Summary
Burada açıklanan endogenously etiketleme için bir protokol proteinler insan indüklenmiş pluripotent kök hücreler CRISPR/Cas9 kullanarak floresan etiketleri ile ifade olmasıdır. Putatively düzenlenen hücreleri hücre aktif floresans sıralayarak zenginleştirilmiş ve klonal hücre satırları oluşturulur.
Abstract
Bir iletişim kuralı bu çerçeve N veya C terminal floresan Etiketler için ifade endojen proteinler erimiş insan indüklenmiş pluripotent kök hücreler (hiPSCs) oluşturmak için sunulmaktadır. Prokaryotik CRISPR/Cas9 sistemi (kümelenmiş düzenli olarak interspaced kısa palindromik tekrarlar/CRISPR-ilişkili 9) Yönetmen: Homoloji onarım (HDR) üzerinden genomik loci içine büyük eksojen dizileri tanıtmak için kullanılır. İstenen knock-içinde elde etmek için bu iletişim kuralını Ribonükleoprotein (RNP) istihdam-nerede vahşi türü Streptococcus pyogenes Cas9 protein, sentetik 2 parça Kılavuzu RNA (gRNA) ve bir donör şablon plazmid teslim edilir hücrelere yaklaşım dayalı Elektroporasyon. Putatively düzenlenmiş hücreler fluorescently tagged proteinler ifade (FACS) sıralama floresans aktif hücre tarafından zenginleştirilmiş. Klonal satır sonra oluşturulur ve hassas düzenleme sonuçlarını analiz edilebilir. Faiz gen genomik locus floresan etiketi tanıtarak, elde edilen hücre altı yerelleştirme ve dinamikleri füzyon proteinin endojen düzenleyici kontrol altında geleneksel overexpression önemli bir gelişme okudu sistemleri. Gen etiketleme için hiPSCs kullanım modeli sistemi olarak tagged proteinler diploit, nontransformed hücrelerde çalışma fırsatı sağlar. HiPSCs birden çok hücre türleri farklı olduğundan, bu yaklaşım oluşturmak ve isogenic hücresel bağlamlarda çeşitli tagged proteinler çalışma fırsatı sağlar.
Introduction
Genom-düzenleme stratejileri, özellikle CRISPR/hücresel çalışmaya Cas9, kullanımı giderek erişilebilir ve değerli1,2,3,4,5, hale geliyor 6 , 7. CRISPR/Cas9 birçok uygulamadan biridir (Yönetmen: Homoloji onarım (HDR)) üzerinden giriş dizilerinin büyük eksojen GFP gibi bir gen veya protein ürünü8 etkinlik muhabirleri olarak hizmet belirli genomik loci içine . Bu teknik bir endojen açık okuma çerçevesi için bir floresan protein sıra katılmak için elde edilen endogenously düzenlenmiş füzyon proteini hücre altı yerelleştirme ve faiz5 protein dinamikleri görselleştirmek için kullanıldığı yerler kullanılabilir ,6,9,10,11. Endogenously tagged proteinler overexpression sistemlere göre birçok avantajlar, büyük dizileri insan genom ekleyerek verimsiz bir süreç genellikle bir seçim ya da bir nüfus yapabilirsiniz hücre elde etmek için zenginleştirme strateji talep iken kolayca okudu5,12olduğu.
Bu iletişim kuralı floresan protein (FP) istenen genomik locus kodlama bir DNA dizisi ekleme açıklar. Protokol tasarım ve donör şablon plazmid ve teslimini Ribonükleoprotein (RNP) karmaşık (sentetik CRISPR RNA (crRNA) ve crRNA (tracrRNA) trans etkinleştirme ile birlikte vahşi türü S. pyogenes Cas9 protein) içerir. Ayrıca açıklanan putatively düzenlenen hücreleri floresan aktif hücre (FACS) sıralama ve klonal hücre satırı oluşturma işlemi üzerinden zenginlik olduğunu. Bugüne kadar bu yöntem monoallelic ya da (nadiren) bı allelic yeşil flüoresan protein (GFP) Etiketler büyük hücresel yapıları temsil eden 25 proteinler etiketleme ile hiPSC satırları oluşturmak için kullanılmıştır. Bu çabalar sonuç düzenlenmiş hücrelerden beklenen genetik ekleme var, doğru belirleyici bir füzyon protein hızlı ve Nanog ve istikrarlı karyotip12 (ve yayınlanmamış veri) korumak için teyit edilmiştir. Bu yöntem aynı zamanda birden çok diğer oluşturmak için kullanılan tek ve çift (aynı hücrede öğesini iki farklı protein) düzenlenmiş nüfus hiPSCs (yayınlanmamış veri).
Birçok geleneksel hücre, onlar diploit, karyotypically kararlı, Sigara dönüştürdü ve proliferatif vardır çünkü insan iPSCs sağlıklı donörün türetilmiş bu genom düzenleme çabaları için seçilmiştir. Bu özellikleri temel hücre biyolojisi ve hastalık modelleme eğitimi için çekici bir model sağlar. Ayrıca, fırsat çeşitli soy ve isogenic hücreleri organoids, doku ve "hastalık bir tabak" modelleri13 gibi kullanarak hücre tipleri arasında paralel olarak birden çok gelişim aşamalarında çalışma hiPSCs farklılaşma potansiyeli sağlar ,14,15. Bu iletişim kuralı hiPSCs (WTC hat) için geliştirilmiş olsa da, diğer memeli hücre hatları kullanarak iletişim kuralları gelişimi için bilgilendirici olabilir.
Protocol
1. crRNA ve donör şablon plazmid için FP Knock-in Silico tasarımı
- NCBI16 ek açıklama eklenen başvuru serisinden veya UCSC genom tarayıcı17 (Örneğin, GenBank formatı) gen ilgi almak ve bir Biyoinformatik yazılım alın. Ana bilgisayar genom dizisi bilinen türevleri göreli başvuru içeren, şimdi tarafından Biyoinformatik yazılım başvuru sırasını ayarlama içerir (konuya bakın).
- İstenen FP ekleme sitesi bulun. C-terminal Etiketler için FP etiketi için sıra son kodon son Bankası ve kodonu ilk Bankası arasında tanıtılacak. N-terminal için etiketleme, FP etiketi için sıra genelde başlama kodonu son Bankası ve sonraki kodon ilk Bankası arasında tanıtılacak. Bu çerçevede olmaya devam ediyor sürece başlama kodonu bir tek kodon exon olduğunda veya bir sinyal sıra protein terminus bulunduğu gibi bazı durumlarda istenen FP ekleme sitesi daha fazla bir 3ʹ bulunduğu yer alan.
- Kullanım 50 bp istenen ekleme site giriş dizisi için herhangi bir halk için elde edilebilir crRNA tasarım aracı olarak her tarafında. 2-4 crRNA hedefleri ekleme bölgesine yakın tanımlandıktan sonra crRNA bağlayıcı siteleri ve Biyoinformatik yazılım protospacer bitişik motifi (PAM) serilerinde (NGG) açıklama ekleyin. Bu crRNAs (crRNA tasarımı üzerinde daha fazla yardım için konuya bakın) çift telli sonları ikna etmek için kullanılır.
