Summary
Beskrevet her er en protokol til tagging endogent udtrykte proteiner med fluorescerende tags i menneskelige inducerede pluripotente stamceller ved hjælp af CRISPR/Cas9. Derfor redigerede celler er beriget af fluorescens aktiveret celle sortering og klonede cellelinjer genereres.
Abstract
En protokol, der præsenteres for at skabe menneskelige inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs), der udtrykker endogene proteiner smeltet for at N - eller C-terminale fluorescerende tags i rammen. De prokaryote CRISPR/Cas9 system (grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentager/CRISPR-associerede 9) kan anvendes til at indføre store eksogene sekvenser i genomisk loci via homologi instrueret reparation (HDR). For at opnå den ønskede knock-i, denne protokol beskæftiger ribonucleoprotein (RNP)-baseret tilgang, hvor vildtype Streptococcus pyogenes Cas9 protein, syntetisk 2-del guide RNA (gRNA) og en donor skabelon plasmid leveres til celler via elektroporation. Derfor redigerede celler, der udtrykker de fluorescently tagged proteiner er beriget af fluorescens aktiveret celle sortering (FACS). Klonede linjer oprettes derefter og kan analyseres for præcis redigering resultater. Ved at indføre de fluorescerende tag på den genomisk locus af gen af interesse, kan den resulterende subcellulært lokalisering og dynamikken i fusion protein studeres under endogene myndighedskontrol, en afgørende forbedring i forhold til konventionelle overekspression systemer. Brug af hiPSCs som et modelsystem for gen kodning giver mulighed for at studere de tagged proteiner i diploide, nontransformed celler. Da hiPSCs kan opdeles i flere celletyper, giver denne tilgang mulighed for at skabe og studere tagged proteiner i en lang række isogene cellulære sammenhænge.
Introduction
Genom-redigering strategier, især CRISPR/Cas9, at studere cellulære processer bliver mere og mere tilgængelige og værdifulde1,2,3,4,5, 6 , 7. en af de mange anvendelser af CRISPR/Cas9 er indførelsen (via homologi instrueret reparation (HDR)) af store eksogene sekvenser som normal god landbrugspraksis i specifikke genomisk loci, der derefter fungere som journalister for aktiviteten af et gen eller protein produkt8 . Denne teknik kan bruges til at tilslutte sig en fluorescerende proteiner sekvens til en endogen åben læsning ramme hvor den resulterende endogent regulerede fusion protein kan bruges til at visualisere subcellulært lokalisering og dynamikken i protein af interesse5 ,6,9,10,11. Mens endogent tagged proteiner giver mange fordele i forhold til overekspression systemer, er indsætte store sekvenser i det menneskelige genom en ineffektiv processen typisk kræver en markering eller berigelse strategi til at opnå en befolkning af celler, der kan være let studerede5,12.
Denne protokol beskriver indsættelsen af en DNA-sekvens kodning en fluorescerende proteiner (FP) i en ønskede genomisk locus. Protokollen omfatter design og levering af donor skabelon plasmid, og ribonucleoprotein (RNP) kompleks (vildtype S. pyogenes Cas9 protein kombineret med syntetisk CRISPR RNA (crRNA) og trans-aktivering crRNA (tracrRNA)). Også beskrevet er berigelsen af derfor redigerede celler via fluorescens aktiveret celle sortering (FACS) og klonede celle linje generation proces. Til dato, har denne metode været brugt til at generere hiPSC linjer med enten monoallelic eller (sjældent) bi-allel grøn fluorescerende proteiner (NGL) tags mærkning femogtyve proteiner repræsenterer store cellulære strukturer. De resulterende redigerede celler fra disse bestræbelser er blevet bekræftet at har den forventede genetiske indsættelse, udtrykke en korrekt localizing fusion protein og vedligeholde pluripotency og en stabil karyotype12 (og ikke-offentliggjorte data). Denne metode er også blevet brugt til at generere flere andre single og dual (to forskellige proteiner markeret i den samme celle) redigeret populationer af hiPSCs (ikke-offentliggjorte data).
Menneskelige iPSCs stammer fra raske donorer blev valgt for indsatsen genom-redigering, fordi i modsætning til mange konventionelle cellelinjer, de er diploide karyotypically, ikke-transformeret, og stabile proliferativ. Disse egenskaber giver en attraktiv model til at studere grundlæggende cellebiologi og sygdom modellering. Derudover giver differentiering potentialet i hiPSCs mulighed for at undersøge flere udviklingsstadier parallelt på tværs af forskellige slægter og celletyper ved hjælp af isogene celler, herunder organoids, væv og "i et fad" sygdomsmodeller13 ,14,15. Denne protokol blev udviklet for hiPSCs (WTC linje), kan det være informativ for udviklingen af protokoller ved hjælp af andre pattedyr cellelinjer.
Protocol
1. i siliciummangan Design af crRNA og Donor skabelon Plasmid for FP Knock-i
- Få kommenteret reference sekvens fra NCBI16 eller UCSC genom Browser17 (fx GenBank format) af gen af interesse og importere den til en Bioinformatik software valg. Hvis værten genomet sekvens er kendt for at indeholde varianter i forhold til referencen, omfatter dem nu ved justering af reference sekvens i bioinformatik-softwaren (Se diskussion).
- Find den ønskede FP indsættelsesstedet. For C-terminale tags, vil sekvens for FP tag blive indført mellem den sidste base af den sidste codon og første base af stop-codon. For N-terminal tagging, blive sekvens for FP tag typisk indført mellem den sidste base af start codon og første base af den næste codon. I nogle tilfælde, såsom når start codon er en enkelt codon exon, eller hvor en signal sekvensen findes nær protein endestation, kan ønskede FP indsættelsesstedet være placeret i en mere 3ʹ holdning, så længe det fortsat i rammen.
- Brug 50 bp på hver side af den ønskede indsættelsesstedet som inputsekvensen for ethvert offentligt tilgængelige crRNA designværktøj. Når 2-4 crRNA mål er identificeret i nærheden af indsættelsesstedet, anmærke crRNA bindingssteder og protospacer-tilstødende motiv (PAM) sekvenser (NGG) i bioinformatik-programmel. Disse crRNAs vil blive brugt til at fremkalde dobbelt strandede pauser (Se diskussion om yderligere retningslinjer vedrørende crRNA design).
