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Genetics

अंतर्जात प्रोटीन टैगिंग में मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम कोशिकाओं का उपयोग CRISPR/Cas9

doi: 10.3791/58130 Published: August 25, 2018

Summary

यहां वर्णित टैगिंग endogenously के लिए एक प्रोटोकॉल मानव प्रेरित pluripotent स्टेम CRISPR/Cas9 का उपयोग कर कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट टैग के साथ प्रोटीन व्यक्त की है । Putatively संपादित कोशिकाओं प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई द्वारा समृद्ध कर रहे हैं और क्लोनिंग सेल लाइनों उत्पन्न कर रहे हैं.

Abstract

एक प्रोटोकॉल मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) है कि एक्सप्रेस अंतर्जात प्रोटीन में फ्रेम N-या सी-टर्मिनल फ्लोरोसेंट टैग से जुड़े पैदा करने के लिए प्रस्तुत किया है । prokaryotic CRISPR/Cas9 प्रणाली (संकुल नियमित रूप से प्रतिरिक्ति लघु palindromic दोहराता/CRISPR-संबंधित 9) exogenous के माध्यम से जीनोमिक loci निर्देशित मरंमत (HDR) में बड़े समरूपता दृश्यों को लागू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । वांछित दस्तक में प्राप्त करने के लिए, इस प्रोटोकॉल ribonucleoprotein (RNP) आधारित दृष्टिकोण जहां जंगली प्रकार स्ट्रेप्टोकोकस pyogenes Cas9 प्रोटीन, सिंथेटिक 2 भाग गाइड आरएनए (gRNA), और एक दाता टेम्पलेट प्लाज्मिड के माध्यम से कोशिकाओं को दिया जाता है रोजगार electroporation । Putatively संपादित कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट में टैग प्रोटीन व्यक्त प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) द्वारा समृद्ध कर रहे हैं. क्लोनिंग लाइनों तो उत्पंन कर रहे है और सटीक संपादन परिणामों के लिए विश्लेषण किया जा सकता है । ब्याज की जीन के जीनोमिक लोकस में फ्लोरोसेंट टैग शुरू करके, परिणामस्वरूप उपसेलुलर स्थानीयकरण और फ्यूजन प्रोटीन की गतिशीलता अंतर्जात विनियामक नियंत्रण के तहत अध्ययन किया जा सकता है, पारंपरिक पर एक महत्वपूर्ण सुधार सिस्टम. जीन टैगिंग के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में hiPSCs का प्रयोग द्विगुणित, विपरिवर्तित कोशिकाओं में टैग किए गए प्रोटीन का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है. चूंकि hiPSCs एकाधिक सेल प्रकार में विभेदित किया जा सकता है, इस दृष्टिकोण को बनाने और अध्ययन isogenic सेलुलर संदर्भों की एक किस्म में प्रोटीन टैग का अवसर प्रदान करता है ।

Introduction

जीनोम का उपयोग संपादन रणनीतियों, विशेष रूप से CRISPR/Cas9, सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए तेजी से सुलभ और मूल्यवान1,2,3,4,5, हो रहा है 6 , 7. CRISPR/Cas9 के कई अनुप्रयोगों में से एक है परिचय (via समरूपता निर्देशित मरंमत (HDR) बड़े exogenous अनुक्रम के ऐसे विशिष्ट GFP जीनोमिक में loci के रूप में है कि एक जीन या प्रोटीन उत्पाद 8 की गतिविधि के लिए रिपोर्टर के रूप में सेवा . इस तकनीक के लिए एक अंतर्जात खुला पढ़ने के फ्रेम जहां जिसके परिणामस्वरूप endogenously विनियमित फ्यूजन प्रोटीन के लिए एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन अनुक्रम में शामिल होने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है सेलुलर स्थानीयकरण और 5 ब्याज के प्रोटीन की गतिशीलता कल्पना ,6,9,10,11. जबकि endogenously टैग प्रोटीन की पेशकश कई लाभ के लिए एक्सप्रेस सिस्टम की तुलना में, मानव जीनोम में बड़े दृश्यों डालने एक अक्षम प्रक्रिया आम तौर पर एक चयन या संवर्धन रणनीति कोशिकाओं की आबादी है कि प्राप्त करने के लिए मांग कर सकते है आसानी से5,12का अध्ययन किया ।

इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक डीएनए एक वांछित जीनोमिक लोकस में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (FP) एंकोडिंग अनुक्रम के सम्मिलन । प्रोटोकॉल डिजाइन और दाता टेंपलेट प्लाज्मिड के वितरण शामिल है, और ribonucleoprotein (RNP) परिसर (वंय प्रकार एस pyogenes Cas9 प्रोटीन सिंथेटिक CRISPR आरएनए (crRNA) और ट्रांस सक्रिय crRNA (tracrRNA) के साथ संयुक्त) । यह भी वर्णित प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) और क्लोनिंग सेल लाइन पीढ़ी प्रक्रिया के माध्यम से putatively संपादित कोशिकाओं के संवर्धन है । तारीख करने के लिए, इस विधि या तो monoallelic या (शायद ही कभी) द्वि-allelic ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के साथ hiPSC लाइनें उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है पच्चीस लेबल के प्रमुख सेलुलर संरचनाओं का प्रतिनिधित्व प्रोटीन । इन प्रयासों से परिणामी संपादित कोशिकाओं की उंमीद आनुवंशिक प्रविष्टि है की पुष्टि की गई है, एक सही ढंग से स्थानीयकरण फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त, और बनाए रखने के pluripotency और एक स्थिर कैरयोटाइप12 (और अप्रकाशित डेटा) । इस विधि भी कई अंय एकल और दोहरी उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है (दो अलग एक ही सेल में टैग प्रोटीन) hiPSCs की आबादी संपादित (अप्रकाशित डेटा) ।

मानव एक स्वस्थ दाता से व्युत्पंन iPSCs इन जीनोम के संपादन के प्रयासों के लिए चुना क्योंकि, कई पारंपरिक कोशिका लाइनों के विपरीत थे, वे द्विगुणित कर रहे हैं, karyotypically स्थिर, गैर तब्दील, और प्रफलन । ये गुण मौलिक कोशिका जीवविज्ञान और रोग मॉडलिंग का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल प्रदान करते हैं । इसके अलावा, hiPSCs के भेदभाव की क्षमता विभिंन वंश और कोशिका organoids, ऊतकों और "एक डिश में रोग" 13 मॉडल सहित isogenic कोशिकाओं का उपयोग प्रकार भर में समानांतर में कई विकास चरणों के अध्ययन का अवसर प्रदान करता है ,१४,१५. हालांकि इस प्रोटोकॉल hiPSCs (वर्ल्ड ट्रेड सेंटर लाइन) के लिए विकसित किया गया था, यह अंय स्तनधारी सेल लाइनों का उपयोग प्रोटोकॉल के विकास के लिए जानकारीपूर्ण जा सकता है ।