Not: Özel crRNA dizileri (önerilen) ticari bir satıcıyla sentezi için gönderilmiş veya sıra bu protokolü kapsamý dýþýndadýr bir klonlama veya vitro sentez strateji, tasarım için bir başlangıç noktası olarak kullanılabilir (konuya bakın ). - Donör şablon plazmid başlatmak için akıntıya karşı dizi istenen ekleme sitesi 1 kb (Bu N-terminal eklemeleri için başlama kodonu içermelidir) 5ʹ Homoloji kolu olarak kullanın ve 1 kb aşağı sırasını istediğiniz ekleme sitesi ' 3ʹ kullanın Homoloji kol (Bu kodonu C-terminal eklemeleri için içermelidir). Bazlar iki Homoloji kolları arasındaki genellikle göz ardı edilir değil. Dahil hücre kültürünü belirli değişik Homoloji kollarında elde edilen düzenlenen hücrelerde bu genetik varyantların korur.
- İki Homoloji kolu arasında FP (veya diğer çakma sırası) için sıra ve bağlayıcı sırası Ekle (halkalı daha fazla rehberlik için konuya bakın). N-terminal Etiketler için bağlayıcı sırası doğrudan FP 3ʹ olmalıdır; C-terminal Etiketler için bağlayıcı sıra doğrudan FP 5ʹ olması.
- CrRNA bağlayıcı siteleri donör dizisinin Cas9 kesme önlemek için donör şablon plazmid bozabilir (tartışma ile ilgili konuları crRNA bağlayıcı siteleri değiştirme bkz). Mümkünse, bir diziye NGG veya hasta yaşlı at dışında PAM bozulma tercih edilir. Alternatif olarak, crRNA (10 üsleri PAM'e proksimal) tohum bölgesinde üç temel nokta mutasyonlar tanıtılması yeterince crRNA bağlama bozmaya öngörülmektedir. Bazı crRNA bağlayıcı siteleri donör şablon plazmid FP sırayla getirilmesi tarafından bozulduğu; PAM, yoksa sağlam bağlama bölge hala bu gibi durumlarda bulunduğundan emin olun.
Not: Silico donör şablon plazmid gen sentezi için ticari bir satıcı tarafından teslim edilebilir veya bu iletişim kuralı kapsamý dýþýndadýr klonlama bir strateji tasarlamak için bir başlangıç noktası olarak kullanılabilir. PUC19 veya pUC57 gibi basit bir omurga yeterlidir.
2. Ribonükleoprotein (RNP) Transfection CRISPR/Cas9 aracılı Knock bileşeninde hiPSCs için
Not: Bu protokol için terim 'gRNA' sentetik crRNA ve tracrRNA düzgün yeniden askıya alınmış, quantified ve pre-complexed üretici yönergelerine başı açıklar ( Tablo malzemelerigörmek). Tüm araçları % 1 ile ek penisilin streptomisin. WTC hiPSC satırının genel kodlamayla kurallar Allen hücre Explorer18,19daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır. WTC hiPSCs bu iletişim kuralı, ancak uygun transfection optimizasyonu, RNP Elektroporasyon ile kullanılır ve donör şablon plazmid-ebilmek var olmak diğer hücre tipleri için başarılı bir şekilde uyarlanmıştır.
- 10 µM çalışma stokları gRNA ve vahşi tür S. pyogenes Cas9 protein2,20hazırlamak; buz üstünde tutun. 1 µg/µL donör şablon plazmid stokunun çalışma hazırlamak; Oda sıcaklığında (RT) tutmak. PH 8.0 TE arabellek için bütün dilutions kullanın.
- Bir matris kaplı 6-iyi doku kültürü tabak taze büyüme ortamının iyi başına 10 µM ROCK inhibitörü (RI) ile takıma 5 mL ile hazırlayın. Plaka ile kitle iletişim araçları da kuluçka makinesine 37 ° C ve % 5 CO2 hazır kadar plaka hücrelere transfection işlemden sonra (maksimum 2 h) tutmak.
Not: Bu protokol için kullanılan tüm matris kaplı plakaları buz gibi Matrigel hacmi 1: WTC hiPSC satır19kültür için 30 soğuk DMEM/F12 medya Allen Enstitüsü bilim hücre'nın protokolü için seyreltilmiş ekleyerek yapılır. - Nazik tek hücreli ayrılma reaktif Malzemeler tabloönerildiği gibi kullanarak, hiPSCs tek hücre süspansiyon ve sayısı hücreleri bir otomatik hücre sayaç veya hemasitometre kullanarak geçiş.
Not: Burada kullanılan WTC hiPSC hattı için detaylı bir protokol Allen hücre Explorer19bulunabilir. Kısaca, RT DPBS bir kez hücrelerle yıkama ve ayrılma reaktif ile 3-5 dakika için tedavi. Sonra hücreleri tek hücre süspansiyon yumuşak pipetting ve pelet tarafından Santrifüjü tarafından triturate. Canlı hücre Pelet 10 µM RI ile desteklenmiş büyüme ortamlarda resuspend.- Bir aliquot 1,84 x 106 hücreler ayrı 1,5 mL tüpler içinde transfected deneysel her koşul için hazırlayın.
Not: Tüm birimleri 2.3 reaksiyonlar kez bir 100 µL Elektroporasyon birimindeki bir 4,5 µL toplam reaksiyon birim için hesaplanır. Bu yinelenen transfection için ve pipetting hata için aşırı hesaplar.
- Bir aliquot 1,84 x 106 hücreler ayrı 1,5 mL tüpler içinde transfected deneysel her koşul için hazırlayın.
- Ribonükleoprotein (RNP) karmaşık tüpler deneysel her koşul için 10 µM gRNA 2,88 µL ve 10 µM 2,88 µL ekleyerek hazırlamak için 1,5 mL tüp Cas9. RT en az 10 dk (en fazla 1 h) için kuluçkaya.
- (2.3.1. adımda hazırlanan) bir hücre aliquot, 211 x g 3 dk RT. aspiratı süpernatant az için cips ve hücre Pelet üreticisinin Elektroporasyon arabellek 220 µL içinde resuspend.
- Resuspended hücrelerin 220 µL adım 2,5 2,4 adımda hazırlanan 1.5 mL RNP karmaşık tüp içine ekleyin.
- 2.4. adımda hazırlanan 1.5 mL tüp 1 µg/µL donör şablon plazmid 4.60 µL ekleyin.
- 2 - 3 kez tüp içeriğini karıştırmak için nucleofection uç ve pipet kullanın, sonra 100 µL süspansiyon, hazırlanan Elektroporasyon cihaza aktarmak. Herhangi bir ipucu kabarcıkları tanıtan kaçının. 1300 V 30 ms 1 darbe için geçerlidir.
- Yavaşça süspansiyon adım 2.2 dönen bir hareket ile hazırlanan 6-şey plaka aktarın. Hücreleri yan yan ve ön arka plaka yavaşça hareket ettirerek dağıtmak.
- Yeni bir nucleofection ipucu kullanarak, hazırlanan 6-şey plaka ikinci bir kuyuya kalan 100 µL süspansiyon ve transfer ile 2.8-2,9 adımları yineleyin.
- 2.4 2.10 aracılığıyla hedefleme-gRNA, donör şablon plazmid sadece ve arabellek tek denetimleri de dahil olmak üzere her gRNA ve donör şablon plazmid birleşim için yineleyin. Çapraz bulaşma kaçınmak için pipet ve nucleofection ipuçları değiştirmek için dikkat ediniz.
