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Medicine

चूहों में बंद ऊरु फ्रैक्चर की पीढ़ी: एक मॉडल अस्थि चिकित्सा अध्ययन करने के लिए

Published: August 16, 2018 doi: 10.3791/58122
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, Indiana University School of Medicine

Summary

murine बंद ऊरु फ्रैक्चर मॉडल हड्डी पुनर्जनन में तेजी लाने के लिए फ्रैक्चर चिकित्सा और उपंयास चिकित्सकीय रणनीतियों का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मंच है । इस शल्य प्रोटोकॉल के लक्ष्य को फीमर स्थिर करने के लिए एक intramedullary स्टील रॉड का उपयोग चूहों में एकतरफा बंद ऊरु भंग उत्पन्न करने के लिए है.

Abstract

अस्थि भंग रोगियों पर जबरदस्त सामाजिक-आर्थिक बोझ थोपने के अलावा, जीवन की उनकी गुणवत्ता को काफी प्रभावित करता है । चिकित्सकीय रणनीति है कि कुशल अस्थि चिकित्सा को बढ़ावा देने के गैर विद्यमान है और उच्च मांग में । फ्रैक्चर चिकित्सा के प्रभावी और reproducible पशु मॉडल हड्डी पुनर्जनन के साथ जुड़े जटिल जैविक प्रक्रियाओं को समझने की जरूरत है । फ्रैक्चर हीलिंग के कई पशु मॉडल वर्षों में उत्पन्न किया गया है; हालांकि, murine फ्रैक्चर मॉडल हाल ही में अस्थि चिकित्सा अध्ययन करने के लिए शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है । खुले और बंद मॉडलों की एक किस्म विकसित किया गया है, लेकिन बंद ऊरु फ्रैक्चर मॉडल एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक तरीके से तेजी से और reproducible परिणाम पैदा करने के लिए एक सरल विधि के रूप में बाहर खड़ा है । इस शल्य चिकित्सा प्रोटोकॉल के लक्ष्य को चूहों में एकतरफा बंद ऊरु भंग उत्पंन और एक intramedullary स्टील रॉड डालने के द्वारा फीमर के बाद फ्रैक्चर स्थिरीकरण की सुविधा है । हालांकि उपकरणों जैसे एक कील या एक पेंच अधिक से अधिक अक्षीय और रोटेशन स्थिरता की पेशकश के रूप में, एक intramedullary रॉड का उपयोग अस्थि ऊतक या हानिकारक पास में नए दोषों के उत्पादन के बिना लगातार उपचार परिणामों के लिए एक पर्याप्त स्थिरीकरण प्रदान करता है मुलायम ऊतक. रेडियोग्राफिक इमेजिंग घट्टा गठन, बोनी संघ की प्रगति पर नजर रखने के लिए प्रयोग किया जाता है, और बोनी घट्टा के बाद पुनर्मॉडलिंग । अस्थि चिकित्सा परिणाम आम तौर पर चंगा हड्डी की ताकत के साथ जुड़े रहे हैं और मरोड़ परीक्षण के साथ मापा. फिर भी, जल्दी सेलुलर और आणविक घटनाओं को समझना फ्रैक्चर की मरंमत के साथ जुड़े हड्डी ऊतक पुनर्जनन के अध्ययन में महत्वपूर्ण है । intramedullary निर्धारण के साथ चूहों में बंद ऊरु फ्रैक्चर मॉडल हड्डी फ्रैक्चर चिकित्सा का अध्ययन करने और उपचार में तेजी लाने के लिए चिकित्सकीय रणनीतियों का मूल्यांकन करने के लिए एक आकर्षक मंच के रूप में कार्य करता है ।

Introduction

भंग सबसे आम ऑस्टियोआर्थराइटिस प्रणाली के लिए होने वाली चोटों के बीच हैं और एक जबरदस्त सामाजिक बोझ के साथ जुड़े रहे हैं, उपचार लागत कि संयुक्त राज्य अमेरिका1में सालाना $२५,०००,०००,००० को पार करने के लिए पेश कर रहे हैं सहित, 2. हालांकि फ्रैक्चर के बहुमत घटना के बिना चंगा, उपचार काफी स्र्कना और उत्पादकता के नुकसान के साथ जुड़ा हुआ है । लगभग 5-10% एक देरी चिकित्सा या गैर संघ, उंर या अंय अंतर्निहित क्रोनिक स्वास्थ्य स्थितियों के कारण, जैसे ऑस्टियोपोरोसिस और मधुमेह3,4,5के रूप में फ्रैक्चर का परिणाम है । कोई एफडीए अनुमोदित औषधीय उपचार वर्तमान में कुशल हड्डी हीलिंग और कम वसूली समय को बढ़ावा देने के लिए उपलब्ध हैं ।

