 上部平台,(4) 垂直立柱, (5) 弹簧和小腿, (6) 下部平台, (7) 支撑台, (8) 隆起旋钮, (a 9) 基地。箭头表示在将重量落到撞击盘上后, 螺纹杆和小腿的向下位移。(b) 骨折是在骨干中使用 (b1) 断头台刀片, 而股骨粗隆间和髁上区域由 (b2) 铁砧支持。(C) 这些图像表明, 在产生骨折之前, 鼠标后肢在支架铁砧的位置。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 使用射线照相术监测骨折诱导和愈合进展情况.(A) 在整个手术过程中都采取了小鼠的射线照相图像, 显示 (Ai) 插入25口径的针逆行穿过股骨的长度, (全部) 在之前放置30口径钨导丝 (Aiii) 产生横向骨折, 并 (禽流感) 稳定的骨折股骨与一个24口径的杆。(B) 每周的影像影像用于监测骨折愈合长达28天的进展情况。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 软骨骨化期软骨形成和新骨基质沉积.(A) 本小组显示7岁和14天的老老茧的组织学切片, 染有甲苯胺蓝。愈伤组织外围以红色勾勒。(B) 本小组显示1型胶原蛋白在骨折愈伤组织内的绿色化染色14天后骨折 (40X 和100X 放大)。样品与 DAPI 复染, 使原子核可视为蓝色。汽车 = 软骨;骨髓;10月 = 老皮质骨头;毛里求斯 = 肌肉。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 骨折愈伤组织的显微 CT 分析.(A) 本小组在骨折后14和28天 (n = 6/组) 显示骨折愈伤组织的纵、横断面显微 CT 图像。(B) 本小组在骨折后14及28天显示平均愈伤组织体积 (mm3)。误差线表示标准偏差。治疗组之间的统计比较是使用一个未配对的2尾学生的t检验进行的。标准偏差;* p < 0.05。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
本手术的目的是在小鼠中产生标准的闭合性股骨骨折。该模型的一个主要优点是, 内固定发生在骨折产生后, 从而避免了髓内棒的角度。也许这个协议最关键的方面是在股骨中段形成一个标准化的横向骨折, 因为骨折几何取决于施加的弯曲力和后肢的位置。在弯矩时, 股骨的定位不当会导致偏斜或粉碎性骨折。重量和下落高度必须是经验主义地预定的, 因为他们取决于老鼠的年龄、性和劳损。采用装有三点弯曲装置的材料试验机可进一步控制所施加的力, 以代替下降的重量24。然而, 产生骨折的体重下降是一个临床相关模型的高冲击或应力相关的伤害。
此外, 手术过程中可能会出现并发症。在骨折发生后, 导丝可能会脱臼, 导致股骨在与髓内杆稳定期间的错位。这可以通过在骨折发生前后的影像影像监测来预防。在粉碎性骨折的情况下, 应排除该动物的研究。此外, 在髓内钉的移植手术后应密切监测动物, 因为这可能会影响受伤肢体的移动和愈合。该技术的一个局限性是,在体内微 CT 或磁共振成像 (MRI) 分析是不可能的, 因为不锈钢髓内杆会损害图像质量。因此, 这些分析只能在体内进行, 在仔细去除髓内棒之后。
虽然有许多小鼠骨折模型, 但闭合性股骨骨折模型是研究骨再生的一种简单、有效、临床相关的方法。内固定与髓内棒, 如本协议所述, 提供了足够的稳定性, 以保持一致的骨愈合, 但可能仍然允许一定程度的轴向和旋转运动的股骨受伤。虽然开放的模型, 如截骨术允许产生标准化的 "骨折", 他们需要一个刚性的外固定骨, 愈合依赖于膜内骨化。急性长骨骨折通常通过软骨和膜内骨化的结合来愈合。因此, 本议定书所描述的股骨闭合性骨折, 为研究骨愈合的基本机制提供了生理学相关的模型。未来的研究涉及小鼠闭合性股骨骨折将受益于开发的阴性髓内棒, 以允许在体内成像技术, 如使用对比染料, 以测量新的血管形成在受伤的肢体。总之, 小鼠闭合性股骨骨折模型是研究与骨损伤和再生相关的细胞和分子事件的一个有吸引力的平台, 确定新的治疗靶点以加速骨愈合。
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Disclosures
这篇手稿的作者没有什么可透露的。作者进一步指出, 对本手稿所报告的研究中使用的所有材料的完全访问没有任何限制。
Acknowledgments
这项工作得到了国防部 (DoD) 美国陆军医学研究和装备司令部 (USAMRMC) 国会定向医学研究项目 (CDMRP) (PR121604) 和国家关节炎和肌肉骨骼研究所赠款的支持。和皮肤病 (结缔组织国立研究院), NIH R01 AR068332 桑卡尔。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oster Minimax Trimmer | Animal World Network | 78049-100 | |
| POVIDONE-IODINE | Thermo Fisher Scientific | 395516 | |
| OPHTHALMIC OINTMENT | Thermo Fisher Scientific | NC0490117 | |
| Styker T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific Corporation | TP-700 | |
| 1ml Sub-Q Syringe | Thermo Fisher Scientific | 309597 | |
| ENCORE Sensi-Touch PF | Moore Medical LLC | 30347 | Latex, powder-free surgical glove |
| PrecisionGlide 25G Hypodermic Needles | Thermo Fisher Scientific | 14-826-49 | |
| Ultra-High-Temperature Tungsten Wire, | McMaster-Carr | 3775K37 | 0.005" Diameter, 1/16 lb. Spool, 380' Long |
| 304 stainless steel, 24G thin walled tubing | Microgroup Inc | 304h24tw-5ft | |
| #15 Scalpel Blades | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| #10 Scalpel Blades | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Narrow Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | Serrated/Straight/12cm |
| Iris Forceps | Fine Science Tools | 11066-07 | 1x2 Teeth/Straight/7cm |
| Dissector Scissors | Fine Science Tools | 14081-09 | Slim Blades/Angled to Side/Sharp-Sharp/10cm |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | ToughCut/Straight/Sharp-Sharp/11.5cm |
| Olsen-Hegar Needle Holder with Suture Cutter | Fine Science Tools | 12002-12 | Straight/Serrated/12cm/with Lock |
| Crile Hemostat | Fine Science Tools | 13004-14 | Serrated/Straight/14cm |
| Tungsten Wire Cutter | ACE Surgical Supply Co., Inc. | 08-051-90 | ACE #150 Wire Cutter, tungsten carbide tips |
| 3-0 VICRYL Suture | Ethicon Suture | J423H | 3-0 VICRYL UNDYED 27" FS-2 CUTTING |
| piXarray 100 Digital Specimen Radiography System | Bioptics, Inc | Cabinet x-ray system | |
| Einhorn 3-Point Bending Device | N/A | N/A | Custom Built |
References
- Schnell, S., Friedman, S. M., Mendelson, D. A., Bingham, K. W., Kates, S. L. The 1-Year Mortality of Patients Treated in a Hip Fracture Program for Elders. Geriatric Orthopaedic Surgery & Rehabilitation. 1 (1), 6-14 (2010).