- 37 ° C ve % 5 CO2transfected hücreleri kuluçkaya. Normal büyüme ortam (RI) 24 h medya değiştirmek ve hiPSCs 72-96 h, confluency izleme her 24 saat besleme devam edin. HiPSCs 60-%80 izdiham ulaştığınızda, adım 3'e geçin.
Not: Ağır hücre ölümü (> % 70, tahmini) normal 24-48 h transfection sonra olduğunu.
3. FACS-zenginleştirme Putatively düzenlenmiş hiPSCs
Not: kök hücre sıralarken, hücre survival tartışma önerilen olarak tanıtmak için araç ayarları uyarlar. Kısaca, büyük meme mümkün (130 µm), düşük debi (≤ 24 µL/dak), kılıf koruyucu madde içermeyen sıvı kullanın (serum gibi Malzemeler tablobakınız) ve düşük örnek basıncı (10 PSI).
- Bir FACS deney başlamadan önce 10 µM RI ile desteklenmiş büyüme medya medya değiştirin ve hayatta kalma FACS sonra tanıtmak hücreleri 37 ° C ve % 5 CO2 2-4 h için kuluçkaya.
- Malzemeler tablo, geçit hiPSCs tek hücreli süspansiyon 10 µM RI19ile desteklenmiş büyüme medya içine önerildiği gibi nazik tek hücreli ayrılma reaktif kullanarak.
- HiPSC süspansiyon polistren yuvarlak popolu tüpler içine 35 µm gözenekli filtre ile filtre.
- Enkaz ve birini dışlamak için ileri dağılım ve yan dağılım (yükseklik ve genişlik dahil) kullanarak hücreleri sıralamak. Kullanım canlı, arabellek sadece FP-pozitif kapısı ayarlamak için hücreleri kontrol öyle ki < %0,1 arabellek tek hücre kapısı içinde düşebilir.
- Sıralama FP-pozitif oluşan tüm popülasyonun hücreleri içeren 0,5-2 1.5-15 mL polipropilen boru mL RT büyüme ortamının 10 µM RI ile desteklenmiştir.
Not: Polipropilen plastik hücre adezyon olasılığını azaltır. - Kendine hakim hücre 211 x g RT. adlı 3 dk de santrifüj kapasitesi
- Dikkatle süpernatant Aspire edin ve hücre Pelet 200 µL 10 µM RI ile desteklenmiş büyüme ortamının içinde resuspend. İlâ 3,000 sıralanmış hücreleri bir taze matris kaplı 96-şey plaka19bir tek şey için transfer.
Not: uygun alet Kur'a hücreler de (toplu olarak) doğrudan bir kuyuya tek büyüme ortamının 10 µM RI, önerilen bir şey başına 1000-3000 hücre yoğunluğu ile takıma 200 µL içeren bir matris kaplı 96-iyi doku kültürü plaka sıralanabilir hiPSC için. - 37 ° C ve % 5 CO2sıralanmış hücreleri kuluçkaya. Medya 24 h 5 mikron RI ile takıma büyüme ortamı değiştirin. 48 h 72-96 h, confluency izleme her 24 saat hücreleri normal büyüme medya (RI) besleme başlar. FACS en az 500 hücre bir 96-şey plaka bir kuyuda tohumlari ise % 50'den büyük olduğu tahmin edilmektedir sonra hayatta kalma.
- Ne zaman hiPSCs % 60-80 izdiham ulaşmak ve olgun morfoloji (düzgün, iyi paketlenmiş koloni merkezleri), geçiş daha büyük bir biçimi tabak 24-şey plaka gibi o zaman bir 24-şey plaka içine 6-şey plakasını gösterme.
- 6-şey plaka hiPSCs % 60-80 izdiham ulaşmak ve olgun göstermek morfoloji, 100 mm plakasına genişletin, yeniden görüntüleme için plaka, cryopreserve veya klon malzeme çekme yoğunluğu (adım 4)19, tohum.
4. Putatively üreten düzenlenmiş klonal hiPSC satırları
- Nazik tek hücreli ayrılma reaktif Malzemeler tabloönerildiği gibi kullanarak, hiPSCs tek hücreli süspansiyon geçiş ve mL19başına hücre sayısı belirler.
- Tohum 10.000 hücre hiPSCs büyüme ortamı kullanarak bir matris kaplı taze 100 mm doku kültürü yemek üzerine düzenlenmiş nüfusun RI1910 µM ile desteklenmiştir. Tohum sonra medya büyüme medya RI 24 s olmadan değiştirin ve taze büyüme medya her 24 h ile hiPSCs 5-7 gün için yem.
- Ne zaman hiPSCs macroscopically görülebilir koloniler oluşturdular (yaklaşık 500 µm) onlar izole edilmesi için büyük vardır. Aşırı matris alıyorum ve büyüme ortamının iyi19başına 10 µM RI ile takıma 100 µL ekleyerek bir matris kaplı 96-şey tabak hazırlamak.
- Bir diseksiyon mikroskop kullan bir P-200 pipet veya benzer, yavaşça scrape ve plaka yüzeyinden bireysel kolonileri Aspire edin. Aktarım birimi (~ 20-100 µL) 4.3 adımda hazırlanan 96-şey plaka tek bir kuyu koloniye içeren.
- Tüm kolonileri aktarıldıktan sonra doku kültürü kuluçka 37˚C ve % 5 CO2plaka kuluçkaya. Medya 24 h normal büyüme medya (RI) değiştirin ve koloniler yaklaşık boyutu (yaklaşık 1500 µm) üç katına kadar hücreleri her 24 saat 72-96 h için besleme devam.
Not: 24-96 kolonileri içinde transfection kullanılan crRNA başına malzeme çekme önerilir. İzole klonların hayatta kalma genellikle % 95'den büyüktür.
- Tüm kolonileri aktarıldıktan sonra doku kültürü kuluçka 37˚C ve % 5 CO2plaka kuluçkaya. Medya 24 h normal büyüme medya (RI) değiştirin ve koloniler yaklaşık boyutu (yaklaşık 1500 µm) üç katına kadar hücreleri her 24 saat 72-96 h için besleme devam.
- Malzemeler tabloönerildiği gibi nazik tek hücreli ayrılma reaktif kullanarak, geçit hiPSC yeni bir matris kaplı 96-şey plaka aşağıdaki gibi19klonlar.
- Bir 8-kanal aspiratör kullanarak, kaldırmak ve medya 96-şey plaka ilk sütundan atın.
- P-200 çok kanallı pipet kullanarak, DPBS ~ 200 µL hücreleri yıkamak için 96-şey plaka ilk sütununu ekleyin. Bir 8-kanal aspiratör kullanarak, kaldırmak ve DPBS yıkama 96-şey plaka ilk sütundan atın.
- P-200 çok kanallı pipet kullanarak, ayrılma reaktif 40 µL 96-şey plaka ilk sütununu ekleyin.
- Toplam altı sütun ipuçları emin olmak için çapraz kontamine-wells için değil değişen 96-şey plaka kadar adım 4.5.1-4.5.3 için yineleyin. Plaka için ayrılma reaktif ilk sütunu (adım 4.5.3) eklendi zaman 3-5 dakikada 37 ° C kuluçka makinesine koyun.