Protocol

1. crRNA के Silico डिजाइन में और एफ पी के लिए दाता टेंपलेट प्लाज्मिड दस्तक में

  1. NCBI16 या UCSC जीनोम ब्राउज़र17 से व्याख्या की संदर्भ अनुक्रम प्राप्तकरें (जैसे, ब्याज की जीन के GenBank प्रारूप) और यह पसंद के एक bioinformatics सॉफ्टवेयर में आयात करते हैं । यदि होस्ट जीनोम अनुक्रम संदर्भ के सापेक्ष वेरिएंट शामिल करने के लिए जाना जाता है, वे अब bioinformatics सॉफ्टवेयर में संदर्भ अनुक्रम को समायोजित करने से शामिल (चर्चा देखें) ।
  2. इच्छित FP प्रविष्टि साइट की स्थिति जानें । C-टर्मिनल टैग के लिए, FP टैग के लिए अनुक्रम अंतिम codon के अंतिम आधार और स्टॉप codon का पहला आधार के बीच पेश किया जाएगा । N-टर्मिनल टैगिंग के लिए, FP टैग के लिए अनुक्रम आमतौर पर प्रारंभ codon के अंतिम आधार और अगले codon का पहला आधार के बीच पेश किया जाएगा । कुछ मामलों में, जैसे जब प्रारंभ codon एक एकल codon एक्सॉन है, या जहाँ एक संकेत अनुक्रम प्रोटीन टर्मिनस के पास मौजूद है, तो इच्छित FP सम्मिलन साइट एक अधिक 3 पिरणामस्वरूप स्थिति में स्थित हो सकता है, जब तक यह फ़्रेम में जारी रहती है ।
  3. किसी भी सार्वजनिक रूप से उपलब्ध crRNA डिजाइन उपकरण के लिए इनपुट अनुक्रम के रूप में वांछित सम्मिलन साइट के प्रत्येक पक्ष पर ५० bp का उपयोग करें । एक बार 2-4 crRNA लक्ष्य सम्मिलन साइट के पास की पहचान कर रहे हैं, bioinformatics सॉफ्टवेयर में crRNA बाइंडिंग साइटों और protospacer-सन्निकट आकृति (पाम) अनुक्रम (NGG) व्याख्या. इन crRNAs डबल असहाय टूटता प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा (crRNA डिजाइन पर अधिक मार्गदर्शन के लिए चर्चा देखें) ।
    नोट: कस्टम crRNA अनुक्रम एक वाणिज्यिक विक्रेता के साथ संश्लेषण के लिए प्रस्तुत किया जा सकता है (अनुशंसित), या अनुक्रम एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में एक क्लोनिंग या इन विट्रो संश्लेषण रणनीति है, जो इस प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर है डिजाइन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता (चर्चा देखें ).
  4. दाता टेंपलेट प्लाज्मिड शुरू करने के लिए, 5 पिरणामस्वरूप समरूपता बांह के रूप में वांछित सम्मिलन साइट के अनुक्रम के ऊपर का 1 केबी का उपयोग करें (यह N-टर्मिनल सम्मिलन के लिए प्रारंभ codon शामिल होना चाहिए), और 3 पिरणामस्वरूप के रूप में वांछित प्रविष्टि साइट के अनुक्रम बहाव के 1 kb का उपयोग करें समरूपता बांह (यह सी के लिए stop codon शामिल करना चाहिए टर्मिनल निवेशन) । दो समरूपता आर्म्स के बीच कुर्सियां सामांयतया छोड़ी नहीं जाती हैं । समरूपता बाहों में सेल लाइन विशिष्ट वेरिएंट सहित परिणामी संपादित कोशिकाओं में इन आनुवंशिक वेरिएंट की रक्षा करेगा ।
  5. दो समरूपता हथियारों के बीच, FP (या अंय दस्तक अनुक्रम में) और linker अनुक्रम (लिंकर्स पर अधिक मार्गदर्शन के लिए चर्चा देखें) के लिए अनुक्रम संमिलित करें । N-टर्मिनल टैग के लिए, linker अनुक्रम सीधे FP के 3 पिरणामस्वरूप होना चाहिए; C-टर्मिनल टैग के लिए, linker अनुक्रम सीधे FP के 5 पिरणामस्वरूप होना चाहिए ।
  6. crRNA दाता टेंपलेट में बाध्यकारी साइटों को बाधित प्लाज्मिड दाता अनुक्रम के Cas9 काटने को रोकने के लिए (जब crRNA बाध्यकारी साइटों फेरबदल विचार के लिए चर्चा देखें) । यदि संभव हो तो, NGG या नाग के अलावा किसी अंय क्रम को पाम के विघटन पसंद है । वैकल्पिक रूप से, crRNA के बीज क्षेत्र में तीन ठिकानों के लिए बिंदु उत्परिवर्तनों का परिचय (10 पाम को समीपस्थ कुर्सियां) को पर्याप्त रूप से crRNA बाध्यकारी बाधा की भविष्यवाणी की है । कुछ crRNA बाइंडिंग साइटों के दाता टेंपलेट प्लाज्मिड में FP अनुक्रम की शुरूआत से बाधित कर रहे हैं; सुनिश्चित करें कि कोई पाम, या बरकरार बाध्यकारी क्षेत्र अभी भी इन मामलों में मौजूद है ।
    नोट: silico दाता टेंपलेट प्लाज्मिड में एक वाणिज्यिक विक्रेता द्वारा जीन संश्लेषण के लिए प्रस्तुत किया जा सकता है, या यह एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है एक क्लोनिंग रणनीति है, जो इस प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर है डिजाइन । pUC19 या pUC57 के रूप में एक सरल रीढ़ पर्याप्त है ।

2. Ribonucleoprotein (RNP) अभिकर्मक for CRISPR/Cas9 के hiPSCs में मध्यस्थता की दस्तक

नोट: इस प्रोटोकॉल में, शब्द ' gRNA ' सिंथेटिक crRNA का वर्णन करता है और tracrRNA ठीक से पुन: निलंबित, quantified, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार पूर्व-जटिल ( सामग्री की तालिकादेखें) । 1% पेनिसिलिन Streptomycin के साथ सभी मीडिया के पूरक । वर्ल्ड ट्रेड सेंटर hiPSC लाइन के जनरल संवर्धन दिशानिर्देश एलन सेल एक्सप्लोरर18,19में और अधिक विस्तार में वर्णित हैं । वर्ल्ड ट्रेड सेंटर hiPSCs इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है, लेकिन उचित अभिकर्मक अनुकूलन के साथ, RNP और दाता टेंपलेट प्लाज्मिड के electroporation सफलतापूर्वक अंय प्रकार के सेल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

  1. gRNA और वाइल्ड टाइप के 10 µ मी वर्किंग स्टॉक्स तैयार करें एस. pyogenes Cas9 प्रोटीन2,20; बर्फ पर रखो । तैयार करें 1 µ g/µ l काम दाता टेम्पलेट प्लाज्मिड का स्टॉक; कमरे के तापमान (आरटी) पर रखें । सभी कमजोर पड़ने के लिए पीएच ८.० ते बफर का प्रयोग करें ।
  2. अच्छी तरह से प्रति 10 µ मीटर रॉक अवरोध करनेवाला (आरआई) के साथ पूरक ताजा विकास मीडिया के 5 मिलीलीटर के साथ एक मैट्रिक्स लेपित 6-well टिशू कल्चर प्लेट तैयार करें । ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह पर मशीन में मीडिया के साथ प्लेट रखें जब तक अभिकर्मक प्रक्रिया (अधिकतम 2 एच) के बाद प्लेट कोशिकाओं को तैयार ।
    नोट: सभी मैट्रिक्स लेपित इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त प्लेटों बर्फ ठंड Matrigel की मात्रा को जोड़ने के द्वारा बनाई गई है ठंडा DMEM/F12 मीडिया में एलन संस्थान के अनुसार सेल विज्ञान प्रोटोकॉल के लिए संवर्धन वर्ल्ड ट्रेड सेंटर hiPSC लाइन पर19
  3. सामग्री की तालिकामें अनुशंसित के रूप में एक सज्जन एकल सेल पृथक्करण एजेंट का उपयोग करना, एक स्वचालित सेल काउंटर, या hemocytometer का उपयोग एकल सेल निलंबन और गिनती कोशिकाओं में hiPSCs पारित.
    नोट: वर्ल्ड ट्रेड सेंटर hiPSC लाइन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल यहां इस्तेमाल किया एलन सेल एक्सप्लोरर19में पाया जा सकता है । संक्षेप में, RT DPBS के साथ एक बार कोशिकाओं को धोने और 3-5 मिनट के लिए पृथक्करण एजेंट के साथ इलाज. फिर एकल सेल निलंबन द्वारा कोमल pipetting और गोली द्वारा केंद्रापसारक में triturate कोशिकाओं । विकास मीडिया में रहते सेल गोली resuspend 10 µ एम आरआई के साथ पूरक ।
    1. प्रत्येक प्रायोगिक शर्त के लिए अलग १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में transfected होने के लिए १.८४ x 106 कोशिकाओं के एक aliquot तैयार करें ।
      नोट: सभी खंड एक १०० µ l electroporation मात्रा, बार २.३ प्रतिक्रियाओं में एक ४.५ µ एल कुल प्रतिक्रिया की मात्रा के लिए गणना कर रहे हैं. डुप्लिकेट अभिकर्मक और pipetting त्रुटि के लिए अतिरिक्त के लिए यह खाता है ।
  4. 10 µ एम gRNA के २.८८ µ l को जोड़कर प्रत्येक प्रयोगात्मक दशा के लिए ribonucleoprotein (RNP) जटिल ट्यूबों तैयार करें और 10 µ m µ के २.८८ Cas9 l को एक १.५ एमएल ट्यूब 10 मिनट (अधिकतम 1 एच) की एक ंयूनतम के लिए आर टी पर मशीन ।
  5. गोली एक सेल aliquot (2.3.1 चरण में तैयार) RT. महाप्राण supernatant में 3 मिनट के लिए २११ x g पर और निर्माता के µ बफर के २२० electroporation एल में सेल गोली resuspend ।
  6. १.५ मिलीलीटर RNP जटिल ट्यूब चरण २.४ में तैयार में चरण २.५ से resuspend कोशिकाओं के २२० µ एल जोड़ें ।
  7. Add ४.६० µ l की 1 µ g/µ l दाता खाके प्लाज्मिड चरण २.४ में तैयार १.५ एमएल ट्यूब को ।
  8. ट्यूब सामग्री को 2-3 बार मिक्स करने के लिए nucleofection टिप और पिपेट का प्रयोग करें, फिर तैयार electroporation डिवाइस में सस्पेंशन के १०० µ l को ट्रांसफर कर दें । टिप में किसी भी बुलबुले शुरू करने से बचें । 30 ms के 1 पल्स के लिए १३०० वी लागू करें
  9. धीरे एक घूमता गति के साथ २.२ कदम से तैयार 6-अच्छी तरह से थाली में निलंबन स्थानांतरण । धीरे प्लेट की ओर ले जाने से कोशिकाओं को फैलाने के पक्ष और सामने से वापस ।
  10. एक नई nucleofection टिप का प्रयोग, दोहराएं चरण 2.8-2.9 निलंबन के शेष १०० µ एल के साथ और एक दूसरी अच्छी तरह से तैयार 6-अच्छी तरह से थाली में स्थानांतरण ।
    1. दोहराएँ चरण २.४ के माध्यम से २.१० प्रत्येक gRNA और दाता टेम्पलेट प्लाज्मिड संयोजन, गैर-लक्ष्यीकरण gRNA सहित, दाता टेम्पलेट प्लाज्मिड केवल, और बफ़र केवल नियंत्रण. क्रॉस-प्रदूषित होने से बचने के लिए पिपेट और nucleofection टिप्स बदलने का ध्यान रखें ।
  11. ३७ ° c और 5% सह2पर transfected कोशिकाओं की मशीन । 24 एच में नियमित रूप से विकास मीडिया (कोई री) के लिए मीडिया बदलें, और 72-96 एच के लिए हर 24 एच hiPSCs खिला जारी, प्रवाह की निगरानी । जब hiPSCs 60-80% संगम तक पहुँचने, चरण 3 के लिए आगे बढ़ें ।
    नोट: भारी सेल मौत (> 70%, अनुमानित) अभिकर्मक के बाद सामांय 24-48 ज है ।

