Summary
Hier beschrieben ist, dass ein Protokoll für die Markierung von endogen Proteine mit fluoreszierenden Tags in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen mit CRISPR/Cas9 ausgedrückt. Vermeintlich bearbeitete Zellen werden bereichert durch Fluoreszenz aktiviert Zellsortierung und klonale Zell-Linien entstehen.
Abstract
Ein Protokoll wird für die Erzeugung von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs), die express körpereigene Proteine fusioniert, um in-N - oder C-terminalen fluoreszierende Tags Frame dargestellt. Die prokaryotische CRISPR/Cas9 System (gruppierten regelmäßig dazwischen kurz palindromische Wiederholungen/CRISPR-assoziierten 9) kann eingesetzt werden, große exogene Sequenzen in genomic Loci über Homologie gerichtet Reparatur (HDR) einzuführen. Erreichung der gewünschten Knock-in beschäftigt dieses Protokoll Ribonucleoprotein (RNP)-basierten Ansatz wo Wildtyp Streptococcus Pyogenes Cas9 Protein, synthetische 2-teilig Guide RNA (gRNA) und ein Spender Vorlage Plasmid werden, um die Zellen über geliefert Elektroporation. Vermeintlich bearbeitete Zellen mit dem Ausdruck das eindringmittel tagged Proteine werden durch Fluoreszenz aktiviert Zelle Sortieren (FACS) bereichert. Klonale Linien werden dann generiert und für präzise Bearbeitung Ergebnisse analysiert werden können. Durch die Einführung der fluoreszierenden Tags bei der genomischen Lokus des Gens von Interesse, kann die daraus resultierende subzelluläre Lokalisation und die Dynamik des Fusionsproteins unter endogenen regulatorischen Kontrolle, eine wesentliche Verbesserung gegenüber herkömmlichen Überexpression untersucht werden Systeme. Die Verwendung von HiPSCs als Modellsystem für die Markierung von Gen bietet die Möglichkeit, die tagged Proteine in nontransformed, diploiden Zellen zu studieren. Da HiPSCs in mehreren Zelltypen unterschieden werden können, bietet dieser Ansatz die Möglichkeit, erstellen und tagged Proteine in einer Vielzahl von isogenen zellulären Kontexten zu studieren.
Introduction
Die Verwendung von Genom-Bearbeitung Strategien, vor allem CRISPR/Cas9, zelluläre Prozesse zu studieren wird immer zugänglich und wertvolle1,2,3,4,5, 6 , 7. eine der vielen Anwendungen von CRISPR/Cas9 ist die Einführung (über Homologie gerichtet Reparatur (HDR)) der großen exogene Sequenzen wie GFP in bestimmten genomic Loci, die dann als Reporter für die Aktivität von Genen oder Proteinen Produkt8 dienen . Diese Technik lässt sich eine fluoreszierendes Protein-Sequenz mit einer endogenen offenen Leserahmen verbinden wo resultierende endogen geregelten Fusionsproteins lässt sich die subzelluläre Lokalisation und Dynamik des Proteins des Interesses5 visualisieren ,6,9,10,11. Während endogen tagged Proteine viele Vorteile im Vergleich zur Überexpression Systeme bieten, ist Einfügen von großen Sequenzen in das menschliche Genom ein ineffizienter Prozess in der Regel eine Auswahl oder Bereicherung Strategie eine Bevölkerung der Zellen zu erhalten, die kann zu verlangen sein leicht studierte5,12.
Dieses Protokoll beschreibt die Einfügung einer DNA-Sequenz, die Kodierung eines fluoreszierenden Proteins (FP) in eine gewünschte genomischen Locus. Das Protokoll umfasst Planung und Lieferung von Spender-Vorlage-Plasmid und komplexe Ribonucleoprotein (RNP) (Wildtyp S. Pyogenes Cas9 Protein in Kombination mit synthetischen CRISPR-RNA (CrRNA) und Trans-Aktivierung CrRNA (TracrRNA)). Auch beschrieben ist die Bereicherung der vermeintlich bearbeitete Zellen durch Fluoreszenz aktiviert Zelle Sortieren (FACS) und die Generierung von klonalen Zelle Linie. Bisher hat diese Methode zum HiPSC Linien mit monoallelisches oder (selten) Bi-Allele grün fluoreszierendes Protein (GFP) Tags Kennzeichnung fünfundzwanzig Proteine repräsentieren wichtige zelluläre Strukturen erzeugen. Die resultierenden bearbeiteten Zellen aus diesen Bemühungen wurden bestätigt haben das erwartete genetische einsetzen, eine korrekte Lokalisierung Fusionsproteins auszudrücken, und Pluripotenz und eine stabile Karyotyp12 (und unveröffentlichte Daten). Mit dieser Methode hat auch mehrere andere generieren Single und Dual (zwei verschiedene Proteine in derselben Zelle markiert) bearbeitet Populationen von HiPSCs (unveröffentlichte Daten).
Menschlichen iPSCs eines gesunden Spenders abgeleitet wurden Erbgut Bearbeitung dafür ausgewählt, weil im Gegensatz zu vielen herkömmlichen Zelllinien, sie diploid, karyotypisch stabil, nicht transformiert und proliferative sind. Diese Eigenschaften stellen ein attraktives Modell für das Studium fundamentale Zellbiologie und Krankheit Modellierung. Darüber hinaus bietet das Potenzial der Differenzierung der HiPSCs die Möglichkeit, mehrere Entwicklungsstadien parallel in verschiedenen Linien und Zelltypen mit isogenen Zellen einschließlich der Organellen, Gewebe und "in einer Schale" Krankheitsmodelle13 studieren ,14,15. Obwohl dieses Protokoll für HiPSCs (WTC Linie) entwickelt wurde, kann es für die Entwicklung von Protokollen mit anderen Säugetieren Zelllinien informativ sein.
Protocol
1. in Silico Gestaltung von CrRNA und Spender Vorlage Plasmid für FP Knock-in
- Erhalten Sie der kommentierten referenzsequenz vom NCBI16 oder der UCSC Genome Browser17 (z. B. GenBank-Format) des Gens von Interesse zu und importieren Sie sie in eine Bioinformatik-Software der Wahl. Wenn die Host-Genomsequenz Varianten im Vergleich zu den Verweis enthalten bekannt ist, sind jetzt durch Anpassung der referenzsequenz in der Bioinformatik-Software (siehe Diskussion).
- Suchen Sie die gewünschte FP Insertionsstelle. Für C-terminale Tags wird die Sequenz für das FP-Tag zwischen der letzten Basis des letzten Codon und den ersten Boden des Stopp-Codon eingeführt. Für die N-terminale tagging werden die Sequenz für das FP-Tag in der Regel zwischen der letzten Basis des Start-Codon und das erste Base der nächsten Codons vorgestellt. In einigen Fällen, z. B. wenn das Start-Codon einer einzigen Codon Exon bzw. wo eine Signalsequenz in der Nähe der Protein-Terminus vorhanden ist kann die gewünschte FP Insertionsstelle mehr 3ʹ Lage, befinden, so lange, wie es nach wie vor im Rahmen.
- Einsatz 50 bp auf jeder Seite der gewünschten Insertionsstelle als die Eingabesequenz für alle öffentlich zugänglichen CrRNA-Design-Tool. Nach 2-4 CrRNA Ziele in der Nähe der Einstichstelle identifiziert werden, kommentieren Sie die CrRNA verbindliche Aufstellungsorte und Protospacer angrenzenden Motiv (PAM) Sequenzen (NGG) in der Bioinformatik-Software. Diese CrRNAs wird verwendet werden, um doppelte gestrandete Pausen induzieren (siehe Diskussion für weitere Hinweise zur CrRNA Design).
