Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Endogene Protein merking i menneskelig indusert Pluripotent stilk celler med CRISPR/Cas9

doi: 10.3791/58130 Published: August 25, 2018

Summary

Beskrevet her er en protokoll for merking endogenously uttrykt proteiner med fluorescerende koder i menneskelig indusert pluripotent stamceller ved hjelp CRISPR/Cas9. Åpenbart redigerte celler er beriket med fluorescens aktivert celle sortering og klonal cellelinjer genereres.

Abstract

En protokoll er presentert for å generere menneskelige indusert pluripotent stamceller (hiPSCs) som uttrykker endogene proteiner smeltet å N - eller C-terminalen fluorescerende koder i rammen. Prokaryote CRISPR/Cas9 systemet (gruppert regelmessig interspaced kort palindromic gjentar/CRISPR-assosiert 9) kan brukes å innføre store eksogene sekvenser i genomisk loci via homologi regissert reparasjon (HDR). For å oppnå den ønskede knock-in, denne protokollen bruker ribonucleoprotein (RNP)-tilnærming der wild type Streptococcus pyogenes Cas9 protein, syntetiske 2-del guide RNA (gRNA) og en donor mal plasmider leveres til cellene via electroporation. Åpenbart redigerte celler uttrykke fluorescently merket proteiner er beriket av fluorescens aktivert celle sortering (FACS). Klonal linjer genereres og kan bli analysert for presis redigering resultater. Ved å introdusere fluorescerende koden på genomisk locus genet av interesse, kan den resulterende subcellular lokalisering og dynamikken i fusion protein studeres under endogene regulatoriske kontroll, en viktig forbedring over konvensjonelle overuttrykte systemer. Bruk av hiPSCs som et modellsystem for genet merking gir mulighet til å studere merket proteinene i diploide, nontransformed celler. Siden hiPSCs kan differensieres ut flere celletyper, gir denne tilnærmingen muligheten til å opprette og studere merket proteiner i en rekke isogenic mobilnettet sammenhenger.

Introduction

Bruk av genomet-redigering strategier, spesielt CRISPR/Cas9, å studere cellulære prosesser blir stadig mer tilgjengelig og verdifulle1,2,3,4,5, 6 , 7. en av de mange programmene i CRISPR/Cas9 er innføringen (via homologi regissert reparasjon (HDR)) av store eksogene sekvenser som GFP i bestemte genomisk loci deretter tjene som journalister for aktiviteten genet eller protein produktet8 . Denne teknikken kan brukes til en fluorescerende protein sekvens til en endogen åpent lesing ramme hvor resulterende endogenously regulert fusion protein kan brukes å visualisere subcellular lokalisering og dynamikken i protein rundt5 ,6,9,10,11. Endogenously merket proteiner tilbyr mange fordeler sammenlignet med overuttrykte systemer, er sette inn store sekvenser i det menneskelige genomet en ineffektiv prosess som vanligvis krever en markering eller berikelse strategi for å få en populasjon av celler som kan være lett studerte5,12.

Denne protokollen beskriver innsetting av en DNA sekvens koding et fluorescerende protein (FP) til et ønsket genomisk locus. Protokollen inneholder design og levering av donor mal plasmider og ribonucleoprotein (RNP) komplekse (wild type S. pyogenes Cas9 protein kombinert med syntetisk CRISPR RNA (crRNA) og trans-aktivering crRNA (tracrRNA)). Også beskrevet er anriking av åpenbart redigerte celler via fluorescens aktivert celle sortering (FACS) og klonal cellen linje Generasjonsprosessen. Hittil har denne metoden brukt til å generere hiPSC linjer med enten monoallelic eller (sjelden) bi-allel grønne fluorescerende protein (GFP) tags merking tjuefem proteiner som representerer store cellulære strukturer. Den resulterende redigerte celler fra dette arbeidet har blitt bekreftet å ha forventet genetisk innsetting, uttrykke et riktig lokalisere fusion protein og vedlikeholde pluripotency og stabile karyotype12 (og upubliserte data). Denne metoden har også blitt brukt til å generere flere andre enkel og dobbel (to ulike proteiner merket i samme celle) endret bestander av hiPSCs (upublisert data).

Menneskelige iPSCs avledet fra en frisk donor ble valgt for granskingen genomet-redigering fordi, i motsetning til mange konvensjonelle cellelinjer, de er diploide, karyotypically stabile, ikke-transformert og proliferativ. Disse egenskapene gir en attraktiv modell for å studere grunnleggende cellebiologi og sykdom modellering. Videre gir differensiering potensialet i hiPSCs deg mulighet til å studere flere utviklingsstadier parallelt i ulike overleveringslinjer og celletyper bruker isogenic cellene organoids, vev og "sykdom i en rett" modeller13 ,14,15. Mens denne protokollen ble utviklet for hiPSCs (WTC linje), kan det være informative for utvikling av protokoller med andre pattedyr linjer.