Not: Bu adımları gerçekleştirmek için gereken zamanı nedeniyle bir seferde en fazla altı sütun (48 wells) tek geçit önerilir. Bu protokolü ilk kez gerçekleştirilirken, sadece bir defada bir veya iki sütun passaging ile başlayın. Bir anda pasajlı sütun sayısını sınırlama hücre içinde hiPSCs için zararlı olabilecek ayrılma reaktif uzun zamandır yaptı değil sağlar. - Plaka ilk sütundaki hücreleri plaka alt kaldırmaya başladık, bir P-200 çok kanallı pipet DPBS 160 µL 96-şey plaka ilk sütununu ekleyin ve hafifçe hücreleri "12: 00'de" triturate için kullanın , "3:00", "6:00" ve "9:00" konumlarını her şey. Tüm birim hücre süspansiyon (200 µL), bir V-alt 96-şey tabağa aktarın.
- Ayrılma reaktif var hücre kalan sütunları için 4.5.5 arasındaki adımları yineleyin; ipuçları çapraz kontamine-wells değil değiştirin.
- V-alt plaka 385 x g, santrifüj RT. adlı 3 dk içinde spin
- P-200 çok kanallı pipet kullanarak, yavaşça süpernatant çıkarın ve taze büyüme ortamının iyi başına 10 µM RI ile takıma 200 µL hücrelerde resuspend. İpuçları değil çapraz kontamine değiştirme tüm kuyular için yineleyin.
- Tüm hücre süspansiyon taze matris kaplı 96-şey plaka19' a aktarın. Doku kültürü kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2plaka kuluçkaya. Normal büyüme ortam (RI) 24 h medya değiştirmek ve klonlar çoğunluğu 60-%80 izdiham ulaşana kadar hücreleri 72-96 h, her 24 saat besleme devam edin.
Not: Bu geçiş hücreleri yaymak ve daha fazla büyüme için 96-şey plaka tüm alana izin vermek için yardımcı olur.
- Klonlar gözlemlemek ve her bireysel klon 96-şey plaka için uygun split oranını belirlemek (Örneğin, 1:10 veya 1:8). Nazik tek hücreli ayrılma reaktifi olarak önerilen Malzemeler tablokullanarak, her klon için uygun hücre süspansiyon oranında aktarma bir yeni matris kaplı 96-şey plaka (adımları 4.5.1-4.5.8) içine geçit hiPSC klonlar. Doku kültürü kuluçka 37˚C ve % 5 CO2plaka kuluçkaya. Normal büyüme ortam (RI) 24 h medya değiştirmek ve klonlar çoğunluğu 60-%80 izdiham ulaşmak ve olgun morfoloji göstermek kadar hücreleri 72-96 h, her 24 saat besleme devam edin.
Not: Bu pasajda her klon dondurucu adımı izleyin kuyu başına hücre sayısı normale yardımcı olur her klon farklı bölme oranı biraz farklı büyüme oranı veya önceki geçiş, hayatta kalma nedeniyle olabilir. Hayatta kalma ve büyüme farklı fiyatlar nedeniyle, bazı klonlar sarmak veya bu adımları passaging büyümeye başarısız.- Hücre süspansiyon ve Pelet gDNA yalıtım centrifuging hücreleri tarafından için kısmı 385 x g 3 dk RT. Kaldır süpernatant az için bir V-alt 96-şey plaka kaydedin ve bir 96-iyi kit kullanarak gDNA yalıtım devam veya plaka, - için 20˚C thr kadar pelleted hücrelerinin depolamak Ee hafta.
5. 96-şey plaka biçiminde klonal hücre satırları dondurma
- Bir tek hücreli ayrılma reaktif kullanarak, daha önce açıklandığı gibi hiPSC klonlar (adımları 4.5.1-4.5.7) geçiş. P-200 çok kanallı pipet kullanarak süpernatant Aspire edin ve 60 µL 10 µM RI ile desteklenmiş büyüme ortamının yeniden askıya. Bütün wells için yineleyin; ipuçları değil çapraz kontamine değiştirin.
- 30 µL hücre süspansiyon, bir matrix olmayan kaplı 96-iyi doku kültürü tabağa aktarın. Sonra hızlı bir şekilde eklemek 170 µL arabellek buz gibi (bkz. Tablo reçetesi) karıştırma olmadan her şey için. Kalan 30 µL süspansiyon, bir kardeş aktarma tarafından tekrar plaka ve 170 µL dondurma ekleyerek arabellek.
Not: bireysel plakalar biri çözdürme sonra hücreleri yedekleme nüfusu var böylece bu işlem yinelenen kardeş plakalar yapılır. Cryopreserved hücreleri yalnızca her diğer sütun bir 96-şey plaka koyarak daha hızlı (adım 5.6) çözdürme için sağlar. - Plaka parafilm ile sarın ve kapaklı bir RT Styrofoam kutusu yerleştirin. Bütün kutu-80 ° C dondurucuya koyun.
- 24 saat sonra Levha strafor kutudan transfer ve 80˚C-dört haftaya kadar depolanır.
Not: hücreler geçici olarak-80 ° C'de depolanan, genetik kalite kontrol deneyleri çözülme ve daha fazla, daha önce yayımlanmış çalışma ele olarak yaymak için klonlar tanımlamak için 4.6.1. adımda elde hücrelerden hasat gDNA ile gerçekleştirilemez 12. kısa bir süre, bir kopya numarası damlacık dijital PCR tahlil GFP bir veya iki kopyasını ve hiçbir donör şablon plazmid omurga entegrasyon içeren klonlar tanımlamak için kullanılabilir. Bir arada son nokta PCR deneyleri ve Sanger sıralama olabilir sonra kesin bir INSERT içeren klonlar tanımlayın. - Çözülme 37 ° c buz topakları eritmek dikkatle izlerken bir doku kültürü kuluçka tüm plaka getirmek. Kuyu plaka kenarında ilk çözülme eğilimindedir.
- Buz Pelet istenen klonu erir, yavaşça tüm 200 µL RT büyüme ortamının 10 µM RI ve RT. 3 min için 211 x g, santrifüj ile takıma 3 mL içeren bir 15 mL konik tüp için transfer
- Süpernatant Aspire edin ve 1 mL 10 µM RI ile desteklenmiş RT büyüme ortamının pelleted hücrelerde resuspend. Taze bir matris kaplı 24-şey plakasına aktarmak ve kuluçkaya 37˚C ve % 5 CO2' de. Normal büyüme ortam (RI) 24 h medya değiştirmek ve klon 60-%80 confluency ulaşır ve olgun morfoloji19vardır kadar hücreleri her 24 saat 72-96 h için besleme devam edin.
Representative Results
Bu denemenin amacı mEGFP (monomeric gelişmiş GFP) sigorta için 5ʹ sonuna LMNB1 gen (protein N-terminus) mEGFP dizisine tanıtarak nükleer lamin B1 protein için oldu. Bir bağlayıcı (amino asit dizisi SGLRSRAQAS) temel alınarak önceki cDNA yapıları Michael Davidson floresan Protein koleksiyonu21seçildi. Donör şablon plazmid her aday crRNA için crRNA bağlama bölgede mEGFP ve bağlayıcı sırası silico ekleme sonra kesilmiş olabilir çünkü hiçbir nokta mutasyonlar potansiyel crRNA tanıma ve bölünme tarafından bozmaya yapılması için gerekli Cas9 (Şekil 1) donör sırasının. Donör sıra 1 kb Homoloji kol kanat her iki ucunda da mEGFP-bağlayıcı sırası yer. Elde edilen 2,734 bp DNA'ın sıra doğrulanmadı, bir pUC57 omurga klonlanmış ve elde edilen donör şablon plazmid endotoksin-Alerjik maxi bir hazırlık kullanılarak saflaştırıldı. Donör şablon plazmid ve RNP karmaşık transfected, putatively düzenlenen hücreleri zenginleştirilmiş ve yerelleştirme mEGFP nükleer lamin B1 füzyon proteinin floresans mikroskobu (Şekil 2) tarafından doğrulandı. Her iki crRNA dizileri putatively düzenlenen nüfus12üretilen rağmen sadece crRNA1 transfection sonuçlarını burada, açıklanır.
