Summary
Beskrivs här är ett protokoll för taggning endogenously uttryckte proteiner med fluorescerande Taggar i mänskliga inducerade pluripotenta stamceller med CRISPR/Cas9. Förment redigerade celler berikas av fluorescens aktiverad cell sortering och klonal cellinjer genereras.
Abstract
Ett protokoll presenteras för att skapa mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) som express endogena proteiner smält för att i-frame N - eller C-terminala fluorescerande taggar. Det prokaryota CRISPR/Cas9-systemet (klustrad regelbundet mellanliggande short palindromic repetitioner/CRISPR-associerade 9) kan användas för att införa stora exogena sekvenser i genomisk lokus via homologi regisserad reparation (HDR). För att uppnå den önskade inpressning, detta protokoll sysselsätter ribonukleoprotein (RNP)-baserat tillvägagångssätt där vildtyp Streptococcus pyogenes Cas9 protein, syntetisk 2-del guide RNA (gärna) och en givare mall plasmid levereras till cellerna via elektroporation. Förment redigerade celler som uttrycker de fluorescently märkta proteinerna berikas av fluorescens aktiverad cell sortering (FACS). Klonal rader genereras sedan och kan analyseras för exakt redigering utfall. Genom att införa fluorescerande etiketten på det genomiska locus av genen av intresse, kan den resulterande subcellulär lokalisering och dynamiken av proteinet fusion studeras under endogena tillsyn, en viktig förbättring jämfört med konventionella överuttryck system. Användningen av hiPSCs som modellsystem för genen taggning ger möjlighet att studera de märkta proteinerna i diploida, nontransformed celler. Eftersom hiPSCs kan differentieras till flera celltyper, ger detta tillvägagångssätt möjlighet att skapa och studera märkta proteiner i olika syngena cellulära sammanhang.
Introduction
Användning av editering strategier, särskilt CRISPR/Cas9, att studera cellulära processer blir alltmer lättillgänglig och värdefulla1,2,3,4,5, 6 , 7. en av de många tillämpningarna av CRISPR/Cas9 är införandet (via homologi regisserad reparation (HDR)) av stora exogena sekvenser såsom GFP till specifika genomisk loci som sedan tjänar som reportrar för aktiviteten av en gen eller protein8 . Denna teknik kan användas att gå med en fluorescerande proteinsekvens till en endogen öppen läsning ram där den resulterande endogenously reglerade fusionsprotein kan användas för att visualisera subcellulär lokalisering och dynamiken i proteinet av intresse5 ,6,9,10,11. Medan endogent märkta proteiner erbjuder många fördelar jämfört med överuttryck system, är sätta in stora sekvenser i det mänskliga genomet en ineffektiv process som vanligtvis kräver en markering eller anrikning strategi att få en population av celler som kan vara enkelt studerade5,12.
Det här protokollet beskriver införandet av en DNA-sekvens som kodning en fluorescerande protein (FP) till en önskad genomisk locus. Protokollet omfattar design och leverans av givare mall plasmiden, och ribonukleoprotein (RNP) komplex (vildtyp S. pyogenes Cas9 protein i kombination med syntetiska CRISPR RNA (crRNA) och trans-aktivera crRNA (tracrRNA)). Beskrev också är berikning av förment redigerade celler via fluorescens aktiverad cell sortering (FACS) och klonal cell linje genereringsprocessen. Hittills har denna metod använts för att generera hiPSC rader med antingen monoallelic eller (sällan) bi-alleliska grönt fluorescerande protein (GFP) Taggar märkning tjugofem proteiner som representerar stora cellulära strukturer. De resulterande redigerade cellerna från dessa ansträngningar har bekräftats har beräknade genetiska insättningspunkten, uttrycka ett korrekt lokalisera fusionsprotein och underhålla pluripotency och en stabil karyotyp12 (och opublicerade data). Denna metod har också använts för att generera flera andra singel och dubbel (två olika proteiner som taggats i samma cell) redigeras populationer av hiPSCs (opublicerade data).
Mänskliga iPSCs härrör från en frisk givare valdes för dessa editering insatser eftersom till skillnad från många konventionella cellinjer, de är diploida, karyotypiskt stabilt, icke-omvandlad och proliferativ. Dessa egenskaper ger en attraktiv modell för att studera grundläggande cellbiologi och sjukdom modellering. HiPSCs differentiering potential ger dessutom möjlighet att studera flera utvecklingsstadier parallellt över olika härstamningar och celltyper med syngena celler inklusive organoids, vävnader och ”sjukdom i en maträtt” modeller13 ,14,15. Medan detta protokoll utvecklades för hiPSCs (WTC linje), kan det vara informativ för utveckling av protokoll som använder andra däggdjursceller linjer.
Protocol
1. i Silico Design av crRNA och givaren mall Plasmid för FP Knock-in
- Erhålla kommenterade reference sekvensen från NCBI16 eller den UCSC genomet webbläsare17 (t.ex. GenBank format) i genen av intresse och importera den till en bioinformatik programvara av val. Om sekvensen värd genomet är kända för att innehålla varianter i förhållande till referensränta, inkludera dem nu genom justera referens sekvensen i programvaran bioinformatik (se diskussion).
- Leta upp önskad FP insticksstället. För C-terminal taggar, kommer sekvensen för taggen FP att införas mellan sista basen av den sista kodon och första basen av den stop kodon. För N-terminala taggning, införs sekvensen för taggen FP normalt mellan sista basen av den start-kodon och första basen av den nästa Codonen. I vissa fall, såsom när den start-kodon är en enda kodon exon, eller där en signal sekvens finns nära den protein terminus, får önskad FP insticksstället befinna sig i en mer 3ʹ position, så länge det fortsätter att vara i ram.
- Använd 50 bp på varje sida av önskad insticksstället som ingående sekvens för alla allmänt tillgängliga crRNA designverktyg. När 2-4 crRNA mål har identifierats nära insticksstället, kommentera crRNA bindande platser och protospacer-intilliggande motiv (PAM) sekvenser (NGG) i programvaran bioinformatik. Dessa crRNAs kommer att användas för att inducera dubbel strandsatta raster (se diskussion för mer vägledning om crRNA design).