Protocol

1. i sili Design av crRNA og Donor mal plasmider for FP Knock-i

  1. Få kommenterte referanse sekvensen fra NCBI16 eller de UCSC genomet nettleser17 (f.eks GenBank-format) av genet av interesse og importere den til en bioinformatikk programvare av valget. Hvis det vert Genova orden er kjent for å inneholde varianter i forhold til referansen, inkluderer de nå justere ved referanse rekkefølgen bioinformatikk programvaren (se diskusjon).
  2. Finn ønsket FP innsetting site. For C-terminalen koder, vil rekkefølgen for FP koden bli introdusert mellom i bunnen av den siste codon og den første basen i stopp codon. For N-terminal merking, vil rekkefølgen for FP koden vanligvis bli introdusert mellom siste bunnen av start codon og den første basen i den neste codon. I noen tilfeller, som når start codon er en enkelt codon ekson eller der en signal sekvens finnes nær protein terminus, kan ønsket FP innsetting site være lokalisert i en mer 3ʹ posisjon, så lenge det fortsetter å være i rammen.
  3. Bruk 50 bp på hver side av ønsket innsetting site som inndatasekvensen for noen offentlig tilgjengelig crRNA design verktøyet. Når 2-4 crRNA mål identifiseres nær innsetting, kommentere crRNA bindende områder og protospacer tilstøtende motiv (PAM) sekvenser (NGG) i bioinformatikk programvaren. Disse crRNAs vil bli brukt til å indusere dobbel strandet pauser (se diskusjon for mer veiledning på crRNA design).
    Merk: Egendefinert crRNA sekvenser kan sendes for syntese med en kommersiell leverandør (anbefales) eller rekkefølgen kan brukes som utgangspunkt til å utforme en kloning eller i vitro syntese strategi, som er utenfor omfanget av denne protokollen (se diskusjon ).
  4. For å starte donor mal plasmider, bruke 1 kb av sekvens oppstrøms av ønsket innsetting site som 5ʹ homologi armen (dette bør inkludere start codon for N-terminal innsettinger) og bruke 1 kb sekvens nedstrøms med ønsket innsetting site som 3ʹ homologi armen (dette bør inkludere stopp codon for C-terminalen innsettinger). Baser mellom to homologi armene utelates vanligvis ikke. Inkludert celle-line spesifikke varianter i homologi armene vil bevare disse genetiske varianter i resulterende redigerte cellene.
  5. Mellom de to homologi armene, sette rekkefølgen for FP (eller andre banker i sekvensen) og koblingsfunksjonalitet sekvensen (se diskusjon for mer veiledning om linkers). For N-terminal koder, bør koblingsfunksjonalitet sekvensen være direkte 3ʹ av FP; for C-terminalen koder, bør koblingsfunksjonalitet sekvensen være direkte 5ʹ av FP.
  6. Avbryte crRNA bindende områder i donor mal plasmider å hindre Cas9 kutte av donor (se diskusjon for hensyn når endrer crRNA bindende områder). Hvis mulig, foretrekkes forstyrrelse av PAM til en serie enn NGG eller NAG. Eventuelt er innføre punkt mutasjoner til tre baser i regionen frø i crRNA (10 baser proksimale til PAM) spådd for å forstyrre tilstrekkelig crRNA binding. Noen crRNA bindende områder avbrutt av innføring av FP rekkefølgen donor mal plasmider; Kontroller at ingen PAM eller intakt bindende område fortsatt finnes i disse tilfellene.
    Merk: I sili donor mal plasmider kan sendes til gen syntese av en kommersiell leverandør, eller den kan brukes som utgangspunkt til å utforme en kloning strategi, som er utenfor omfanget av denne protokollen. En enkel ryggrad som pUC19 eller pUC57 er tilstrekkelig.

2. ribonucleoprotein (RNP) hva for CRISPR/Cas9 mediert banke i hiPSCs

Merk: I denne protokollen, begrepet "gRNA" beskriver syntetiske crRNA og tracrRNA riktig re suspendert kvantifisert og pre-kompleksbundet henhold til produsentens anvisninger (se Tabell for materiale). Supplere alle medier med 1% Penicillin Streptomycin. Generelle dyrking retningslinjer av WTC hiPSC linjen er beskrevet mer detaljert Allen celle Explorer18,19. WTC hiPSCs brukes i denne protokollen, men med riktig transfection optimalisering, electroporation av RNP og donor mal plasmider kan bli vellykket tilpasset andre celletyper.