Bemærk: Brugerdefinerede crRNA sekvenser kan indgives til syntese med en kommerciel leverandør (anbefales) eller sekvensen kan bruges som udgangspunkt til at designe en kloning eller in vitro- syntese strategi, som er uden for rammerne af denne protokol (Se diskussion ). - At indlede donor skabelon plasmid, bruge 1 kb af sekvens opstrøms af ønskede indsættelsesstedet som 5ʹ homologi arm (dette bør omfatte start codon for N-terminale indrykninger) og bruge 1 kb af sekvens nedstrøms for den ønskede indsættelsesstedet som 3ʹ Homologi arm (dette bør omfatte stop-codon for C-terminale indrykninger). Baser mellem to homologi armene er typisk ikke udeladt. Herunder cellelinie specifikke varianter i homologi våben vil bevare disse genetiske varianter i de resulterende redigerede celler.
- Mellem de to homologi arme, indsætte sekvensen for FP (eller andre knock-i rækkefølge) og linker sekvens (Se diskussion om yderligere retningslinjer vedrørende linkers). For N-terminale tags, skal linker sekvens være direkte 3ʹ af FP; for C-terminale tags bør linker sekvensen direkte 5ʹ af rammeprogrammet.
- Forstyrre crRNA bindingssteder i donor skabelon plasmid at forhindre Cas9 skæring af donor sekvens (Se diskussion for overvejelser, når at ændre crRNA bindingssteder). Hvis det er muligt, foretrækkes afbrydelse af PAM til en sekvens end NGG eller NAG. Alternativt, at indføre punktmutationer til tre baser i regionen frø af crRNA (10 baser proksimalt for PAM) forventes at tilstrækkeligt forstyrre crRNA bindende. Nogle crRNA bindingssteder er forstyrret af indførelsen af FP sekvens i donor skabelon plasmid; sikre, at ingen PAM, eller intakt bindende regionen stadig eksisterer i disse tilfælde.
Bemærk: I siliciummangan donor skabelon plasmid kan indgives for gen syntese af en kommerciel leverandør, eller det kan bruges som udgangspunkt til at designe en kloning strategi, som er uden for rammerne af denne protokol. En simpel rygraden som pUC19 eller pUC57 er tilstrækkelige.
2. ribonucleoprotein (RNP) Transfektion for CRISPR/Cas9 medieret Knock-i i hiPSCs
Bemærk: I denne protokol, udtrykket 'gRNA' beskriver syntetisk crRNA og tracrRNA korrekt re suspenderet, kvantificerede og pre-kompleksbundet pr fabrikantens anvisninger (Se Tabel af materialer). Supplere alle medier med 1% Penicillin Streptomycin. Generelle dyrkningsbaserede retningslinjer af WTC hiPSC linje er beskrevet mere detaljeret på Allen celle Explorer18,19. WTC hiPSCs anvendes i denne protokol, men med ordentlig Transfektion optimering, elektroporation af RNP og donor skabelon plasmid kan tilpasses med succes til andre celletyper.
- Forberede 10 µM arbejder bestande af gRNA og vildtype S. pyogenes Cas9 protein2,20; holde på is. Forberede 1 µg/µL arbejder bestand af donor skabelon plasmid; holde ved stuetemperatur (RT). Brug pH 8,0 TE buffer for alle fortyndinger.
- Forberede en matrix-belagt 6-godt vævskultur plade med 5 mL frisk vækst medier suppleret med 10 µM ROCK inhibitor (Ri) pr. brønd. Holde plade med medier i inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 indtil klar til plade celler efter Transfektion procedure (højst 2 h).
Bemærk: Alle matrix-belagte plader anvendes i denne protokol er lavet ved at tilføje et bind for iskold Matrigel fortyndes 1:30 i kolde DMEM/F12 medier ifølge Allen Institute for celle videnskab protokol for dyrkning WTC hiPSC linje19. - Brug en blid encellede dissociation reagens, som anbefalet i Tabel af materialer, passage hiPSCs i én celle suspension og tælle celler ved hjælp af en automatiseret celle counter, eller hemocytometer.
Bemærk: En detaljeret protokol for linjen WTC hiPSC bruges her kan findes på Allen celle Explorer19. Kort, vaske cellerne en gang med RT DPBS og behandle med dissociation reagens i 3-5 minutter. Derefter hakkede celler i én celle suspension af blid pipettering og pellet ved centrifugering. Resuspenderes levende celle i vækst medier suppleret med 10 µM Ri.- Forberede en alikvot af 1,84 x 106 celler for hver eksperimentelle betingelse at være transfekteret i separate 1,5 mL rør.
Bemærk: Alle diskenheder er beregnet for en 4,5 µL samlede reaktion volumen i en 100 µL elektroporation volumen, gange 2,3 reaktioner. Denne tegner sig for dublerede Transfektion og overskydende for pipettering fejl.
- Forberede en alikvot af 1,84 x 106 celler for hver eksperimentelle betingelse at være transfekteret i separate 1,5 mL rør.
- Forberede ribonucleoprotein (RNP) kompleks rør for hver eksperimentelle betingelse ved at tilføje 2,88 µL af 10 µM gRNA og 2,88 µL af 10 µM Cas9 til en 1,5 mL tube. Der inkuberes ved RT i mindst 10 min (maksimalt 1 h).
- Pellet én celle alikvot (udarbejdet i trin 2.3.1) ved 211 x g i 3 min på RT. aspirat supernatanten og resuspend celle pellet i 220 µL af producentens elektroporation buffer.
- Tilføje 220 µL af resuspenderede celler fra trin 2,5 til 1,5 mL RNP komplekse tube forberedt i trin 2.4.
- Tilføje 4.60 µL 1 µg/µL donor skabelon plasmid til 1,5 mL tube forberedt i trin 2.4.
- Brug nucleofection spids og pipette til at blande rør indholdet 2 - 3 gange, derefter overføre 100 µL af suspension til rede elektroporation enhed. Undgå at indføre nogen bobler i spidsen. Anvende 1300 V for 1 pulsen på 30 ms.
- Forsigtigt overføre suspension til rede 6-godt pladen fra trin 2.2 med en hvirvlende bevægelse. Sprede celler ved at forsigtigt flytte pladen side til side og front-to-back.
- Bruger en ny nucleofection-tip, Gentag trin 2,8-2,9 med de resterende 100 µL af suspension og overførsel til en anden brønd af rede 6-godt plade.
- Gentag trin 2.4 gennem 2.10 for hver gRNA og donor skabelon plasmid kombination, herunder ikke-targeting gRNA, donor skabelon plasmid kun og buffer eneste kontrolelementer. Sørge for at ændre pipette og nucleofection tips til at undgå krydskontaminering.
- Inkubér transfekteret celler ved 37 ° C og 5% CO2. Ændre medierne til regelmæssig vækst medier (ingen Ri) på 24 h, og fortsætte med fodring hiPSCs hver 24 h i 72-96 timer, overvågning af confluency. Når hiPSCs når 60-80% sammenløb, Fortsæt til trin 3.