३. FACS-संवर्धन Putatively सम्पादित hiPSCs

नोट: जब स्टेम सेल छंटाई, साधन सेटिंग्स अनुकूलन सेल अस्तित्व को बढ़ावा देने के रूप में चर्चा में सुझाव दिया । संक्षेप में, सबसे बड़ी संभव नोजल का उपयोग करें (१३० µm), एक कम प्रवाह दर (≤ 24 µ एल/मिनट), परिरक्षक-मुक्त म्यान द्रव (जैसे खारा, सामग्री की तालिकादेखें), और कम नमूना दबाव (10 psi) ।

  1. एक FACS प्रयोग शुरू करने से पहले, विकास मीडिया को बदलने के लिए मीडिया के साथ पूरक 10 µ m आरआई और ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह पर गर्मी कोशिकाओं 2-4 एच के लिए FACS के बाद अस्तित्व को बढ़ावा देने के लिए ।
  2. के रूप में सामग्री की तालिकामें सिफारिश की एक सौंय एकल सेल पृथक्करण एजेंट का उपयोग करना, एक विकास में hiPSCs पारित-सेल निलंबन में 10 µ एम री19के साथ पूरक मीडिया ।
  3. फ़िल्टर hiPSC निलंबन के माध्यम से ३५ µm मेष फिल्टर polystyrene दौर में तली ट्यूबों ।
  4. मलबे और दोहरी को बाहर करने के लिए कक्ष को सॉर्ट करें और साइड स्कैटर (ऊँचाई बनाम चौड़ाई सहित) का उपयोग करके क्रमबद्ध करना । पी-पॉजीटिव गेट सेट करने के लिए लाइव, बफ़र केवल नियंत्रण कक्षों का उपयोग करें, जैसे कि < 0.1% बफ़र केवल कक्ष गेट के भीतर आते हैं ।
  5. FP-पॉजिटिव कोशिकाओं की पूरी आबादी को क्रमबद्ध करें 1.5-15 मिलीलीटर में 0.5-RT विकास मीडिया के 2 मिलीलीटर के साथ 10 µ एम आरआई के पूरक ।
    नोट:, प्लास्टिक के लिए सेल आसंजन के लिए क्षमता कम कर देता है ।
  6. २११ x जी पर 3 मिनट के लिए आरटी में एकत्र कोशिकाओं केंद्रापसारक
  7. ध्यान से महाप्राण supernatant और २०० µ में सेल गोली resuspend विकास मीडिया के एल 10 µ एम आरआई के साथ पूरक । एक ताजा मैट्रिक्स-लेपित ९६-अच्छी तरह से19प्लेट की एक भी अच्छी तरह से करने के लिए ३,००० हल कोशिकाओं को हस्तांतरण ।
    नोट: उचित साधन सेटअप के साथ, कोशिकाओं को भी (थोक में) सीधे एक मैट्रिक्स लेपित ९६-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति २०० µ एल विकास मीडिया के एक अनुशंसित घनत्व पर 10 µ एम आरआई के साथ पूरक की एक भी अच्छी तरह से हल किया जा सकता है 1000-3000 कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से त्यात hiPSC.
  8. ३७ ° c और 5% CO2पर सॉर्ट की गई कक्षों की मशीन । विकास मीडिया के लिए मीडिया बदलें 24 एच में 5 µ एम आरआई के साथ पूरक । ४८ घंटे में कोशिकाओं खिला शुरू नियमित रूप से विकास मीडिया (कोई री) हर 24 एच के लिए 72-96 h, निगरानी प्रवाह । FACS के बाद अस्तित्व के लिए ५०% से अधिक होने का अनुमान है अगर ५०० कोशिकाओं की एक ंयूनतम एक ९६ अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से वरीयता प्राप्त कर रहे हैं ।
    1. जब hiPSCs 60-80% संगम और शो परिपक्व आकृति विज्ञान (चिकनी, अच्छी तरह से पैक कॉलोनी केंद्रों) तक पहुंचने, ऐसे 24 अच्छी तरह से थाली के रूप में एक बड़ा प्रारूप प्लेट में पारित, तो एक 24 अच्छी थाली से एक 6-अच्छी थाली में ।
    2. जब एक 6-खैर प्लेट में hiPSCs 60-80% संगम तक पहुँचने और परिपक्व आकृति विज्ञान दिखाएँ, एक १०० मिमी प्लेट को विस्तार, इमेजिंग के लिए फिर से प्लेट, cryopreserve, या क्लोन उठा घनत्व पर बीज (चरण 4)19.