फ्रैक्चर हीलिंग एक जटिल और अत्यधिक गतिशील कई सेल प्रकार के समंवय को शामिल प्रक्रिया है । अत:, इस प्रक्रिया को तेज करने वाले चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान के लिए महत्वपूर्ण है सेलुलर और आणविक घटनाओं के साथ जुड़े हड्डी पुनर्जनन की एक व्यापक समझ । अन्य मानव रोगों के साथ के रूप में, एक उच्च नवागत और reproducible पशु मॉडल की स्थापना अस्थि चिकित्सा के अध्ययन में महत्वपूर्ण है । ऐसे भेड़ और सूअर के रूप में बड़ा जानवर, अस्थि remodeling गुण और मानव के समान यांत्रिकी है, लेकिन महंगे हैं, पर्याप्त चिकित्सा समय की आवश्यकता है, और आसानी से आनुवंशिक हेरफेर6के लिए उत्तरदाई नहीं हैं । दूसरी ओर, ऐसे चूहों और चूहों के रूप में छोटे जानवर मॉडल, हैंडलिंग की एक आसानी, रखरखाव की कम लागत, लघु प्रजनन चक्र, और एक छोटे चिकित्सा समय7सहित कई फायदे, प्रदान करते हैं । इसके अलावा, माउस जीनोम पूरी तरह से अनुक्रम है, तेजी से हेरफेर और आनुवंशिक वेरिएंट की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है । इस प्रकार, माउस एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली मानव रोग, चोट का अध्ययन करने के लिए है, और8मरंमत । मनुष्यों में, ऑस्टियोपोरोसिस और मधुमेह की तरह comorbidities एक देरी चिकित्सा की संभावना बढ़ जाती है । मौजूदा माउस मॉडलों की एक संख्या comorbidities के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध हैं जैसे ऑस्टियोपोरोसिस और मधुमेह हड्डी की चोट और चिकित्सा पर हो रहा है । ऑस्टियोपोरोसिस से पीड़ित रोगियों एक फ्रैक्चर उपचार9के बाद के चरणों के दौरान एक स्पष्ट रूप से कम हड्डी गठन है । Ovariectomized (OVX) चूहों तेजी से हड्डी हानि और विलंबित अस्थि चिकित्सा रजोनिवृत्ति उपरांत ऑस्टियोपोरोसिस10,11में मनाया कि इसी तरह के प्रदर्शन । इसके अतिरिक्त, प्रकार मैं और प्रकार द्वितीय मधुमेह के कई माउस मॉडल कम अस्थि जन phenotypes और बिगड़ा फ्रैक्चर मानव11में देखा उपचार की नकल । इसके अलावा, murine फ्रैक्चर मॉडल घट्टा में होने वाली जटिल जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने और अस्थि ऊतक पुनर्जनन में तेजी लाने वाले उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों का पता लगाने के लिए एक बहुमुखी मंच के रूप में कार्य करते हैं ।

अस्थि संरचना और चयापचय में मतभेद के बावजूद, अस्थि भंग चिकित्सा की समग्र प्रक्रिया चूहों और मनुष्यों में बहुत समान रहता है, endochondral और intramembranous हड्डी बन जाना का एक संयोजन शामिल अस्थि remodeling द्वारा पीछा किया. Endochondral हड्डी बन जाना कम यांत्रिक रूप से स्थिर फ्रैक्चर अंतर है, जहां वे chondrocytes में अंतर है कि अतिवृद्धि और एक नरम mineralize उत्पादन उपास्थि घट्टा आसपास के क्षेत्रों में जनक कोशिकाओं की भर्ती शामिल है । जनक कोशिकाओं की दूसरी लहर घट्टा घुसपैठ और परिपक्व osteoblasts में अंतर है कि नए स्रावित अस्थि मैट्रिक्स12,13,14,15. intramembranous हड्डी बन जाना के दौरान, progenitors पर periosteal और endosteal सतहों सीधे मैट्रिक्स स्रावित osteoblasts में अंतर और फ्रैक्चर गैप9,11,12 के पाटन की सुविधा ,13. एक साथ, endochondral और intramembranous ossifications परिणाम के विकास में एक कठिन घट्टा है, जो आगे के लिए एक मजबूत माध्यमिक हड्डी के रूप में सक्षम है फार्म का समर्थन यांत्रिक भार13,14 ,15. स्वस्थ मनुष्यों में, उपचार प्रक्रिया लगभग 3 महीने लगते हैं, चूहों में केवल ३५ दिनों की तुलना में16.