Bemærk: Tunge celledød (> 70%, anslået) er normalt 24-48 h efter Transfektion.
3. FACS-berigelse af derfor redigeret hiPSCs
Bemærk: Når sortering stamceller, tilpasse Apparatindstillingen for at fremme celle overlevelse som foreslået i diskussionen. Kort, bruge den største dyse muligt (130 µm), en lav strømningshastighed (≤ 24 µL/min), konserveringsmiddel-fri kappe væske (f.eks. saltvand, se Tabel af materialer), og lave prøve pres (10 psi).
- Forud for begyndelsen en FACS eksperiment, ændre media vækst medier suppleret med 10 µM Ri og inkuberes celler ved 37 ° C og 5% CO2 for 2-4 h for at fremme overlevelse efter FACS.
- Brug en blid encellede dissociation reagens som anbefalet i Tabel af materialer, passage hiPSCs i én celle suspension i vækst medier suppleret med 10 µM Ri19.
- Filtrer hiPSC suspension gennem 35 µm mesh-filter i polystyren rundbundet rør.
- Sortere celler ved hjælp af forward scatter og side scatter (herunder højde vs bredde) at udelukke debris og dubletter. Brug live, buffer kun styre celler til at indstille FP-positive gate, således at < 0,1% af buffer kun celler falder inden for porten.
- Sortere hele befolkningen i FP-positive celler ind i en 1,5-15 mL polypropylen rør indeholdende 0,5-2 mL RT vækst medier suppleret med 10 µM Ri.
Bemærk: Polypropylen reducerer mulighederne for celle vedhæftning til plast. - Centrifugeres indsamlede celler ved 211 x g i 3 min på RT.
- Omhyggeligt Aspirér supernatanten og resuspend celle pellet i 200 µL af vækst medier suppleret med 10 µM Ri. Overføre op til 3.000 sorteret celler til et enkelt godt af en frisk matrix-belagt 96-brønd plade19.
Bemærk: Med passende instrument setup, celler kan også sorteres (i bulk) direkte ind i et enkelt godt af en matrix-belagt 96-brønd vævskultur plade der indeholder 200 µL af vækst medier suppleret med 10 µM Ri på en anbefalet massefylde på 1.000-3.000 celler pr. brønd for hiPSC. - Inkuber sorteret celler ved 37 ° C og 5% CO2. Ændre medierne til vækst medier suppleret med 5 µM Ri på 24 h. På 48 h begynde fodring celler regelmæssig vækst medier (ingen Ri) hver 24 h i 72-96 timer, overvågning af confluency. Overlevelse efter FACS skønnes for at være større end 50%, hvis mindst 500 celler er seedet i et godt af en 96-brønd plade.
- Når hiPSCs når 60-80% sammenløbet og Vis modne morfologi (glat, godt pakket koloni Centre), passage ind i et større format plade som en 24-godt plade, så fra en 24-godt plade i en 6-godt plade.
- Når hiPSCs i en 6-godt plade nå 60-80% sammenløbet og Vis modne morfologi, udvide til en 100 mm plade, re plade til billedbehandling, cryopreserve eller frø på klon plukning tæthed (trin 4)19.
4. generere derfor redigeret klonede hiPSC linjer
- Brug en blid encellede dissociation reagens, som anbefalet i Tabel af materialer, passage hiPSCs i én celle suspension og bestemme antallet af celler pr. mL19.
- Frø 10.000 celler af den redigerede population af hiPSCs på en frisk matrix-belagt 100 mm vævskultur parabol vækst medier suppleret med 10 µM Ri19. Ændre medierne til vækst medier uden Ri 24 timer efter såning, og foder hiPSCs med friske vækst medier hver 24 h til 5-7 dage.
- Når hiPSCs har dannet kolonier, der er synlige makroskopisk (ca. 500 µm), de er store nok til at være isoleret. Forberede en matrix-belagt 96-brønd plade ved sugning overskydende matrix og tilføje 100 µL af vækst medier suppleret med 10 µM Ri pr. godt19.
- På dissekere mikroskop brug en P-200 pipette, eller ligner forsigtigt skrabe og Opsug enkelte kolonier fra plade overflade. Overføre volumen (~ 20-100 µL) indeholdende koloni til et enkelt godt af 96-brønd pladen forberedt i trin 4.3.
- Efter alle kolonier er blevet overført, Ruger plade i en vævskultur inkubator ved 37˚C og 5% CO2. Ændre medierne til regelmæssig vækst medier (ingen Ri) på 24 h, og fortsætte med fodring celler hver 24 h i 72-96 timer indtil kolonier har cirka tredoblet i størrelse (ca 1500 µm).
Bemærk: Picking 24-96 kolonier pr. crRNA anvendes i Transfektion anbefales. Overlevelse af isolerede kloner er typisk større end 95%.
- Efter alle kolonier er blevet overført, Ruger plade i en vævskultur inkubator ved 37˚C og 5% CO2. Ændre medierne til regelmæssig vækst medier (ingen Ri) på 24 h, og fortsætte med fodring celler hver 24 h i 72-96 timer indtil kolonier har cirka tredoblet i størrelse (ca 1500 µm).
- Brug en blid encellede dissociation reagens som anbefalet i Tabel af materialer, kloner passage hiPSC i en ny matrix-belagt 96-brønd plade som følger19.
- Brug af en 8-kanal indsugningsventil, Fjern og kassér medier fra den første kolonne i 96-brønd plade.
- Ved hjælp af en P-200 multikanalpipette, tilføje ~ 200 µL af DPBS til den første kolonne i 96-brønd pladen til at vaske cellerne. Brug af en 8-kanal indsugningsventil, Fjern og kassér DPBS vask fra den første kolonne i 96-brønd plade.
- Ved hjælp af en P-200 multikanalpipette, tilføje 40 µL af dissociation reagens til den første kolonne i 96-brønd plade.
- Gentag trin 4.5.1-4.5.3 for op til i alt seks kolonner af 96-brønd plade, ændre tips at være sikker på ikke cross-forurene brønde. Pladen anbringes i 37 ° C inkubator for 3-5 minutter fra det tidspunkt dissociation reagens blev tilføjet til den første kolonne (trin 4.5.3).
Bemærk: Det anbefales at eneste passage højst seks kolonner (48 wells) på et tidspunkt på grund af den tid det tager for at udføre disse trin. Når du udfører denne protokol for første gang, start med kun passaging et eller to kolonner på en gang. Begrænse antallet af kolonner passaged på én gang sikrer, at cellerne ikke efterlades i dissociation reagens for længe, hvilket kan være skadeligt for hiPSCs. - Når cellerne i den første kolonne af pladen er begyndt at løfte pladen bunden, multikanalpipette P-200 at tilføje 160 µL af DPBS til den første kolonne i 96-brønd plade og forsigtigt hakkede cellerne på "12:00" , "3:00", "6:00" og "9:00" positioner i hver brønd. Overføre hele mængden af cellesuspension (200 µL) til en V-bund 96-brønd plade.