Obs: Anpassade crRNA sekvenser kan lämnas för syntes med en kommersiell leverantör (rekommenderas) eller sekvensen kan användas som utgångspunkt för att designa en kloning eller in vitro- syntes-strategi, som är utanför ramen för detta protokoll (se diskussionen ). - Att initiera givare mall plasmiden, använda 1 kb av sekvens uppströms av önskad insticksstället som 5ʹ homologi arm (detta bör omfatta de start-kodon för N-terminala infogningar) och använda 1 kb av sekvens nedströms av önskad insticksstället som 3ʹ homologi arm (detta bör omfatta de stop kodon för C-terminal infogningar). Baser mellan de två homologi utelämnas normalt inte. Inklusive cellinje specifika varianter i homologi armarna kommer att bevara dessa genetiska varianter i de resulterande redigerade cellerna.
- Mellan de två homologi, infoga sekvensen för FP (eller andra knock-i sekvens) och sekvensen länkare (se diskussion för mer vägledning om linkers). För N-terminala taggar, bör länkare sekvensen vara direkt 3ʹ av ramprogrammet. för C-terminal Taggar bör länkare sekvensen direkt 5ʹ av FP.
- Störa crRNA bindningsställen i givaren mall plasmiden att förhindra Cas9 skärning av givare sekvens (se diskussion för överväganden när förändra crRNA bindande platser). Om möjligt, är störningar av PAM en sekvens än NGG eller NAG att föredra. Alternativt förutspås att införa punktmutationer till tre baser i regionen utsäde i crRNA (10 baser proximalt PAM) att tillräckligt störa crRNA bindande. Vissa crRNA bindningsställen störs av införandet av FP sekvensen i givaren mall plasmiden; Se till att inga PAM eller intakt bindande region fortfarande existerar i dessa fall.
Obs: I silico givare mall Plasmiden kan lämnas för gen syntes av en kommersiell leverantör, eller det kan användas som en utgångspunkt för att utforma en strategi för kloning, som är utanför ramen för detta protokoll. En enkel ryggrad såsom pUC19 eller pUC57 är tillräcklig.
2. ribonukleoprotein (RNP) Transfection för CRISPR/Cas9 medierad Knock-in i hiPSCs
Obs: I detta protokoll, termen 'gärna' beskriver syntetiska crRNA och tracrRNA ordentligt igen svävande, kvantifierade och pre-komplex per tillverkarens anvisningar (se Tabell för material). Kompletterar alla medier med 1% Penicillin Streptomycin. Allmänna riktlinjer för odling av WTC hiPSC linjen beskrivs mer i detalj på Allen Cell Explorer18,19. WTC hiPSCs används i detta protokoll, men med ordentlig transfection optimering, elektroporation av RNP och givare mall Plasmiden kan framgångsrikt anpassas till andra celltyper.
- Förbereda 10 µM arbetande bestånd av gärna och vildtyp S. pyogenes Cas9 protein2,20; hålla på is. Förbereda 1 µg/µL arbetar beståndet av givare mall plasmid; Förvara i rumstemperatur (RT). Använd pH 8,0 TE buffert för alla utspädningar.
- Förbereda en matris-belagd 6-väl vävnadsodling tallrik med 5 mL färsk tillväxtmassmedia kompletteras med 10 µM ROCK hämmare (Ri) per brunn. Hålla plattan med media i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2 tills den platta celler efter transfection förfarandet (max 2 h).
Obs: Alla matrix-belagda plattor används i protokollet görs genom att lägga till en volym av iskall Matrigel utspädd 1:30 i kalla DMEM/F12 media enligt Allen Institute för Cell vetenskapens protokoll för odling i WTC hiPSC linje19. - Använder en skonsam encelliga dissociation-reagens som rekommenderas i Tabellen för material, passage hiPSCs i enskild cell fjädring och räkna celler med en automatisk cell counter eller hemocytometer.
Obs: Ett detaljerat protokoll för WTC hiPSC raden används här kan hittas på Allen Cell Explorer19. Kortfattat, tvätta cellerna en gång med RT DPBS och behandla med dissociation reagens för 3-5 minuter. Sedan pulverisera celler till encelliga suspension av mild pipettering och pellet genom centrifugering. Återsuspendera cellpelleten levande i tillväxtmassmedia kompletteras med 10 µM Ri.- Förbereda en alikvot av 1,84 x 106 celler för varje experimentella villkor att vara transfekterade i separata 1,5 mL rör.
Obs: Alla volymerna beräknas för en 4,5 µL totala reaktionsvolym i en 100 µL elektroporation volym, ggr 2,3 reaktioner. Detta står för dubbla transfection och överskott för pipettering fel.
- Förbereda en alikvot av 1,84 x 106 celler för varje experimentella villkor att vara transfekterade i separata 1,5 mL rör.
- Förbereda ribonukleoprotein (RNP) komplexa rör för varje experimentella villkor genom att lägga till 2.88 µL 10 µM gärna och 2.88 µL 10 µM Cas9 till ett 1,5 mL rör. Inkubera vid RT i minst 10 min (max 1 h).
- Pellet en cell delmängd (bereddes i steg 2.3.1) vid 211 x g i 3 min vid RT. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 220 µL av tillverkarens elektroporation buffert.
- Lägga till 220 µL återsuspenderad celler från steg 2.5 i 1,5 mL RNP komplexa röret bereddes i steg 2,4.
- Tillsätt 4.60 µL 1 µg/µL donator mall plasmid i 1,5 mL röret bereddes i steg 2,4.
- Använd nucleofection tip och pipetten för att blanda tube innehåll 2 - 3 gånger, sedan överföra 100 µL av suspensionen till beredda elektroporation enheten. Undvika att införa eventuella bubblor i spetsen. Tillämpa 1300 V för 1 puls av 30 ms.
- Försiktigt över till beredda 6-väl plattan från steg 2.2 med virvlande rörelser. Skingra celler genom att försiktigt flytta plattan sida till sida och front-to-back.
- Använder en ny nucleofection spets, upprepa steg 2,8-2,9 med de resterande 100 µL av fjädring och överföring i en andra bra Skyltens 6-väl förberedda.
- Upprepa steg 2,4 genom 2.10 för varje gärna och givare mall plasmid kombination, inklusive icke-targeting gärna, givare mall plasmid endast och buffert endast kontroller. Var noga med för att ändra pipett och nucleofection tips för att undvika korskontaminering.
- Inkubera transfekterade celler vid 37 ° C och 5% CO2. Ändra media till regelbunden tillväxt medier (ingen Ri) på 24 h och fortsätta utfodring hiPSCs varje 24 h för 72-96 h, övervakning konfluens. När hiPSCs når 60-80% sammanflödet, vidare till steg 3.
Obs: Tunga celldöd (> 70%, beräknad) är normalt 24-48 h efter transfection.