  1. Forberede 10 µM arbeider bestander av gRNA og vill-type S. pyogenes Cas9 protein2,20; Hold på is. Forberede 1 µg/µL arbeider lager av donor mal plasmider; holde ved romtemperatur (RT). Bruk pH 8.0 TE buffer for alle fortynninger.
  2. Forberede en matrix-belagt 6-og vev kultur plate med 5 mL frisk vekst medier med 10 µM ROCK hemmer (Ri) per brønn. Hold plate med media i kuvøse på 37 ° C og 5% CO2 til du er klar til platen celler etter hva prosedyren (maksimum 2 h).
    Merk: Alle matrise-belagte plater brukes i denne protokollen er laget ved å legge til et volum av iskalde Matrigel utvannet 1:30 i kalde DMEM/F12 media ifølge Allen Institute for cellen vitenskapens protokollen for dyrking WTC hiPSC linje19.
  3. Bruke en mild encellede dissosiasjon reagens som anbefalt i Tabellen for materiale, passasje hiPSCs i én celle suspensjon og antall celler ved hjelp av en automatisert celle teller eller hemocytometer.
    Merk: En detaljert protokoll for WTC hiPSC linje her finner Allen celle Explorer19. Kort, vask celler når med RT DPBS og behandle med dissosiasjon reagens for 3-5 minutter. Deretter triturate celler i én celle suspensjon av mild pipettering og pellets med sentrifugering. Resuspend levende celle pellet i vekst medier med 10 µM Ri.
    1. Klargjør en aliquot 1.84 x 106 celler for hver eksperimentelle tilstand å være transfekterte i separate 1,5 mL rør.
      Merk: Alle volumer beregnet for et 4,5 µL totale reaksjon volum i et 100 µL electroporation volum, ganger 2.3 reaksjoner. Dette står for dupliserte transfection og overflødig for pipettering feil.
  4. Forberede ribonucleoprotein (RNP) komplekse rør for hver eksperimentelle tilstand ved å legge 2,88 µL av 10 µM gRNA og 2,88 µL av 10 µM Cas9 til en 1,5 mL tube. Ruge på RT minimum 10 min (maksimalt 1 h).
  5. Pellets én celle aliquot (forberedt i trinn 2.3.1) 211 x g i 3 minutter på RT. leveringstanken nedbryting og resuspend celle pellet i 220 µL av produsentens electroporation buffer.
  6. Legge til 220 µL av resuspended celler fra trinn 2.5 inn i 1,5 mL RNP komplekse røret i trinn 2.4.
  7. Legge til 4.60 µL av 1 µg/µL donor mal plasmider 1,5 mL tube i trinn 2.4.
  8. Bruk nucleofection tips og pipette for å blande innhold 2 - 3 ganger, deretter overføre 100 µL av suspensjon til forberedt electroporation enheten. Unngå å innføre bobler i spissen. Bruke 1300 V for 1 pulsen på 30 ms.
  9. Forsiktig overføre suspensjon i forberedt 6-vel platen fra trinn 2.2 med en virvlende bevegelse. Spre celler ved å forsiktig flytte platen til siden og foran å bak.
  10. Bruker nye nucleofection tips, Gjenta trinn 2.8-2.9 med de resterende 100 µL av suspensjon og overføre til en ny brønn av forberedt 6-vel plate.
    1. Gjenta 2.4 gjennom 2.10 for hver gRNA og donor mal plasmider kombinasjon, inkludert ikke-målretting gRNA, giver mal plasmider bare og buffer eneste kontrollene. Ta vare for å endre pipette og nucleofection tips for å unngå kryss-kontaminering.
  11. Inkuber transfekterte cellene på 37 ° C og 5% CO2. Endre media til vanlig vekst medier (ingen Ri) på 24 h og fortsette mate hiPSCs hver 24 h 72-96 h, overvåking confluency. Når hiPSCs nå 60-80% samløpet, går du til trinn 3.
    Merk: Tunge celledød (> 70%, estimert) er normalt 24-48 h etter hva.

3. FACS-anriking av åpenbart endret hiPSCs

Merk: Når sortering stamceller, tilpasse instrument-innstillingene for å fremme cellen overlevelse som foreslått i diskusjonen. Kort, bruker største munnstykket mulig (130 µm), lav strømningsrate (≤ 24 µL/min), konserveringsmidler-free skjede væske (se Tabell for materialesom saltvann,), og lav utvalg Press (10 psi).

  1. Før begynnelsen en FACS eksperiment, endre media til vekst medier med 10 µM Ri og ruge cellene på 37 ° C og 5% CO2 for 2-4 h for å fremme overlevelse etter FACS.
  2. Bruke en mild encellede dissosiasjon reagens som anbefalt i Tabellen for materiale, passasje hiPSCs i én celle suspensjon i vekst medier med 10 µM Ri19.
  3. Filtrere hiPSC suspensjon gjennom 35 µm maske filter i polystyren rund bunn rør.
  4. Sortere celler med fremover scatter og siden xy (inkludert høyde og bredde) å utelukke rusk og doublets. Bruk live, buffer bare kontrollere celler sette FP-positive porten, slik at < 0,1% av buffer bare celler innenfor porten.
  5. Sorter hele befolkningen i FP-positive celler i en 1.5-15 mL polypropylen rør som inneholder 0,5-2 mL RT vekst medier med 10 µM Ri.
    Merk: Polypropylen reduserer muligheten for celleadhesjon plast.
  6. Sentrifuge avhentet celler 211 x g i 3 minutter på RT.
  7. Nøye Sug opp nedbryting og resuspend celle pellet i 200 µL av veksten medier med 10 µM Ri. Overføre opptil 3000 sorterte cellene til en enkelt brønn en fersk matrix-belagt 96-brønns plate19.
    Merk: Med riktige instrumentet oppsettet celler kan også sorteres (i bulk) direkte inn i en enkelt brønn av en matrise-belagt 96-brønns vev kultur plate inneholder 200 µL av veksten medier med 10 µM Ri på en anbefalt tetthet av 1000-3000 celler per brønn for hiPSC.
  8. Inkuber sorterte cellene på 37 ° C og 5% CO2. Endre media til vekst medier med 5 µM Ri på 24 h. Begynne fôring celler vanlige vekst medier (ingen Ri) hver 24 h 72-96 h, overvåking confluency på 48 timer. Overlevelse etter FACS er anslått til mer enn 50% hvis minst 500 celler er sådd i en godt av en 96-brønns plate.
    1. Når hiPSCs nå 60-80% samløpet og Vis modne morfologi (glatt, godt pakket kolonien sentre), passering i et større format plate som en 24-vel plate, så fra en 24-vel-plate i en 6-vel plate.
    2. Når hiPSCs i en 6-vel plate nå 60-80% samløpet og vise eldre morfologi, utvide til en 100 mm plate, nytt plate for bildebehandling, cryopreserve eller frø klone plukking tetthet (trinn 4)19.