Hinweis: Benutzerdefinierte CrRNA Sequenzen für die Synthese mit einem kommerziellen Anbieter (empfohlen) eingereicht werden können, oder die Sequenz kann als Ausgangspunkt verwendet werden, um ein Klonen oder in-vitro- Synthese-Strategie zu entwerfen, die außerhalb des Rahmens dieses Protokolls ist (siehe Diskussion ). - Zur Einleitung des Spenders Vorlage Plasmid verwenden Sie 1 kb Sequenz stromaufwärts von der gewünschten Einstichstelle als 5ʹ Homologie Arm (dazu gehört das Start-Codon für N-terminale Insertionen) und 1 kb Sequenz stromabwärts von der gewünschten Einstichstelle als die 3ʹ Homologie-Arm (dazu gehört das Stopcodon für C-terminale Einfügungen). Basen zwischen den beiden Armen der Homologie werden in der Regel nicht ausgelassen. Einschließlich der Zelllinie spezifischen Varianten in den Armen der Homologie werden diese genetischen Varianten in der resultierenden bearbeiteten Zellen beibehalten.
- Zwischen den beiden Armen der Homologie, legen Sie die Reihenfolge für die FP (oder andere Knock-in-Sequence) und der Linker-Sequenz (siehe Diskussion für weitere Hinweise zur Linker). Für N-terminale Tags sollten die Linker-Sequenz direkt 3ʹ des RP; für C-terminale Tags sollte die Linker-Sequenz direkt 5ʹ des RP.
- Stören CrRNA Bindungsstellen in der Spender Vorlage Plasmid Cas9 Schneiden von Spender-Sequenz zu verhindern (siehe Diskussion Überlegungen CrRNA Bindungsstellen zu ändern). Wenn möglich, ist die Unterbrechung der PAM auf eine Sequenz als NGG oder NAG bevorzugt. Alternativ ist, Einführung von Punktmutationen, drei Stützpunkte in der Samen-Region von CrRNA (10 Basen proximal zu PAM) voraussichtlich ausreichend CrRNA Bindung stören. Einige CrRNA-Bindungsstellen sind durch Einführung der FP-Sequenz in der Spender Vorlage Plasmid gestört; sicherstellen Sie, dass keine PAM oder intakte Bindung Region in diesen Fällen noch vorhanden ist.
Hinweis: In Silico Spender Vorlage Plasmid kann von einem kommerziellen Anbieter für Gensynthese eingereicht werden, oder es kann als Ausgangspunkt verwendet werden, um eine Klonen Strategie zu entwerfen, die außerhalb des Rahmens dieses Protokolls ist. Es genügt eine einfache Rückgrat wie pUC19 oder pUC57.
2. Ribonucleoprotein (RNP) Transfection CRISPR/Cas9 vermittelte Knock-in in hiPSCs
Hinweis: In diesem Protokoll beschreibt der Begriff 'gRNA', synthetische CrRNA und TracrRNA ordnungsgemäß wieder ausgesetzt, quantifizierte und Pre-komplexiert gemäß Herstellerangaben (siehe Tabelle der Materialien). Ergänzen Sie alle Medien mit 1 % Penicillin-Streptomycin. Kultivierung Leitlinien der WTC HiPSC Linie sind bei Allen Handy Explorer18,19detailliert beschrieben. WTC-HiPSCs dienen in diesem Protokoll, aber mit der richtigen Transfektion Optimierung, Elektroporation von RNP und Spender Vorlage Plasmid kann andere Zelltypen erfolgreich angepasst werden.
- Bereiten Sie 10 µM arbeiten Aktien gRNA und Wildtyp S. Pyogenes Cas9 Protein2,20; halten Sie auf dem Eis. Bereiten Sie 1 µg/µL arbeiten Bestand an Spender Vorlage Plasmid vor; halten Sie bei Raumtemperatur (RT). Verwenden Sie TE-Puffer pH 8.0 für alle Verdünnungen.
- Bereiten Sie eine Matrix beschichtet 6-Well-Zellkultur-Platte mit 5 mL frisches Wachstumsmedien mit 10 µM-ROCK-Inhibitor (Ri) pro Bohrloch ergänzt. Halten Sie Platte mit Medien im Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 bis bereit Platte Zellen nach die Transfektion Verfahren (max. 2 h).
Hinweis: Alle Matrix-beschichteten Platten in diesem Protokoll verwendeten erfolgen durch Hinzufügen von einem Volumen von eiskalten Matrigel 01:30 in kalten DMEM/F12-Medien nach dem Allen Institut für Cell Science-Protokoll für die Kultivierung der WTC HiPSC Linie19verdünnt. - Verwenden eine sanfte einzellige Dissoziation-Reagenz, wie in der Tabelle der Materialienempfohlen, die passage HiPSCs in einzellige Federung und Anzahl Zellen mit einem automatisierten Zelle Zähler oder Hemocytometer.
Hinweis: Ein detailliertes Protokoll für die WTC-HiPSC-Linie verwendet hier finden Sie bei Allen Handy Explorer19. Kurz, waschen Zellen einmal mit RT DPBS und behandeln mit Dissoziation Reagenz für ca. 3-5 Minuten. Dann genannte Zellen durch Zentrifugation in Single-Zellsuspension durch sanfte pipettieren und Pellet. Aufzuwirbeln Sie live Cell Pellet in Wachstumsmedien ergänzt mit 10 µM Ri.- Bereiten Sie eine Aliquote von 1,84 x 106 Zellen für jede experimentelle Bedingung, in separaten 1,5 mL Röhrchen transfiziert.
Hinweis: Alle Bände sind für eine 4,5 µL Gesamt Reaktionsvolumen in einem 100 µL Elektroporation Band mal 2,3 Reaktionen berechnet. Diese Konten für doppelte Transfektion und überschüssige pipettieren Fehler.
- Bereiten Sie eine Aliquote von 1,84 x 106 Zellen für jede experimentelle Bedingung, in separaten 1,5 mL Röhrchen transfiziert.
- Vorbereitung Ribonucleoprotein (RNP) komplexe Rohre für jede experimentelle Bedingung durch Zugabe von 2,88 µL 10 µM gRNA und 2.88 µL 10 µM Cas9, eine 1,5 mL-Tube. Ein Minimum von 10 min (max. 1 h) bei RT inkubieren.
- Pellet-eine Zelle aliquoten (vorbereitet in Schritt 2.3.1) 211 X g für 3 min bei RT Aspirat überstand und Aufschwemmen Zelle Pellet in 220 µL des Herstellers Elektroporation Puffer.
- Fügen Sie 220 µL resuspendierte Zellen aus Schritt 2.5 in 1,5 mL RNP komplexe Rohr in Schritt 2.4 vorbereitet.
- Der 1,5 mL Tube vorbereitet im Schritt 2.4 fügen Sie 4,60 µL Plasmid 1 µg/µL Spender Vorlage hinzu.
- Verwenden Sie Nucleofection Spitze und Pipette, um den Inhalt der Tube 2 - 3 mal mischen, dann übertragen Sie 100 µL der Suspension auf das vorbereitete Elektroporation Gerät. Einführung von Bläschen in der Spitze zu vermeiden. Gelten Sie 1300 V für 1 Puls von 30 ms.