फ्रैक्चर हीलिंग सामांयतः या तो खुले या बंद शल्य मॉडल17का उपयोग कर अध्ययन किया गया है । इस तरह के एक गंभीर आकार दोष या पूर्ण osteotomy की पीढ़ी के रूप में खुला शल्य दृष्टिकोण, चोट स्थान और ज्यामिति comminuted भंग की वजह से विचलन को कम करने के लिए मानकीकरण. Osteotomies एक उत्कृष्ट मॉडल के लिए एक गैर संघ के पीछे अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन क्योंकि चिकित्सा अक्सर बंद भंग की तुलना में देरी है के रूप में सेवा करते हैं । इसके अलावा, एक कठोर बाहरी निर्धारण osteotomized हड्डी को स्थिर करने के लिए आवश्यक है, पुनर्जनन मुख्य रूप से intramembranous हड्डी बन जाना पर निर्भर करेगा जिसका अर्थ है । खुला सर्जिकल दृष्टिकोण इस तरह के नाखून, पिन क्लिप ताला के रूप में उपकरणों का उपयोग करें, और खंडित अंग के लिए अक्षीय और घूर्णन स्थिरता प्रदान करने के लिए प्लेट्स ताला; हालांकि, इस तरह के उपकरणों महंगी और सर्जरी में काफी अधिक समय की आवश्यकता होती है18,19,20,21. दूसरी ओर, बंद मॉडल एक सरल intramedullary निर्धारण डिवाइस के साथ स्थिर कर रहे हैं, endochondral चिकित्सा को उत्तेजित करने के लिए पर्याप्त अस्थिरता के लिए अनुमति देता है । नतीजतन, बंद फ्रैक्चर मॉडल आसानी से एक गैर संघ की शर्तों की नकल नहीं है । आंतरिक निर्धारण तकनीक, intramedullary पिन, नाखून, और संपीड़न शिकंजा के रूप में, वे सस्ते, उपयोग करने के लिए आसान कर रहे हैं के रूप में लाभप्रद रहे हैं, और सर्जरी में समय को कम करने21,22,23. कुछ मामलों में, intramedullary पिन फ्रैक्चर से पहले डाला जाता है, लेकिन intramedullary पिन के झुकने angulation या खंडित फीमर के विस्थापन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, एक चर घट्टा आकार और चिकित्सा के लिए योगदान दे. फ्रैक्चर स्थान और ज्यामिति बंद मॉडलों में मानकीकरण करने के लिए और अधिक कठिन हैं, के रूप में वे एक तीन सूत्री झुकने डिवाइस का उपयोग कर उत्पन्न कर रहे हैं, जिसमें एक वजन diaphysis पर छोड़ दिया है. हालांकि, उचित तकनीक के साथ, इस शल्य चिकित्सा दृष्टिकोण तेजी से और सुसंगत परिणाम प्रदान करता है । इसके अलावा, बंद फ्रैक्चर मॉडल उच्च बल प्रभाव या यांत्रिक तनाव22की वजह से भंग अध्ययन करने के लिए एक नैदानिक प्रासंगिक उपकरण के रूप में कार्य करता है ।

इस सर्जिकल प्रोटोकॉल पहले वर्णित एक intramedullary पिन का उपयोग कर चूहों और चूहों में खंडित femurs को स्थिर करने के तरीकों से अनुकूलित किया गया था22,24,25। सबसे पहले, एक छोटे व्यास के एक intramedullary सुई intracondylar पायदान के माध्यम से प्रवेश के एक बिंदु स्थापित करने के लिए डाला जाता है, और एक guidewire ऊरु midshaft में एक अनुप्रस्थ फ्रैक्चर पैदा करने से पहले शुरू की है एक गुरुत्वाकर्षण पर निर्भर तीन बिंदु का उपयोग डिवाइस झुका । एक बंद ऊरु फ्रैक्चर के सफल पीढ़ी के बाद, एक बड़ा व्यास के एक intramedullary रॉड भंग फीमर को स्थिर करने के लिए गाइड तार पर शामिल किया गया है । इस विधि फ्रैक्चर के दौरान intramedullary पिन के angulation की वजह से देरी चिकित्सा के जोखिम से बचा जाता है, रॉड पद फ्रैक्चर के स्थान के रूप में घायल फीमर की स्थिति और अनुकूलित स्थिरीकरण के लिए अनुमति देता है ।