3. FACS-anrikning av förment redigerad hiPSCs
Obs: När sortering stamceller, anpassa instrumentets inställningar för att främja cellöverlevnad som föreslås i diskussionen. Kort, använda största munstycket möjligt (130 µm), ett lågt flöde (≤ 24 µL/min), konserveringsmedel slida vätska (till exempel koksaltlösning, se Tabell för material), och låg prov tryck (10 psi).
- Innan du påbörjar en FACS experiment, ändra media till tillväxtmassmedia kompletteras med 10 µM Ri och inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO2 för 2-4 h för att främja överlevnad efter FACS.
- Använda en mild encelliga dissociation-reagens som rekommenderas i Tabellen för material, passage hiPSCs till encelliga suspension i tillväxtmassmedia kompletteras med 10 µM Ri19.
- Filtrera hiPSC fjädring genom 35 µm nätfiltret in polystyren rundkolv rören.
- Sortera celler med framåt scatter och side scatter (inklusive höjd kontra bredd) för att utesluta skräp och midjekort jacka. Använd live, buffert bara styra celler att ställa in utfärda utegångsförbud för FP-positiv, sådan att < 0,1% av buffert endast celler omfattas av grinden.
- Sortera den hela befolkningen av FP-positiva celler i ett 1,5-15 mL polypropylen rör innehållande 0,5-2 mL av RT tillväxtmassmedia kompletteras med 10 µM Ri.
Obs: Polypropylen minskar potentialen för celladhesion till plast. - Centrifugera insamlade celler vid 211 x g i 3 min vid RT.
- Försiktigt Aspirera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 200 µL tillväxtmassmedia kompletteras med 10 µM Ri. Överför upp till 3.000 sorterade celler till en enda brunn av en färsk matrix-belagd plattan med 96 brunnar19.
Obs: Med lämpligt instrument setup, celler kan också sorteras (i bulk) direkt i en enda brunn matrix-belagd 96 brunnar vävnadsodling platta innehållande 200 µL tillväxtmassmedia kompletteras med 10 µM Ri på en rekommenderad densitet av 1 000-3 000 celler per brunn för hiPSC. - Inkubera sorterade celler vid 37 ° C och 5% CO2. Ändra media till tillväxtmassmedia kompletteras med 5 µM Ri på 24 h. 48 h börja utfodring celler regelbunden tillväxt medier (ingen Ri) varje 24 h för 72-96 h, övervakning konfluens. Överlevnad efter FACS beräknas vara större än 50% om minst 500 celler är seedad i en brunn i en plattan med 96 brunnar.
- När hiPSCs når 60-80% sammanflödet och Visa mogen morfologi (jämn, väl packad kolonin centers), passage i ett större format plattan såsom en 24-well platta och sedan från en 24-well platta till en 6-bra platta.
- När hiPSCs i en 6-well platta når 60-80% sammanflödet och Visa mogen morfologi, expandera till en 100 mm platta, åter tallrik för avbildning, frysa eller utsäde klon plockning densitet (steg 4)19.
4. generera förment redigeras klonal hiPSC linjer
- Använder en skonsam encelliga dissociation-reagens som rekommenderas i Tabellen för material, passage hiPSCs till encelliga suspension och bestämma antalet celler per mL19.
- Utsäde 10.000 celler av hiPSCs på en färsk matrix-belagd 100 mm vävnadsodling maträtt med tillväxtmassmedia kompletteras med 10 µM Ri19redigerade befolkning. Ändra media till tillväxt medier utan Ri 24 h efter sådd och mata hiPSCs med färska tillväxt medier varje 24 h för 5-7 dagar.
- När hiPSCs har bildat kolonier som är synliga makroskopiskt (cirka 500 µm) de är tillräckligt stora för att vara isolerad. Förbereda en matris-belagd plattan med 96 brunnar genom att aspirera överskott matris och lägga 100 µL av tillväxtmassmedia kompletteras med 10 µM Ri per väl19.
- På dissekera Mikroskop användning en P-200 pipett eller liknande, att försiktigt skrapa och aspirera enskilda kolonier från den platta ytan. Överföra volym (~ 20-100 µL) som innehåller kolonin till en enda brunn den plattan med 96 brunnar bereddes i steg 4,3.
- Efter alla kolonier har överförts, inkubera plattan i en vävnadskultur inkubator på 37˚C och 5% CO2. Ändra media till regelbunden tillväxt medier (ingen Ri) på 24 h och fortsätta utfodring celler varje 24 h för 72-96 h tills kolonierna har ungefär tredubblats i storlek (cirka 1500 µm).
Obs: Plocka 24-96 kolonier per crRNA som används i transfection rekommenderas. Överlevnad av isolerade kloner är vanligtvis större än 95%.
- Efter alla kolonier har överförts, inkubera plattan i en vävnadskultur inkubator på 37˚C och 5% CO2. Ändra media till regelbunden tillväxt medier (ingen Ri) på 24 h och fortsätta utfodring celler varje 24 h för 72-96 h tills kolonierna har ungefär tredubblats i storlek (cirka 1500 µm).
- Använder en skonsam encelliga dissociation-reagens som rekommenderas i Tabellen för material, kloner passage hiPSC i en ny matris-belagd-plattan med 96 brunnar enligt följande19.
- Använder en 8-kanals insugningsventil, avlägsna och kassera media från den första kolumnen i plattan med 96 brunnar.
- En P-200 flerkanalspipett Lägg till ~ 200 µL av DPBS till den första kolumnen i plattan med 96 brunnar att tvätta cellerna. Använder en 8-kanals insugningsventil, avlägsna och kassera DPBS tvätta från den första kolumnen i plattan med 96 brunnar.
- Med hjälp av en P-200 flerkanalspipett, tillsätt 40 µL av dissociation reagens till den första kolumnen i plattan med 96 brunnar.
- Upprepa steg 4.5.1-4.5.3 för upp till totalt sex kolonner av den plattan med 96 brunnar, ändra tips vara säker på att inte cross-förorena brunnar. Placera plattan i 37 ° C inkubator för 3-5 minuter från det att dissociation reagensen lades till den första kolumnen (steg 4.5.3).
Obs: Det rekommenderas att endast passagen maximalt sex kolumner (48 brunnar) i taget på grund av den tid det tar för att utföra dessa steg. När du utför detta protokoll för första gången, börja med endast passaging en eller två kolumner i taget. Begränsa antalet kolumner anpassade samtidigt säkerställer att cellerna inte är kvar i dissociation reagensen för länge, vilket kan vara skadligt för hiPSCs. - När cellerna i den första kolumnen av plattan har börjat att lyfta plattan längst ner, Använd en P-200 flerkanalspipett att lägga 160 µL av DPBS till den första kolumnen i plattan med 96 brunnar och försiktigt pulverisera cellerna på den ”12:00” , ”3:00”, ”6:00” och ”9:00” positioner i varje brunn. Över hela volymen av cellsuspensionen (200 µL) till en V-botten 96 brunnar tallrik.