- Gentag trin 4.5.5 for de resterende kolonner af celler, der har dissociation reagens i dem; ændre tips om ikke cross-forurene brønde.
- Spin V-bundplade i en centrifuge på 385 x g i 3 min. på RT.
- Ved hjælp af en P-200 multikanalpipette, forsigtigt fjerne supernatanten og resuspend celler i 200 µL af friske vækst medier suppleret med 10 µM Ri pr. brønd. Gentag for alle brønde, ændre tips om cross-forurener.
- Overføre alle cellesuspension til en frisk matrix-belagt 96-brønd plade19. Inkuber plade i en vævskultur inkubator ved 37 ° C og 5% CO2. Ændre medierne til regelmæssig vækst medier (ingen Ri) på 24 h, og fortsætte med fodring celler hver 24 h i 72-96 timer, indtil fleste af kloner nå 60-80% sammenløb.
Bemærk: Denne passage hjælper til at sprede ud af cellerne og giver mulighed for mere vækst over hele området med 96 brønde plade.
- Observere kloner og identificere en passende delingsforholdet for hver enkelte klon i 96-brønd plade (f.eks. 1:10 eller 1:8). Brug en blid encellede dissociation reagens som foreslået i Tabel af materialer, kloner passage hiPSC i en ny matrix-belagt 96-brønd plade (trin 4.5.1-4.5.8) overføre forholdet mellem cellesuspension til hver klon. Inkuber plade i en vævskultur inkubator ved 37˚C og 5% CO2. Ændre medierne til regelmæssig vækst medier (ingen Ri) på 24 h, og fortsætte med fodring celler hver 24 h i 72-96 timer, indtil fleste af kloner nå 60-80% sammenløb, og Vis modne morfologi.
Bemærk: Hver klon kan have en anden delingsforholdet bestemmes på grund af lidt forskellige vækst eller overlevelse fra de tidligere passage, så denne passage hjælper til at normalisere antallet af celler pr. brønd af hver klon til frysning skridt til at følge. På grund af de varierende satser for overlevelse og vækst, kan nogle kloner vokse hen over eller undlader at vokse under disse passaging trin.- Gem resten af cellesuspension og pellet for gDNA isolation ved centrifugering celler i en V-bund 96-brønd plade på 385 x g i 3 min. på RT. Fjern supernatanten og gå videre til gDNA isolation ved hjælp af en 96-brønd kit eller gemme plade pelleted celler i - 20˚C for op til thr ee uger.
5. kryopræservering af klonede cellelinjer i 96-brønd plade format
- Ved hjælp af en enkelt celle dissociation reagens, passage hiPSC kloner som tidligere beskrevet (trin 4.5.1-4.5.7). Opsug supernatanten ved hjælp af en P-200 multikanalpipette og genopslæmmes i 60 µL af vækst medier suppleret med 10 µM Ri. Gentag for alle brønde; ændre tips om cross-forurener.
- Overføre 30 µL af cellesuspension til en ikke-matrix belagt 96-brønd vævskultur plade. Derefter hurtigt tilføje 170 µL frysning buffer (Se Tabel af materialer) til hver brønd, uden blanding. Gentag ved at overføre de resterende 30 µL af suspension i en søster plade og tilføje 170 µL frysning buffer.
Bemærk: Denne proces sker i dublerede søster plader så et back-up befolkning af celler findes efter optøning en af de enkelte plader. Ibrugtagning kun hver anden kolonne i en 96-brønd plade befrugtede celler giver mulighed for hurtigere optøning (trin 5.6). - Wrap plade med parafilm og sted i en RT Styrofoam boks med låg. Placer boksen hele i et-80 ° C fryser.
- Efter 24 h kan plader overføres ud af boksen Styrofoam og opbevares ved - 80˚C for op til fire uger.
Bemærk: Mens cellerne er midlertidigt opbevares ved-80 ° C, genetiske kvalitet kontrol-assays kan udføres med gDNA høstet fra celler fremstillet i trin 4.6.1 for at identificere kloner til at tø og udbrede yderligere, som drøftet i tidligere udgivne arbejde 12. kort, en kopi nummer droplet digital PCR assay kan bruges til at identificere kloner, der indeholder en eller to kopier af normal god landbrugspraksis og ingen donor skabelon plasmid rygraden integration. En kombination af end-point PCR assays og Sanger sekvensering kan derefter identificere kloner, der indeholder en præcis indsætte. - For at tø, bringe hele pladen til 37 ° C i en vævskultur inkubator, ser omhyggeligt for ice pellets til at smelte. Brønde på kanten af pladen har tendens til at tø først.
- Når isen pellet af ønskede klon smelter, forsigtigt overføre hele 200 µL til en 15 mL konisk tube indeholder 3 mL af RT vækst medier suppleret med 10 µM Ri og centrifugeres ved 211 x g i 3 min på RT.
- Opsug supernatanten og resuspend pelleted celler i 1 mL RT vækst medier suppleret med 10 µM Ri. Overførsel til en frisk matrix-belagt 24-godt plade og inkuberes ved 37˚C og 5% CO2. Ændre medierne til regelmæssig vækst medier (ingen Ri) på 24 h, og fortsætte med fodring celler hver 24 h i 72-96 timer indtil klonen når 60-80% confluency og har modne morfologi19.
Representative Results
Målet med dette eksperiment var at sammensmelte mEGFP (monomere forbedret NGL) at den nukleare lamin B1 protein ved at indføre mEGFP sekvens til 5ʹ slutningen af LMNB1-genet (N-terminalen af proteinet). En linker (aminosyresekvens SGLRSRAQAS) blev valgt på grundlag af tidligere cDNA konstruktioner fra Michael Davidson fluorescerende proteiner samling21. Fordi regionen crRNA bindende i donor skabelon plasmid for hver kandidat crRNA blev forstyrret efter i siliciummangan indsættelse af mEGFP og linker sekvens, ingen punktmutationer skulle gøres for at forstyrre potentielle crRNA anerkendelse og spaltning af Cas9 af donor sekvens (figur 1). Donor sekvens indeholdt 1 kb homologi arme flankerende begge ender af mEGFP-linker sekvens. De resulterende 2,734 bp DNA blev klonet i en pUC57 rygrad, sekvensen verificeres, og den resulterende donor skabelon plasmid blev renset ved hjælp af en endotoxin-fri maxi prep. Donor skabelon plasmid og RNP komplekse var transfekteret, derfor redigerede celler blev beriget og lokalisering af de mEGFP-nukleare lamin B1 fusion protein blev bekræftet af Fluorescens mikroskopi (figur 2). Kun resultater fra crRNA1 Transfektion er beskrevet her, selv om begge crRNA sekvenser produceret derfor redigerede populationer12.