4. generere åpenbart endret klonal hiPSC linjer

  1. Bruke en mild encellede dissosiasjon reagens som anbefalt i Tabellen for materiale, passasje hiPSCs i én celle suspensjon og bestemme antall celler per mL19.
  2. Frø 10.000 celler av befolkningen redigert av hiPSCs på en fersk matrix-belagt 100 mm vev kultur parabol bruke vekst medier med 10 µM Ri19. Endre media til vekst medier uten Ri 24 timer etter såing, og feed hiPSCs med ferske vekst medier hver 24 timer for 5-7 dager.
  3. Når hiPSCs har dannet kolonier som synlige macroscopically (ca 500 µm) de er store nok til å være isolert. Forberede en matrix-belagt 96-brønns plate ved aspirating overflødig matrise og legge til 100 µL av veksten medier med 10 µM Ri per godt19.
  4. På en dissecting mikroskop bruk en P-200 pipette, eller lignende, å forsiktig skrape og Sug opp individuelle kolonier fra tallerken overflaten. Overføre volum (~ 20-100 µL) som inneholder kolonien i en enkelt brønn av 96-brønns plate i trinn 4.3.
    1. Etter at alle koloniene er overført, ruge platen i en vev kultur inkubator på 37˚C og 5% CO2. Endre media til vanlig vekst medier (ingen Ri) på 24 h og fortsette mate celler hver 24 h 72-96 h til koloniene er ca tredoblet i størrelse (ca 1500 µm).
      Merk: Plukke 24-96 kolonier per crRNA brukes i hva de anbefaler. Overlevelse av isolerte kloner er vanligvis større enn 95%.
  5. Bruke en mild encellede dissosiasjon reagens som anbefalt i Tabellen for materiale, kloner passasje hiPSC i en ny matrise-belagt 96-brønns plate som følger19.
    1. Bruker en 8-kanals aspirator, fjerne og kast media fra den første kolonnen i 96-brønnen platen.
    2. Bruker en P-200 flerkanals pipette, legge til ~ 200 µL av DPBS i den første kolonnen i 96-brønnen plate å vaske cellene. Bruke en 8-kanals aspirator, fjerne og forkaste DPBS vask fra den første kolonnen i 96-brønnen platen.
    3. Bruker en P-200 flerkanals pipette, legge til 40 µL av dissosiasjon reagensen i den første kolonnen i 96-brønnen platen.
    4. Gjenta trinn 4.5.1-4.5.3 for opptil totalt seks kolonner av 96-brønns plate, endre tips å forsikre ikke kors-forurense brønner. Plass platen i 37 ° C inkubator for 3-5 minutter fra tiden dissosiasjon reagensen var lagt til den første kolonnen (trinn 4.5.3).
      Merk: Det anbefales å bare passasje maksimalt seks kolonner (48 wells) om gangen på grunn av tiden det tar for å utføre disse trinnene. Når du utfører denne protokollen for første gang, start med passaging bare én eller to kolonner om gangen. Begrense antall kolonner passaged samtidig sikrer at cellene er igjen i dissosiasjon reagensen for lenge, som kan være skadelig for hiPSCs.
    5. Når cellene i den første kolonnen i platen har begynt å løfte av platen bunnen, bruk en P-200 flerkanals pipette legge 160 µL av DPBS til den første kolonnen i 96-brønnen platen og forsiktig triturate cellene på "12:00" , "3:00", "6:00" og "9:00" posisjoner i hver brønn. Overføre hele volumet av cellen suspensjon (200 µL) til en V-bunn 96-brønns plate.
    6. Gjenta trinn 4.5.5 for de gjenværende kolonnene som har dissosiasjon reagens i dem. endre tips om ikke kryss-smitte brønner.
    7. Spin V-bunnplaten i en centrifuge 385 x g for 3 min på RT.
    8. Bruke en P-200 flerkanals pipette, Fjern nedbryting og resuspend celler i 200 µL av fersk vekst medier med 10 µM Ri per brønn. Gjenta for alle brønner, endre tips om ikke kryss-smitte.
    9. Overføre alle cellen suspensjon til en frisk matrix-belagt 96-brønns plate19. Inkuber platen i en vev kultur inkubator på 37 ° C og 5% CO2. Endre media til vanlig vekst medier (ingen Ri) på 24 h og fortsette mate celler hver 24 h 72-96 h, til fleste kloner nå 60-80% samløpet.
      Merk: Denne passasjen bidrar til å spre ut cellene og gi rom for mer vekst over hele området i 96-brønnen platen.
  6. Observere kloner og identifisere en passende delt ratio for hver individuelle klone i 96-brønnen plate (f.eks 1:10 eller 1:8). Bruke en mild encellede dissosiasjon reagens som foreslått i Tabellen for materiale, kloner passasje hiPSC i en ny matrise-belagt 96-brønns plate (trinn 4.5.1-4.5.8) overføre forholdet celle suspensjon passer for hver klone. Inkuber platen i en vev kultur inkubator på 37˚C og 5% CO2. Endre media til vanlig vekst medier (ingen Ri) på 24 h og fortsette mate celler hver 24 h 72-96 h, til fleste kloner nå 60-80% samløpet og vise eldre morfologi.
    Merk: Hver klone kan ha en annen delt forhold på grunn av annerledes vekst eller overlevelse fra forrige passering, så denne passasjen hjelper normalisere antall celler per brønn av hver Klon for frysing trinn å følge. På grunn av den varierende prisen for overlevelse og vekst, kan noen kloner overgrow eller ikke klarer å vokse i disse passaging trinn.
    1. Lagre resten av cellen hjuloppheng og pellets gDNA isolering av sentrifugering celler i en V-bunn 96-brønns plate 385 x g for 3 min på rett fjerne supernatant og videre til gDNA isolasjon bruker en 96-brønns kit eller lagre platen pelleted celler på - 20˚C for opp til thr EE uker.