- Übertragen Sie sanft die Aussetzung in die vorbereiteten 6-Well-Platte aus Schritt 2.2 mit einer wirbelnden Bewegung. Sanft bewegen der Platte seitliche und Front-to-Back, um Zellen zu zerstreuen.
- Mit einer neuen Nucleofection-Spitze, wiederholen Sie die Schritte 2,8-2,9 mit der verbleibenden 100 µL der Aufhängung und Übertragung in einen zweiten Brunnen bereit 6-Well-Platte.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.4 durch 2.10 für jede gRNA und Spender Vorlage Plasmid, einschließlich nicht-targeting gRNA, Spender Vorlage Plasmid nur und Puffer nur Steuerelemente. Achten Sie darauf, um Pipette und Nucleofection Tipps zur Vermeidung von Kreuzkontamination zu ändern.
- Inkubieren Sie transfizierte Zellen bei 37 ° C und 5 % CO2. Wechseln Sie das Medium zu regelmäßigen Wachstumsmedien (keine Ri) auf 24 h und weiter füttern HiPSCs alle 24 h für 72-96 h, Überwachung Konfluenz. Wenn HiPSCs 60-80 % Zusammenfluss erreicht haben, fahren Sie fort mit Schritt 3 fort.
Hinweis: Schwere Zelltod (> 70 % geschätzt) ist normal 24-48 h nach Transfektion.
(3) FACS-Anreicherung von vermeintlich bearbeitet hiPSCs
Hinweis: Beim Sortieren von Stammzellen passen Sie Geräteeinstellungen Zelle überleben wie vorgeschlagen in der Diskussion zu fördern. Kurz, verwenden Sie die größte Düse (130 µm), ein geringer Durchfluss (≤ 24 µL/min), Konservierungsstoffe Scheide Flüssigkeit (z. B. Kochsalzlösung, siehe Tabelle der Materialien), und niedrigen Druck (10 Psi).
- Vor Beginn einer FACS-Experiments, ändern Sie Medien, Wachstumsmedien ergänzt mit 10 µM Ri und inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C und 5 % CO2 für 2-4 h Überleben nach FACS zu fördern.
- Mit einem sanften einzellige Dissoziation Reagens wie in der Tabelle der Materialienempfohlen, die passage HiPSCs in einzellige Suspension im Wachstumsmedium mit 10 µM Ri19ergänzt.
- Filtern Sie HiPSC Aufhängung durch 35 µm Siebfilter in Polystyrol Runde Talsohle Röhren.
- Sortieren Sie Zellen mittels forward Scatter und Side Scatter (einschließlich Höhe und Breite), Schutt und Dubletten auszuschließen. Live, Puffer nur kontrollieren Zellen auf das FP-positiven Tor, so dass < 0,1 % der Puffer nur Zellen fallen in das Tor.
- Art der gesamten Bevölkerung der FP-positiven Zellen in einem 1,5-15 mL Polypropylen Röhrchen mit 0,5-2 mL RT Wachstumsmedien mit 10 µM Ri ergänzt.
Hinweis: Polypropylen verringert das Potenzial für die Zelladhäsion auf den Kunststoff. - Zentrifugieren Sie gesammelten Zellen bei 211 X g für 3 min bei RT
- Vorsichtig Aspirieren Sie überstand und Aufschwemmen Sie Zelle Pellet in 200 µL Wachstumsmedien mit 10 µM Ri ergänzt. Übertragen Sie bis zu 3.000 sortierte Zellen zu einem einzigen Brunnen von einem frischen Matrix-beschichteten 96-Well-Platte19.
Hinweis: Mit geeigneten Instrument-Setup, können Zellen auch (in Bulk) direkt in einen einzigen Brunnen einer 96-Well-Zellkultur Matrix-beschichtete Platte mit 200 µL Wachstumsmedien ergänzt mit 10 µM Ri bei einer empfohlenen Dichte von 1.000-3.000 Zellen pro Bohrloch sortiert werden für HiPSC. - Inkubieren Sie sortierte Zellen bei 37 ° C und 5 % CO2. Wechseln Sie das Medium, Wachstumsmedien ergänzt mit 5 µM Ri um 24 Uhr. 48 h Beginn Fütterung Zellen regelmäßig Wachstumsmedien (keine Ri) alle 24 h für 72-96 h, Überwachung Konfluenz. Überleben nach FACS schätzungsweise 50 % größer sein, wenn ein Minimum von 500 Zellen in einen Brunnen einer 96-Well-Platte ausgesät werden.
- Wenn HiPSCs Zusammenfluss von 60-80 % zu erreichen und zeigen Reife Morphologie (glatte, gut verpackt Kolonie Zentren), Durchgang in einem größeren Format Platte wie ein 24-Well-Platte, dann von einer 24-Well-Platte in einem 6-Well-Platte.
- Wenn die HiPSCs in einem 6-Well-Platte Zusammenfluss von 60-80 % zu erreichen und zeigen Reife Morphologie, erweitern, um eine 100 mm-Platte, Platte neu für die Bildgebung, Tiefgefrieren oder Samen bei Klon Kommissionierung Dichte (Schritt 4)19.
4. erzeugen vermeintlich bearbeitet klonalen HiPSC Linien
- Verwenden eine sanfte einzellige Dissoziation-Reagenz, wie in der Tabelle der Materialienempfohlen, passage HiPSCs in einzellige Suspension und bestimmen Sie die Anzahl der Zellen pro mL19.
- 10.000 Samenzellen der bearbeiteten Bevölkerung der HiPSCs auf eine frische Matrix beschichtet 100 mm Gewebe Kulturschale mit Wachstumsmedien ergänzt mit 10 µM Ri19. Wechseln Sie das Medium, Wachstumsmedien ohne Ri 24 h nach der Aussaat, und füttern Sie die HiPSCs mit frischen Wachstumsmedien alle 24 h für ca. 5-7 Tage.
- Wenn HiPSCs Kolonien gebildet haben, die makroskopisch sichtbar sind (ca. 500 µm) sind sie groß genug, um isoliert werden. Bereiten Sie eine Matrix-beschichteten 96-Well-Platte durch Absaugen überschüssigen Matrix und Hinzufügen von 100 µL Wachstumsmedien mit 10 µM Ri pro gut19ergänzt.
- Auf einen sezierenden Mikroskop Verwendung eine P-200 Pipette oder ähnlich vorsichtig abkratzen und Aspirieren Sie einzelne Kolonien von der Plattenoberfläche. Volumen (~ 20-100 µL), enthält die Kolonie zu einem einzigen Brunnen der 96-Well-Platte in Schritt 4.3 vorbereitet.
- Nach der Übertragung aller Kolonien brüten Sie die Platte in einer Gewebekultur Inkubator an 37˚C und 5 % CO2. Wechseln Sie das Medium zu regelmäßigen Wachstumsmedien (keine Ri) auf 24 h und weiter füttern Zellen alle 24 h für 72-96 h bis Kolonien in der Größe (ca. 1500 µm) etwa verdreifacht haben.
Hinweis: Kommissionierung 24-96 Kolonien pro CrRNA verwendet in der Transfektion wird empfohlen. Überleben von isolierten Klonen ist in der Regel mehr als 95 %.
- Nach der Übertragung aller Kolonien brüten Sie die Platte in einer Gewebekultur Inkubator an 37˚C und 5 % CO2. Wechseln Sie das Medium zu regelmäßigen Wachstumsmedien (keine Ri) auf 24 h und weiter füttern Zellen alle 24 h für 72-96 h bis Kolonien in der Größe (ca. 1500 µm) etwa verdreifacht haben.