I forhold til den negative kontrol, som indeholdt ingen gRNA, Cas9 protein eller donor skabelon plasmid elektroporation reaktion (kun buffer), LMNB1 crRNA1 transfekteret indeholdt celler 0,95% mEGFP-positive celler repræsenterer den derfor redigerede mEGFP-nukleare lamin B1 befolkning (figur 3a). Dette resultat var inden for rækkevidde af knock-i effektivitetsgevinster observeret på tværs af mange genomisk loci ved hjælp af denne metode, som tidligere rapporteret12.
MEGFP-positive celler blev isoleret af FACS og afbildet af levende mikroskopi til at bekræfte forventede lokalisering af den mEGFP-nukleare lamin B1 fusion protein til nukleare konvolutten. Efter FACS-berigelse var ca 90% af sorterede celler fra befolkningens LMNB1 crRNA1 mEGFP-positive (som fastlagt af mikroskopi), tyder på, at nogle mEGFP-negative celler Co renset med normal god landbrugspraksis-positive celler under proceduren sortering. Dette var et acceptabelt niveau af berigelse, der er tilladt for pluk af 96 kloner, der kunne derefter genetisk screenet for vellykket redigering. Generelt, en skæringsdato for vellykket berigelse er 50% normal god landbrugspraksis positive.
Størstedelen af befolkningens sorteret celle vises fluorescens på nuklear kuvert (nukleare periferien) i nondividing celler og til en udvidet nuclear lamina i cytoplasma under mitosen giver tillid i den korrekte genomisk redigere på LMNB1 locus. Befolkningens beriget indeholdt celler med enten lys eller svagt signal. Denne forskel i signal intensitet kan afspejle en kombination af rigtige og forkerte redigering resultater og højdepunkter utility til at generere en genetisk validerede klonede linje for yderligere undersøgelser (Se diskussion) (figur 3b)12. Efter klonede linje generation, validerede genetisk celler viste ensartet normal god landbrugspraksis intensitet i mikroskopi eksperimenter (figur 3 c).
Figur 1 . Design strategi for N-terminus NGL tagging af LMNB1 gen. Koden normal god landbrugspraksis var designet til N-terminale indsættelse 5ʹ af den første exon af LMNB1 placeret på kromosom 5. Både 5ʹ og 3ʹ homologi arme er 1 kb hver og mødes mellem start codon (ATG) og den anden codon (homologi arme kun delvist repræsenteret i figur). To kandidat crRNAs var designet til at guide Cas9 til spaltes så tæt på den tilsigtede indsættelsesstedet som muligt, mens du stadig være unikke i genomet. Rækkefølge for mEGFP og en aminosyre linker blev indsat bare 3ʹ af start codon (mEGFP og linker sekvens ikke at skalere). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Arbejdsproces til fremstilling af endogent markeret hiPSC klonede linjer. Transfektion komponenter, herunder Cas9/crRNA/tracrRNA RNP komplekset (vist som røde Cas9 protein med guld crRNA og lilla tracrRNA), de donor skabelon plasmid som indeholder homologi arme (HAs, vist i guld), og FP + linker sekvens (vist i grøn), var electroporated. Efter 4 dage, blev FP-positive derfor redigeret celler beriget af FACS og udvidet som en befolkning af såning alle de sorterede celler i en enkelt brønd af en 96-brønd plade (~ 1.000 celler), og derefter udvidet i kultur indtil flere millioner indbyggere arbejder celler kan analyseres som befolkningens"beriget" (se protokollen trin 3.8). FP-positive celler udbyttet af eksperiment på grund af variabel rente af HDR12; en vellykket berigelse kan typisk omfatte ~ 300-5.000 celler efter Transfektion af ca 1,6 x 106 hofter celler. Foreløbige billeddiagnostiske undersøgelser bekræftet signal og lokalisering af fusion protein i befolkningens beriget. Kolonier blev manuelt samlet i en 96-brønd plade for ekspansion og kryopræservering. Yderligere genomisk kvalitetskontrol screening ved hjælp af droplet digital PCR (ddPCR) og andre PCR-baserede assays blev derefter brugt til at identificere korrekt redigerede kloner, som tidligere beskrevet12. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Berigelse af derfor redigerede cellepopulationer. (A) Flow flowcytometri parceller af LMNB1 redigeret celler fire dage efter Transfektion. Y-aksen viser normal god landbrugspraksis intensitet og x-aksen viser forward scatter. Sortering gates var indstille baseret på den buffer, der kun kontrol. Da hiPSCs er følsom over for undertrykkelse af netbårne, live/døde pletten var udeladt og en meget konservativ FSC/SSC gate blev brugt i stedet. (B) efter berigelse, populationen af LMNB1 Cr1 redigeret celler viste ~ 90% af celler med normal god landbrugspraksis lokalisering til nukleare kuvert (forventet LMNB1 lokalisering). Befolkningen indeholdt celler af varierende normal god landbrugspraksis intensitet samt nogle normal god landbrugspraksis-negative celler. Skala barer er 10 mikrometer. (C) efter klonede linje generation, celler viste en ensartet normal god landbrugspraksis intensitet, med nogle cellecyklus afhængige forskelle. Skalalinjen er 20 mikron.
Discussion
Metoden fremlægges her til generering af endogent reguleret fluorescerende protein fusioner i hiPSCs er en alsidig og kraftfuld tilgang til at generere gen redigeret cellelinjer med applikationer lige fra levende celle imaging til forskellige funktionelle studier og " i et fad"sygdomsmodeller ved hjælp af patient-afledte hiPSC linjer13,14,15. Mens denne metode har været brugt til at indføre store FP tags til N - eller C-terminus af endogene proteiner, kunne det potentielt bruges til at indføre andre tags eller små genetiske ændringer til model eller korrekte sygdomsforårsagende mutationer22,23 . Til mindre skær, størrelsen af homologi arm kan reduceres, men den generelle tilgang til redigering, præsenteret i denne metode kan stadig gælde24,25. Mens brugen af hiPSCs er kraftigt opfordret til deres store utility, med omhyggelig optimering, kan denne protokol tilpasses for at redigere genomer af andre pattedyr cellelinjer.