Ne zaman transfected LMNB1 crRNA1 yok gRNA, Cas9 protein veya donör şablon plazmid Elektroporasyon tepki (sadece tampon) bulunan, negatif denetimine göre hücrelerin putatively düzenlenen temsil eden %0,95 mEGFP pozitif hücreler bulunan mEGFP-nükleer okan B1 nüfus (Şekil 3a). Bu yöntemi kullanarak daha önce bildirilen12olarak birçok genomik loci arasında gözlenen çakma verimliliği aralığında sonucuydu.
MEGFP-pozitif hücreler tarafından FACS izole ve tarafından mEGFP-nükleer lamin B1 füzyon protein nükleer zarf için beklenen yerelleştirme onaylamak için canlı mikroskobu görüntüsü. FACS-zenginleştirme sonra sıralanmış hücreleri LMNB1 crRNA1 nüfusunun yaklaşık yüzde 90'ını mEGFP-pozitif (tarafından belirlenen mikroskobu), bazı mEGFP negatif hücreler GFP pozitif hücrelerle birlikte sıralama işlemi sırasında saf bir ima vardı. Bu malzeme çekme sonra genetik olarak başarılı düzenleme için taramaya tabi 96 klon için izin zenginleştirme kabul edilebilir bir düzeyde oldu. Genellikle, bir kesme başarılı zenginleştirme için % 50'dir GFP pozitif.
Sıralanan hücre nüfusun çoğunluğu floresan nondividing hücrelerdeki nükleer zarf (nükleer çevre), görüntülenen ve mitoz sağlayan güven doğru genomik sırasında sitoplazma içinde genişletilmiş bir nükleer lamina için LMNB1 Düzenle odağı. Parlak veya loş sinyali ile zenginleştirilmiş nüfus bulunan hücreler. Sinyal şiddeti bu farklılığı doğru ve yanlış sonuçlar ve parlak nokta için genetik olarak doğrulanmış bir klonal satır daha fazla üretme yeni çalışmalar (konuya bakın) düzenleme yansıtıyor olabilir (Şekil 3b)12. Klonal satır nesil sonra genetik olarak Tekdüzen GFP yoğunluğu mikroskobu deneyler (Şekil 3 c) gösterdi hücreleri geçerliliği.
Resim 1 . Tasarım LMNB1 gen N-terminus GFP etiketleme için strateji. GFP etiket N-terminal ekleme 5ʹ 5 kromozom üzerinde bulunan LMNB1 ilk exon olarak dizayn edilmiştir. 5ʹ ve 3ʹ Homoloji vardır 1 kb ve buluşma başlama kodonu (ATG) ve ikinci kodon (yalnızca kısmen şekilde temsil Homoloji kol) arasında silah. İki aday crRNAs Cas9 amaçlanan ekleme sitesi gibi mümkün olduğunca yakın süre hareketsiz genom benzersiz varlık ayırmak için rehberlik etmek üzere tasarlanmışlardı. MEGFP ve bir amino asit bağlayıcı için sırası başlama kodonu (değil ölçeklemek için mEGFP ve bağlayıcı sırası) eklenen sadece 3ʹ olduğunu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Endogenously üretimi için iş akışı hiPSC klonal satırları öğesini. Transfection, (gibi kırmızı Cas9 protein altın crRNA ve mor tracrRNA ile gösterilen), Cas9/crRNA/tracrRNA RNP karmaşık Homoloji silah (HAs altın gösterilen), içeren donör şablon plazmid kapsayan bileşenler ve FP + bağlayıcı sırası (gösterilen yeşil) olduğunu electroporated. 4 gün sonra FP-pozitif putatively düzenlenmiş hücreler FACS tarafından zenginleştirilmiş bir popülasyon olarak sıralanmış hücrelerin tümünü bir 96-şey plaka (~ 1000 hücreleri) tek bir kuyunun içine tohum tarafından genişletilmiş ve sonra birkaç milyon çalışma nüfusu kadar kültür genişletilmiş hücreleri "zenginleştirilmiş nüfus" denetlesinler (bkz. iletişim kuralı adım 3.8). FP-pozitif hücre verim deneme HDR12değişken oranları nedeniyle tarafından farklıdır; başarılı bir zenginleştirme genellikle ~ 300-5.000 içerebilir6 kalça hücreler hücreleri yaklaşık 1.6 x 10 transfection sonra. Ön görüntüleme çalışmaları sinyal ve yerelleştirme zenginleştirilmiş nüfus füzyon proteinin doğruladı. Koloniler el ile genişleme ve dondurma için bir 96-şey tabak içine tutuklandılar. Daha fazla genomik kalite kontrol tarama damlacık dijital kullanarak PCR (ddPCR) ve diğer PCR tabanlı deneyleri sonra düzgün düzenlenmiş klonlar, yukarıda açıklanan12olarak tanımlamak için kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Putatively düzenlenen hücre popülasyonlarının zenginleştirme. (A) LMNB1 ve akış sitometresi araziler düzenlenmiş hücreler dört gün sonrası transfection. Y ekseni GFP yoğunluğu ve x ekseni ileri dağılım görüntüler. Sıralama gates salt arabellek denetimde göre ayarlanmış. HiPSCs pertürbasyon için hassas olduğundan, canlı/ölü leke ihmal ve bir çok muhafazakar FSC/SSC kapı yerine kullanılmıştır. (B) zenginleştirme sonra LMNB1 Cr1 nüfusu ~ %90 GFP nükleer zarf (beklenen LMNB1 yerelleştirme) yerelleştirme ile hücre gösterdi hücreleri düzenlenmiş. Nüfus değişen GFP şiddeti hücrelerin yanı sıra bazı GFP negatif hücreler içeriyor. Ölçek barlar 10 mikron vardır. (C) klonal satır nesil sonra bir üniforma GFP yoğunluğu, bazı hücre döngüsü bağımlı farklılıklar ile hücreleri gösterdi. Ölçek çubuğu 20 mikron olduğunu.
Discussion
Yöntemi Endogenously üreten floresan protein füzyon hiPSCs içinde düzenlenir için burada sunulan canlı hücre görüntüleme için çeşitli fonksiyonel çalışmalar arasında değişen uygulamalar ile düzenlenmiş geni hücre hatları oluşturmak için çok yönlü ve güçlü bir yaklaşım olduğunu ve " hiPSC hasta elde edilen satırları13,14,15kullanarak bir tabak hastalığında"modelleri. Bu yöntem büyük FP etiketleri N - veya C-terminus için endojen proteinlerin tanıtmak için kullanılan iken, bu potansiyel olarak modeli veya doğru hastalığa neden olan mutasyonlar22,23 diğer Etiketler veya küçük genetik değişiklikler tanıtmak için kullanılabilir . İçin daha küçük ekler, Homoloji kol boyutunu azalabilir ama bu yöntemde sunulan düzenlemeye genel yaklaşım hala24,25geçerli olmayabilir. HiPSCs kullanımı ile dikkatli optimizasyonu, onların büyük yarar için kuvvetle teşvik olsa da bu iletişim kuralı diğer memeli hücre hatları genleri düzenlemek için adapte.