- Mit einem sanften einzellige Dissoziation Reagens wie in der Tabelle der Materialienempfohlen, Klone Durchgang HiPSC in eine neue Matrix-beschichteten 96-Well-Platte wie folgt19.
- Verwenden eine 8-Kanal-Absauganlage, entfernen Sie und entsorgen Sie Medien aus der ersten Spalte der 96-Well-Platte.
- Fügen Sie mithilfe einer P-200 Mehrkanal-Pipette ~ 200 µL des DPBS auf die erste Spalte der 96-Well-Platte, die Zellen zu waschen. Verwenden eine 8-Kanal-Absauganlage, entfernen Sie und entsorgen Sie DPBS waschen aus der ersten Spalte der 96-Well-Platte.
- Fügen Sie mithilfe einer P-200 Mehrkanal-Pipette 40 µL Reagenz Dissoziation in der ersten Spalte der 96-Well-Platte.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.5.1-4.5.3 für bis zu insgesamt sechs Säulen des 96-Well-Platte, wechselnden Tipps um sicher zu sein, um nicht Kreuz-Brunnen zu verschmutzen. Platzieren Sie die Platte in den Inkubator 37 ° C für 3-5 Minuten ab dem Zeitpunkt der ersten Spalte (Schritt 4.5.3) Dissoziation Reagenz hinzugefügt wurde.
Hinweis: Es ist einzige Passage maximal sechs Spalten (48 Brunnen) zu einem Zeitpunkt aufgrund der Zeit empfohlen, die es braucht, um diese Schritte ausführen. Bei der Durchführung dieses Protokolls zum ersten Mal starten Sie mit nur ein oder zwei Spalten gleichzeitig passagierung. Begrenzung der Anzahl der Spalten auf einmal passagiert sorgt dafür, dass Zellen nicht in die Dissoziation Reagenz zu lange haben die für HiPSCs schädlich sein könnten. - Wenn die Zellen in der ersten Spalte der Platte begonnen haben, heben Sie die Platte unten, verwenden Sie eine P-200 Mehrkanal-Pipette, um die erste Spalte der 96-Well-Platte 160 µL des DPBS hinzu und sanft die Zellen bei der "12:00" genannte , "03:00", "06:00" und "09:00" Positionen der einzelnen Brunnen. Übertragen Sie das gesamte Volumen der Zellsuspension (200 µL) auf einem V-Boden-96-Well-Platte.
- Wiederholen Sie Schritt 4.5.5 für die verbleibenden Spalten von Zellen, die Dissoziation Reagenz in ihnen; Ändern Sie Tipps, nicht Kreuz-Brunnen verunreinigen.
- Drehen Sie die V-Bodenplatte in einer Zentrifuge bei 385 X g für 3 min bei RT
- Mit einer P-200 Mehrkanal-Pipette, entfernen Sie vorsichtig den überstand und Aufschwemmen Sie Zellen in 200 µL frisches Wachstum Medien mit 10 µM Ri pro Bohrloch ergänzt. Wiederholen Sie für alle Brunnen, wechselnde Tipps, nicht Cross verunreinigen.
- Die Zellsuspension auf eine frische Matrix-beschichteten 96-Well-Platte19übertragen. Inkubieren Sie die Platte in einer Gewebekultur Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2. Wechseln Sie das Medium zu regelmäßigen Wachstumsmedien (keine Ri) auf 24 h und weiter füttern Zellen alle 24 h für 72-96 h, bis die Mehrheit der Klone Zusammenfluss von 60-80 % erreichen.
Hinweis: Diese Passage hilft, die Zellen verteilt und ermöglichen mehr Wachstum über die gesamte Fläche des 96-Well-Platte.
- Klone zu beobachten und eine entsprechende Split-Verhältnis für jede einzelne Klon in 96-Well-Platte zu identifizieren (z. B. 01:10 oder 1:8). Verwenden eine sanfte einzellige Dissoziation Reagenz wie in der Tabelle der Materialien, klont Durchgang HiPSC in eine neue Matrix-beschichteten 96-Well-Platte (Schritte 4.5.1-4.5.8) ein Verhältnis von der Zellsuspension für jeden Klon zu übertragen. Inkubieren Sie die Platte in einer Gewebekultur Inkubator an 37˚C und 5 % CO2. Wechseln Sie das Medium zu regelmäßigen Wachstumsmedien (keine Ri) auf 24 h und weiter füttern Zellen alle 24 h für 72-96 h, bis die Mehrheit der Klone Zusammenfluss von 60-80 % zu erreichen und Reife Morphologie zeigen.
Hinweis: Jeder Klon möglicherweise eine verschiedene Split-Verhältnis wegen etwas anderen Wachstumsrate oder das Überleben von den vorherigen Durchgang, so dass diese Passage hilft, um die Anzahl der Zellen pro Bohrloch von jeder Klon für den eiskalten Schritt folgen zu normalisieren. Aufgrund der unterschiedlichen Zinssätzen von überleben und Wachstum können einige Klone überwuchern oder nicht während dieser Schritte passagierung wachsen.- Speichern Sie den Rest der Zellsuspension und Pellet gDNA Isolation durch sandbacken Zellen in einem V-Boden-96-Well-Platte bei 385 X g für 3 min bei RT. entfernen Sie überstand und fahren Sie mit gDNA Isolierung mit einem 96-Well-Kit oder speichern Sie Platte gebeizte Zellen bei - 20˚C für bis zu thr EE-Wochen.
5. die Kryokonservierung von klonalen Zelllinien in 96-Well-Plattenformat
- Verwenden eine einzelne Zelle Dissoziation-Reagenz, Durchgang HiPSC Klone wie oben beschrieben (Schritte 4.5.1-4.5.7). Den Überstand mit einer P-200 Mehrkanal-Pipette abzusaugen und wieder in 60 µL Wachstumsmedien ergänzt mit 10 µM Ri auszusetzen. Wiederholen Sie für alle Brunnen; Ändern Sie Tipps, nicht Cross verunreinigen.
- Übertragen Sie 30 µL Zellsuspension auf einer beschichteten 96-Well-Zellkultur-Matrix-Platte. Fügen Sie dann schnell 170 µL Puffer Einfrieren (siehe Tabelle der Materialien) in jede Vertiefung, ohne sich zu vermischen. Durch die Übertragung der restlichen 30 µL der Suspension in eine Schwester wiederholen Platte und das Hinzufügen von 170 µL Einfrieren zu puffern.
Hinweis: Dieser Prozess in doppelte Schwester Platten erfolgt damit eine Back-up Population von Zellen vorhanden ist, nach dem Auftauen eines einzelnen Platten. Nur jede andere Spalte einer 96-Well-Platte kryokonservierte Zellen Inbetriebnahme ermöglicht schneller Auftauen (Schritt 5.6). - Wickeln Sie Platte mit Parafilm und in eine RT Styropor-Box mit Deckel. Legen Sie die ganze Kiste in einem-80 ° C Gefrierschrank.
- Nach 24 Stunden können Platten aus Styropor-Box übertragen und dort gespeichert auf - 80˚C bis zu vier Wochen.