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Protocol

निंनलिखित प्रक्रिया इंडियाना विश्वविद्यालय स्कूल ऑफ मेडिसिन संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) से अनुमोदन के साथ किया गया था । सभी अस्तित्व सर्जरी NIH दिशा निर्देशों द्वारा उल्लिखित के रूप में बाँझ शर्तों के तहत प्रदर्शन किया गया । दर्द और संक्रमण के जोखिम उचित एनाल्जेसिक और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ प्रबंधित करने के लिए एक सफल परिणाम सुनिश्चित किया गया ।

1. संज्ञाहरण और तैयारी

  1. माउस वजन और ketamine (१०० मिलीग्राम/kg) और xylazine (10 मिलीग्राम/intraperitoneal (आईएफसआई) मार्ग के माध्यम से प्रशासित) के मिश्रण के साथ यह anesthetize । एक खाली पिंजरे में माउस प्लेस और यह निगरानी जब तक यह पूरी तरह से बेहोश है ।
  2. सुनिश्चित करें कि माउस एक पैर की अंगुली चुटकी पलटा का उपयोग कर बेहोश है । अपनी आंखों के लिए नेत्र मरहम लागू करने के लिए उंहें बाहर सुखाने से बचाने के लिए ।
  3. दाहिने अंग से फर निकालें. एक आयोडीन आधारित सफ़ाई और ७०% इथेनॉल के साथ शल्य साइट नीचे पोंछ । सर्जिकल घुटने के केंद्र में शुरू करने और एक परिपत्र स्वीप जावक बनाने साइट सफ़ाई । ताजा सफ़ाई के साथ इस 3x दोहराएं, ७०% इथेनॉल के साथ समाप्त ।
  4. buprenorphine हाइडरोक्लॉराइड analgesia (०.०३ मिलीग्राम/) की एक ऑपरेटिव खुराक प्रशासन तत्काल पश्चात दर्द प्रबंधन के लिए चमड़े के नीचे ।
  5. एक हीटिंग एक बाँझ सर्जिकल पैड द्वारा कवर पैड पर माउस प्लेस ।

2. शल्य दृष्टिकोण

नोट: फ्रैक्चर से पहले, वजन और ड्रॉप ऊंचाई विशिष्ट तनाव, उंर के लिए निर्धारित empirically होना चाहिए, और चूहों के सेक्स सर्जरी से पहले । इस शल्य प्रक्रिया उंर के 10 सप्ताह में C57BJ6 पुरुष चूहों के लिए अनुकूलित है ।

  1. अपनी पीठ पर माउस प्लेस और ऑपरेटिव पैर के घुटने फ्लेक्स । एक स्केलपेल ब्लेड का प्रयोग, एक १.५ सेमी घुटने संयुक्त पर केंद्रित चीरा बनाते हैं ।
  2. बाद में संदंश का उपयोग वुटने विस्थापित करने के लिए फीमर के बाहर का अंत बेनकाब । trochlear नाली के केंद्र में एक १.५-लंबी 25 गेज स्टेनलेस स्टील hypodermic सुई में डालें, एक प्रतिगामी तरीके से दिमाग़ी नहर की लंबाई नीचे और फीमर के समीपस्थ अंत के माध्यम से । पिन का उचित स्थान सुनिश्चित करने के लिए एक्स-रे लें ।
    नोट: सुई माउस के पृष्ठीय पक्ष से बाहर निकलने के लिए guidewire के लिए एक रास्ता बनाने चाहिए ।
  3. सुई के शाफ्ट के माध्यम से एक 4-लंबी ३६ गेज टंगस्टन guidewire पास, बाहर फीमर पर हब के माध्यम से प्रवेश करने और माउस के पृष्ठीय पक्ष पर बेवल बाहर निकलने ।
  4. guidewire के सफल स्थान के बाद, ध्यान से धीरे से हब पर खींच जबकि अंग और जगह में guidewire पकड़े द्वारा 25 गेज सुई हटा दें । एक्स-रे द्वारा guidewire की नियुक्ति की पुष्टि करें ।
  5. प्रभाव डिस्क (आंकड़ा 1a) के ऊपर ३४.६ सेमी की ऊंचाई से एक ३९१ g वजन पकड़ो । फीमर क्षैतिज रूप से दो सहायक बिंदुओं पर स्थिति, ऐसी है कि intertrochanteric और supracondylar क्षेत्रों का समर्थन anvils पर फीमर आराम (आंकड़ा 1b) और अंग के पार्श्व पक्ष लोड हो रहा है बिंदु का सामना करना पड़ रहा है (चित्रा 1C ). वजन ड्रॉप और ध्यान से तुरंत फ्रैक्चर के बाद डिवाइस से माउस को हटा दें ।
  6. एक्स-रे द्वारा फ्रैक्चर स्थान की पुष्टि करें ।
  7. सम्मिलित 24 गेज guidewire पर स्टेनलेस स्टील hypodermic ट्यूबिंग खंडित फीमर को स्थिर करने के लिए.
    नोट: इस आवेदन प्रविष्टि के बिंदु एक छोटे व्यास की एक सुई का उपयोग कर उत्पन्न किया गया था के रूप में कुछ बल की आवश्यकता हो सकती. व्यास में यह अंतर प्रभावी ढंग से फीमर के समीपस्थ अंत के माध्यम से 24 गेज रॉड के संभावित प्रवास को रोकता है । प्रविष्टि की गहराई को मैंयुअल रूप से महसूस किया जा सकता है के रूप में कुंद टयूबिंग अधिक से अधिक trochanter की cortical हड्डी मिलता है ।
  8. स्टील रॉड की स्थिति की पुष्टि करें और guidewire को हटाने से पहले एक्स-रे द्वारा खंडित फीमर के स्थिरीकरण ।
  9. तार कटर का उपयोग कर फीमर के बाहर के छोर पर अतिरिक्त टयूबिंग काट । संदंश का उपयोग कर एक कोमल नीचे बल लागू करने के लिए condyles की सतह के तहत उजागर ट्यूबिंग दफन, घुटने के जोड़ों को खोजने के लिए सावधान नहीं किया जा रहा ।
  10. संदंश का उपयोग कर वुटने का स्थान । एक 5-0 अवशोषित टांका के साथ चीरा साइट बंद करो ।