Bir gen FP etiketleme için ilgi transkript bereket (Mikroarray veya RNA-Seq veri) tahminleri tanımlarken iyi bir noktası olup olmadığını bir gen veya izoformu ilgi ifade edilir, her ne kadar transkript düzeyleri her zaman ile ilişkili değil değerlendirmek için başladın mı protein düzeyleri. Burada açıklanan FACS-zenginleştirme strateji en az orta derecede iyi ifade genler için faiz hücre tipi en iyisi olacak. Bu strateji aynı zamanda centrin, kardiomyopati ve paxillin gibi punctate ve/veya ayrı yerelleştirme desenleri sinyal arka plan oranı çok düşük12,19yerini göster füzyon seçiminde başarılı olmuştur. Değil son derece ifade edilir veya sadece türev hücre tiplerinde ifade edilir genlerin ek seçim stratejileri gerektirebilir.
İnsan hücre hatlarında kullanılan crRNA ve donör şablon plazmid tasarımlar için başlangıç noktası insan başvuru genom (GRCh38) olmalıdır. Farklı hücre hatları genleri aynı tür içinde değişebilir ve CRISPR/Cas9 sıra özgü olduğundan, bu hücre satırı özel türevleri (Tek nükleotid polimorfizmleri veya ekleme/silme (indels)) tanımlamak son derece yararlıdır çünkü Bu ve başvuru genom farklı tasarım içine bu dahil. Bu crRNAs ana bilgisayar genom ile uyumlu olacak ve donör şablon plazmid Homoloji silah herhangi bir hücre kültürünü belirli türevlerini korunmasını sağlar. Homozigoz türevleri crRNAs ve donör şablon plazmid Homoloji kollarına tasarım işlemi sırasında dahil önerilen bir stratejidir. Heterozigoz varyant birleştiren isteğe bağlıdır. Belirli reaktifler çakma büyük deneyler için kullanılan ve bu iletişim kuralı için diğer kritik noktalar aşağıda ele alınmıştır.
Cas9 Protein
Cas9 protein kullanarak birincil yararı bu Cas9 tanıtımı ve gRNA bir RNP karmaşık olarak Cas9 ve gRNA ifadesi nerede ve gün boyunca devam yol plazmid tabanlı yaklaşımlar karşılaştırıldığında nükleaz aktivitesinin sınırlı bir süresi neden olduğu gösterilmiştir daha büyük - ve off-hedef etkinlik26,27. Cas9 protein kullanarak ek bir yararı, bir kez hücrelerin içinde ayırmak hazır olmasıdır. Bu transkripsiyon, çeviri ve protein26,28işleme gerektiren Cas9 mRNA veya Cas9/gRNA plazmid kullanmanın daha geleneksel yöntemleri ile karşıttır. Wildtype S. pyogenes Cas9 protein şimdi birçok ticari kaynaklardan kullanılabilir.
Kılavuzu RNA
Sıfır veya birkaç tahmin edilen kapalı-hedefleri içinde ana bilgisayar genom29,30,31,32crRNA hedefler istenen FP ekleme sitesi yakınındaki bulmak için halka açık birçok araç vardır. HDR ve HDR sonucu duyarlığını verimliliği büyük ölçüde verilen locus12, kullanılan crRNA hedefler arasında değişmektedir. Bu nedenle, birkaç crRNAs test (2-4 ve tercihen içinde 50 bp istenen ekleme sitesi) bu başarılı bir düzenleme deneme olasılığını artırabilir locus önerilir. GRNA teslim etmek için geçerli olanakları dahil sentetik 2 parça crRNA ve tracrRNA, sentetik tek gRNAs (sgRNAs), vitro transkripsiyonu sgRNAs veya sgRNA U6 organizatörü üzerinden ifade hücrelere bir plazmid teslim. Bu iletişim kuralı için yüksek bölünme etkinliği optimize edilmemiş. Değiştirilmemiş 2 parça crRNA ve tracrRNA ( Tablo malzemelerigörmek) hücrelere az potansiyel pertürbasyon neden mono allelic FP öğesini hücre hatları oluşturmak amacı ile kullanılmıştır.
Donör şablon plazmid
Donör şablon plazmid ana bilgisayar genom HDR olay sırasında dahil sağlanan bazı Homoloji dizisi kol çünkü nokta mutasyonlar crRNA tanıma sitelere daha fazla bölünme HDR takip Cas9 tarafından önlemek için tanıttı. Genellikle basit yıkıcı PAM dizisi mutasyona değişimdir. Kanonik olmayan bazı PAM dizileri hala vahşi türü S. pyogenes Cas9 tarafından kabul edilebilir çünkü NGG, hasta yaşlı at veya NGA33kullanmaktan kaçınmak en iyisidir. Homoloji kol mutasyona, eş anlamlı olmayan mutasyonlar ve nadir kodon giriş önlemek. PAM sıra eş anlamlı bir değişiklik mümkün değilse, tohum bölgede üç eş anlamlı nokta mutasyonlar yapmayı düşünün (10 bp PAM'e proksimal) crRNA bağlama sitenin. Aşırı bu bölgelerde önemli yasal dizileri içerebilir yana 5ʹ çevrilmeyen bölgesi (UTR) Bu değişiklik yaparken özen gösterilmelidir. UCSC genom browserâ €™ s karşılaştırmalı genomik parça bu gibi durumlarda, rehberlik sağlayabilir gibi sigara korunmuş üsleri değişikliklere daha iyi son derece korunmuş üsleri17' ye değiştirir daha tolere gibi bir genetik koruma veritabanı danışmanlık. Bazen yeter FP serisi sadece ekleme crRNA bağlama Makinası ( Şekil 1); olduğu gibi bozmaya Ancak, yeni eklenen sıra crRNA bağlama ve PAM sahneleri kalıcılığını kontrol edilmelidir.
Amino asit Halkalı arasında FP ve yerli protein füzyon protein34işlevi tasarruf etmek için tavsiye edilir. Sık sık bir amino asit bağlayıcı belirli ücret veya boyut için seçmiş olabilirsiniz. CDNA füzyon Eğer hedefli için benzer bir tasarım ile endojen füzyon protein de okudu, aynı bağlayıcı sırası için CRISPR/Cas9 çakma deney12,19kullanılabilir. Bu tür bilgileri kullanılamıyorsa, GTSGGS gibi kısa bir bağlayıcı da olmuştur başarıyla12kullandık. Diğer çalışmalar hedefler35çeşitli için bir genel küçük 3-amino asit bağlayıcı sırası ile başarı göstermiştir.
Transfection ve FACS zenginleştirme
Bir adım sistem reaktifler geniş bir yelpazede boyutu, ücret ve kompozisyon teslim etmek için kullanılabilir, ancak birçok ticari olarak mevcut transfection reaktifler hücreleri, moleküller belirli türdeki teslimat için formüle edilmiştir. HiPSCs gibi zor transfect hücreleri için ortak bir transfection yöntemi olmanın yanı sıra, Elektroporasyon Ayrıca bu yöntemde anlatıldığı gibi tüm üç bileşen için tak-CRISPR/Cas9-aracılı FP içinde teslim avantajı bulunuyor. Çoğalmasıyla zaman zaman bu yöntemi (veri gösterilmez) geliştirmek ve aynı zamanda başkaları tarafından RNP teslim26,28için,36 kullanılmıştır piyasada bulunan diğer reaktifler göre en iyi sonuçları üretmek için bulundu .