Hinweis: Während die Zellen vorübergehend bei-80 ° C gelagert werden, können genetische Qualitätskontrolle Assays durchgeführt werden mit dem gDNA geerntet von Zellen im Schritt 4.6.1 Ermittlung der Klone zu tauen und weiter wie beschrieben in zuvor veröffentlichte Arbeit zu verbreiten 12. kurz, ein Kopie Zahl Tropfen digitale PCR Assay verwendet werden, um Klone zu identifizieren, die eine oder zwei Kopien der GLP und keine Spender Vorlage Plasmid Rückgrat Integration enthalten. Eine Kombination von Endpunkt PCR-Assays und Sanger-Sequenzierung können dann identifizieren Klone, die einen präzisen Einsatz enthalten. - Zum Auftauen, bringen Sie die gesamte Platte auf 37 ° C in einer Gewebekultur Inkubator, beobachtete sorgfältig für die Eis-Pellets zu schmelzen. Brunnen am Rande der Platte sind in der Regel zuerst Auftauen.
- Wenn das Eis Pellet der gewünschten Klon schmilzt sanft ins gesamte 200 µL eine 15 mL konische Röhrchen mit 3 mL RT Wachstumsmedien ergänzt mit 10 µM Ri und Zentrifuge bei 211 X g für 3 min bei RT
- Aspirieren Sie überstand und aufzuwirbeln Sie gebeizte Zellen in 1 mL RT Wachstumsmedien ergänzt mit 10 µM Ri. Übertragen auf eine frische Matrix beschichtet 24-Well-Platte und inkubieren Sie bei 37˚C und 5 % CO2. Wechseln Sie das Medium zu regelmäßigen Wachstumsmedien (keine Ri) auf 24 h und weiter füttern Zellen alle 24 h für 72-96 h, bis der Klon 60-80 % Konfluenz erreicht und Reife Morphologie19 hat.
Representative Results
Das Ziel dieses Experiments wurde zu mEGFP (Monomere verbesserte GFP) verschmelzen mit dem nuklearen lamin B1-Protein durch die Einführung der mEGFP-Sequenz am 5ʹ Ende des LMNB1-Gens (N-Terminus des Proteins). Ein Linker (Aminosäure-Sequenz SGLRSRAQAS) wurde von Michael Davidson fluoreszierende Protein Sammlung21basierend auf vorherigen cDNA Konstrukte gewählt. Da die CrRNA Bindung Region in dem Spender Vorlage Plasmid für jeden Kandidaten CrRNA nach dem einsetzen in Silico des mEGFP und der Linker-Sequenz unterbrochen wurde, musste keine Punktmutationen unternommen werden, um potenzielle CrRNA Anerkennung und Spaltung durch stören Cas9 der Spender-Sequenz (Abbildung 1). Die Spender-Sequenz enthalten 1 kb Homologie Arme flankieren beidseitig die mEGFP-Linker-Sequenz. Die daraus resultierende 2.734 bp DNA geklont wurde in einem pUC57 Rückgrat, Reihenfolge überprüft, und die daraus resultierende Spender Vorlage Plasmid gereinigt wurde, mit einem Endotoxin-freie Maxi Prep. Die Spender Vorlage Plasmid und komplexe RNP transfiziert wurden, vermeintlich bearbeitete Zellen angereichert wurden und die Lokalisierung des mEGFP des Nuklearbereichs lamin B1 Fusionsproteins wurde bestätigt durch Fluoreszenz-Mikroskopie (Abbildung 2). Nur Ergebnisse aus der crRNA1-Transfection werden hier beschrieben, obwohl beide CrRNA Sequenzen vermeintlich bearbeiteten Populationen12hergestellt.
Im Vergleich zu der negativen Kontrolle, die keine gRNA, Cas9 Protein oder Spender Vorlage Plasmid in die Elektroporation Reaktion (nur Puffer) enthalten, die LMNB1 crRNA1 transfizierten enthalten Zellen 0,95 % mEGFP-positiven Zellen repräsentieren die vermeintlich bearbeitete mEGFP-Kern lamin B1 Bevölkerung (Abb. 3a). Dieses Ergebnis war im Bereich der Knock-in Effizienz über viele genomic Loci, die mit dieser Methode, wie bereits berichtet12beobachtet.
Die mEGFP-positiven Zellen wurden durch FACS isoliert und durch live Mikroskopie erwarteten Lokalisierung des mEGFP des Nuklearbereichs lamin B1-Fusionsproteins, die Kernhülle bestätigen abgebildet. Nach FACS-Anreicherung waren etwa 90 % der sortierten Zellen aus der LMNB1 crRNA1 Bevölkerung mEGFP-positiv (wie von Mikroskopie bestimmt), was darauf hindeutet, das einige mEGFP-Negative Zellen mit den GFP-positiven Zellen während der Sortierung Prozedur Co gereinigt. Dies war ein akzeptables Niveau der Bereicherung, die für die Kommissionierung von 96 Klonen erlaubt, die für die erfolgreiche Bearbeitung dann genetisch untersucht werden konnte. Im Allgemeinen ist ein Cut-off für erfolgreiche Bereicherung 50 % GFP positiv.
Der Großteil der sortierten Zellpopulation Fluoreszenz an die Kernhülle (nukleare Peripherie) in den nondividing Zellen angezeigt und eine erweiterte nuclear Lamina im Zytoplasma während der Mitose mit Vertrauen in die richtigen genomische bearbeiten in der LMNB1 Locus. Die angereicherte Bevölkerung enthaltenen Zellen mit entweder hell oder dunkel-Signal. Dieser Unterschied in der Signalintensität spiegeln eine Kombination der richtigen und falschen bearbeiten, Ergebnisse und Highlights, die das Dienstprogramm erzeugen eine genetisch validierte klonale Linie für weitere Studien (siehe Diskussion) (Abb. 3 b)12. Klonale Linie hinweg validiert genetisch Zellen zeigte gleichmäßige Intensität der GFP in Mikroskopie Experimente (Abb. 3 c).