4. पैदा Putatively संपादित क्लोनल hiPSC लाइंस

  1. सामग्री की तालिकामें सिफारिश के रूप में एक सज्जन एकल सेल पृथक्करण एजेंट का उपयोग करना, एकल सेल निलंबन में पारित hiPSCs और प्रति मिलीलीटर कोशिकाओं की संख्या का निर्धारण19.
  2. बीज १०,००० एक ताजा मैट्रिक्स पर hiPSCs की संपादित जनसंख्या की कोशिकाओं लेपित १०० mm ऊतक संस्कृति विकास मीडिया का उपयोग कर डिश 10 µ एम री19के साथ पूरक । बदलने के बिना विकास मीडिया के लिए मीडिया री 24 एच बोने के बाद, और 5-7 दिनों के लिए हर 24 ज ताजा विकास मीडिया के साथ hiPSCs फ़ीड ।
  3. जब hiPSCs ने ऐसी कालोनियों का गठन किया है जो macroscopically दिखाई देती है (लगभग ५०० µm) वे पृथक होने के लिए काफी बड़े हैं । aspirating अतिरिक्त मैट्रिक्स द्वारा एक मैट्रिक्स लेपित ९६-अच्छी तरह से थाली तैयार है और विकास मीडिया के १०० µ एल जोड़ने अच्छी तरह से19प्रति 10 µ एम आरआई के साथ पूरक ।
  4. एक विदारक खुर्दबीन पर एक पी-२०० पिपेट, या इसी तरह का उपयोग करने के लिए धीरे से परिमार्जन और प्लेट की सतह से व्यक्तिगत कालोनियों महाप्राण । स्थानांतरण खंड (~ 20-100 µ एल) से युक्त एक ही कुआं के लिए कॉलोनी ९६-ठीक चरण ४.३ में तैयार प्लेट ।
    1. सभी कालोनियों स्थानांतरित कर दिया गया है के बाद, 37 ˚ सी और 5% CO2में एक ऊतक संस्कृति मशीन में थाली मशीन । 24 एच में नियमित रूप से विकास मीडिया (कोई री) के लिए मीडिया बदलें, और 72-96 घंटे के लिए हर 24 एच खिलाने जारी जब तक कालोनियों लगभग आकार में तीन गुना है (लगभग १५०० µm) ।
      नोट: अभिकर्मक में प्रयुक्त प्रति crRNA 24-96 कालोनियों को खरीदना अनुशंसित है । अलग क्लोन की उत्तरजीविता आम तौर पर ९५% से अधिक है ।
  5. एक सौंय एकल सेल पृथक्करण एजेंट के रूप में सामग्री की तालिकामें सिफारिश का प्रयोग, एक नया मैट्रिक्स में पारित hiPSC क्लोन-लेपित ९६ अच्छी तरह से थाली के रूप में19निंनानुसार है ।
    1. एक 8 चैनल aspirator का उपयोग करना, निकालें और ९६-well थाली के पहले कॉलम से मीडिया को त्यागें ।
    2. एक पी-२०० मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करना, कोशिकाओं को धोने के लिए ९६ अच्छी तरह से थाली के पहले कॉलम के लिए DPBS के ~ २०० µ एल जोड़ें । एक 8 चैनल aspirator का उपयोग करना, निकालें और ९६-well थाली के पहले कॉलम से DPBS धो त्यागें ।
    3. P-२०० मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, ९६-वेल प्लेट के पहले स्तंभ में पृथक्करण रिएजेंट के ४० µ l को जोड़ें.
    4. दोहराएं चरण 4.5.1-4.5.3 ९६-well थाली के छह स्तंभों की कुल तक के लिए, युक्तियां बदलने के लिए कुओं को दूषित पार नहीं यकीन है । ३७ ° c मशीन में पृथक्करण एजेंट पहले स्तंभ (चरण 4.5.3) के लिए जोड़ा गया था समय से 3-5 मिनट के लिए प्लेट रखें ।
      नोट: यह केवल एक अधिकतम छह कॉलम (४८ कुओं) के समय यह इन चरणों का प्रदर्शन करने के लिए लेता है के कारण समय पर पारित करने के लिए सिफारिश की है । पहली बार इस प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करते समय, केवल passaging एक या दो स्तंभों के साथ प्रारंभ करें । एक समय में पारित स्तंभों की संख्या सीमित यह सुनिश्चित करता है कि कोशिकाओं को भी लंबे समय के लिए पृथक्करण एजेंट में नहीं छोड़ दिया है, जो hiPSCs के लिए हानिकारक हो सकता है ।
    5. जब प्लेट के पहले कॉलम में कोशिकाओं को बंद प्लेट नीचे उठाना शुरू कर दिया है, एक पी २०० मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करने के लिए DPBS के पहले कॉलम में १६० µ एल जोड़ने के लिए ९६ अच्छी तरह से प्लेट और धीरे triturate पर कोशिकाओं "12:00" , "3:00", "6:00", और "9:00" प्रत्येक कुआं के स्थान । एक वी-नीचे ९६-अच्छी तरह से थाली के लिए सेल निलंबन (२०० µ एल) के पूरे खंड स्थानांतरण ।
    6. उन में पृथक्करण एजेंट है जो उन कक्षों के बचे हुए स्तंभों के लिए चरण 4.5.5 दोहराएँ; कुओं को दूषित नहीं पार करने के लिए सुझाव बदलें ।
    7. आरटी में 3 मिनट के लिए ३८५ x g पर एक केंद्रापसारक में V-नीचे प्लेट स्पिन
    8. एक पी-२०० मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करना, धीरे supernatant और ताजा विकास मीडिया के २०० µ एल में कोशिकाओं को पुनः निलंबित 10 µ एम आरआई के प्रति अच्छी तरह से पूरक । सभी कुओं के लिए दोहराएं, युक्तियां बदलने के रूप में पार नहीं दूषित ।
    9. एक ताजा मैट्रिक्स-लेपित ९६-well प्लेट19करने के लिए सेल निलंबन के सभी स्थानांतरण । ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% CO2में एक ऊतक संस्कृति मशीन में थाली मशीन । 24 एच में नियमित रूप से विकास मीडिया (कोई री) के लिए मीडिया बदलें, और 72-96 ज के लिए हर 24 एच खिला कोशिकाओं जारी, जब तक क्लोन के बहुमत 60-80% संगम तक पहुंचने ।
      नोट: इस मार्ग से बाहर कोशिकाओं को फैलाने में मदद करता है और ९६-अच्छी तरह से थाली के पूरे क्षेत्र में अधिक वृद्धि के लिए अनुमति देते हैं ।
  6. क्लोन का पालन करें और ९६-अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक व्यक्ति के क्लोन के लिए एक उपयुक्त विभाजन अनुपात की पहचान (जैसे, 1:10, या 1:8) । एक कोमल एकल सेल पृथक्करण एजेंट का उपयोग कर के रूप में सामग्री की तालिकामें सुझाव दिया, एक नया मैट्रिक्स में पारित hiPSC क्लोन-लेपित ९६-अच्छी तरह से थाली (4.5.1-4.5.8) सेल प्रत्येक क्लोन के लिए उपयुक्त निलंबन का अनुपात स्थानांतरित । एक ऊतक संस्कृति मशीन में 37 ˚ सी और 5% CO2में थाली मशीन । 24 एच में नियमित रूप से विकास मीडिया (कोई री) के लिए मीडिया बदलें, और 72-96 एच के लिए हर 24 एच खिला कोशिकाओं जारी, जब तक क्लोन के बहुमत 60-80% संगम तक पहुंचने, और परिपक्व आकृति विज्ञान दिखाओ ।
    नोट: प्रत्येक क्लोन क्योंकि पिछले पारित होने से थोड़ा अलग विकास दर या अस्तित्व के एक अलग विभाजन अनुपात है, तो इस यात्रा के लिए ठंड कदम का पालन करने के लिए प्रत्येक क्लोन के प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं की संख्या को सामान्य करने में मदद करता है हो सकता है. अस्तित्व और विकास की बदलती दरों के कारण, कुछ क्लोनों को विकसित या इन passaging चरणों के दौरान बढ़ने में विफल हो सकता है ।
    1. gDNA अलगाव के लिए सेल निलंबन और गोली के शेष बचाने के लिए एक वी में कक्ष-नीचे ९६ अच्छी तरह से थाली में ३८५ एक्स जी पर 3 मिनट के लिए आरटी । supernatant निकालें और gDNA एक ९६-well किट का उपयोग कर अलगाव के लिए आगे बढ़ना, या-20 ˚ C पर छर्रों कोशिकाओं की दुकान की थाली के लिए ऊपर के लिए अपनाओ सप्ताह.

5. ९६ में क्लोनिंग सेल लाइनों के Cryopreservation-खैर प्लेट प्रारूप

  1. एक एकल सेल पृथक्करण एजेंट का उपयोग करना, पारित hiPSC क्लोन के रूप में पहले वर्णित (4.5.1 कदम-4.5.7) । महाप्राण ने supernatant का उपयोग करते हुए पी-२०० मल्टीचैनल पिपेट और री-सस्पेंड में ६० µ एल ग्रोथ मीडिया के पूरक 10 µ एम री के साथ । सभी कुओं के लिए दोहराएँ; युक्तियां बदलें के रूप में पार नहीं दूषित ।
  2. एक गैर मैट्रिक्स लेपित ९६-well टिशू कल्चर की थाली के लिए सेल निलंबन के 30 µ एल स्थानांतरण । तो जल्दी से जोड़ें १७० µ एल ठंड बफर ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए एक अच्छी तरह से, मिश्रण के बिना । एक बहन की थाली में निलंबन के शेष 30 µ एल स्थानांतरित करके और १७० µ एल ठंड बफर जोड़ने से दोहराएँ ।
    नोट: यह प्रक्रिया डुप्लिकेट बहन प्लेट में किया जाता है ताकि एक बैक-अप की जनसंख्या कोशिकाओं की एक अलग प्लेटों के गल जाने के बाद मौजूद है । एक ९६-अच्छी तरह से प्लेट के केवल हर दूसरे कॉलम में cryopreserved कोशिकाओं डाल तेजी से गल (५.६ कदम) के लिए अनुमति देता है ।
  3. parafilm के साथ लपेटें थाली और ढक्कन के साथ एक आरटी स्टायरोफोम बॉक्स में जगह है । एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में पूरे बॉक्स प्लेस ।
  4. के बाद 24 एच प्लेटों स्टायरोफोम बॉक्स से बाहर स्थानांतरित किया जा सकता है और पर संग्रहित-80 ˚ सी अप करने के लिए चार सप्ताह के लिए ।
    नोट: जबकि कोशिकाओं को अस्थायी रूप से-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत कर रहे हैं, आनुवंशिक गुणवत्ता नियंत्रण परख gDNA के साथ किया जा सकता है से काटा कोशिकाओं में प्राप्त की कोशिकाएं क्रम में गल क्लोन और प्रचार के लिए और आगे, के रूप में पहले प्रकाशित काम में चर्चा की 12. संक्षेप में, एक प्रतिलिपि संख्या छोटी बूंद डिजिटल पीसीआर परख के लिए क्लोन है कि GFP और कोई दाता प्लाज्मिड रीढ़ एकीकरण टेंपलेट के एक या दो प्रतियां शामिल की पहचान किया जा सकता है । अंत बिंदु पीसीआर परख और सैंज अनुक्रमण का एक संयोजन तो क्लोन है कि एक सटीक डालने में शामिल की पहचान कर सकते हैं ।
  5. गल करने के लिए, एक ऊतक संस्कृति मशीन में ३७ ° c करने के लिए पूरी थाली लाने के लिए, बर्फ छर्रों पिघल करने के लिए ध्यान से देख । प्लेट के किनारे पर कुंए पहले गल जाते हैं.
    1. जब वांछित क्लोन के बर्फ गोली पिघला देता है, धीरे एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब के लिए पूरे २०० µ एल हस्तांतरण आर टी विकास मीडिया के 3 मिलीलीटर 10 µ एम आरआई के साथ पूरक है और आरटी में 3 मिनट के लिए २११ x g पर केंद्रापसारक ।
    2. महाप्राण supernatant और आर टी विकास मीडिया के 1 मिलीलीटर में छर्रों कोशिकाओं को निलंबित 10 µ एम आरआई के साथ पूरक । एक ताजा मैट्रिक्स-लेपित 24-अच्छी तरह से थाली और 37 ˚ C और 5% सह पर मशीन के लिए स्थानांतरण2। 24 एच में नियमित रूप से विकास मीडिया (कोई री) के लिए मीडिया बदलें, और 72-96 एच के लिए हर 24 एच खिला कोशिकाओं जारी जब तक क्लोन 60-80% प्रवाह तक पहुंचता है और परिपक्व आकृति विज्ञान19है ।