HiPSCs düzenlemek için bu iletişim kuralını kullanan zaman özel hücreleri önce ve sonra düzenleme için optimum hücre hayatta kalma ve en az spontan Farklılaşma süreci gen nazik işlenmesini sağlamak için özen gösterilmelidir. Özellikle, FACS zenginleştirme yöntemleri en büyük meme mümkün (130 µm), düşük debi (≤24 µL/dak), kılıf koruyucu madde içermeyen sıvı kullanılarak kök hücreleri sıralamak için adapte edilmelidir (serum gibi Malzemeler tablobakınız) ve düşük örnek basınç (10 PSI). Hangi kök hücre içinde suboptimal canlılık sonuç, sıralama, tek hücre yerine FACS zenginleştirilmiş hiPSCs toplu olarak sıralanır ve hücre canlılığı ve kök hücre bütünlüğünü optimize etmek için bir popülasyon olarak genişletilmiş. Ancak, tek hücre sıralama daha az duyarlı hücre tipleri için uygun olabilir. Hücre yaşam teşvik etmek, hücreler kültür artık FACS zenginleştirme için hasat sonra bir saat daha döndü ve sıralama işlemi boyunca oda sıcaklığında muhafaza. Bazı hücre tipleri için hücre hayatta kalma da kuluçka hücreleri buz (4 ° C) sıralama işlemi boyunca tarafından gelişmiş olabilir.
FP-pozitif hücreleri toplu genişlemesi klonal satırlar önce füzyon protein yerelleştirme için görüntüleme analizi tarafından nüfus değerlendirmek için bir fırsat sağlar. Hücreleri elde edilen zenginleştirilmiş nüfusu bazı çalışmalar için yeterli olsa da, bu nüfus sık sık değişen yoğunluk FP sinyal görüntüler. İzole klonal satırlarda Tekdüzen sinyal (Şekil 3), onları işlevsel deneyler12için daha uygun hale vardır.
Klonal hücre satırı üretimi
Düzenleme ve klonal çizgi oluşturma işlemi, hücre morfolojisi izlemek önemlidir. besleyici-Alerjik koşullarında yetiştirilen hiPSC kolonileri düzgün kenarlara ve hatta, iyi Paketli Merkezi12,18,19göstermelidir. Farklılaşmış hücreler kültür az % 5 dikkat edilmelidir. Bireysel kolonileri seçilmesinde bu sergi iyi morfoloji tercih. Olaylar passaging 96-şey plaka sırasında klonlar morfoloji için kontrol edin ve bu farklılaşma için kurşun ya da genetik dengesizlik belirtisi olabilir gibi büyümüş bu durdurma.
Hassas düzenleme, genetik onay için klonal hücre hatları nesil sağlar Çift Kişilik strand Cas9 kaynaklı genom tatili nedeniyle önemli olduğu kez tamir imprecisely istenen locus etiketi birleşmesiyle rağmen. Yukarıda açıklanan PCR tabanlı deneyleri göstermiştir ki üst üste on benzersiz genomik loci birçok (% 45) FP ifade klonlar genom12donör plazmid omurga tümleştirme hedeflenen locus ya da (nadiren) rastgele gelen acı. Ayrıca, %23 GFP pozitif klonlar (n = 177) arasında on benzersiz loci mutasyonlar veya etiketlenmemiş alleli NHEJ12nedeniyle büyük olasılıkla beklenen crRNA kesme sitedeki yakınındaki liman bulunmuştur. Bu genetik analiz birçok klonal satır (~ 100 klonlar/edit) FP-ifade ve beklenen füzyon protein yerelleştirme yalnız hassas12 düzenleme garanti etmez bu yana, bir hücre nüfus mümkün değil genetik doğrulama önemini vurguladı . Ayrıca, bu PCR tabanlı deneyleri anlamlı Analizi tamamlanmadan önce klonal hattı üretimi için ihtiyaç mevsimlerinde hücreleri herhangi bir kesinlik ile zenginleştirilmiş bir nüfusu gerçekleştirilemez. Eklenen FP etiketinin genetik onay ve düzenlenmemiş alleli (içinde mono allelic düzenlenen klon) genetik bütünlüğünü doğrulama etiketi ifade ötesine hedeflenen odağı, hassas düzenleme sağlamak için gerekli her ikisi de vardır.
Bı allelic düzenlemeleri oranı düşük ve hedef kapalı mutasyonlar (olarak Sanger ve exome sıralama bölümü) eksikliği bu yöntemi (yayınlanmamış veri)12kullanarak tarih gözlemlenmiştir. Bu kısa ömürlü RNP kullanım için CRISPR/Cas9 deneyler26,27açıklayan önceki çalışmaları ile tutarlıdır. Klonal hücre hatları bı allelic düzenlemeleri ile eksikliği da odağı belirli olabilir veya hücre yetersizliği nedeniyle iki tahammül etmek nerede sözde bı allelic düzenlenen hücreleri olduğunu daha önce yayımlanmış deneyler üzerinden önerilen olarak gerekli bir protein kopyalarını öğesini bir odağı (LMNB1), bir (TUBA1B)12görülmektedir. Bı-allelic tam olarak doğrulanmış klonal hücre hatları bu yöntemi (ST6GAL1) etiket ST6 beta-galactoside alpha-2, 6-sialyltransferase 1 ve RAB5A üye RAS onkogen ailesi (RAB5A) mEGFP19ile kullanarak üretilmedi.