3. पश्चात प्रबंधन

  1. सर्जरी के बाद, चूहों आईएफसआई मार्ग के माध्यम से बाँझ खारा के ५०० µ एल करने के लिए उन्हें उनके पश्चात वसूली में सहायता करने के लिए के साथ इंजेक्ट किया जा सकता है ।
  2. एक गर्म वसूली बिस्तर पर जानवरों की निगरानी जब तक वे सर्जरी से जगाने । एक बार एम्बूलेंस, उन्हें उनके पिंजरे में वापस लौटा दें ।
  3. वे ठीक से उपचार कर रहे हैं और गतिशीलता हासिल सुनिश्चित करने के लिए सर्जरी के बाद कई दिनों के लिए चूहों की बारीकी से निगरानी करने के लिए जारी. प्रशासन buprenorphine हाइडरोक्लॉराइड analgesia (०.०३ मिलीग्राम/चमड़े के नीचे 3 दिनों के लिए हर 6 घंटे सर्जरी के बाद, और के रूप में इसके बाद की जरूरत है । गैर-स्टेरॉयड विरोधी भड़काऊ दवाओं (एनएसएआईडी) के उपयोग से बचें के रूप में वे सर्जरी के बाद हड्डी चिकित्सा ख़राब करने के लिए दिखाया गया है.

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Representative Results

शल्य प्रक्रिया के सफल कार्यांवयन रेडियोग्राफिक इमेजिंग के साथ निगरानी की गई । महत्वपूर्ण कदम एक intramedullary सुई के सम्मिलन, एक गाइड वायर की नियुक्ति, ऊरु midshaft में एक अनुप्रस्थ फ्रैक्चर की प्रेरण, और एक intramedullary रॉड (चित्रा 2aमैं - 2Aiv) के साथ उचित स्थिरीकरण शामिल हैं । फ्रैक्चर घट्टा की चिकित्सा प्रगति 28 दिनों के लिए सर्जरी (चित्रा बी) के बाद साप्ताहिक रेडियोग्राफिक छवियों के साथ नजर रखी थी । 10-16 के बाद के दिनों में फ्रैक्चर, chondrocytes से गुजरा अतिवृद्धि और एक प्रमुख नरम घट्टा के रूप में उपास्थि खनिज का उत्पादन किया ।

जल्दी सेलुलर और आणविक endochondral और intramembranous ossifications में शामिल घटनाओं को समझना महत्वपूर्ण है जब अस्थि भंग चिकित्सा का अध्ययन । Femurs 7 में toluidine नीले और 14 दिनों के बाद फ्रैक्चर फ्रैक्चर गैप (3ए) में एक उपास्थि मैट्रिक्स के गठन की कल्पना के साथ दाग थे । उपास्थि गठन फ्रैक्चर के बाद 7 दिनों का पता लगाने और 14 दिन फ्रैक्चर के बाद फ्रैक्चर गैप के साथ गठबंधन किया गया था ।