5. kryonisk bevaring av klonal cellelinjer i 96-brønnen plate format

  1. Bruker en enkeltcelle dissosiasjon reagens, passasje hiPSC kloner som beskrevet tidligere (trinn 4.5.1-4.5.7). Sug opp nedbryting bruker en P-200 flerkanals pipette og re avbryte 60 µL av veksten medier med 10 µM Ri. Gjenta for alle brønnene; endre tips om ikke kryss-smitte.
  2. Overføring 30 µL av cellen suspensjon til en ikke-matrix belagt 96-brønns vev kultur plate. Deretter raskt legge til 170 µL frysing buffer (se Tabell for materiale) i hver brønn, uten blanding. Gjenta ved å overføre de resterende 30 µL av suspensjon i en søster plate og legge til 170 µL frysing buffer.
    Merk: Denne prosessen gjøres i like søster plater slik at sikkerhetskopiering innbyggere celler finnes etter tining en av enkelte plater. Putting cryopreserved celler i bare hver andre kolonnen av en 96-brønns plate gir raskere tining (trinn 5.6).
  3. Pakk plate med parafilm og plasser i en RT Styrofoam boks med lokk. Sett hele boksen i-80 ° C fryser.
  4. Etter 24 h kan plater overføres esken Styrofoam og lagret på - 80˚C i opptil fire uker.
    Merk: Mens cellene lagres midlertidig på-80 ° C, genetisk kvalitetskontroll analyser kan utføres med gDNA høstet fra celler fikk i trinn 4.6.1 for å identifisere Klonene å tine og overføres videre, som omtalt i tidligere utgitte verk 12. kort, en kopi nummer slippverktøy digital PCR analysen kan brukes til å identifisere kloner som inneholder en eller to kopier av GFP og ingen donor mal plasmider ryggraden integrasjon. En kombinasjon av end-point PCR analyser og Sanger sekvensering kan deretter identifisere kloner som inneholder en nøyaktig setter.
  5. Tin, ta med hele platen til 37 ° C i en vev kultur inkubator, ser nøye på snøbyger å smelte. Brønner på kanten av tallerkenen pleier å tine først.
    1. Når isen pellet av ønsket Klon smelter, forsiktig overføre hele 200 µL til en 15 mL konisk rør som inneholder 3 mL RT vekst medier med 10 µM Ri og sentrifuge 211 x g for 3 min på RT.
    2. Sug opp nedbryting og resuspend pelleted celler i 1 mL av RT vekst medier med 10 µM Ri. Overføre til en frisk matrix-belagt 24-vel plate og ruge på 37˚C og 5% CO2. Endre media til vanlig vekst medier (ingen Ri) på 24 h og fortsette mate celler hver 24 h 72-96 h til klone når 60-80% confluency og har eldre morfologi19.

Representative Results

Målet med dette eksperimentet var å fusjonere mEGFP (monomerisk forbedret GFP) å kjernefysiske lamin B1 protein ved å innføre mEGFP rekkefølgen på 5ʹ slutten av LMNB1 genet (N-terminus av protein). Et linker (aminosyresekvens SGLRSRAQAS) ble valgt basert på tidligere cDNA konstruksjoner fra Michael Davidson fluorescerende Protein samling21. Fordi crRNA binding regionen i donor mal plasmider for hver kandidat crRNA forstyrret etter i sili innsetting av mEGFP og koblingsfunksjonalitet rekkefølgen, uten punkt mutasjoner nødvendig å forstyrre potensielle crRNA anerkjennelse og spalting av Cas9 av donor sekvensen (figur 1). Donor sekvensen inneholdt 1 kb homologi armene flankert begge ender av mEGFP-linker sekvensen. De resulterende 2,734 bp DNA ble klonet i et pUC57 miljø, sekvens bekreftet, og den resulterende donor mal plasmider var renset med en endotoxin-fri maxi prep. Donor mal plasmider og RNP komplekse var transfekterte, åpenbart redigerte celler ble beriket og lokalisering av mEGFP-kjernefysiske lamin B1 fusion protein ble bekreftet av fluorescens mikroskopi (figur 2). Bare resultatene fra crRNA1-hva er beskrevet her, selv om begge crRNA sekvenser produsert åpenbart redigerte bestander12.