- Upprepa steg 4.5.5 för de återstående kolumnerna av celler som har dissociation reagens i dem; ändra tips om inte cross-förorena brunnar.
- Snurra den V-botten plattan i en centrifug vid 385 x g under 3 minuter vid RT.
- Med P-200 flerkanalig pipett försiktigt avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 200 µL av färska tillväxtmassmedia kompletteras med 10 µM Ri per brunn. Upprepa för alla brunnar, byta tips om inte cross-förorena.
- Överföra alla cellsuspensionen till en färsk matrix-belagd plattan med 96 brunnar19. Inkubera plattan i en vävnadskultur inkubator vid 37 ° C och 5% CO2. Ändra media till regelbunden tillväxt medier (ingen Ri) på 24 h och fortsätta utfodring celler varje 24 h för 72-96 h, tills majoriteten av kloner når 60-80% sammanflödet.
Obs: Denna passage hjälper till att sprida ut cellerna och möjliggör mer tillväxt över hela området i plattan med 96 brunnar.
- Observera kloner och identifiera en lämplig delningsfaktorn för varje enskild klon i plattan med 96 brunnar (t.ex. 1:10 eller 1:8). Med en skonsam encelliga dissociation-reagens som föreslås i Tabellen för material, kloner passage hiPSC i en ny matris-belagd plattan med 96 brunnar (steg 4.5.1-4.5.8) överföra ett förhållande av cellsuspensionen lämpliga för varje klon. Inkubera plattan i en vävnadskultur inkubator på 37˚C och 5% CO2. Ändra media till regelbunden tillväxt medier (ingen Ri) på 24 h och fortsätta utfodring celler varje 24 h för 72-96 h, tills majoriteten av kloner kommer 60-80% sammanflödet, och Visa mogen morfologi.
Observera: Varje klon kan ha en annan delningsfaktorn på grund av lite olika tillväxttakt eller överlevnad från tidigare passage, så denna passage hjälper till att normalisera antalet celler per brunn av varje klon för frysning steg att följa. På grund av de varierande satser som överlevnad och tillväxt, kan vissa kloner växa över eller misslyckas att växa under dessa passaging steg.- Spara resten av cellsuspensionen och pellet för gDNA isolering genom centrifugering celler i en V-botten 96 brunnar tallrik vid 385 x g i 3 min i RT. ta bort supernatanten och vidare till gDNA isolering med en 96 brunnar, eller lagra platta av pelleterat celler vid - 20 ˚c för upp till thr ee veckor.
5. Frysförvaring av klonala cellinjer i plattan med 96 brunnar format
- Använda en encellig dissociation reagens, passage hiPSC kloner som tidigare beskrivits (steg 4.5.1-4.5.7). Aspirera supernatanten med P-200 flerkanalig pipett och slamma i 60 µL tillväxtmassmedia kompletteras med 10 µM Ri. Upprepa för alla brunnar; ändra tips om inte cross-förorena.
- Överföra 30 µL cellsuspension till en icke-matrix belagda 96 brunnar vävnadsodling tallrik. Sedan snabbt lägga till 170 µL frysning buffert (se Tabell för material) till varje brunn, utan att blanda. Upprepa genom att överföra de återstående 30 µL av suspensionen i en syster plattan och lägga till 170 µL frysning buffert.
Obs: Denna process sker i dubbla syster plattor så att en säkerhetskopiera befolkningen av celler finns efter upptining en av de enskilda plattorna. Att sätta frysförvarade celler i endast varje andra kolumnen i en plattan med 96 brunnar möjliggör snabbare upptining (steg 5,6). - Wrap med parafilm och placera i en RT frigolitlåda med lock. Placera rutan hela i-80 ° C frys.
- Efter 24 h kan plattorna överföras ur frigolit lådan och lagras vid - 80˚C för upp till fyra veckor.
Obs: Medan cellerna tillfälligt lagras vid-80 ° C, genetiska kvalitetskontroll analyser kan utföras med den gDNA skördas från celler som erhölls i steg 4.6.1 för att identifiera klonerna för att Tina och sprida vidare, som diskuterats i tidigare publicerade arbete 12. kort, en kopia nummer droplet digital PCR-analys kan användas för att identifiera kloner som innehåller en eller två kopior av god Jordbrukarsed och ingen givare mall plasmid ryggraden integration. En kombination av slutpunkten PCR-analyser och Sanger sekvensering kan sedan identifiera kloner som innehåller ett exakt skär. - För att tina upp, ta med hela plattan till 37 ° C i en vävnadskultur inkubator, titta noga för is pelletsen att smälta. Brunnar på kanten av plattan tenderar att Tina först.
- När isen pelleten av önskad klon smälter, försiktigt över hela 200 µL till en 15 mL koniska rör innehållande 3 mL RT tillväxtmassmedia kompletteras med 10 µM Ri och centrifugera vid 211 x g under 3 minuter vid RT.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleterat celler i 1 mL av RT tillväxtmassmedia kompletteras med 10 µM Ri. Överföring till en färsk matrix-belagd 24-well platta och inkubera vid 37˚C och 5% CO2. Ändra media till regelbunden tillväxt medier (ingen Ri) på 24 h och fortsätta utfodring celler varje 24 h för 72-96 h tills klonen når 60-80% konfluens och har mogna morfologi19.
Representative Results
Målet med detta experiment var att säkring mEGFP (monomer förbättrade GFP) till nukleära lamin B1 proteinet genom att införa mEGFP sekvensen till 5ʹ slutet av den LMNB1 genen (N-terminalen av protein). En länkare (amino syra ordnar SGLRSRAQAS) valdes utifrån tidigare cDNA konstruktioner från Michael Davidson fluorescerande Protein samling21. Eftersom regionen crRNA bindande i givaren mall plasmiden för varje kandidat crRNA stördes efter i silico införande av mEGFP och sekvensen länkare, ingen punktmutationer behövde göras att störa potentiella crRNA erkännande och klyvning av Cas9 av givare sekvensen (figur 1). Sekvensen givare innehöll 1 kb homologi armar flankerar båda ändarna av mEGFP-linker sekvensen. De resulterande 2 734 bp DNA var klonade in ett pUC57 ryggrad, sekvens verifierade, och den resulterande givare mall plasmiden renades med en endotoxinfria maxi prep. Den givaren mall plasmid och RNP komplexa var transfekterade, förment redigerade celler berikades och lokalisering av den mEGFP-nukleära lamin B1-fusionsprotein bekräftades av fluorescensmikroskopi (figur 2). Endast resultat från de crRNA1 transfection beskrivs här, även om båda crRNA sekvenser producerat förment redigerade populationer12.