नरम घट्टा के गठन के बाद, osteoclasts resorbed calcified उपास्थि, और परिपक्व osteoblasts संश्लेषित नई हड्डी मैट्रिक्स. शुरू में, घट्टा के भीतर अस्थि मैट्रिक्स जमाव विशेष रूप से गैर विशिष्ट था, लेकिन समय के साथ calcified उपास्थि का एक remodeling, मध्य क्षेत्र और फ्रैक्चर घट्टा की परिधि में और अधिक परिभाषित संरचनाओं का उत्पादन किया. प्रकार 1 कोलेजन (COL1) हड्डी मैट्रिक्स का एक प्रमुख घटक है, और अपनी अभिव्यक्ति स्थानिक संगठन और अस्थि मैट्रिक्स के सापेक्ष राशि है कि 14 दिनों के बाद फ्रैक्चर (3बी आंकड़ा) मौजूद था दिखाया । एक साथ लिया, इन आंकड़ों endochondral चिकित्सा के दौरान उपास्थि और प्राथमिक अस्थि मैट्रिक्स का समन्वित उत्पादन दिखाते हैं ।

इसके बाद, 17-35 के बाद के दिनों के दौरान फ्रैक्चर, प्राथमिक हड्डी के रूप में एक मजबूत माध्यमिक हड्डी है कि cortical midshaft12के रूप में फिर से मॉडलिंग की थी । Microcomputed टोमोग्राफी (माइक्रो सीटी) विश्लेषण घट्टा 14 और 28 के बाद फ्रैक्चर के बीच लगभग ५०% की मात्रा में कमी आई है, घट्टा (4a - 4B) की एक प्रभावी remodeling का संकेत पता चला । हालांकि रेडियोग्राफिक इमेजिंग तकनीक अस्थि सामग्री और microarchitecture के एक मूल्यवान आकलन प्रदान करते हैं, मरोड़ परीक्षण ठीक से गैर घायल contralateral फीमर के सापेक्ष हड्डी ताकत का आकलन करने के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।

Figure 1
चित्रा 1: फ्रैक्चर तंत्र का एक आरेख और एक फ्रैक्चर की पीढ़ी के दौरान माउस के स्थान । (क) इस पैनल के लिए फ्रैक्चर पैदा करते थे और घटकों की एक पहचान: (एक1) प्रभाव डिस्क, (एक2) नट और लड़ी पिरोया छड़, (एक3) ऊपरी मंच इस्तेमाल तंत्र का एक चित्र से पता चलता है, (एक4) ऊर्ध्वाधर पदों, (एक5) वसंत और पिंडली, (एक6) कम मंच, (एक7) का समर्थन मंच, (एक8) knurled घुंडी, और (एक ९) आधार. तीर एक वजन प्रभाव डिस्क पर छोड़ दिया है के बाद लड़ी पिरोया छड़ और टांग के एक नीचे विस्थापन का संकेत मिलता है । (ख) फ्रैक्चर के मध्य में उत्पन्न होते हैं diaphysis (बी1) गिलोटिन ब्लेड का उपयोग करते हुए फीमर के intertrochanteric और supracondylar क्षेत्रों (बी2) anvils द्वारा समर्थित हैं । (ग) ये छवियां समर्थन anvils भर में एक फ्रैक्चर की पीढ़ी से पहले माउस हिंद अंग की स्थिति का प्रदर्शन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: फ्रैक्चर प्रेरण और उपचार रेडियोग्राफी के उपयोग के साथ प्रगति पर नजर रखी । (ए) चूहों के रेडियोग्राफिक छवियों को दिखा सर्जरी भर में ले जाया गया (ऐ) एक 25 गेज सुई फीमर की लंबाई के माध्यम से प्रतिगामी, (Aii) 30 गेज टंगस्टन guidewire के स्थान से पहले की प्रविष्टि ( Aiii) एक अनुप्रस्थ फ्रैक्चर की पीढ़ी, और (Aiv) एक 24 गेज रॉड के साथ खंडित फीमर के स्थिरीकरण. (ख) साप्ताहिक रेडियोग्राफिक छवियों के लिए उपचार की प्रगति की निगरानी के लिए 28 दिनों के बाद फ्रैक्चर का इस्तेमाल किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: endochondral हड्डी बन जाना के दौरान उपास्थि गठन और नए अस्थि मैट्रिक्स जमाव. (क) इस पैनल के ऊतकवैज्ञानिक वर्गों से पता चलता है 7-और 14 दिन पुराने calluses सना हुआ toluidine नीले रंग के साथ । घट्टा परिधि लाल रंग में उल्लिखित है । (ख) इस पैनल से पता चलता है कोलेजन प्रकार के लिए धुंधला immunohistochemistry फ्रैक्चर घट्टा के भीतर हरे रंग के रूप में 1 अभिव्यक्ति 14 दिनों के बाद फ्रैक्चर (40X और 100X इज़ाफ़ा) । नमूनों को नीले रंग के रूप में नाभिक की कल्पना करने के लिए DAPI के साथ counterstained गया । कार = उपास्थि; बीएम = अस्थि मज्जा; झालेले = जुने cortical वाढ; मस = बलवान । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: फ्रैक्चर घट्टा के माइक्रो-सीटी विश्लेषण । (क) इस पैनल के 14 और 28 दिनों के बाद फ्रैक्चर (एन = 6/समूह) में फ्रैक्चर घट्टा के अनुदैर्ध्य और पार अनुभागीय माइक्रो-सीटी छवियों को दर्शाता है । (ख) इस पैनल के 14 और 28 दिनों के बाद फ्रैक्चर पर मतलब घट्टा मात्रा (मिमी3) से पता चलता है । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । उपचार समूहों के बीच सांख्यिकीय तुलना एक ख़राब 2-पूंछ छात्र टीपरीक्षण का उपयोग किया गया था । मानक विचलन; * p < ०.०५ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस शल्य प्रक्रिया का लक्ष्य चूहों में मानकीकृत बंद ऊरु भंग उत्पन्न करने के लिए है. इस मॉडल का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि आंतरिक निर्धारण फ्रैक्चर की पीढ़ी के बाद जगह लेता है, जिससे intramedullary रॉड के एक angulation से बचने । शायद इस प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण पहलू ऊरु midshaft में एक मानकीकृत अनुप्रस्थ फ्रैक्चर की पीढ़ी है, के रूप में फ्रैक्चर ज्यामिति लागू झुकने बल और हिंद अंग की स्थिति पर निर्भर है । झुकने पल के दौरान फीमर की अनुचित स्थिति टेढ़ा या comminuted भंग करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । वजन और बूंद ऊंचाई empirically पूर्व निर्धारित किया जाना चाहिए, क्योंकि वे उंर, लिंग, और चूहों के तनाव पर निर्भर हैं । लागू बल और एक सामग्री परीक्षण एक गिरा वजन24के स्थान पर एक तीन बिंदु झुकने उपकरण के साथ सज्जित मशीन का उपयोग कर नियंत्रित किया जा सकता है । हालांकि, एक गिरा वजन के साथ फ्रैक्चर पैदा उच्च प्रभाव या तनाव से संबंधित चोटों के एक नैदानिक प्रासंगिक मॉडल है ।