Abbildung 1 . Design-Strategie für die N-Terminus GFP Kennzeichnung des LMNB1 Gens. Das GFP-Tag wurde für N-terminale Einfügung 5ʹ des ersten Exons des LMNB1 befindet sich auf Chromosom 5 entwickelt. 5ʹ und 3ʹ Homologie Arme sind 1 kb und Treffen zwischen dem Start-Codon (ATG) und dem zweiten Codon (Homologie Arme nur teilweise dargestellt in Abbildung). Zwei Kandidaten CrRNAs wurden entwickelt, um Cas9, so nah wie möglich an die vorgesehene Einstichstelle wie möglich, während immer noch einzigartig in das Genom zu Spalten führen. Sequenz zur mEGFP und eine Aminosäure Linker waren eingefügten nur 3ʹ von dem Start-Codon (mEGFP und Linker Sequenz nicht maßstabsgetreu). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Arbeitsablauf für die Herstellung von endogen getaggt klonalen Linien HiPSC. Transfektion Komponenten, einschließlich des Cas9/CrRNA/TracrRNA RNP-komplexes (dargestellt als rote Cas9 Protein mit gold CrRNA und lila TracrRNA), dem Spender Vorlage Plasmid enthält die Homologie Arme (HAs, gezeigt in Gold), und FP + Linker Sequenz (gezeigt im grün), wurden elektroporiert. Nach 4 Tagen wurden die vermeintlich bearbeitet FP-Positive Zellen angereichert durch FACS erweitert als Population durch impfen aller sortierten Zellen in einen einzigen Brunnen einer 96-Well-Platte (~ 1.000 Zellen) und dann bis mehrere Millionen Menschen arbeiten in Kultur erweitert Zellen könnten als "angereicherte Bevölkerung" geprüft werden (siehe Protokoll Schritt 3,8). Die Ausbeute an FP-positiven Zellen unterscheidet sich durch Experiment durch Variablen Zinssätzen von HDR-12; eine erfolgreiche Bereicherung umfassen in der Regel ~ 300-5.000 Zellen nach Transfektion von ca. 1,6 x 106 HiPS-Zellen. Bildgebende Voruntersuchungen bestätigt das Signal und die Lokalisierung des Fusionsproteins in der angereicherten Bevölkerung. Kolonien wurden manuell in eine 96-Well-Platte für Expansion und Kryokonservierung abgeholt. Weitere genomische Qualitätskontrolle Screening mit Tröpfchen digitalen PCR (DdPCR) und andere PCR-basierte Assays wurde dann verwendet, um richtig bearbeitete Klone als zuvor beschriebenen12zu identifizieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Anreicherung von vermeintlich bearbeitete Zellpopulationen. (A) Flow Cytometry Grundstücke der LMNB1 Zellen vier Tage nach Transfektion bearbeitet. Die y-Achse zeigt GFP Intensität und der x-Achse forward Scatter. Sortier Tore wurden basierend auf den Puffer nur Kontrolle festgelegt. Da HiPSCs empfindlich auf Störungen reagieren, lebenden/Toten Fleck wurde weggelassen und eine sehr konservative FSC/SSC-Tor wurde stattdessen verwendet. (B) nach der Bereicherung, bearbeitet die Bevölkerung der LMNB1 Cr1 Zellen zeigten ca. 90 % der Zellen mit GFP Lokalisierung, die Kernhülle (erwartete LMNB1 Lokalisierung). Die Bevölkerung enthaltenen Zellen unterschiedlicher Intensität der GFP sowie einige GFP-negativen Zellen. Maßstabsleisten sind 10 Mikron. (C) nach klonalen Linie Generation Zellen zeigte eine einheitliche GFP-Intensität, mit einigen Zellzyklus abhängige Unterschiede. Maßstabsleiste ist 20 Mikrometer.
Discussion
Die Methode, die hier vorgestellten Erzeugung endogen fluoreszierenden Proteins Fusionen im HiPSCs geregelt ist ein vielseitiges und leistungsstarkes Ansatz zur Generierung von Gen bearbeitet Zelllinien mit Anwendungen von live Cell Imaging bis hin zu verschiedenen funktionelle Studien und " in einer Schale "Krankheitsmodelle mit Patienten abgeleitet HiPSC Linien13,14,15. Während diese Methode verwendet wurde, um große FP-Tags, die N - oder C-Terminus des endogenen Proteinen einzuführen, könnte es verwendet werden, andere Tags oder kleine genetische Veränderungen vorzustellen Modell oder richtige krankheitsverursachende Mutationen22,23 . Für kleinere Einsätze die Größe der Homologie-Arm kann reduziert werden, aber allgemeinen Ansatzes für die Bearbeitung präsentiert in dieser Methode kann noch24,25gelten. Während der Einsatz von HiPSCs dringend aufgefordert, für ihre große Nützlichkeit mit sorgfältige Optimierung ist kann dieses Protokoll angepasst werden, damit um die Genome von anderen Säugetieren Zelllinien zu bearbeiten.
Wenn ein Gen des Interesses für die Markierung von FP identifiziert Transkript Fülle schätzt (von Microarray oder RNA-Seq-Daten) sind ein guter Ausgangspunkt für die Beurteilung, ob ein Gen oder Isoform von Interesse zum Ausdruck kommt, obwohl Transkript Ebenen korreliert nicht immer mit Protein-Ebene. Die hier beschriebene FACS-Anreicherung-Strategie funktioniert am besten für Gene, die zumindest mäßig gut ausgedrückt werden in der Zelle Art von Interesse. Diese Strategie wurde auch erfolgreich bei der Auswahl für Fusionen, die punktförmige und/oder diskrete Lokalisierung Muster wie centrin, Desmoplakin und Paxillin zeigen, wo ist die Signal-Hintergrund-Verhältnis sehr geringen12,19. Gene, die nicht stark ausgedrückt werden oder werden nur in Derivative Zelltypen exprimiert erfordern zusätzliche Selektionsstrategien.
Der Ausgangspunkt für CrRNA und Spender Plasmid Vorlagendesigns in humanen Zelllinien verwendet sollte der menschliche Bezug Genom (GRCh38). Da das Genom der verschiedenen Zelllinien innerhalb derselben Spezies variieren können, und CRISPR/Cas9 Sequenz-spezifisch ist, ist es äußerst hilfreich, Zelle linienspezifische Varianten (single Nucleotide Polymorphisms oder Einfügungen/Löschungen (Indels)) zu identifizieren Das unterscheiden sich von den Referenz-Genom und integrieren diese in das Design. Dadurch wird sichergestellt, dass CrRNAs mit das wirtsgenom kompatibel ist und, dass die Spender Vorlage Plasmid Homologie Arme jede Zelllinie spezifischen Varianten erhalten bleibt. Eine vorgeschlagene Strategie ist homozygote Varianten in CrRNAs und Spender Vorlage Plasmid Homologie Arme während des Designprozesses zu integrieren. Einbindung der heterozygote Varianten ist optional. Die spezifischen Reagenzien für große Knock-in Experimenten verwendet und andere wichtigen Überlegungen für dieses Protokoll werden unten besprochen.
Cas9 Protein
Der Hauptvorteil der Verwendung von Cas9 Protein ist, dass die Einführung der Cas9 und gRNA als eine komplexe RNP hat gezeigt, dass eine begrenzte Dauer der Nuklease Aktivität im Vergleich zu Plasmid-basierte Ansätze wo Ausdruck der Cas9 und gRNA kann weiterhin für Tage und führen zur Folge zu größeren - und off-Target Aktivität26,27. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von Cas9 Protein ist, dass es einmal im Inneren der Zellen Spalten zur Verfügung. Gegensatz zu herkömmlichen Methoden der Verwendung von Cas9 mRNA oder Cas9/gRNA Plasmid, die Transkription, Übersetzung und Protein26,28Verarbeitung erfordern. Wildtyp S. Pyogenes Cas9 Protein ist jetzt von vielen kommerziellen Quellen zur Verfügung.
Guide RNA
Es gibt viele öffentlich verfügbaren Tools für die Suche nach CrRNA Ziele in der Nähe der gewünschten FP Insertionsstelle, die keine oder nur wenige vorhergesagten off-Ziele in das Wirt Genom29,30,31,32haben. Effizienzgewinne bei HDR und die Präzision der HDR-Ergebnisse variieren stark zwischen den CrRNA Zielen, die an einem bestimmten Locus12verwendet. Aus diesem Grund testen mehrere CrRNAs (2-4 und vorzugsweise innerhalb 50 bp der gewünschten Insertionsstelle) pro Locus wird empfohlen, da dies die Wahrscheinlichkeit für eine erfolgreiche Bearbeitung Experiment erhöhen kann. Derzeitige Möglichkeiten für die Bereitstellung von gRNA enthalten synthetische 2-Komponenten CrRNA und TracrRNA, synthetische einzelne gRNAs (SgRNAs), in-vitro- SgRNAs oder bei der Auslieferung ein Plasmid auf Zellen, die mit dem Ausdruck der SgRNA von einer U6-Promoter transkribiert. Dieses Protokoll wurde nicht für hohe Spaltung Aktivität optimiert. Unveränderte 2-Komponenten CrRNA und TracrRNA (siehe Tabelle der Materialien) wurden mit dem Ziel der Erzeugung von Mono-Allele FP-Tags Zell-Linien während die potenzielle geringsten Störung in den Zellen verursacht verwendet.