Representative Results

इस प्रयोग का लक्ष्य था mEGFP (monomeric एन्हांस्ड GFP) को नाभिकीय लामिन B1 प्रोटीन से mEGFP अनुक्रम को शुरू करके पिरणामस्वरूप जीन (एन-प्रोटीन के N-टर्मिनस) के 5 LMNB1 छोर तक पहुंचना । एक लिंकर (एमिनो एसिड अनुक्रम SGLRSRAQAS) पिछले सीडीएनए के आधार पर चुना गया था माइकल डेविडसन फ्लोरोसेंट प्रोटीन संग्रह21से constructs । क्योंकि प्रत्येक उंमीदवार crRNA के लिए दाता टेंपलेट प्लाज्मिड में crRNA बंधन क्षेत्र mEGFP के silico प्रविष्टि में और linker अनुक्रम के बाद बाधित हो गया था, कोई बात नहीं परिवर्तन की जरूरत को संभावित crRNA मांयता और दरार को बाधित किया जाएगा दाता अनुक्रम की Cas9 (चित्रा 1) । दाता अनुक्रम 1 केबी समरूपता हथियार mEGFP-linker अनुक्रम के दोनों सिरों पार्श्व निहित । डीएनए के परिणामस्वरूप २,७३४ बीपी एक pUC57 रीढ़, सत्यापित अनुक्रम में क्लोन किया गया था, और जिसके परिणामस्वरूप दाता टेंपलेट प्लाज्मिड एक endotoxin मुक्त मैक्सी प्रस्तुत करने का उपयोग कर शुद्ध किया गया था । दाता टेंपलेट प्लाज्मिड और RNP परिसर transfected थे, putatively संपादित कोशिकाओं को समृद्ध थे, और mEGFP के स्थानीयकरण-परमाणु लामिन B1 फ्यूजन प्रोटीन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2) द्वारा पुष्टि की गई थी । crRNA1 अभिकर्मक से केवल परिणाम यहां वर्णित हैं, हालांकि दोनों crRNA putatively संपादित आबादी12का उत्पादन किया जुगाड़ ।

जब नकारात्मक नियंत्रण है, जो कोई gRNA, Cas9 प्रोटीन, या दाता टेंपलेट electroporation प्रतिक्रिया में प्लाज्मिड (केवल बफर) निहित की तुलना में, LMNB1 crRNA1 transfected कोशिकाओं में ०.९५% mEGFP-सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व putatively संपादित mEGFP-नाभिकीय लामिन B1 जनसंख्या (चित्र 3ए) । इस परिणाम की श्रेणी के भीतर था नॉक-इन क्षमता में मनाया कई जीनोमिक loci इस विधि का उपयोग कर, के रूप में पहले की रिपोर्ट12

mEGFP-सकारात्मक कोशिकाओं FACS द्वारा अलग और mEGFP-परमाणु लामिन B1 फ्यूजन प्रोटीन के परमाणु लिफाफा के लिए अपेक्षित स्थानीयकरण की पुष्टि करने के लिए जीना माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged थे । FACS-संवर्धन के बाद, LMNB1 crRNA1 जनसंख्या से क्रमबद्ध कोशिकाओं के लगभग ९०% mEGFP सकारात्मक थे (के रूप में माइक्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित), सुझाव है कि कुछ mEGFP-नकारात्मक कोशिकाओं छंटाई प्रक्रिया के दौरान GFP-सकारात्मक कोशिकाओं के साथ शुद्ध । इस संवर्धन के एक स्वीकार्य स्तर है कि ९६ क्लोन है कि फिर सफल संपादन के लिए आनुवंशिक रूप से दिखलाई जा सकता है चुनने के लिए अनुमति दी गई थी । आम तौर पर, सफल संवर्धन के लिए एक कट-ऑफ ५०% GFP सकारात्मक है ।

क्रमबद्ध कोशिका जनसंख्या के अधिकांश विभाजित कोशिकाओं में परमाणु लिफाफा (परमाणु परिधि) पर प्रतिदीप्ति प्रदर्शित किया और कोशिका द्रव्य के भीतर एक विस्तारित परमाणु लेमिना के लिए LMNB1 पर सही जीनोमिक संपादित में विश्वास प्रदान बँटवारा के दौरान ठिकाना. समृद्ध जनसंख्या या तो उज्ज्वल या मंद संकेत के साथ कोशिकाओं को समाहित । संकेत तीव्रता में यह अंतर सही और गलत संपादन परिणामों का एक संयोजन को प्रतिबिंबित और आगे के अध्ययन के लिए एक आनुवंशिक रूप से मांय क्लोनिंग लाइन पैदा करने की उपयोगिता पर प्रकाश डाला जा सकता है (चर्चा देखें) (चित्र 3 बी)12। क्लोनिंग लाइन पीढ़ी के बाद, आनुवंशिक रूप से मान्य कोशिकाओं सूक्ष्म प्रयोगों (चित्रा 3सी) में वर्दी GFP तीव्रता दिखाया.

Figure 1
चित्रा 1 . LMNB1 जीन की N-टर्मिनस GFP टैगिंग के लिए डिजाइन कार्यनीति । GFP टैग एन के लिए डिजाइन टर्मिनल प्रविष्टि 5 गुणसूत्र 5 पर स्थित LMNB1 के पहले एक्सॉन के पिरणामस्वरूप । दोनों 5 पिरणामस्वरूप और 3 पिरणामस्वरूप समरूपता आर्म्स 1 kb हैं और ये स्टार्ट codon (ATG) और दूसरी codon (समरूपता आर्म्स केवल आंशिक रूप से फिगर में दर्शाया गया है) के बीच मिलते हैं. दो उंमीदवार crRNAs Cas9 गाइड करने के लिए संभव के रूप में इरादा सम्मिलन साइट के करीब के रूप में सट करने के लिए डिजाइन किए गए थे, जबकि अभी भी जीनोम में अनूठा जा रहा है । mEGFP के लिए अनुक्रम और एक एमिनो एसिड लिंकर शुरू codon के सिर्फ 3 पिरणामस्वरूप डाला (mEGFP और लिंकर अनुक्रम पैमाने पर नहीं) थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 . endogenously टैग hiPSC क्लोनिंग लाइनों के उत्पादन के लिए कार्यप्रवाह । Cas9/crRNA/tracrRNA RNP परिसर (गोल्ड Cas9 और बैंगनी crRNA के साथ लाल tracrRNA प्रोटीन के रूप में दिखाया गया है) सहित अभिकर्मक घटकों, दाता प्लाज्मिड हथियार युक्त समरूपता टेम्पलेट (है, सोने में दिखाया गया है), और FP + linker अनुक्रम (हरे रंग में दिखाया गया है), थे electroporated । 4 दिनों के बाद, एफ पी-सकारात्मक putatively संपादित कोशिकाओं FACS द्वारा समृद्ध और एक ९६ के एक अच्छी तरह से थाली (~ १,००० कोशिकाओं), और तब तक संस्कृति में विस्तार के सभी हल कोशिकाओं के बोने के द्वारा एक जनसंख्या के रूप में विस्तार किया गया कई लाख की एक कार्यशील जनसंख्या कोशिकाओं को "समृद्ध जनसंख्या" (देखें प्रोटोकॉल चरण ३.८) के रूप में परख सकता है । FP-धनात्मक कोशिकाओं की पैदावार HDR12की परिवर्तनीय दरों के कारण प्रयोग द्वारा भिंन है; एक सफल संवर्धन आम तौर पर शामिल हो सकते है ~ 300-लगभग १.६ x 106 कूल्हों की कोशिकाओं के अभिकर्मक के बाद 5000 कोशिकाओं । प्रारंभिक इमेजिंग अध्ययन संकेत और समृद्ध आबादी में फ्यूजन प्रोटीन के स्थानीयकरण की पुष्टि की । कालोनियों मैंयुअल रूप से एक ९६-विस्तार और cryopreservation के लिए अच्छी तरह से थाली में उठाया गया । आगे जीनोमिक गुणवत्ता नियंत्रण छोटी बूंद डिजिटल पीसीआर (ddPCR) और अंय पीसीआर आधारित परख का उपयोग कर जांच तो ठीक से संपादित क्लोन की पहचान के लिए इस्तेमाल किया गया था, के रूप में पहले12वर्णित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 . putatively संपादित सेल आबादी का संवर्धन । (क) LMNB1 संपादित कोशिकाओं के cytometry भूखंडों का प्रवाह चार दिन पश्चात अभिकर्मक. y-अक्ष GFP तीव्रता प्रदर्शित करता है और x-अक्ष आगे स्कैटर प्रदर्शित करता है. सॉर्टिंग गेट्स केवल-बफ़र नियंत्रण पर आधारित सेट किए गए थे । चूंकि hiPSCs गड़बड़ी के प्रति संवेदनशील होते हैं, इसलिए जीवित/मृत दाग का लोप किया गया और इसके बजाय एक बहुत ही रूढ़िवादी FSC/एसएससी गेट का इस्तेमाल किया गया । (ख) संवर्धन के बाद, LMNB1 Cr1 संपादित कोशिकाओं की आबादी GFP स्थानीयकरण के साथ परमाणु लिफाफे (अपेक्षित LMNB1 स्थानीयकरण) के साथ कोशिकाओं के ~ ९०% दिखाया । जनसंख्या GFP तीव्रता बदलती के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कुछ GFP-नकारात्मक कोशिकाओं की कोशिकाओं को समाहित । स्केल पट्टियां 10 माइक्रोन हैं । (ग) क्लोनिंग लाइन पीढ़ी के बाद, कोशिकाओं को एक समान GFP तीव्रता दिखाया, कुछ कोशिका चक्र निर्भर मतभेदों के साथ । स्केल बार 20 माइक्रोन है ।