इसके अलावा, जटिलताओं शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के दौरान विकसित कर सकते हैं । guidewire फ्रैक्चर की पीढ़ी के बाद, intramedullary रॉड के साथ स्थिरीकरण के दौरान घायल फीमर का एक ग़लत संरेखण करने के लिए अग्रणी हो सकता है । इससे पहले और बाद में फ्रैक्चर की पीढ़ी के रेडियोग्राफिक इमेजिंग के साथ निगरानी द्वारा रोका जा सकता है । comminuted फ्रैक्चर के मामले में, पशु अध्ययन से बाहर रखा जाना चाहिए । इसके अलावा, जानवरों intramedullary रॉड के प्रवास के लिए सर्जरी के बाद बारीकी से नजर रखी जानी चाहिए, क्योंकि यह गतिशीलता और घायल अंग की चिकित्सा को प्रभावित कर सकता है । तकनीक की एक सीमा है कि vivo में माइक्रो-सीटी या चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) विश्लेषण संभव नहीं हैं, के रूप में स्टेनलेस स्टील intramedullary रॉड छवि गुणवत्ता समझौता होगा । इसलिए, इन विश्लेषण केवल intramedullary रॉड के सावधान हटाने के बाद, vivo पूर्वप्रदर्शन किया जा सकता है ।