Jämfört med den negativa kontrollen, som innehöll ingen gärna, Cas9 protein eller givare mall plasmid i elektroporation reaktionen (endast buffert), den LMNB1 crRNA1 transfekterade innehöll cellerna 0,95% mEGFP-positiva celler representerar den förment redigerade mEGFP-nukleär lamin B1 befolkningen (figur 3a). Detta resultat var inom spänna av inpressning effektivitetsvinster observerats över många genomisk lokus använder denna metod, som tidigare rapporterats12.
MEGFP-positiva celler var isolerade av FACS och fotograferad av levande mikroskopi bekräfta förväntade lokalisering av mEGFP-nukleära lamin B1 fusionsprotein på kärn-kuvertet. Efter FACS-anrikning var cirka 90% av sorterade celler från LMNB1 crRNA1 befolkningen mEGFP-positiv (som bestäms av mikroskopi), tyder på att vissa mEGFP-negativa celler renas tillsammans med GFP-positiva celler under förfarandet för sortering. Detta var en acceptabel nivå av anrikning som tillåtna för plockning av 96 kloner som sedan kunde undersökas genetiskt för framgångsrika redigering. I allmänhet en cut-off för framgångsrika berikning är 50% GFP positivt.
Majoriteten av sorterade cell befolkningen visas fluorescens vid kärn kuvertet (nukleära periferi) i nondividing celler och att en utökad kärnkraft lamina inom cytoplasman under Mitos som ger förtroende i rätt genomisk redigera på LMNB1 Locus. Den berikade befolkningen innehöll celler med antingen ljusa eller svagt signal. Denna skillnad i signalintensitet kan återspegla en kombination av korrekta och felaktiga redigering utfall och markeringar verktyget för att generera en genetiskt validerade klonal linje för ytterligare studier (se diskussion) (figur 3b)12. Efter klonal linje generation, validerade genetiskt celler visade enhetliga GFP intensitet i mikroskopi experiment (figur 3 c).
Figur 1 . Design strategi för N-terminalen GFP taggning av LMNB1-genen. Taggen GFP var avsedd för N-terminala införande 5ʹ av den första exon av LMNB1 ligger på kromosom 5. Både 5ʹ och 3ʹ homologi armar är 1 kb varje och träffas mellan det start-kodon (ATG) och den andra kodon (homologi vapen endast delvis representerade i figur). Två kandidat crRNAs utformades för att vägleda Cas9 klyva så nära avsedda insticksstället som möjligt, medan det fortfarande är unik i genomet. Sekvens för mEGFP och en aminosyra linker var infogade bara 3ʹ av de start-kodon (mEGFP och linker sekvens inte att skala). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Arbetsflöde för att producera endogenously taggade hiPSC klonal linjer. Transfection komponenter, inklusive Cas9/crRNA/tracrRNA RNP komplexet (visas som röda Cas9 protein med guld crRNA och lila tracrRNA), donator mall plasmiden som innehåller homologi armarna (har, visas i guld), och FP + linker sekvens (visas i grönt), var electroporated. Efter 4 dagar, FP-positiv förment redigeras cellerna var berikas av FACS och expanderat som en population genom sådd alla sorterade celler i en enda bra av en plattan med 96 brunnar (~ 1000 celler), och sedan utökades i kultur till en befolkning på flera miljoner celler kan analyseras som ”berikade befolkningen” (se protokollet steg 3.8). Avkastningen av FP-positiva celler skiljer sig genom experiment på grund av varierande räntesatser HDR12; en framgångsrik berikning kan vanligtvis omfatta ~ 300-5000 celler efter transfection cirka 1,6 x 106 höfter celler. Preliminära imaging studier bekräftade signal och lokalisering av proteinet fusion i berikade befolkningen. Kolonier var manuellt plockade in en plattan med 96 brunnar för expansion och frysförvaring. Ytterligare genomisk kvalitetskontroll screening med droplet digital PCR (ddPCR) och andra PCR-baserade analyser användes sedan för att identifiera korrekt redigerade kloner, som tidigare beskrivits12. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Anrikning av förment redigerade cellpopulationer. (A) flöde flödescytometri tomter i LMNB1 redigeras celler fyra dagar efter transfection. Y-axeln visar god Jordbrukarsed intensitet och x-axeln visar framåt scatter. Sortering gates var ställa baserat på kontrollen endast buffert. Eftersom hiPSCs är känsliga för störning, live/dead fläcken utelämnades och en mycket konservativ FSC/SSC grind användes i stället. (B) efter anrikning, befolkningen i LMNB1 Cr1 redigeras celler visade ~ 90% av celler med GFP lokalisera på kärn kuvertet (beräknade LMNB1 lokalisering). Befolkningen innehöll celler av varierande GFP intensitet samt vissa GFP-negativa celler. Skala barer är 10 µm. (C) efter klonal linje generation, celler visade en enhetlig GFP intensitet, med vissa cellcykeln beroende skillnader. Skalstapeln är 20 µm.
Discussion
Metoden presenteras här för generera endogenously reglerade fluorescerande protein fusioner i hiPSCs är en mångsidig och kraftfull metod för att generera gen redigeras cellinjer med applikationer alltifrån levande cell imaging till olika funktionella studier och ” i en maträtt ”sjukdomsmodeller med patientderiverade hiPSC linjerna13,14,15. Medan denna metod har använts för att införa stora FP taggar till N - eller C-terminus av endogena proteiner, skulle det potentiellt kunna användas att introducera andra taggar eller små genetiska förändringar till modell eller rätta sjukdomsframkallande mutationer22,23 . För mindre skär, storleken på homologi armen kan minskas, men den allmänna strategin för redigering presenteras i denna metod kan fortfarande tillkomma24,25. Medan användningen av hiPSCs är starkt uppmuntras för deras allra utility, med noggrann optimering, kan detta protokoll anpassas för att redigera genomen hos andra däggdjur cellinjer.