Discussion

विधि hiPSCs में endogenously विनियमित फ्लोरोसेंट प्रोटीन संलयन उत्पंन करने के लिए यहां प्रस्तुत की एक बहुमुखी और शक्तिशाली दृष्टिकोण है जीने सेल इमेजिंग से विभिंन कार्यात्मक अध्ययन करने के लिए आवेदन के साथ जीन संपादित सेल लाइनों को पैदा करने के लिए और " एक डिश में रोग "रोगी-व्युत्पंन hiPSC लाइनों13,14,15का उपयोग कर मॉडल । हालांकि इस विधि N के लिए बड़े FP टैग लागू करने के लिए इस्तेमाल किया गया है या सी-अंतर्जात प्रोटीन के टर्मिनस, यह संभवतः के लिए अंय टैग या छोटे आनुवंशिक परिवर्तन मॉडल या सही रोग से परिचय किया जा सकता है-उत्परिवर्तनों22,23 के कारण . छोटे आवेषण के लिए, समरूपता बांह का आकार कम हो सकता है, लेकिन इस पद्धति में प्रस्तुत संपादन करने के लिए सामांय दृष्टिकोण अभी भी24,25लागू हो सकता है । जबकि hiPSCs का उपयोग दृढ़ता से अपने विशाल उपयोगिता के लिए प्रोत्साहित किया जाता है, सावधान अनुकूलन के साथ, इस प्रोटोकॉल के लिए अंय स्तनधारी सेल लाइनों के जीनोम संपादित अनुकूलित हो सकता है ।

जब एफ पी टैगिंग के लिए ब्याज की एक जीन की पहचान, प्रतिलिपि बहुतायत का अनुमान (microarray या आरएनए-Seq डेटा से) का आकलन है कि एक जीन या ब्याज की isoform व्यक्त की है के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु हैं, हालांकि प्रतिलिपि स्तर हमेशा के साथ सहसंबंधी नहीं है प्रोटीन का स्तर । FACS-संवर्धन रणनीति यहां वर्णित जीन के लिए सबसे अच्छा काम करेंगे कि कम से मध्यम अच्छी तरह से ब्याज की कोशिका प्रकार में व्यक्त कर रहे हैं । इस रणनीति भी फ्यूजन कि शो कबरा और/या centrin, desmoplakin, और paxillin के रूप में असतत स्थानीयकरण पैटर्न जहां पृष्ठभूमि अनुपात करने के लिए संकेत बहुत कम है के लिए चयन में सफल रहा है12,19। जीन है कि उच्च व्यक्त नहीं कर रहे है या केवल व्युत्पंन सेल प्रकार में व्यक्त कर रहे है अतिरिक्त चयन रणनीतियों की आवश्यकता हो सकती है ।

मानव कोशिका रेखाओं में प्रयुक्त crRNA और दाता टेम्पलेट प्लाज्मिड डिजाइनों के लिए प्रारंभिक बिंदु मानव संदर्भ जीनोम (GRCh38) होना चाहिए. क्योंकि विभिन्न कोशिका रेखाओं के जीनोम एक ही प्रजाति के भीतर भिन्न हो सकते हैं, और चूँकि CRISPR/Cas9 अनुक्रम-विशिष्ट है, इसलिए यह सेल लाइन-विशिष्ट वेरिएंट (एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपताओं या सम्मिलन/विलोपन (indels)) की पहचान करने के लिए अत्यंत उपयोगी है कि संदर्भ जीनोम से अलग है और डिजाइन में इन शामिल । यह सुनिश्चित करता है कि crRNAs मेजबान जीनोम के साथ संगत होगा और है कि दाता समरूपता शस्त्र प्लाज्मिड टेंपलेट किसी भी सेल लाइन विशिष्ट वेरिएंट बनाए रखने होंगे । एक सुझाव दिया रणनीति डिजाइन प्रक्रिया के दौरान crRNAs और दाता प्लाज्मिड समरूपता हथियार टेंपलेट में homozygous वेरिएंट शामिल है । heterozygous वेरिएंट को शामिल करना वैकल्पिक है । इस प्रोटोकॉल के लिए बड़े नॉक-इन प्रयोगों और अन्य प्रमुख बातों के लिए उपयोग किए गए विशिष्ट रिएजेंट नीचे चर्चा में हैं.

Cas9 प्रोटीन

Cas9 प्रोटीन का उपयोग करने का प्राथमिक लाभ यह है कि एक RNP परिसर के रूप में Cas9 और gRNA का परिचय nuclease के प्लाज्मिड-आधारित दृष्टिकोण की तुलना में गतिविधि की एक सीमित अवधि में परिणाम दिखाया गया है, जहां Cas9 और gRNA की अभिव्यक्ति दिनों के लिए जारी रख सकते है और नेतृत्व पर-और ऑफ़-टारगेट गतिविधि को अधिक से अधिक26,27। Cas9 प्रोटीन का उपयोग करने का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि यह कोशिकाओं के अंदर एक बार सट करने के लिए आसानी से उपलब्ध है । यह Cas9 mRNA या Cas9/gRNA प्लाज्मिड कि प्रतिलेखन, अनुवाद और प्रोटीन प्रसंस्करण26,28की आवश्यकता का उपयोग कर के और अधिक परंपरागत तरीकों के साथ विरोधाभासों । Wildtype एस pyogenes Cas9 प्रोटीन अब कई वाणिज्यिक स्रोतों से उपलब्ध है ।

गाइड आरएनए

वहाँ कई सार्वजनिक रूप से वांछित FP सम्मिलन साइट है कि शून्य या कुछ की भविष्यवाणी की है के पास crRNA लक्ष्य खोजने के लिए उपलब्ध उपकरण हैं-मेजबान जीनोम29,30,31,३२में लक्ष्य । hdr में क्षमता और hdr परिणाम की परिशुद्धता crRNA लक्ष्य के बीच व्यापक रूप से बदलती है एक दिया लोकस12में इस्तेमाल किया । इस कारण से, परीक्षण के लिए कई crRNAs (2-4 और अधिमानतः के भीतर ५० बीपी प्रविष्टि साइट की) लोकस प्रति यह एक सफल संपादन प्रयोग की संभावना बढ़ सकता है के रूप में सिफारिश की है । gRNA पहुंचाने के लिए मौजूदा संभावनाओं सिंथेटिक 2 भाग crRNA और tracrRNA, सिंथेटिक एकल gRNAs (sgRNAs), इन विट्रो में sgRNAs, या एक प्लाज्मिड प्रमोटर से sgRNA व्यक्त कोशिकाओं को एक U6 पहुंचाने में शामिल हैं । इस प्रोटोकॉल उच्च क्लीवेज गतिविधि के लिए अनुकूलित नहीं किया गया था । unmodified 2-भाग crRNA और tracrRNA ( सामग्री की तालिकादेखें) मोनो-allelic FP-टैग सेल लाइनों के उत्पादन के लक्ष्य के साथ इस्तेमाल किया गया था, जबकि कोशिकाओं को कम क्षमता गड़बड़ी के कारण ।