- Burge, R., et al. Incidence and economic burden of osteoporosis-related fractures in the United States, 2005-2025. Journal of Bone and Mineral Research. 22 (3), 465-475 (2007).
- Cunningham, B. P., Brazina, S., Morshed, S., Miclau, T. III Fracture healing: A review of clinical, imaging and laboratory diagnostic options. Injury. 48, S69-S75 (2017).
- Einhorn, T. A. Can an anti-fracture agent heal fractures? Clinical Cases in Mineral and Bone Metabolism. 7 (1), 11-14 (2010).
- Hak, D. J., et al. Delayed union and nonunions: epidemiology, clinical issues, and financial aspects. Injury. 45, Suppl 2. S3-S7 (2014).
- Decker, S., Reifenrath, J., Omar, M., Krettek, C., Muller, C. W. Non-osteotomy and osteotomy large animal fracture models in orthopedic trauma research. Orthopaedic Reviews (Pavia). 6 (4), 5575 (2014).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Jacenko, O., Olsen, B. R. Transgenic mouse models in studies of skeletal disorders. Journal of Rheumatology Supplement. 43, 39-41 (1995).
- Nikolaou, V. S., Efstathopoulos, N., Kontakis, G., Kanakaris, N. K., Giannoudis, P. V. The influence of osteoporosis in femoral fracture healing time. Injury. 40 (6), 663-668 (2009).
- Bain, S. D., Bailey, M. C., Celino, D. L., Lantry, M. M., Edwards, M. W. High-dose estrogen inhibits bone resorption and stimulates bone formation in the ovariectomized mouse. Journal of Bone and Mineral Research. 8 (4), 435-442 (1993).
- Haffner-Luntzer, M., Kovtun, A., Rapp, A. E., Ignatius, A. Mouse Models in Bone Fracture Healing Research. Current Molecular Biology Reports. 2 (2), 101-111 (2016).
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews in Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Seminar in Cellular and Developmental Biology. 19 (5), 459-466 (2008).
- Ai-Aql, Z. S., Alagl, A. S., Graves, D. T., Gerstenfeld, L. C., Einhorn, T. A. Molecular mechanisms controlling bone formation during fracture healing and distraction osteogenesis. Journal of Dental Research. 87 (2), 107-118 (2008).
- Gerstenfeld, L. C., et al. Three-dimensional Reconstruction of Fracture Callus Morphogenesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54 (11), 1215-1228 (2006).
- Marsell, R., Einhorn, T. A. Emerging bone healing therapies. Journal of Orthopaedic Trauma. 24, Suppl 1. S4-S8 (2010).
- Lybrand, K., Bragdon, B., Gerstenfeld, L. Mouse models of bone healing: fracture, marrow ablation, and distraction osteogenesis. Current Protocols of Mouse Biology. 5 (1), 35-49 (2015).
- Garcia, P., et al. The LockingMouseNail--a new implant for standardized stable osteosynthesis in mice. Journal of Surgical Research. 169 (2), 220-226 (2011).
- Histing, T., et al. An internal locking plate to study intramembranous bone healing in a mouse femur fracture model. Journal of Orthopaedic Research. 28 (3), 397-402 (2010).
- Garcia, P., et al. A new technique for internal fixation of femoral fractures in mice: impact of stability on fracture healing. Journal of Biomechistry. 41 (8), 1689-1696 (2008).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration. Journal of Orthopaedic Trauma. 23 (5 Suppl), S31-S38 (2009).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 97-101 (1984).
- Holstein, J. H., Menger, M. D., Culemann, U., Meier, C., Pohlemann, T. Development of a locking femur nail for mice. Journal of Biomechistry. 40 (1), 215-219 (2007).
- McBride-Gagyi, S. H., McKenzie, J. A., Buettmann, E. G., Gardner, M. J., Silva, M. J. Bmp2 conditional knockout in osteoblasts and endothelial cells does not impair bone formation after injury or mechanical loading in adult mice. Bone. 81, 533-543 (2015).
- Williams, J. N., et al. Inhibition of CaMKK2 Enhances Fracture Healing by Stimulating Indian Hedgehog Signaling and Accelerating Endochondral Ossification. Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).