När identifiera en gen av intresse för FP taggning, avskrift överflöd uppskattar (från microarray eller RNA-Seq data) är en bra utgångspunkt för att bedöma huruvida en gen eller isoform av intresse uttrycks, även om avskrift nivåer inte alltid korrelerar med proteinnivåer. FACS-anrikning strategin beskrivs här fungerar bäst för gener som uttrycks åtminstone måttligt väl i celltyp av intresse. Denna strategi har också varit framgångsrik i att välja för fusioner som visar punktuell eller diskret lokalisering mönster såsom centrin, desmoplakin och paxillin där signal-bakgrund-förhållande är mycket låg12,19. Gener som uttrycks inte mycket eller uttrycks endast i derivat celltyper kan kräva ytterligare urval strategier.
Utgångspunkten för crRNA och givaren plasmid mallar används i mänskliga cellinjer bör vara mänsklig referens genomet (GRCh38). Eftersom genomen hos olika cellinjer kan variera inom samma art, och eftersom CRISPR/Cas9 är sekvens-specifik, är det extremt bra att identifiera cell linjespecifika varianter (enda nukleotid polymorfismer eller infogningar/borttagningar (indels)) som skiljer sig från referens genomet och införliva dessa i designen. Detta säkerställer att crRNAs kommer att vara kompatibel med värd genomet och att givaren mall plasmid homologi armarna kommer att behålla någon cellinje särskilda varianter. En föreslagen strategi är att införliva homozygot varianter i crRNAs och givaren mall plasmid homologi armar under designprocessen. Det är valfritt att införliva heterozygot varianter. De specifika reagenserna används för stora inpressning experiment och andra viktiga överväganden för detta protokoll diskuteras nedan.
Cas9 Protein
Den främsta fördelen med att använda Cas9 protein är att införa Cas9 och gärna som en komplex RNP har visat sig resultera i en begränsad varaktighet av nuclease aktivitet jämfört med plasmid-baserat tillvägagångssätt där uttryck av Cas9 och gärna kan fortsätta i dagar och leda till större på - och off-target aktivitet26,27. Ytterligare en fördel med att använda Cas9 protein är att det är lättillgängliga att klyva en gång inne i cellerna. Detta kontrasterar mot mer konventionella metoder för att använda Cas9 mRNA eller Cas9/gärna plasmiden som kräver transkription, översättning och protein bearbetning26,28. Vildtyp S. pyogenes Cas9 protein är nu tillgänglig från många kommersiella källor.
Guide RNA
Det finns många allmänt tillgängliga verktyg för att hitta crRNA mål nära önskad FP insticksstället som har noll eller några förutspådda off-mål i den värd genom29,30,31,32. Effektivitetsvinster i HDR och precisionen av HDR resultatet varierar kraftigt mellan crRNA mål används på en viss locus12. Av denna anledning, testa flera crRNAs (2-4 och helst inom 50 bp av önskad insticksstället) per locus rekommenderas eftersom det kan öka sannolikheten för ett framgångsrikt redigering experiment. Aktuella möjligheter för att leverera gärna inkludera syntetisk 2-del crRNA och tracrRNA, syntetiska inre gRNAs (sgRNAs), in vitro- transkriberat sgRNAs eller leverera en plasmid till celler som uttrycker sgRNA från U6 främjare. Detta protokoll har inte optimerats för höga klyvning aktivitet. Omodifierade 2-del crRNA och tracrRNA (se Tabell för material) användes med målet att generera mono-alleliska FP-taggade cellinjer samtidigt som de orsakar den minst potentiell störning till cellerna.
Givare mall Plasmid
Eftersom några av homologi arm sekvens förutsatt i givaren mall plasmid kommer att införlivas i den värd arvsmassan under händelsen HDR, bör punktmutationer till crRNA erkännande platser införas för att förhindra ytterligare klyvning av Cas9 efter HDR. Ofta är den enklaste störande ändringen att mutera PAM sekvensen. Eftersom vissa icke-kanoniska PAM sekvenser kan fortfarande kännas igen av vildtyp S. pyogenes Cas9, är det bäst att undvika att använda NGG, NAG eller NGA33. När muterar homologi armen, undvika icke-synonymt mutationer och införandet av sällsynta kodon. Om en synonymt förändring till PAM sekvensen inte är möjligt, överväga att göra tre synonymt punktmutationer i regionen utsäde (10 bp proximalt PAM) av crRNA bindningsstället. Extrem försiktighet iakttas när du gör dessa ändringar i regionen 5ʹ oöversatta (UTR) eftersom dessa regioner kan innehålla viktiga reglerande sekvenser. Consulting en genetiskt bevarande databas som UCSC genomet webbläsarens komparativ genomik spår kan ge vägledning i dessa fall som ändringar av icke-bevarad baser kan tolereras bättre än ändringar mycket baser17. Ibland är enbart införande av sekvensen FP tillräckligt för att störa crRNA bindningsstället (som i figur 1). den nyligen tillagda sekvensen bör dock kontrolleras för varaktigheten av crRNA bindande och PAM sekvenser.
Aminosyra linkers mellan FP och infödda protein rekommenderas att bevara funktionen av de fusion protein34. En aminosyra linker kan ofta väljas för sin särskild avgift eller storlek. Om en cDNA fusion med en design som liknar den riktade endogena undersökts fusionsprotein väl, att samma linker sekvens kan användas för CRISPR/Cas9 inpressning experiment12,19. Om sådan information är tillgänglig, en kort länkare som GTSGGS har också varit framgångsrikt använt12. Andra studier har visat framgång med en generisk små 3-amino acid linker sekvens för en mängd mål35.
Transfection och FACS berikning
Många kommersiellt tillgängliga transfection reagenser är formulerade för leverans av vissa typer av molekyler till celler, medan ett elektroporation system kan användas för att leverera reagenser med ett brett utbud av storlek, kostnad och sammansättning. Förutom att vara en vanlig transfection metod för hård-till-transfect celler som hiPSCs, bär elektroporation också fördelen med att leverera alla tre komponenter för CRISPR/Cas9-medierad FP inpressning som beskrivs för denna metod. Elektroporation konstaterades för att producera de bästa resultat jämfört med andra kommersiellt tillgängliga reagens när utveckla denna metod (inga data anges), och har också använts av andra för RNP leverans26,28,36 .