Genom Düzenle duyarlığını teyit, ötesinde daha fazla klonal satır karakterize ve tüm kök hücre, genomik, yerine getirmek klonlar tanımlamak için kullanılan kalite kontrol deneyleri çeşitli vardır ve hücre biyolojik ölçüt olarak gelecekte çalışmalar kullanmak . Hücre biyolojik ve fonksiyonel deneyleri uygun ifade, yerelleştirme ve füzyon protein12işlevini doğrulamak için kullanılabilir. Karşılaştırma için düzenlenmemiş ebeveyn denetimleri yerelleştirme, dinamikleri ve işlevi düzenleme işlemi olan etkisinin değerlendirmek yardımcı olacaktır. Büyüme Analizi ve genomik istikrar için testler de yardımcı olabilir gibi diğer deneyleri tagged proteini hücreye perturbing olup olmadığını belirleyin. HiPSC bu protokol için kullanırken, Nanog işaretleri ve farklılaşma potansiyeli değerlendirme aşağı için değerli bir klon12çalışmaları belirlemede kritik olabilir. Çünkü kültür genişletilmiş hiPSC büyüme oranı izleme genetik istikrarsızlık için neden olduğu gösterilmiştir ve karyotip klonal hücre hatları da önemli12,37. Ancak, son amaçlı düzenlenmiş hücreleri kullanımı sonuçta düzeyi ve kalite kontrol analizi genişliğini belirleyecektir ve uygulamaya göre değişir.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Pek çok yorum içeren tartışmalar ve gen düzenleme, Thao illüstrasyon, Angelique Nelson için makalenin eleştirel okuma ve Andrew mEGFP öğesini okan B1 hücre kültürünü oluşturmak için Tucker için tavsiyeler için Daphne Dambournet teşekkür ederiz. Kök hücre ve gen düzenleme ve Allen Enstitüsü'nde tahlil geliştirme ekipleri için bilim hücre gen düzenleme ve kalite kontrol süreci katkılarından dolayı kabul etmek istiyorum. Bizim gen düzenlenmiş hücre kültürünü oluşturmak için kullanılan WTC satır Gladstone Enstitüleri ve UCSF Bruce R. Conklin laboratuarda tarafından sağlandı. Ve destek Allen Enstitüsü bilim hücre kurucusu, Paul G. Allen, vizyonunu, cesaret, için için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Geneious R9 | Biomatters, or similar | bioinformatics software for in silico donor plasmid design | |
| TE Buffer pH 8.0 | IDT, or similar | 11-01-02-05 | |
| HERAcell VIOS 160i CO2 incubator, or similar | ThermoFisher Scientific, or similar | 51030408 | |
| Pipettes (1000 µL, 200 µL, 20 µL, 10 µL, 2 µL) | Rainin, or similar | ||
| Pipette tips (1000 µL, 200 µL, 20 µL) | Rainin, or similar | ||
| Multi-channel Pipette (200 µL) | Rainin, or similar | ||
| Serological pipetes (25 mL, 10 mL, 5 mL) | Costar, or similar | ||
| BRAND 8-Channel Manifold for Quiksip, Autoclavable | Millipore Sigma, or similar | BR704526-1EA | use with non-filtered pipet tips, such as Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10, below |
| Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10 | Thermo Fisher, or similar | 3501-05 | |
| XP2 Pipette Controller | Drummond, or similar | 4-000-501 | |
| Disposable Pasteur Pipets | VWR, or similar | 53300-567 | |
| Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | CELLGARD, or similar | NU-481 | |
| Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | lot tested before use with hiPSC |
| DMEM/F12 (-phenol red) | Gibco | 11039-021 | cold, for diluting Matrigel 1:30 |
| mTeSR1 Complete Media | StemCell Technologies | 85850 | recommended growth media for WTC hiPSC line |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| WTC hiPSC line | Coriell | GM25256 | the hiPSC line used in this protocol is available through Coriell |
| Tissue culture dish 100 mm | Falcon | 353003 | |
| 6-well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 657160 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A11105-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| 15 mL polystyrene conical | Sarstedt | 62.554.100 | |
| Y-27632 (ROCK Inhibitor) | StemCell Technologies | 72308 | |
| Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic crRNA, unmodified (custom sequence) | Dharmacon | Custom0247 | |
| Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA | Dharmacon | U-002005-05 | |
| Recombinant wild-type Streptococcus pyogenes Cas9-NLS purified protein, 40 µM | University of California-Berkeley QB3 Macrolab | ||
| Custom donor plasmid (PriorityGENE) | Genewiz | donor insert design was synthesized and cloned into pUC57 backbone by Genewiz | |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| NucleoBond Xtra Maxi EF | Clontech | 740424.50 | |
| Neon Transfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | |
| Neon Transfection System, 100 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK10096 | |
| 5 mL Polystyrene Round-bottom Tube with Cell Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 15 mL High Clarity Polyproylene Conical Tube | Falcon | 352196 | |
| FACSAriaIII Fusion | BD Biosciences | 656700 | |
| FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| FlowJo version 10.2 | TreeStar | ||
| NERL Blood Bank Saline | ThermoFisher Scientific | 8504 | used as preservative-free FACS Buffer |
| Olympus SZX7 Stereo Microscope, or similar | Olympus, or similar | ||
| Tissue culture plate, 96-well | Falcon | 353072 | |
| 96 well Cell Culture Plate, V-Bottom | CELLSTAR | 351180 | |
| CryoStor CS10 | Sigma | C2874-100ML | used as cryopreservation buffer for cells in 96-well plate format |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| 24 well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 662160 |
References
- Wood, A. J., et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 333 (6040), 307 (2011).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Dambournet, D., Hong, S. H., Grassart, A., Drubin, D. G. Tagging endogenous loci for live-cell fluorescence imaging and molecule counting using ZFNs, TALENs, and Cas9. Methods in Enzymology. , 139-160 (2014).
- Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Sci Rep. 5, 9592 (2015).
- Hendriks, W. T., Warren, C. R., Cowan, C. A. Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells: Approaches, Pitfalls, and Solutions. Cell Stem Cell. 18 (1), 53-65 (2016).
- Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Cell Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
- Doyon, J. B., et al. Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells. Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).
- Cho, W. K., et al. Super-resolution imaging of fluorescently labeled, endogenous RNA Polymerase II in living cells with CRISPR/Cas9-mediated gene editing. Sci Rep. 6, 35949 (2016).
- White, C. W., Vanyai, H. K., See, H. B., Johnstone, E. K. M., Pfleger, K. D. G. Using nanoBRET and CRISPR/Cas9 to monitor proximity to a genome-edited protein in real-time. Sci Rep. 7 (1), 3187 (2017).
- Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Mol Biol Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).
- Soldner, F., et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations. Cell. 146 (2), 318-331 (2011).
- Young, J. E., Goldstein, L. S. Alzheimer's disease in a dish: promises and challenges of human stem cell models. Human Molecular Genetics. 21 (R1), R82-R89 (2012).
- Soares, F. A., Sheldon, M., Rao, M., Mummery, C., Vallier, L. International coordination of large-scale human induced pluripotent stem cell initiatives: Wellcome Trust and ISSCR workshops white paper. Stem Cell Reports. 3 (6), 931-939 (2014).
- Gene, NCBI- National Center for Biotechnology Information. , U.S. National Library of Medicine. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene (2017).
- Gene, NCBI- National Center for Biotechnology Information. , UCSC Genome Browser. https://genome.ucsc.edu/ (2017).
- Allen Cell Methods: Single cell passaging human iPS cells. , https://www.youtube.com/watch?v=wao2UcMFPMc (2018).
- Allen Cell Explorer. , http://www.allencell.org/ (2017).
- Lingeman, E., Jeans, C., Corn, J. E. Production of Purified CasRNPs for Efficacious Genome Editing. Curr Protoc Mol Biol. 120, 31-31 (2017).
- Michael Davidson Fluorescent Protein Collection. , https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/davidson/ (2017).
- Cox, D. B., Platt, R. J., Zhang, F. Therapeutic genome editing: prospects and challenges. Nature Medicine. 21 (2), 121-131 (2015).
- Haas, S. A., Dettmer, V., Cathomen, T. Therapeutic genome editing with engineered nucleases. Hamostaseologie. 37 (1), 45-52 (2017).
- Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K., Carroll, D. Donor DNA Utilization During Gene Targeting with Zinc-Finger Nucleases. G3 (Bethesda). 3 (4), 657-664 (2013).
- Orlando, S. J., et al. Zinc-finger nuclease-driven targeted integration into mammalian genomes using donors with limited chromosomal homology. Nucleic Acids Research. 38 (15), e152 (2010).
- DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein. Methods. 121-122, 9-15 (2017).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
- Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44 (W1), W272-W276 (2016).
- Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
- Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
- CRISPOR V4.3. , http://crispor.tefor.net/ (2017).
- Zhang, Y., et al. Comparison of non-canonical PAMs for CRISPR/Cas9-mediated DNA cleavage in human cells. Sci Rep. 4, 5405 (2014).
- Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Adv Drug Deliv Rev. 65 (10), 1357-1369 (2013).
- Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (25), E3501-E3508 (2016).
- Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
- Baker, D., et al. Detecting Genetic Mosaicism in Cultures of Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 7 (5), 998-1012 (2016).