Spender-Vorlage Plasmid
Weil einige der Homologie Sequenz arm, sofern beim Spender Vorlage Plasmid während der HDR-Veranstaltung in das wirtsgenom integriert werden, sollten Punktmutationen auf die CrRNA Anerkennung Websites eingeführt werden, um weitere Spaltung durch Cas9 nach HDR zu verhindern. Oft ist die einfachste störenden Veränderungen, die PAM-Sequenz zu mutieren. Da einige nicht-kanonische PAM-Sequenzen noch von Wildtyp S. Pyogenes Cas9 erkannt werden können, empfiehlt es sich, vermeiden die Verwendung von NGG, NAG oder NGA33. Wenn die Homologie Arm mutiert, vermeiden Sie nicht Synonym Mutationen und die Einführung von seltenen Codons. Wenn ein Synonym der PAM-Sequenz nicht möglich ist, erwägen, drei gleichbedeutend Punktmutationen im Großraum Samen (10 bp proximalen PAM) der CrRNA-Bindungsstelle. Extreme Vorsicht geboten bei diesen Änderungen in der 5ʹ unübersetzte Region (UTR), da diese Regionen wichtige regulatorische Sequenzen enthalten können. Beratung einer genetischen Erhaltung Datenbank wie der UCSC Genome Browser vergleichende Genomik Spuren in diesen Fällen Hilfestellung können da Änderungen nicht konserviert Basen besser toleriert werden können, als zu hoch konservierte Basen17ändert. Manchmal reicht die bloße Aufnahme der FP-Sequenz, stören die CrRNA-Bindungsstelle (wie in Abbildung 1); Allerdings sollte die neu angehängte Sequenz für das Fortbestehen des CrRNA Bindung und PAM Sequenzen überprüft werden.
Aminosäure-Linker zwischen den FP und dem nativen Protein werden empfohlen, um die Funktion der Fusion Protein34zu sparen. Oft kann eine Aminosäure-Linker für seine besondere Belastung oder Größe gewählt werden. Wenn eine cDNA-Fusion mit einem Design ähnlich wie die gezielte endogenen ist Schmelzverfahren Protein gut untersucht worden, dass gleiche Linker-Sequenz für die CRISPR/Cas9 Knock-in Experiment12,19verwendet werden kann. Wenn diese Informationen nicht verfügbar ist, wurde auch ein kurze Linker wie GTSGGS12erfolgreich eingesetzt. Andere Studien haben Erfolg mit einer generischen kleine 3-amino Acid Linker-Sequenz für eine Vielzahl von Zielen35gezeigt.
Transfektion und FACS Bereicherung
Viele im Handel erhältlichen Transfektion Reagenzien sind für die Lieferung von bestimmten Arten von Molekülen, Zellen, formuliert, während eine Elektroporation-System verwendet werden kann, Reagenzien mit einer breiten Palette von Größe, Ladung und Zusammensetzung zu liefern. Abgesehen davon, dass eine gängige Methode der Transfektion für Zellen zu transfizieren, wie HiPSCs, trägt Elektroporation auch den Vorteil aller drei Komponenten für CRISPR/Cas9-vermittelten FP Knock-in zu liefern, wie in diesem Verfahren beschrieben. Elektroporation wurde festgestellt, dass die besten Ergebnisse im Vergleich zu anderen im Handel erhältlichen Reagenzien bei der Entwicklung dieser Methode (Daten nicht gezeigt), und wurde auch von anderen RNP Lieferung26,28,36 verwendet zu produzieren .
Wenn Sie dieses Protokoll verwenden für die Bearbeitung von HiPSCs, sollte besondere Vorsicht geboten, um schonende Behandlung der Zellen vor und nach das Gen Bearbeitungsprozess für optimale Zelle überleben und minimale spontane Differenzierung zu gewährleisten. Insbesondere sollten die FACS Anreicherungsverfahren für die Sortierung von Stammzellen mithilfe der größten Düse (130 µm), ein geringer Durchfluss (≤24 µL/min), Konservierungsstoffe Scheide Flüssigkeit angepasst werden (z. B. Kochsalzlösung, siehe Tabelle der Materialien), und niedrige Probe Druck (10 Psi). Statt einzelne Zelle Sortieren, führt zu suboptimalen Lebensfähigkeit in Stammzellen, FACS-angereicherten HiPSCs sortiert in loser Schüttung und erweitert als Population Zelle Lebensfähigkeit und Stammzellforschung Integrität zu optimieren. Jedoch kann einzelne Zelle Sortierung für weniger empfindliche Zelltypen geeignet. Um das Überleben der Zellen zu fördern, sind Zellen wieder Kultur nicht mehr als eine Stunde nach der Ernte für die FACS-Bereicherung und bei Raumtemperatur während der Sortiervorgang aufbewahrt. Für einige Zelltypen kann Zelle überleben auch durch Inkubation Zellen auf Eis (4 ° C) während das Sortierverfahren verbessert werden.
Die Bulk-Erweiterung des FP-positiven Zellen ermöglicht es, die Bevölkerung durch bildgebende Analyse für die Fusion Protein Lokalisierung vor der Generierung von klonalen Linien zu bewerten. Während der daraus resultierenden angereicherten Population von Zellen für einige Studien ausreichend sein kann, zeigen diese Populationen häufig FP Signal von unterschiedlicher Intensität. Die isolierten klonalen Linien haben einheitliche Signal (Abbildung 3), so dass sie besser geeignet für funktionelle Experimente12.
Klonale Zellgeneration Linie
Während der Bearbeitung und klonale Linie Generation ist es wichtig, die Zellmorphologie überwachen. HiPSC Kolonien gewachsen in den Feeder-freien Bedingungen sollen glatte Kanten und eine gleichmäßige, gut verpackt Zentrum12,18,19aufweisen. Differenzierte Zellen sind in weniger als 5 % der Kultur zu beachten. Bei der einzelnen Kolonien Kommissionierung, wählen Sie diejenigen die Ausstellung gute Morphologie. Während der 96-Well-Platte passagierung Veranstaltungen Klone für Morphologie zu überprüfen und diejenigen, die überwuchert haben, so kann dies ein Hinweis auf genetische Instabilität sein oder zu einer Differenzierung führen einzustellen.
Generation von klonalen Zell-Linien können für genetische Bestätigung der präzisen Bearbeitung, was wichtig ist, weil Cas9-induzierten Doppelstrang im Genom bricht oft repariert ungenau trotz Einbeziehung des Tags an den gewünschten Ort. Zuvor beschriebenen PCR-basierten Tests zeigten, dass kumulativ über zehn einzigartige genomic Loci viele (45 %) der FP exprimierenden Klone litt Spender Plasmid Rückgrat Integration bei der gezielten Lokus oder (selten) nach dem Zufallsprinzip in der Genom-12. Darüber hinaus 23 % der GFP-positiven Klone (n = 177) über zehn einzigartige Loci wurden gefunden, um Mutationen an oder in der Nähe des erwarteten CrRNA schneiden in der unmarkierten Allel, wahrscheinlich wegen NHEJ12beherbergen. Diese genetische Analyse von vielen klonalen Linien (~ 100 Klone/Edit) unterstrich die Bedeutung der genetischen Validierung, die nicht in einer Zellpopulation möglich ist, da FP-Ausdruck und erwartete Fusion Protein Lokalisierung allein keine präzise Bearbeitung12 gewährleisten . Darüber hinaus können diese PCR-basierten Tests ausgeführt werden, auf eine angereicherte Population von Zellen mit Bestimmtheit, rechtfertigt die Notwendigkeit einer klonalen Linie Generation bevor aussagekräftige Analyse abgeschlossen werden kann. Genetische Bestätigung des eingefügten FP Tags und Überprüfung der genetische Integrität des unbearbeiteten Allels (in einem Mono-Allele bearbeitete Klon) sind notwendig, um sicherzustellen, präzise Bearbeitung bei der gezielten Lokus über Tag-Ausdruck.