När du använder detta protokoll för redigering hiPSCs, bör särskild försiktighet iakttas att säkerställa skonsam hantering av cellerna före och efter genen redigeringsprocessen för optimal cellöverlevnad och minimal spontana differentiering. I synnerhet de FACS anrikningsmetoder bör anpassas för sortering av stamceller med hjälp av största munstycket möjligt (130 µm), ett lågt flöde (≤24 µL/min), konserveringsmedel slida vätska (till exempel koksaltlösning, se Tabell för material), och låg prov Tryck (10 psi). I stället för enstaka cell sortering, vilket resulterar i suboptimala livskraft i stamceller, de FACS-berikade hiPSCs sorteras i bulk och expanderat som en population att optimera cellernas livskraft och stamceller integritet. Dock kan det vara lämpligt för mindre känsliga celltyper enda cell sortering. För att främja cellöverlevnad, celler returneras till kultur inte längre än en timme efter skörd för FACS anrikningen och förvarats i rumstemperatur under hela sortering. För vissa celltyper, kan cellöverlevnad också förstärkas av ruvande celler på is (4° C) under hela sortering.
Bulk utbyggnaden av FP-positiva celler ger en möjlighet att utvärdera befolkningen av bildanalys för fusion protein lokalisering före klonal radgenerering. Medan den resulterande berikad befolkningen av celler kan räcka för vissa studier, visar dessa populationer ofta FP signal av varierande intensitet. Isolerade klonal raderna har enhetliga signal (figur 3), vilket gör dem lämpligare för funktionella experiment12.
Klonal Cell linje Generation
Under hela redigering och klonal linje generation är det viktigt att övervaka cellmorfologi. hiPSC kolonier odlas i feeder-fria villkor bör uppvisa jämna kanter och en jämn, väl packad center12,18,19. Differentierade celler observeras i mindre än 5% av kulturen. När plocka enskilda kolonier, välja dem som uppvisar bra morfologi. Under den plattan med 96 brunnar passaging händelser, kontrollera kloner för morfologi och avbryta dem som har övervuxna eftersom detta kan leda till differentiering eller vara ett tecken på genetisk instabilitet.
Generation av klonala cellinjer möjliggör genetisk bekräftelse av exakt redigering, vilket är viktigt eftersom Cas9-inducerad double strand breaks i genomet ofta repareras imprecisely trots införlivandet av etiketten på det önska locus. Tidigare beskrivna PCR-baserade analyser visade att kumulativt över tio unika genomisk loci många (45%) av FP-uttryckande klonerna drabbades av givare plasmid ryggraden integration på det rikta locus eller (sällan) slumpmässigt i genomet12. Dessutom, 23% av GFP-positiva kloner (n = 177) över tio unika loci befanns harbor mutationer på eller nära den förvänta crRNA skärande platsen i den otaggade allelen, troligen på grund av NHEJ12. Denna genetiska analyser av många klonal linjer (~ 100 kloner/redigera) underströk vikten av genetisk validering som inte är möjligt i en cell befolkningen eftersom FP-uttryck och förväntade fusion protein lokalisering ensam inte garanterar exakt redigering12 . Dessutom kan inte dessa PCR-baserade analyser utföras på en berikad population av celler med säkerhet, motiverar behovet av klonala linje generation innan meningsfull analys kan slutföras. Genetiska bekräftelse av taggen infogade FP och verifiering av genetisk integritet den oredigerade allelen (i en mono-alleliska redigerade klon) är både nödvändigt för att säkerställa exakt redigering på den riktade locus bortom etikettuttrycket.
Bi-alleliska redigeringar med låg hastighet och brist på off-target mutationer (som analyseras av Sanger och exome sekvensering) har observerats hittills använder denna metod (opublicerade data)12. Detta överensstämmer med tidigare studier som beskriver användningen av kortvarig RNP för CRISPR/Cas9 experiment26,27. Avsaknaden av klonala cellinjer med bi-alleliska redigeringar kan också vara locus specifika eller på grund av cellen oförmåga att tolerera två taggade kopior av en viktig protein som föreslagits från tidigare publicerade experiment där förmodade bi-alleliska redigerade celler var observerats för en locus (LMNB1), men inte en annan (TUBA1B)12. BI-alleliska fullt validerade klonal cellinjer har genererats med hjälp av denna metod att tag ST6 beta-galactoside alpha-2, 6-sialyltransferase 1 (ST6GAL1) och RAB5A medlem RAS onkogen familj (RAB5A) med mEGFP19.
Bortom bekräftar precision redigera i genomet, det finns en mängd kvalitetskontroll analyser som kan användas för att ytterligare karakterisera klonal linjen och identifiera kloner som uppfyller alla stamceller, genomisk, och cellen biologiska kriterier för att användas i framtida studier . Cell biologiska och funktionella analyser kan användas för att bekräfta lämpliga uttryck, lokalisering och funktion av fusion protein12. Jämförelsen till oredigerad Föräldrakontroll hjälper utvärdera påverkan av redigeringen på lokalisering, dynamik och funktion. Andra analyser avgöra såsom Tillväxtanalys och tester för genomisk stabilitet kan också hjälpa om märkta proteinet är störande till cellen. När du använder hiPSC i detta protokoll, kan utvärdering av pluripotency markörer och differentiering potential vara avgörande för att fastställa en klon som är värdefull för nedströms studier12. Eftersom extended kultur av hiPSC har visat sig leda till genetisk instabilitet, övervakning tillväxttakten och karyotyp klonal cellinjer är också viktiga12,37. Emellertid avsedd slutliga användning av redigerade cellerna kommer i slutändan bestämma nivå och bredd av kvalitetskontroll analys och varierar beroende på programmet.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Daphne Dambournet för många insiktsfulla diskussioner och rådgivning på genen redigering, Thao göra för illustration, Angelique Nelson för kritisk läsning av manuskriptet och Andrew Tucker för att skapa raden mEGFP-taggade Lamin B1 cellen. Vi vill uppmärksamma de stamceller och Gene Editing och Assay utvecklingsteam vid Allen Institute för Cell vetenskap för deras bidrag till genen redigering och kvalitetskontroll. WTC raden som vi använde för att skapa vår gen-redigeras cellinje tillhandahölls av Bruce R. Conklin Laboratory vid Gladstone institut och UCSF. Vi tackar Allen Institute for Cell vetenskap grundare, Paul G. Allen, för hans vision, uppmuntran och stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Geneious R9 | Biomatters, or similar | bioinformatics software for in silico donor plasmid design | |
| TE Buffer pH 8.0 | IDT, or similar | 11-01-02-05 | |
| HERAcell VIOS 160i CO2 incubator, or similar | ThermoFisher Scientific, or similar | 51030408 | |
| Pipettes (1000 µL, 200 µL, 20 µL, 10 µL, 2 µL) | Rainin, or similar | ||
| Pipette tips (1000 µL, 200 µL, 20 µL) | Rainin, or similar | ||
| Multi-channel Pipette (200 µL) | Rainin, or similar | ||
| Serological pipetes (25 mL, 10 mL, 5 mL) | Costar, or similar | ||