Når du identificerer et gen af interesse for FP tagging, udskrift overflod skøn (fra microarray eller RNA-Seq data) er et godt udgangspunkt for vurderingen af, om et gen eller isoform af interesse er udtrykt, selv om afskriften niveauer ikke altid korrelerer med protein niveauer. FACS-berigelse strategi beskrevet her vil fungere bedst for gener, der er mindst moderat godt udtrykt i celletype af interesse. Denne strategi har også været en succes i at vælge for fusioner, der viser punktformet og/eller diskrete lokalisering mønstre som centrin, desmoplakin og paxillin hvor signal-baggrund-forholdet er meget lav12,19. Gener, der udtrykkes ikke meget eller er kun udtrykt i afledte celletyper kan kræve yderligere udvalg strategier.
Udgangspunktet for crRNA og donor skabelon plasmid design anvendes i human cellelinjer bør være menneskelige reference genom (GRCh38). Fordi genomer af forskellige cellelinjer kan variere inden for samme art, og fordi CRISPR/Cas9 sekvens-specifikke, det er ekstremt nyttigt at identificere celle linjespecifikke varianter (single nucleotide polymorphisms eller indrykninger/sletninger (indels)) der adskiller sig fra reference genom og indarbejde disse i design. Dette sikrer, at crRNAs vil være forenelig med værten genom og at donor skabelon plasmid homologi våben vil bevare cellelinie specifikke varianter. En foreslåede strategi er at indarbejde homozygot varianter i crRNAs og donor skabelon plasmid homologi arme under designprocessen. Indarbejde heterozygous varianter er valgfri. De specifikke reagenser anvendes til store knock-i eksperimenter og andre centrale overvejelser i forbindelse med denne protokol er diskuteret nedenfor.
Cas9 Protein
Den primære fordel ved hjælp af Cas9 protein er der introducerer Cas9 og gRNA som en kompleks RNP har vist sig at resultere i en begrænset varighed af nukleasen aktivitet sammenlignet med plasmid-baserede tilgange hvor udtryk for Cas9 og gRNA kan fortsætte i dage og fører til større om - og off-målet aktivitet26,27. En yderligere fordel ved at anvende Cas9 protein er, at det er let tilgængelige for kløve en gang inde i cellerne. Dette står i kontrast til mere konventionelle metoder for at bruge Cas9 mRNA eller Cas9/gRNA plasmid, der kræver transskription, translation og protein behandling26,28. Vildtype S. pyogenes Cas9 protein er nu tilgængelig fra mange kommercielle kilder.
Guide RNA
Der er mange offentligt tilgængelige værktøjer til at finde crRNA mål i nærheden af den ønskede FP indsættelsesstedet, som har nul eller par forudsagte off-mål i vært genom29,30,31,32. Effektivitetsgevinster i HDR og præcisionen af HDR resultatet varierer meget mellem crRNA mål anvendes på en given locus12. Af denne grund, test flere crRNAs (2-4 og helst inden for 50 bp af ønskede indsættelsesstedet) pr. locus er anbefales, da dette kan øge sandsynligheden for en vellykket redigering eksperiment. Nuværende muligheder for at levere gRNA omfatte syntetisk 2-del crRNA og tracrRNA, syntetisk enkelt gRNAs (sgRNAs), in vitro- transskriberet sgRNAs, eller levere en plasmid til celler, der udtrykker sgRNA fra en U6 promotor. Denne protokol blev ikke optimeret til høj kavalergang aktivitet. Uforandret 2-del crRNA og tracrRNA (Se Tabel af materialer) blev brugt med formålet at generere mono-allel FP-tagged cellelinjer samtidig forårsager den mindst mulige undertrykkelse af netbårne til cellerne.
Donor skabelon Plasmid
Fordi nogle af homologi arm sekvens forudsat i donor skabelon plasmid vil blive indarbejdet i vært genom under hændelsen HDR, bør punktmutationer til crRNA anerkendelse websteder indføres for at forhindre yderligere spaltning af Cas9 efter HDR. Ofte er den enkleste forstyrrende ændring at mutere PAM sekvens. Fordi nogle ikke-kanoniske PAM sekvenser kan stadig genkendes af vildtype S. pyogenes Cas9, er det bedst at undgå at bruge NGG, NAG eller NGA33. Når muterer homologi arm, undgå ikke-synonym mutationer og indførelsen af sjældne kodon. Hvis en synonym ændring til PAM sekvens ikke er muligt, overveje at gøre tre synonymt punktmutationer i regionen frø (10 bp proksimalt for PAM) af crRNA bindingssted. Største omhu bør tages, når du foretager disse ændringer i 5ʹ utranslaterede region (UTR), da disse regioner kan indeholde vigtige lovgivningsmæssige sekvenser. Høring en genetisk bevarelse database som UCSC genom browserens Komparativ genomforskning spor kan vejlede i disse tilfælde, da ændringer ikke bevaret baser kan være bedre tolereret end ændringer meget bevaret baser17. Undertiden er blot indsættelse af FP sekvens nok til at forstyrre crRNA bindingssted (som i figur 1); men den nyligt tilføjede sekvens skal kontrolleres for vedvarende crRNA bindende og PAM sekvenser.
Aminosyre linkers mellem rammeprogrammet og de indfødte protein anbefales at bevare funktionen af fusion protein34. Ofte kan en aminosyre linker vælges for dens bestemt gebyr eller størrelse. Hvis en cDNA fusion med et design ligner den målrettede endogene er fusion protein blevet godt undersøgt, at samme linker sekvens kan anvendes til CRISPR/Cas9 knock-i eksperimentet12,19. Hvis sådanne oplysninger ikke er tilgængelig, en kort linker som GTSGGS har også været anvendt med succes12. Andre studier har påvist succes med en generisk små 3-amino syre linker sekvens for en række mål35.
Transfektion og FACS berigelse
Mange kommercielt tilgængelige Transfektion reagenser er formuleret for levering af visse typer af molekyler i celler, der henviser til, at en elektroporation system kan bruges til at levere reagenser med en bred vifte af størrelse, ladning og sammensætning. Ud over at være en fælles Transfektion metode for svært at transfect celler som hiPSCs, bærer elektroporation også fordel af levere alle tre komponenter til CRISPR/Cas9-medieret FP knock-i som beskrevet i denne metode. Elektroporation blev fundet til at producere de bedste resultater i forhold til andre kommercielt tilgængelige reagenser når udvikle denne metode (data ikke vist), og er også blevet brugt af andre for RNP levering26,28,36 .