I forhold til kontrollen negative, som inneholdt ingen gRNA, Cas9 proteiner eller donor mal plasmider electroporation reaksjon (buffer bare), LMNB1 crRNA1 transfekterte finnes celler 0,95% mEGFP-positive cellene representerer det åpenbart redigerte mEGFP-kjernefysiske ved B1 befolkningen (figur 3a). Dette resultatet var innen bank i effektivitet observert over mange genomisk loci bruker denne metoden, som tidligere rapportert12.

MEGFP-positive cellene var isolert av FACS og fotografert av live mikroskopi å bekrefte forventede lokalisering av mEGFP-kjernefysiske lamin B1 fusion protein til den kjernefysiske konvolutten. Etter FACS-berikelse var ca 90% av sortert celler fra befolkningen LMNB1 crRNA1 mEGFP-positive (som bestemmes av mikroskopi), tyder på at noen mEGFP-negativ celler co renset med GFP-positive celler under sortering prosedyren. Dette var et akseptabelt nivå berikelse som tillatt for plukking av 96 kloner som kan deretter bli genetisk vist for vellykket redigering. Vanligvis et cut-off for vellykket berikelse er 50% GFP positive.

Flertallet av befolkningen sorterte cellen vises fluorescens den kjernefysiske konvolutten (kjernefysisk periferi) i nondividing celler og til en utvidet kjernefysiske lamina i cytoplasma under mitose gir tillit til riktig genomisk redigere LMNB1 locus. Befolkningen beriket inneholdt celler med enten sterkt eller svakt signal. Denne forskjellen i signal intensitet kan gjenspeile en kombinasjon av riktige og uriktige resultater og høylys verktøyet genererer en genetisk validert klonal linje for videre studier (se diskusjon) (figur 3b)12. Etter klonal linje generasjon, validerte genetisk celler viste uniform GFP intensitet mikroskopi eksperimenter (Figur 3 c).

Figure 1
Figur 1 . Utforme strategi for N-terminus GFP merking av LMNB1 genet. GFP-kode ble utviklet for N-terminal innsetting 5ʹ av den første ekson av LMNB1 ligger på kromosom 5. Både 5ʹ og 3ʹ homologi armene er 1 kb og møte mellom start codon (ATG) og den andre codon (homologi våpen bare delvis representert i figuren). To kandidaten crRNAs ble utformet for å veilede Cas9 deler så nær tiltenkte innsetting site som mulig, samtidig som unike i genomet. Rekkefølgen for mEGFP og en aminosyre linker var innsatte bare 3ʹ av start codon (mEGFP og linker sekvens ikke å skalere). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Arbeidsflyt for å produsere endogenously merket hiPSC klonal linjer. Hva komponenter, inkludert Cas9/crRNA/tracrRNA RNP komplekset (vises som en rød Cas9 protein med gull crRNA og lilla tracrRNA), donor mal plasmider inneholder homologi armene (har, i gull), og FP + linker sekvens (vist inne grønn), var electroporated. Etter 4 dager, var FP-positive åpenbart endret cellene beriket av FACS utvidet som en populasjon av seeding alle sortert inn i en enkelt brønn av en 96-brønns plate (~ 1000 celler) og deretter utvidet i kultur til arbeider innbyggere flere millioner cellene kan være assayed som "beriket befolkningen" (se protokollen trinn 3.8). Avkastningen av FP-positive celler forskjellig forsøket på grunn av variable priser HDR12; en vellykket berikelse kan vanligvis inneholde ~ 300-5000 celler etter transfection ca 1,6 x 106 hofter celler. Foreløpig tenkelig studier bekreftet signalet og lokalisering av fusion protein i befolkningen beriket. Koloniene ble manuelt plukket i en 96-brønns plate for ekspansjon og kryonisk bevaring. Videre genomisk kvalitetskontroll screening med slippverktøy digital PCR (ddPCR) og andre PCR-baserte analyser ble deretter brukes til å identifisere riktig redigerte kloner, som beskrevet tidligere12. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Anriking av åpenbart redigerte celle populasjoner. (A) flyt cytometri tomter i LMNB1 endret celler fire dager etter hva. Y-aksen viser GFP intensitet og x-aksen viser frem scatter. Sortering gates ble sett basert på kontrollen buffer-bare. Siden hiPSCs er følsomme for forstyrrelsene, live/dead flekken ble utelatt og en svært konservativ FSC/SSC gate ble brukt i stedet. (B) etter berikelse, befolkningen i LMNB1 Cr1 endret celler viste ~ 90% av celler med GFP lokalisering til kjernefysiske konvolutten (forventet LMNB1 lokalisering). Befolkningen inneholder celler med ulik intensitet og GFP samt noen GFP-negativ celler. Skala barer er 10 mikrometer. (C) etter klonal linje generasjon, celler viste en ensartet GFP intensitet, forskjeller i cellen syklus avhengige. Skala er 20 mikron.

Discussion

Metoden som presenteres her for generering av endogenously regulert fluorescerende protein fusjoner i hiPSCs er en allsidig og kraftig tilnærming for å generere genet endret linjer med programmer alt fra levende celle imaging til ulike funksjonelle studier og " sykdom i en rett"modeller med pasient-avledede hiPSC linjene13,14,15. Mens denne metoden er brukt til å innføre store FP koder til N - eller C-terminus endogene proteiner, kan det potensielt brukes til å introdusere andre koder eller liten genetiske endringer til modell eller riktig sykdomsfremkallende mutasjoner22,23 . For mindre inserts, reduseres størrelsen på homologi armen, men den generelle tilnærmingen til redigering presentert i denne metoden kan fortsatt gjelde24,25. Mens bruken av hiPSCs sterkeste for deres store verktøyet, med forsiktig optimalisering, kan denne protokollen tilpasses for å redigere genomer av andre pattedyr linjer.