हालांकि कई murine फ्रैक्चर मॉडल हैं, बंद ऊरु फ्रैक्चर मॉडल हड्डी पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए एक सरल, कुशल, और नैदानिक प्रासंगिक विधि के रूप में बाहर खड़ा है । आंतरिक निर्धारण एक intramedullary रॉड के साथ, जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, लगातार हड्डी उपचार के लिए पर्याप्त स्थिरता प्रदान करता है, लेकिन अभी भी घायल फीमर के अक्षीय और रोटेशन आंदोलन के कुछ डिग्री के लिए अनुमति दे सकता है । जबकि खुले मॉडल जैसे osteotomies मानकीकृत "भंग की पीढ़ी के लिए अनुमति देते हैं," वे हड्डी के एक कठोर बाहरी निर्धारण की आवश्यकता होती है, और चिकित्सा intramembranous हड्डी बन जाना पर निर्भर करता है । तीव्र लंबी हड्डी भंग आमतौर पर endochondral और intramembranous हड्डी बन जाना का एक संयोजन के माध्यम से चंगा । इसलिए, इस प्रोटोकॉल में वर्णित बंद ऊरु फ्रैक्चर अस्थि चिकित्सा के अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉडल प्रदान करते हैं । भविष्य murine बंद ऊरु भंग शामिल अध्ययन एक radiolucent intramedullary रॉड के विकास से लाभ के लिए vivo इमेजिंग तकनीक के लिए अनुमति देते हैं, ऐसे कंट्रास्ट रंजक के उपयोग के रूप में नए vasculature के गठन को मापने के रूप में घायल अंग । कुल मिलाकर, murine बंद ऊरु फ्रैक्चर मॉडल एक आकर्षक मंच के लिए सेलुलर और आणविक अस्थि चोट और पुनर्जनन और अस्थि चिकित्सा में तेजी लाने के उपंयास चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान के साथ जुड़े घटनाओं का अध्ययन है ।

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Disclosures

इस पांडुलिपि के लेखकों के पास कुछ भी खुलासा नहीं है. लेखक आगे राज्य है कि सभी इस पांडुलिपि में रिपोर्ट अध्ययन में प्रयुक्त सामग्री के लिए पूर्ण उपयोग पर कोई प्रतिबंध नहीं हैं ।

Acknowledgments

यह काम रक्षा विभाग (DoD) अमेरिकी सेना चिकित्सा अनुसंधान और Materiel कमान (USAMRMC) कांग्रेस के चिकित्सा अनुसंधान कार्यक्रम (CDMRP) (PR121604) और गठिया और पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस के राष्ट्रीय संस्थानों के निर्देश से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था और चर्म रोग (NIAMS), NIH R01 AR068332 को उमा संकार ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Oster Minimax Trimmer Animal World Network 78049-100
POVIDONE-IODINE Thermo Fisher Scientific 395516
OPHTHALMIC OINTMENT Thermo Fisher Scientific NC0490117
Styker T/Pump Warm Water Recirculator Kent Scientific Corporation TP-700
1ml Sub-Q Syringe Thermo Fisher Scientific 309597
ENCORE Sensi-Touch PF Moore Medical LLC 30347 Latex, powder-free surgical glove
PrecisionGlide 25G Hypodermic Needles Thermo Fisher Scientific 14-826-49
Ultra-High-Temperature Tungsten Wire, McMaster-Carr 3775K37 0.005" Diameter, 1/16 lb. Spool, 380' Long
304 stainless steel, 24G thin walled tubing Microgroup Inc 304h24tw-5ft
#15 Scalpel Blades Fine Science Tools 10015-00
#10 Scalpel Blades Fine Science Tools 10010-00
Narrow Pattern Forceps Fine Science Tools 11002-12 Serrated/Straight/12cm
Iris Forceps Fine Science Tools 11066-07 1x2 Teeth/Straight/7cm
Dissector Scissors Fine Science Tools 14081-09 Slim Blades/Angled to Side/Sharp-Sharp/10cm
Fine Scissors Fine Science Tools 14058-11 ToughCut/Straight/Sharp-Sharp/11.5cm
Olsen-Hegar Needle Holder with Suture Cutter Fine Science Tools 12002-12 Straight/Serrated/12cm/with Lock
Crile Hemostat Fine Science Tools 13004-14 Serrated/Straight/14cm
Tungsten Wire Cutter ACE Surgical Supply Co., Inc. 08-051-90 ACE #150 Wire Cutter, tungsten carbide tips
3-0 VICRYL Suture Ethicon Suture J423H 3-0 VICRYL UNDYED 27" FS-2 CUTTING
piXarray 100 Digital Specimen Radiography System Bioptics, Inc Cabinet x-ray system
Einhorn 3-Point Bending Device N/A N/A Custom Built

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References

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चिकित्सा समस्या १३८ अस्थि भंग फीमर फ्रैक्चर हीलिंग माउस फ्रैक्चर मॉडल
चूहों में बंद ऊरु फ्रैक्चर की पीढ़ी: एक मॉडल अस्थि चिकित्सा अध्ययन करने के लिए
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Williams, J. N., Li, Y., Valiya… More

Williams, J. N., Li, Y., Valiya Kambrath, A., Sankar, U. The Generation of Closed Femoral Fractures in Mice: A Model to Study Bone Healing. J. Vis. Exp. (138), e58122, doi:10.3791/58122 (2018).

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