दाता टेम्पलेट प्लाज्मिड

क्योंकि समरूपता हाथ दाता टेंपलेट प्लाज्मिड में उपलब्ध कराई क्रम के कुछ hdr घटना के दौरान मेजबान जीनोम में शामिल किया जाएगा, crRNA मांयता साइटों के लिए बिंदु उत्परिवर्तनों hdr निंनलिखित Cas9 द्वारा आगे दरार को रोकने के लिए शुरू किया जाना चाहिए । अक्सर सरल विघटनकारी परिवर्तन के लिए पाम अनुक्रम बदलना है । क्योंकि कुछ गैर विहित पाम अनुक्रम अभी भी जंगली प्रकार एस pyogenes Cas9 द्वारा मांयता प्राप्त किया जा सकता है, यह सबसे अच्छा है NGG, नाग या NGA३३का उपयोग कर से बचने के । जब समरूपता बांह में बदलना, गैर पर्यायी उत्परिवर्तनों और दुर्लभ codons के परिचय से बचें । यदि पाम अनुक्रम के लिए एक पर्याय परिवर्तन संभव नहीं है, बीज क्षेत्र में तीन पर्याय बिंदु उत्परिवर्तन बनाने पर विचार (10 पाम के लिए) बीपी crRNA बाध्यकारी साइट के समीपस्थ । इन क्षेत्रों में महत्वपूर्ण विनियामक अनुक्रम हो सकता है जब से 5 पिरणामस्वरूप untranslated क्षेत्र (UTR) में इन परिवर्तनों को बनाने जब चरम देखभाल लिया जाना चाहिए । इस तरह के UCSC जीनोम ब्राउज़र की तुलनात्मक जीनोमिक्स पटरियों के रूप में एक आनुवंशिक संरक्षण डेटाबेस परामर्श इन मामलों में मार्गदर्शन प्रदान कर सकते हैं, गैर के लिए परिवर्तन के रूप में संरक्षित ठिकानों को उच्च संरक्षित ठिकानों17परिवर्तन से बेहतर बर्दाश्त किया जा सकता है । कई बार FP अनुक्रम की मात्र प्रविष्टि crRNA बाइंडिंग साइट ( चित्रा 1में के रूप में) को बाधित करने के लिए पर्याप्त है; हालांकि, नए जोड़े अनुक्रम crRNA बाध्यकारी और पाम दृश्यों के हठ के लिए जांच की जानी चाहिए ।

एफ पी और देशी प्रोटीन के बीच एमिनो एसिड लिंकर्स को फ्यूजन प्रोटीन३४के समारोह के संरक्षण की सिफारिश की है । अक्सर एक एमिनो एसिड लिंक अपने विशेष शुल्क या आकार के लिए चुना जा सकता है । यदि लक्षित अंतर्जात फ्यूजन प्रोटीन के समान डिजाइन के साथ एक सीडीएनए संलयन अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है, कि एक ही linker अनुक्रम CRISPR/Cas9 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता दस्तक-प्रयोग में12,19। यदि ऐसी जानकारी अनुपलब्ध है, तो GTSGGS के रूप में एक छोटा लिंक भी सफलतापूर्वक12का उपयोग किया गया है । अंय अध्ययनों से एक सामांय छोटे 3-३५लक्ष्य की एक किस्म के लिए एमिनो एसिड linker अनुक्रम के साथ सफलता का प्रदर्शन किया है ।

अभिकर्मक व FACS संवर्धन

कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मक रिएजेंट कोशिकाओं के अणुओं के कुछ प्रकार के वितरण के लिए तैयार कर रहे हैं, जबकि एक electroporation प्रणाली आकार, प्रभारी, और संरचना की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ रिएजेंट देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । hiPSCs जैसे कठिन-से-transfect कोशिकाओं के लिए एक आम अभिकर्मक विधि होने के अलावा, electroporation भी CRISPR के लिए सभी तीन घटकों को देने का लाभ वहन करती है/Cas9-मध्यस्थता FP नॉक-इन के रूप में इस पद्धति में वर्णित है । Electroporation के लिए सबसे अच्छा परिणाम जब अंय व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है जब इस विधि (डाटा नहीं दिखाया गया है) के विकास के लिए जब की तुलना में पाया गया था, और भी RNP प्रसव के लिए दूसरों के द्वारा इस्तेमाल किया गया है26,28,३६ .

संपादन hiPSCs के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय, विशेष देखभाल से पहले और इष्टतम सेल अस्तित्व और कम से सहज भेदभाव के लिए जीन संपादन प्रक्रिया के बाद कोशिकाओं की कोमल हैंडलिंग सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए । विशेष रूप से, FACS संवर्धन विधियों सबसे बड़ा संभव नलिका (१३० µm), एक कम प्रवाह दर (≤ 24 µ l/), परिरक्षक-मुक्त म्यान द्रव (जैसे खारा, सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके स्टेम सेल छंटाई के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, और कम नमूना दबाव (10 साई) । इसके बजाय एकल कोशिका छंटाई, जो स्टेम सेल में इष्टतम व्यवहार्यता में परिणाम, FACS-समृद्ध hiPSCs थोक में हल कर रहे है और एक जनसंख्या के रूप में विस्तारित करने के लिए सेल व्यवहार्यता और स्टेम सेल अखंडता का अनुकूलन । हालांकि, एकल कक्ष सॉर्टिंग कम संवेदनशील कक्ष प्रकारों के लिए उपयुक्त हो सकता है । सेल अस्तित्व को बढ़ावा देने के लिए, कोशिकाओं को FACS संवर्धन के लिए फसल कटाई के बाद अब एक घंटे से अधिक संस्कृति को लौट रहे है और छंटाई की प्रक्रिया में कमरे के तापमान पर रखा । कुछ सेल प्रकार के लिए, सेल अस्तित्व भी छंटाई प्रक्रिया के दौरान बर्फ (4 डिग्री सेल्सियस) पर कोशिकाओं को गर्मी से बढ़ाया जा सकता है ।

FP-सकारात्मक कोशिकाओं का थोक विस्तार क्लोनिंग लाइनों को पैदा करने से पहले फ्यूजन प्रोटीन स्थानीयकरण के लिए इमेजिंग विश्लेषण द्वारा जनसंख्या का मूल्यांकन करने का अवसर प्रदान करता है । जबकि कोशिकाओं के परिणामस्वरूप समृद्ध जनसंख्या कुछ अध्ययनों के लिए पर्याप्त हो सकता है, इन आबादियों अक्सर तीव्रता बदलती के FP संकेत प्रदर्शन । अलग क्लोनिंग लाइनों वर्दी संकेत (चित्रा 3) है, उन्हें कार्यात्मक प्रयोगों12के लिए और अधिक उपयुक्त बनाने.

क्लोनिंग सेल लाइन जनरेशन

संपादन और क्लोनिंग लाइन पीढ़ी प्रक्रिया के दौरान, यह सेल आकृति विज्ञान की निगरानी के लिए महत्वपूर्ण है । hiPSC फीडर में उगाई गई कालोनियां-मुक्त शर्तों चिकनी किनारों और एक भी, अच्छी तरह से पैक केंद्र12,18,19प्रदर्शन करना चाहिए । विभेदित कोशिकाओं को संस्कृति के 5% से कम में मनाया जाना चाहिए । जब व्यक्तिगत कालोनियों उठा, उन है कि प्रदर्शन अच्छा आकृति विज्ञान चुनें । ९६-खैर प्लेट passaging घटनाओं के दौरान, आकृति विज्ञान के लिए क्लोन की जाँच करें और उन है कि यह भेदभाव करने के लिए नेतृत्व या आनुवंशिक अस्थिरता का एक संकेत हो सकता है के रूप में ऊंचा हो गया है बंद ।