Når du bruger denne protokol til at redigere hiPSCs, tages særlige pleje til at sikre skånsom håndtering af celler før og efter gen redigeringsprocessen for optimal celle overlevelse og minimal spontan differentiering. Især FACS berigelse metoder bør tilpasses for at sortere stamceller ved hjælp af den største dyse muligt (130 µm), en lav strømningshastighed (≤24 µL/min), konserveringsmiddel-fri kappe væske (f.eks. saltvand, se Tabel af materialer), og lave prøve pres (10 psi). I stedet for enkelt celle sortering, hvilket resulterer i suboptimal levedygtighed i stamceller, er de FACS-beriget hiPSCs sorteret i bulk og udvidet som en befolkning til at optimere celle levedygtighed og stamceller integritet. Dog kan enkelt celle sortering være relevante for mindre følsomme celletyper. For at fremme celle overlevelse, er celler vendt tilbage til kultur ikke længere end en time efter høst for FACS berigelse og opbevares ved stuetemperatur under hele sorteringen. For nogle celletyper, kan celle overlevelse også forbedres ved kvægbruget celler på is (4° C) under hele sorteringen.
Bulk udvidelse af FP-positive celler giver mulighed for at evaluere befolkningen af imaging analyse for fusion protein lokalisering inden generering klonede linjer. Mens den resulterende berigede befolkning af celler kan være tilstrækkeligt for nogle undersøgelser, vises disse populationer ofte FP signal af varierende intensitet. De isolerede klonede linjer har ensartet signal (figur 3), hvilket gør dem mere relevante for funktionelle eksperimenter12.
Klonede celle linje Generation
I hele den redigering og klonede linje generation proces er det vigtigt at overvåge celle morfologi. hiPSC kolonier vokset i feeder-fri betingelser skal udstille glatte kanter og en selv, godt pakket center12,18,19. Differentierede celler bør observeres i mindre end 5% af kulturen. Når picking enkelte kolonier, Vælg de at udstille gode morfologi. Under 96-brønd pladen passaging begivenheder, kontrollere kloner til morfologi og afbryde dem, der har tilgroet, da dette kan føre til differentiering eller være en indikation af genetiske ustabilitet.
Generation af klonede cellelinjer giver mulighed for genetisk bekræftelse af præcise redigering, hvilket er vigtigt, fordi Cas9-induceret dobbeltstrenget pauser i genomet er ofte repareret upræcist trods indarbejdelse af tag på det ønskede sted. Tidligere beskrevet PCR-baserede analyser viste, at kumulativt over ti unikke genomisk loci mange (45%) af FP-udtrykker kloner lidt fra donor plasmid rygraden integration i den målrettede locus eller (sjældent) tilfældigt i genom12. Derudover 23% af normal god landbrugspraksis-positive kloner (n = 177) på tværs af ti unikke loci fandtes for at havnen mutationer på eller i nærheden af webstedet forventede crRNA opskæring i de ukodede allel, sandsynligvis på grund af NHEJ12. Denne genetiske analyser af mange klonede linjer (~ 100 kloner/Rediger) understregede betydningen af genetiske validering, det ikke er muligt i en celle population fordi FP-udtryk og forventede fusion protein lokalisering alene ikke garanterer præcis redigering12 . Derudover kan ikke disse PCR-baserede analyser udføres på en beriget befolkning af celler med sikkerhed, berettiger behovet for klonede linje generation før meningsfuld analyse kan fuldføres. Genetisk bekræftelse af de indsatte FP tag og verifikation af den genetiske integritet af den uredigerede allel (i en mono-allel redigerede klon) er begge nødvendige for at sikre præcis redigering på den målrettede locus ud over mærkatudtrykket.
En lav grad af bi-allel redigeringer og mangel på off-target mutationer (som analyserede af Sanger og exome-sekventering) er blevet observeret til dato ved hjælp af denne metode (ikke-offentliggjorte data)12. Dette er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser beskriver brugen af kort-varigt RNP til CRISPR/Cas9 eksperimenter26,27. Manglen på klonede cellelinjer med bi-allel redigeringer kan også være locus specifikke eller på grund af cellen manglende evne til at tåle to markeret kopier af en vigtig protein som foreslået fra tidligere udgivne eksperimenter hvor formodede bi-allel redigerede celler blev observeret for et locus (LMNB1), men ikke en anden (TUBA1B)12. Bi-allel fuldt valideret klonede cellelinjer der er genereret ved hjælp af denne metode til at tag ST6 beta-galactoside alpha-2, 6-sialyltransferase 1 (ST6GAL1), og RAB5A medlem RAS onkogen familie (RAB5A) med mEGFP19.
Ud over bekræfter præcision af edit på genomet, der er en bred vifte af kvalitet kontrol-assays, der kan bruges til yderligere at karakterisere den klonede linje og identificere kloner, der opfylder alle stamceller, genomisk, og celle biologiske kriterier til brug i fremtidige undersøgelser . Celle biologisk og funktionel assays kan bruges til at bekræfte passende udtryk, lokalisering og funktion af fusion protein12. Sammenligningen til uredigeret Forældrekontrol vil hjælpe vurdere redigeringsprocessen indflydelse på lokalisering, dynamik og funktion. Andre assays afgøre såsom vækst analyse og test for genomisk stabilitet kan også hjælpe, om den mærkede protein er forstyrrende til cellen. Når du bruger hiPSC i denne protokol, kan evaluering af pluripotency markører og differentiering potentiale være afgørende ved fastsættelsen af en klon, der er værdifulde for nedstrøms undersøgelser12. Fordi udvidet kultur af hiPSC har vist sig at føre til genetiske ustabilitet, overvågning af vækstrate og karyotype af klonede cellelinjer er også vigtige12,37. Dog beregnet endelige brugen af de redigerede celler vil i sidste ende bestemme niveau og bredde af kvalitetskontrol analyse og vil variere baseret på programmet.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Daphne Dambournet for mange indsigtsfulde drøftelser og rådgivning om gen redigering, Thao for illustration, Angelique Nelson for kritisk læsning af håndskriftet, og Andrew Tucker til at generere linjen mEGFP-tagged Lamin B1 celle. Vi ønsker at anerkende de stamceller og genet Editing og Assay udviklingsteams på Allen Institute for celle videnskab for deres bidrag til gen redigering og kvalitetskontrol. Linjen WTC, som vi brugte til at oprette vores gen-redigeret cellelinie blev leveret af Bruce R. Conklin Laboratory på Gladstone institutter og UCSF. Vi takker Allen Institut for celle videnskab grundlægger, Paul G. Allen, for hans vision, opmuntring, og støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Geneious R9 | Biomatters, or similar | bioinformatics software for in silico donor plasmid design | |
| TE Buffer pH 8.0 | IDT, or similar | 11-01-02-05 | |
| HERAcell VIOS 160i CO2 incubator, or similar | ThermoFisher Scientific, or similar | 51030408 | |
| Pipettes (1000 µL, 200 µL, 20 µL, 10 µL, 2 µL) | Rainin, or similar | ||
| Pipette tips (1000 µL, 200 µL, 20 µL) | Rainin, or similar | ||
| Multi-channel Pipette (200 µL) | Rainin, or similar | ||
| Serological pipetes (25 mL, 10 mL, 5 mL) | Costar, or similar | ||