Når identifisere en genet av interesse for FP merking, transkripsjon overflod anslår (fra microarray eller RNA-Seq data) er et godt utgangspunkt for å vurdere om en genet eller isoformen av interesse er uttrykt, selv om transkripsjon nivåer ikke alltid samsvarer med protein nivå. FACS-berikelse strategi beskrevet her vil fungere best for gener som er minst middels godt uttrykt i celle type interesse. Denne strategien har også vært vellykket i å velge for fusjoner som viser vises punctate og/eller diskrete lokalisering mønstre som centrin, desmoplakin og paxillin hvor signal bakgrunn forhold er svært lav12,19. Gener som ikke er svært uttrykt eller uttrykkes bare i avledede celletyper kan kreve ekstra strategier.

Utgangspunktet for crRNA og donor mal plasmider design brukt i humane cellelinjer skal menneskelige referanse genomet (GRCh38). Fordi genomer av forskjellige linjer kan variere i samme art, og fordi CRISPR/Cas9 er sekvens-spesifikke, er det svært nyttig å identifisere celle linje-spesifikke varianter (single nukleotid eller innsettinger/slettinger (indeler)) Det skiller seg fra referanse genomet og innlemme disse i utformingen. Dette sikrer at crRNAs vil være kompatibel med verten genomet og at donor mal plasmider homologi armene vil beholde alle cellen linje spesifikke varianter. En foreslått strategi er å innlemme homozygous varianter i crRNAs og donor mal plasmider homologi armene under utformingen. Det er valgfritt å innlemme heterozygote varianter. Bestemt reagensene brukt for store banker i eksperimenter og andre viktige hensyn for denne protokollen er omtalt nedenfor.

Cas9 Protein

Hovedfordelen ved hjelp av Cas9 protein er at innføring av Cas9 og gRNA som en RNP kompleks har blitt vist å føre en begrenset varighet av nuclease aktivitet i forhold til plasmider-baserte tilnærminger der uttrykk for Cas9 og gRNA kan fortsette i dager og føre større på - og off-målet aktivitet26,27. En ekstra fordel av å bruke Cas9 protein er at det er lett tilgjengelig deler en gang i cellene. Dette står i kontrast med mer konvensjonelle metoder av benytter Cas9 mRNA eller Cas9/gRNA plasmider som krever transkripsjon, oversettelse og protein behandling26,28. Wildtype S. pyogenes Cas9 protein er nå tilgjengelig fra mange kommersielle kilder.

Guide RNA

Det er mange offentlig tilgjengelige verktøy for å finne crRNA mål i nærheten av ønsket FP innsetting område som har ingen eller få spådd av mål i vert genomet29,30,31,32. Effektivitet i HDR og presisjonen for HDR utfallet varierer mye mellom crRNA mål brukes på en gitt locus12. Derfor teste flere crRNAs (2-4 og helst 50 bp av ønsket innsetting site) per locus er anbefalt som dette kan øke sannsynligheten for et vellykket redigering eksperiment. Gjeldende muligheter for å levere gRNA inkluderer syntetiske 2-part crRNA og tracrRNA, syntetisk enkelt gRNAs (sgRNAs), i vitro transkribert sgRNAs eller levere en plasmider celler uttrykke sgRNA fra en U6 promoter. Denne protokollen ble ikke optimalisert for høy cleavage aktivitet. Uforandret 2-part crRNA og tracrRNA (se Tabell for materiale) ble brukt med mål om å generere mono-allel FP-merket cellelinjer mens forårsaker minst potensielle forstyrrelsene til cellene.

Donor mal plasmider

Fordi noen av homologi arm rekkefølgen gitt i donor mal plasmider vil bli innarbeidet i vert genomet under hendelsen HDR, bør punkt mutasjoner til crRNA anerkjennelse nettsteder innføres for å hindre ytterligere spalting av Cas9 etter HDR. Enkleste forstyrrende endringen er ofte å mutere PAM sekvensen. Fordi noen ikke-kanoniske PAM sekvenser kan fortsatt bli gjenkjent av vill-type S. pyogenes Cas9, er det best å unngå å bruke NGG, NAG eller NGA33. Når mutere homologi armen, unngå ikke-synonymt mutasjoner og innføring av sjeldne kodon. Hvis en synonymt endring PAM sekvensen ikke er mulig, kan du vurdere å gjøre tre synonymt punkt mutasjoner i regionen frø (10 bp proksimale til PAM) på crRNA binding området. Ekstrem forsiktighet bør utvises når du gjør disse endringene i 5ʹ uoversatt regionen (UTR) siden disse områdene kan inneholde viktige forskrifter sekvenser. Konsulenttjenester en genetisk bevaring database som UCSC genomet nettleserens komparativ genomikk spor kan gi veiledning i disse tilfellene som endringer i ikke-bevart baser kan være bedre tolerert enn endres til høyt konservert baser17. Noen ganger er bare innsetting av FP sekvensen nok til å forstyrre crRNA bindende nettsted (som i figur 1). men skal nylig tilføyde sekvensen sjekkes for utholdenhet crRNA bindende og PAM sekvenser.