क्लोनिंग सेल लाइनों की पीढ़ी सटीक संपादन है, जो महत्वपूर्ण है की आनुवंशिक पुष्टि के लिए अनुमति देता है क्योंकि Cas9-प्रेरित जीनोम में डबल किनारा टूटता अक्सर वांछित लोकस पर टैग के शामिल होने के बावजूद गलत रूप से मरंमत कर रहे हैं । पहले वर्णित पीसीआर आधारित परख दिखाया है कि संचई दस अद्वितीय जीनोमिक भर में loci कई (४५%)-एक्सप्रेस क्लोन के लक्षित लोकस पर दाता प्लाज्मिड रीढ़ एकीकरण से पीड़ित या (शायद ही कभी)12जीनोम में बेतरतीब ढंग से । इसके अतिरिक्त, GFP के 23%-सकारात्मक क्लोन (n = 177) दस अद्वितीय loci भर में या प्रत्याशित crRNA काटने साइट के पास में टैग एलील, सबसे NHEJ12के कारण होने की संभावना के पास बंदरगाह उत्परिवर्तनों के लिए पाए गए । कई क्लोनिंग लाइनों के इस आनुवंशिक विश्लेषण (~ १०० क्लोन/आनुवंशिक मांयता है कि FP-अभिव्यक्ति और अपेक्षित फ्यूजन प्रोटीन स्थानीयकरण अकेले सटीक संपादन 12 गारंटी नहीं है के बाद से एक कोशिका आबादी में संभव नहीं है के महत्व को रेखांकित . इसके अतिरिक्त, इन पीसीआर आधारित परख किसी भी निश्चितता के साथ कोशिकाओं की समृद्ध आबादी पर नहीं किया जा सकता है, सार्थक विश्लेषण से पहले क्लोनिंग लाइन पीढ़ी के लिए आवश्यकता वारंट पूरा किया जा सकता है । डाला FP टैग और अप्रकाशित एलील की आनुवंशिक अखंडता के सत्यापन के आनुवंशिक पुष्टि (एक मोनो allelic संपादित क्लोन में) दोनों के लिए टैग अभिव्यक्ति से परे लक्षित लोकस पर सटीक संपादन सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं ।

द्वि-allelic संपादन और ऑफ लक्ष्य उत्परिवर्तनों की कमी की एक कम दर (के रूप में सैंज और exome अनुक्रमण द्वारा परख) इस विधि (अप्रकाशित डेटा)12का उपयोग करने की तारीख को मनाया गया है । इस पिछले CRISPR/Cas9 प्रयोगों26,27के लिए कम-स्थाई RNP के उपयोग का वर्णन अध्ययनों के अनुरूप है । द्वि-allelic संपादन के साथ क्लोनिंग सेल लाइनों की कमी भी विशिष्ट या सेल की अक्षमता के कारण लोकस किया जा सकता है एक आवश्यक प्रोटीन की प्रतियां दो टैग को बर्दाश्त के रूप में पहले से प्रकाशित प्रयोगों से जहां ख्यात द्वि-allelic संपादित कोशिकाओं थे सुझाया एक लोकस (LMNB1) के लिए मनाया, लेकिन नहीं एक और (TUBA1B)12। द्वि-allelic पूरी तरह से मान्य क्लोनल सेल लाइनों ST6 बीटा-galactoside अल्फा-2, 6-sialyltransferase 1 (ST6GAL1), और RAB5A सदस्य रास oncogene परिवार (RAB5A) के साथ mEGFP19टैग करने के लिए इस विधि का उपयोग कर उत्पन्न किया गया है.

जीनोम में संपादित की पुष्टि परिशुद्धता परे, वहां गुणवत्ता नियंत्रण परख कि आगे क्लोनिंग लाइन विशेषताएं और क्लोनों कि सभी स्टेम सेल, जीनोमिक, और सेल जैविक मानदंडों को पूरा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की एक किस्म है भविष्य के अध्ययन में उपयोग के लिए . सेल जैविक और कार्यात्मक परख के लिए उपयुक्त अभिव्यक्ति, स्थानीयकरण, और फ्यूजन प्रोटीन12के समारोह की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अप्रकाशित अभिभावक नियंत्रणों की तुलना स्थानीयकरण, गतिशीलता और फ़ंक्शन पर संपादन प्रक्रिया के प्रभाव का मूल्यांकन करने में मदद करेगी । ऐसे विकास विश्लेषण और जीनोमिक स्थिरता के लिए परीक्षण के रूप में अंय परख भी अगर टैग प्रोटीन सेल को perturbing है निर्धारित करने में मदद कर सकते हैं । जब इस प्रोटोकॉल में hiPSC का उपयोग कर, pluripotency मार्करों और भेदभाव की क्षमता का मूल्यांकन एक क्लोन है कि बहाव12के अध्ययन के लिए मूल्यवान है निर्धारित करने में महत्वपूर्ण हो सकता है । क्योंकि hiPSC की विस्तारित संस्कृति आनुवंशिक अस्थिरता के लिए नेतृत्व दिखाया गया है, विकास दर और क्लोनिंग सेल लाइनों के कैरयोटाइप की निगरानी भी महत्वपूर्ण है12,३७। हालांकि, संपादित कोशिकाओं के अंतिम उद्देश्य का उपयोग अंततः स्तर और गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण के विस्तार का निर्धारण करेगा और आवेदन के आधार पर भिंन होगा ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम कई व्यावहारिक विचार विमर्श और जीन संपादन पर सलाह के लिए Daphne Dambournet धंयवाद, थाओ चित्रण के लिए करते हैं, पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए Angelique नेल्सन, और एंड्रयू टकर mEGFP B1 सेल लाइन टैग पैदा करने के लिए । हम सेल विज्ञान के लिए एलन संस्थान में जीन संपादन और गुणवत्ता नियंत्रण प्रक्रिया के लिए उनके योगदान के लिए स्टेम सेल और जीन संपादन और परख विकास टीमों को स्वीकार करना चाहते हैं । वर्ल्ड ट्रेड सेंटर लाइन है कि हम अपने जीन-संपादित सेल लाइन बनाने के लिए इस्तेमाल किया ग्लैडस्टोन संस्थानों और UCSF में ब्रूस आर Conklin प्रयोगशाला द्वारा प्रदान किया गया था । हम सेल विज्ञान के संस्थापक, पॉल जी एलन के लिए एलन संस्थान, उसकी दृष्टि, प्रोत्साहन के लिए धंयवाद, और समर्थन करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Geneious R9 Biomatters, or similar bioinformatics software for in silico donor plasmid design
TE Buffer pH 8.0 IDT, or similar 11-01-02-05
HERAcell VIOS 160i CO2 incubator, or similar ThermoFisher Scientific, or similar 51030408
Pipettes (1000 µL, 200 µL, 20 µL, 10 µL, 2 µL) Rainin, or similar
Pipette tips (1000 µL, 200 µL, 20 µL) Rainin, or similar
Multi-channel Pipette (200 µL) Rainin, or similar
Serological pipetes (25 mL, 10 mL, 5 mL) Costar, or similar
BRAND 8-Channel Manifold for Quiksip, Autoclavable Millipore Sigma, or similar BR704526-1EA use with non-filtered pipet tips, such as Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10, below
Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10 Thermo Fisher, or similar 3501-05
XP2 Pipette Controller Drummond, or similar 4-000-501
Disposable Pasteur Pipets VWR, or similar 53300-567
Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet CELLGARD, or similar NU-481
Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced Corning 354230 lot tested before use with hiPSC
DMEM/F12 (-phenol red) Gibco 11039-021 cold, for diluting Matrigel 1:30
mTeSR1 Complete Media StemCell Technologies 85850 recommended growth media for WTC hiPSC line
Penicillin-streptomycin Gibco 15070-063
WTC hiPSC line Coriell GM25256 the hiPSC line used in this protocol is available through Coriell
Tissue culture dish 100 mm Falcon 353003
6-well Cell Culture Plate CELLSTAR 657160
StemPro Accutase Gibco A11105-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) no calcium, no magnesium Gibco 14190144
15 mL polystyrene conical Sarstedt 62.554.100
Y-27632 (ROCK Inhibitor) StemCell Technologies 72308
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic crRNA, unmodified (custom sequence) Dharmacon Custom0247
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA Dharmacon U-002005-05
Recombinant wild-type Streptococcus pyogenes Cas9-NLS purified protein, 40 µM University of California-Berkeley QB3 Macrolab
Custom donor plasmid (PriorityGENE) Genewiz donor insert design was synthesized and cloned into pUC57 backbone by Genewiz
DNA LoBind Tube 1.5 mL Eppendorf 22431021
NucleoBond Xtra Maxi EF Clontech 740424.50
Neon Transfection System ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System, 100 µL kit ThermoFisher Scientific MPK10096
5 mL Polystyrene Round-bottom Tube with Cell Strainer Cap Falcon 352235
15 mL High Clarity Polyproylene Conical Tube Falcon 352196
FACSAriaIII Fusion BD Biosciences 656700
FACSDiva software BD Biosciences
FlowJo version 10.2 TreeStar
NERL Blood Bank Saline ThermoFisher Scientific 8504 used as preservative-free FACS Buffer
Olympus SZX7 Stereo Microscope, or similar Olympus, or similar
Tissue culture plate, 96-well Falcon 353072
96 well Cell Culture Plate, V-Bottom CELLSTAR 351180
CryoStor CS10 Sigma C2874-100ML used as cryopreservation buffer for cells in 96-well plate format
Parafilm Bemis PM-996
24 well Cell Culture Plate CELLSTAR 662160

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References

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अंतर्जात प्रोटीन टैगिंग में मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम कोशिकाओं का उपयोग CRISPR/Cas9
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Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (138), e58130, doi:10.3791/58130 (2018).More

Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (138), e58130, doi:10.3791/58130 (2018).

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