| BRAND 8-Channel Manifold for Quiksip, Autoclavable | Millipore Sigma, or similar | BR704526-1EA | use with non-filtered pipet tips, such as Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10, below |
| Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10 | Thermo Fisher, or similar | 3501-05 | |
| XP2 Pipette Controller | Drummond, or similar | 4-000-501 | |
| Disposable Pasteur Pipets | VWR, or similar | 53300-567 | |
| Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | CELLGARD, or similar | NU-481 | |
| Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | lot tested before use with hiPSC |
| DMEM/F12 (-phenol red) | Gibco | 11039-021 | cold, for diluting Matrigel 1:30 |
| mTeSR1 Complete Media | StemCell Technologies | 85850 | recommended growth media for WTC hiPSC line |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| WTC hiPSC line | Coriell | GM25256 | the hiPSC line used in this protocol is available through Coriell |
| Tissue culture dish 100 mm | Falcon | 353003 | |
| 6-well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 657160 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A11105-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| 15 mL polystyrene conical | Sarstedt | 62.554.100 | |
| Y-27632 (ROCK Inhibitor) | StemCell Technologies | 72308 | |
| Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic crRNA, unmodified (custom sequence) | Dharmacon | Custom0247 | |
| Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA | Dharmacon | U-002005-05 | |
| Recombinant wild-type Streptococcus pyogenes Cas9-NLS purified protein, 40 µM | University of California-Berkeley QB3 Macrolab | ||
| Custom donor plasmid (PriorityGENE) | Genewiz | donor insert design was synthesized and cloned into pUC57 backbone by Genewiz | |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| NucleoBond Xtra Maxi EF | Clontech | 740424.50 | |
| Neon Transfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | |
| Neon Transfection System, 100 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK10096 | |
| 5 mL Polystyrene Round-bottom Tube with Cell Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 15 mL High Clarity Polyproylene Conical Tube | Falcon | 352196 | |
| FACSAriaIII Fusion | BD Biosciences | 656700 | |
| FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| FlowJo version 10.2 | TreeStar | ||
| NERL Blood Bank Saline | ThermoFisher Scientific | 8504 | used as preservative-free FACS Buffer |
| Olympus SZX7 Stereo Microscope, or similar | Olympus, or similar | ||
| Tissue culture plate, 96-well | Falcon | 353072 | |
| 96 well Cell Culture Plate, V-Bottom | CELLSTAR | 351180 | |
| CryoStor CS10 | Sigma | C2874-100ML | used as cryopreservation buffer for cells in 96-well plate format |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| 24 well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 662160 |
References
- Wood, A. J., et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 333 (6040), 307 (2011).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Dambournet, D., Hong, S. H., Grassart, A., Drubin, D. G. Tagging endogenous loci for live-cell fluorescence imaging and molecule counting using ZFNs, TALENs, and Cas9. Methods in Enzymology. , 139-160 (2014).
- Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Sci Rep. 5, 9592 (2015).
- Hendriks, W. T., Warren, C. R., Cowan, C. A. Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells: Approaches, Pitfalls, and Solutions. Cell Stem Cell. 18 (1), 53-65 (2016).
- Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Cell Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
- Doyon, J. B., et al. Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells. Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).
- Cho, W. K., et al. Super-resolution imaging of fluorescently labeled, endogenous RNA Polymerase II in living cells with CRISPR/Cas9-mediated gene editing. Sci Rep. 6, 35949 (2016).
- White, C. W., Vanyai, H. K., See, H. B., Johnstone, E. K. M., Pfleger, K. D. G. Using nanoBRET and CRISPR/Cas9 to monitor proximity to a genome-edited protein in real-time. Sci Rep. 7 (1), 3187 (2017).
- Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Mol Biol Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).
- Soldner, F., et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations. Cell. 146 (2), 318-331 (2011).
- Young, J. E., Goldstein, L. S. Alzheimer's disease in a dish: promises and challenges of human stem cell models. Human Molecular Genetics. 21 (R1), R82-R89 (2012).
- Soares, F. A., Sheldon, M., Rao, M., Mummery, C., Vallier, L. International coordination of large-scale human induced pluripotent stem cell initiatives: Wellcome Trust and ISSCR workshops white paper. Stem Cell Reports. 3 (6), 931-939 (2014).
- Gene, NCBI- National Center for Biotechnology Information. , U.S. National Library of Medicine. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene (2017).
- Gene, NCBI- National Center for Biotechnology Information. , UCSC Genome Browser. https://genome.ucsc.edu/ (2017).
- Allen Cell Methods: Single cell passaging human iPS cells. , https://www.youtube.com/watch?v=wao2UcMFPMc (2018).
- Allen Cell Explorer. , http://www.allencell.org/ (2017).
- Lingeman, E., Jeans, C., Corn, J. E. Production of Purified CasRNPs for Efficacious Genome Editing. Curr Protoc Mol Biol. 120, 31-31 (2017).
- Michael Davidson Fluorescent Protein Collection. , https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/davidson/ (2017).
- Cox, D. B., Platt, R. J., Zhang, F. Therapeutic genome editing: prospects and challenges. Nature Medicine. 21 (2), 121-131 (2015).
- Haas, S. A., Dettmer, V., Cathomen, T. Therapeutic genome editing with engineered nucleases. Hamostaseologie. 37 (1), 45-52 (2017).
- Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K., Carroll, D. Donor DNA Utilization During Gene Targeting with Zinc-Finger Nucleases. G3 (Bethesda). 3 (4), 657-664 (2013).
- Orlando, S. J., et al. Zinc-finger nuclease-driven targeted integration into mammalian genomes using donors with limited chromosomal homology. Nucleic Acids Research. 38 (15), e152 (2010).
- DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein. Methods. 121-122, 9-15 (2017).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
- Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44 (W1), W272-W276 (2016).
- Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
- Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
- CRISPOR V4.3. , http://crispor.tefor.net/ (2017).
- Zhang, Y., et al. Comparison of non-canonical PAMs for CRISPR/Cas9-mediated DNA cleavage in human cells. Sci Rep. 4, 5405 (2014).
- Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Adv Drug Deliv Rev. 65 (10), 1357-1369 (2013).
- Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (25), E3501-E3508 (2016).
- Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
- Baker, D., et al. Detecting Genetic Mosaicism in Cultures of Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 7 (5), 998-1012 (2016).