| BRAND 8-Channel Manifold for Quiksip, Autoclavable | Millipore Sigma, or similar | BR704526-1EA | use with non-filtered pipet tips, such as Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10, below |
| Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10 | Thermo Fisher, or similar | 3501-05 | |
| XP2 Pipette Controller | Drummond, or similar | 4-000-501 | |
| Disposable Pasteur Pipets | VWR, or similar | 53300-567 | |
| Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | CELLGARD, or similar | NU-481 | |
| Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | lot tested before use with hiPSC |
| DMEM/F12 (-phenol red) | Gibco | 11039-021 | cold, for diluting Matrigel 1:30 |
| mTeSR1 Complete Media | StemCell Technologies | 85850 | recommended growth media for WTC hiPSC line |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| WTC hiPSC line | Coriell | GM25256 | the hiPSC line used in this protocol is available through Coriell |
| Tissue culture dish 100 mm | Falcon | 353003 | |
| 6-well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 657160 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A11105-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| 15 mL polystyrene conical | Sarstedt | 62.554.100 | |
| Y-27632 (ROCK Inhibitor) | StemCell Technologies | 72308 | |
| Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic crRNA, unmodified (custom sequence) | Dharmacon | Custom0247 | |
| Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA | Dharmacon | U-002005-05 | |
| Recombinant wild-type Streptococcus pyogenes Cas9-NLS purified protein, 40 µM | University of California-Berkeley QB3 Macrolab | ||
| Custom donor plasmid (PriorityGENE) | Genewiz | donor insert design was synthesized and cloned into pUC57 backbone by Genewiz | |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| NucleoBond Xtra Maxi EF | Clontech | 740424.50 | |
| Neon Transfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | |
| Neon Transfection System, 100 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK10096 | |
| 5 mL Polystyrene Round-bottom Tube with Cell Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 15 mL High Clarity Polyproylene Conical Tube | Falcon | 352196 | |
| FACSAriaIII Fusion | BD Biosciences | 656700 | |
| FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| FlowJo version 10.2 | TreeStar | ||
| NERL Blood Bank Saline | ThermoFisher Scientific | 8504 | used as preservative-free FACS Buffer |
| Olympus SZX7 Stereo Microscope, or similar | Olympus, or similar | ||
| Tissue culture plate, 96-well | Falcon | 353072 | |
| 96 well Cell Culture Plate, V-Bottom | CELLSTAR | 351180 | |
| CryoStor CS10 | Sigma | C2874-100ML | used as cryopreservation buffer for cells in 96-well plate format |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| 24 well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 662160 |
References
- Wood, A. J., et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 333 (6040), 307 (2011).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Dambournet, D., Hong, S. H., Grassart, A., Drubin, D. G. Tagging endogenous loci for live-cell fluorescence imaging and molecule counting using ZFNs, TALENs, and Cas9. Methods in Enzymology. , 139-160 (2014).
- Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Sci Rep. 5, 9592 (2015).
- Hendriks, W. T., Warren, C. R., Cowan, C. A. Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells: Approaches, Pitfalls, and Solutions. Cell Stem Cell. 18 (1), 53-65 (2016).
- Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Cell Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
- Doyon, J. B., et al. Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells. Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).
- Cho, W. K., et al. Super-resolution imaging of fluorescently labeled, endogenous RNA Polymerase II in living cells with CRISPR/Cas9-mediated gene editing. Sci Rep. 6, 35949 (2016).
- White, C. W., Vanyai, H. K., See, H. B., Johnstone, E. K. M., Pfleger, K. D. G. Using nanoBRET and CRISPR/Cas9 to monitor proximity to a genome-edited protein in real-time. Sci Rep. 7 (1), 3187 (2017).
- Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Mol Biol Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).
- Soldner, F., et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations. Cell. 146 (2), 318-331 (2011).
- Young, J. E., Goldstein, L. S. Alzheimer's disease in a dish: promises and challenges of human stem cell models. Human Molecular Genetics. 21 (R1), R82-R89 (2012).
- Soares, F. A., Sheldon, M., Rao, M., Mummery, C., Vallier, L. International coordination of large-scale human induced pluripotent stem cell initiatives: Wellcome Trust and ISSCR workshops white paper. Stem Cell Reports. 3 (6), 931-939 (2014).
- Gene, NCBI- National Center for Biotechnology Information. , U.S. National Library of Medicine. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene (2017).
- Gene, NCBI- National Center for Biotechnology Information. , UCSC Genome Browser. https://genome.ucsc.edu/ (2017).
- Allen Cell Methods: Single cell passaging human iPS cells. , https://www.youtube.com/watch?v=wao2UcMFPMc (2018).
- Allen Cell Explorer. , http://www.allencell.org/ (2017).
- Lingeman, E., Jeans, C., Corn, J. E. Production of Purified CasRNPs for Efficacious Genome Editing. Curr Protoc Mol Biol. 120, 31-31 (2017).
- Michael Davidson Fluorescent Protein Collection. , https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/davidson/ (2017).
- Cox, D. B., Platt, R. J., Zhang, F. Therapeutic genome editing: prospects and challenges. Nature Medicine. 21 (2), 121-131 (2015).
- Haas, S. A., Dettmer, V., Cathomen, T. Therapeutic genome editing with engineered nucleases. Hamostaseologie. 37 (1), 45-52 (2017).
- Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K., Carroll, D. Donor DNA Utilization During Gene Targeting with Zinc-Finger Nucleases. G3 (Bethesda). 3 (4), 657-664 (2013).
- Orlando, S. J., et al. Zinc-finger nuclease-driven targeted integration into mammalian genomes using donors with limited chromosomal homology. Nucleic Acids Research. 38 (15), e152 (2010).
- DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein. Methods. 121-122, 9-15 (2017).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
- Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44 (W1), W272-W276 (2016).
- Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
- Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
- CRISPOR V4.3. , http://crispor.tefor.net/ (2017).
- Zhang, Y., et al. Comparison of non-canonical PAMs for CRISPR/Cas9-mediated DNA cleavage in human cells. Sci Rep. 4, 5405 (2014).
- Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Adv Drug Deliv Rev. 65 (10), 1357-1369 (2013).
- Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (25), E3501-E3508 (2016).
- Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
- Baker, D., et al. Detecting Genetic Mosaicism in Cultures of Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 7 (5), 998-1012 (2016).