Eine niedrige Rate von Bi-Allele Bearbeitungen und Mangel an Ziel-Mutationen (als vermutlich durch Sanger und Exome Sequenzierung) wurden bisher mit dieser Methode (unveröffentlichte Daten)12beobachtet. Dies steht im Einklang mit früheren Studien beschreiben die Verwendung von kurz andauernde RNP CRISPR/Cas9 Experimente26,27. Das Fehlen von klonalen Zelllinien mit Bi-Allele Bearbeitungen kann auch bestimmten Locus oder wegen der Unfähigkeit der Zelle zwei tolerieren markiert Kopien ein essentielles Protein wie vorgeschlagen von zuvor veröffentlichten Experimenten wo vermeintliche Bi-Allele bearbeitete Zellen für einen Locus (LMNB1), beobachtet aber nicht eine andere (TUBA1B)12. BI-Allele vollständig validierten klonalen Zelllinien wurden mit dieser Methode zu Tag ST6 Beta-Galactoside Alpha-2, 6-Sialyltransferase 1 (ST6GAL1) und RAB5A Mitglied RAS Onkogen Familie (RAB5A) mit mEGFP19generiert.
Darüber hinaus bestätigen die Präzision der Bearbeitung im Genom, gibt es eine Vielzahl von Qualitätskontrolle-Assays, die verwendet werden können, weiter charakterisieren die klonale Linie und Klone, die erfüllen alle Stammzelle, genomische, zu identifizieren und Zelle biologischen Kriterien für die Verwendung in Zukunft Studien . Biologische und funktionelle Assays Zelle lässt sich angemessener Ausdruck, Lokalisierung und Funktion der Fusion Protein12bestätigen. Vergleich zum unbearbeiteten Kindersicherung wird dazu beitragen, den Einfluss des Bearbeitungsprozesses für Lokalisierung, Dynamik und Funktion zu beurteilen. Andere Tests festzustellen wie Wachstum Analysen und Tests für die genomische Stabilität können auch helfen, ob das tagged Protein störenden auf die Zelle. Bei Verwendung von HiPSC in dieses Protokoll kann Bewertung der Pluripotenz Marker und Differenzierung Potenzial bei der Bestimmung, dass ein Klon, das wertvoll für flussabwärts12Studien kritisch. Weil Kultur erweitert HiPSC hat gezeigt, dass genetische Instabilität, Überwachung der Wachstumsrate führen und Karyotyp klonalen Zell-Linien ist auch wichtig,12,37. Allerdings bestimmt das Finale bearbeitete Zellen wird letztlich bestimmen die Höhe und Breite der Qualitätskontrolle Analyse und variieren basierend auf der Anwendung.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Daphne Dambournet für viele aufschlussreiche Gespräche und Ratschläge auf gen bearbeiten, Thao für Illustration, Angelique Nelson für kritische Lektüre des Manuskripts und Andrew Tucker zur Erzeugung der mEGFP-Tags Lamin B1-Zell-Linie. Wir möchten die Stammzellen und Gene Editing und Assay-Entwicklung-Teams bei Allen Institut für Cell Science für ihre Beiträge zu bearbeiten gen und Qualitätskontrolle anerkennen. Die WTC-Linie, die wir zur Erstellung unserer gen bearbeitet Zelllinie sorgte das Bruce R. Conklin Laboratory in Gladstone Institute und UCSF. Wir bedanken uns bei Allen Institute for Cell Science Gründer, Paul G. Allen, für seine Vision, Ermutigung und Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Geneious R9 | Biomatters, or similar | bioinformatics software for in silico donor plasmid design | |
| TE Buffer pH 8.0 | IDT, or similar | 11-01-02-05 | |
| HERAcell VIOS 160i CO2 incubator, or similar | ThermoFisher Scientific, or similar | 51030408 | |
| Pipettes (1000 µL, 200 µL, 20 µL, 10 µL, 2 µL) | Rainin, or similar | ||
| Pipette tips (1000 µL, 200 µL, 20 µL) | Rainin, or similar | ||
| Multi-channel Pipette (200 µL) | Rainin, or similar | ||
| Serological pipetes (25 mL, 10 mL, 5 mL) | Costar, or similar | ||
| BRAND 8-Channel Manifold for Quiksip, Autoclavable | Millipore Sigma, or similar | BR704526-1EA | use with non-filtered pipet tips, such as Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10, below |
| Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10 | Thermo Fisher, or similar | 3501-05 | |
| XP2 Pipette Controller | Drummond, or similar | 4-000-501 | |
| Disposable Pasteur Pipets | VWR, or similar | 53300-567 | |
| Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | CELLGARD, or similar | NU-481 | |
| Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | lot tested before use with hiPSC |
| DMEM/F12 (-phenol red) | Gibco | 11039-021 | cold, for diluting Matrigel 1:30 |
| mTeSR1 Complete Media | StemCell Technologies | 85850 | recommended growth media for WTC hiPSC line |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| WTC hiPSC line | Coriell | GM25256 | the hiPSC line used in this protocol is available through Coriell |
| Tissue culture dish 100 mm | Falcon | 353003 | |
| 6-well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 657160 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A11105-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| 15 mL polystyrene conical | Sarstedt | 62.554.100 | |
| Y-27632 (ROCK Inhibitor) | StemCell Technologies | 72308 | |
| Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic crRNA, unmodified (custom sequence) | Dharmacon | Custom0247 | |
| Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA | Dharmacon | U-002005-05 | |
| Recombinant wild-type Streptococcus pyogenes Cas9-NLS purified protein, 40 µM | University of California-Berkeley QB3 Macrolab | ||
| Custom donor plasmid (PriorityGENE) | Genewiz | donor insert design was synthesized and cloned into pUC57 backbone by Genewiz | |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| NucleoBond Xtra Maxi EF | Clontech | 740424.50 | |
| Neon Transfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | |
| Neon Transfection System, 100 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK10096 | |
| 5 mL Polystyrene Round-bottom Tube with Cell Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 15 mL High Clarity Polyproylene Conical Tube | Falcon | 352196 | |
| FACSAriaIII Fusion | BD Biosciences | 656700 | |
| FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| FlowJo version 10.2 | TreeStar | ||
| NERL Blood Bank Saline | ThermoFisher Scientific | 8504 | used as preservative-free FACS Buffer |
| Olympus SZX7 Stereo Microscope, or similar | Olympus, or similar | ||
| Tissue culture plate, 96-well | Falcon | 353072 | |
| 96 well Cell Culture Plate, V-Bottom | CELLSTAR | 351180 | |
| CryoStor CS10 | Sigma | C2874-100ML | used as cryopreservation buffer for cells in 96-well plate format |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| 24 well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 662160 |
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