Aminosyren linkers mellom FP og innfødt protein anbefales å spare funksjon fusion protein34. Ofte bli en aminosyre koblingsfunksjonalitet valgt for spesielle kostnader eller størrelse. Hvis en cDNA blanding med design ligner den målrettede endogene er fusion protein godt studert, at samme koblingsfunksjonalitet sekvens kan brukes til CRISPR/Cas9 bank i eksperimentet12,19. Hvis slik informasjon er tilgjengelig, et kort linker som GTSGGS har også vært brukt med hell12. Andre studier har vist suksess med en generisk små 3-amino acid koblingsfunksjonalitet sekvens for en rekke mål35.

Hva og FACS berikelse

Mange kommersielt tilgjengelig transfection reagenser er formulert for levering av visse typer molekyler til celler, mens et electroporation system kan brukes til å levere reagenser med en rekke størrelse, kostnad og komposisjon. I tillegg til å være en vanlig transfection måte vanskelig å transfect celler som hiPSCs, bærer electroporation også fordelen av levere alle tre komponentene for CRISPR/Cas9-mediert FP banker som beskrevet i denne metoden. Electroporation ble funnet for å produsere de beste resultatene sammenliknet med andre tilsvarede reagenser når utvikle denne metoden (data ikke vist) og er også brukt av andre for RNP levering26,28,36 .

Når du bruker denne protokollen for redigering hiPSCs, bør forsiktighet tas å sikre skånsom behandling av cellene før og etter genet redigeringsprosessen for optimal celle overlevelse og minimal spontan differensiering. Spesielt FACS berikelse metodene bør tilpasses for sortering stamceller ved hjelp av største munnstykket mulig (130 µm), lav strømningsrate (≤24 µL/min), konserveringsmidler-free skjede væske (se Tabell for materialesom saltvann,), og lav utvalg Trykk (10 psi). I stedet for enkeltcelle sortering, som resulterer i suboptimal levedyktighet i stamceller, FACS-beriket hiPSCs sorteres i bulk og utvidet som innbyggere å optimalisere celle levedyktighet og stamcelleforskningen integritet. Imidlertid kan enkelt celle sortering være passende for mindre sensitive celletyper. For å fremme cellen overlevelse, er celler tilbake til kultur ikke lenger enn en time etter høsting for FACS anriking og holdt ved romtemperatur gjennom sortering prosessen. For noen celletyper, kan celle overlevelse også bli styrket av rugende celler på is (4° C) gjennom sortering prosessen.

Bulk utvidelse av FP-positive celler gir en mulighet til å evaluere befolkningen av tenkelig analyse for fusion protein lokalisering før generere klonal linjer. Mens den resulterende beriket populasjonen av celler kan være tilstrekkelig for noen studier, vise populasjonene ofte FP signal av varierende intensitet. Isolert klonal linjene har uniform signal (Figur 3), noe som gjør dem mer passende for funksjonell eksperimenter12.

Klonal linje generasjon

Gjennom redigering og klonal linje Generasjonsprosessen er det viktig å overvåke celle morfologi. hiPSC kolonier vokst mater-gratis forhold bør utstilling kantutjevning og en selv, godt pakket center12,18,19. Differensierte celler praktiseres i mindre enn 5% av kulturen. Når plukke personlige kolonier, Velg de som utstillingen god morfologi. I 96-brønnen platen passaging hendelser, kontroller kloner for morfologi og avslutte de som har grodd som dette kan føre til differensiering eller være en indikasjon på genetisk ustabilitet.

Generasjon av klonal cellelinjer lar genetisk bekreftelse av nøyaktig redigering, noe som er viktig fordi Cas9-indusert dobbel-strand bryter i genomet er ofte reparert unøyaktig til tross for inkorporering av koden på ønsket locus. Tidligere beskrevet PCR-baserte analyser viste at kumulativt over ti unike genomisk loci mange (45%) FP-uttrykke kloner LED fra donor plasmider ryggraden integrasjon på målrettet locus eller (sjelden) tilfeldig i genomet12. I tillegg 23% av GFP-positive kloner (n = 177) over ti unike loci ble funnet til havn mutasjoner på eller nær forventet crRNA kutte i det umerkede allelet, mest sannsynlig skyldes NHEJ12. Denne genetisk analyse av mange klonal linjer (~ 100 kloner/Rediger) understreket betydningen av genetisk valideringstypen ikke er mulig i en celle befolkningen siden FP-uttrykk og forventet fusion protein lokalisering alene ikke garanterer presis redigering12 . I tillegg kan ikke disse PCR-baserte analyser utføres på en beriket populasjon av celler med noen sikkerhet, krever behovet for klonal linje generasjon før meningsfull analyse kan fullføres. Genetisk bekreftelse av innsatte FP koden og verifisering av genetisk integriteten til det uredigerte allelet (i en mono-allel redigerte klone) er begge nødvendig for å sikre presis redigering på målrettet locus utover merkeuttrykket.

En lav rate bi-allel redigeringer og mangel på off-målet mutasjoner (som assayed av Sanger og exome sekvensering) har blitt observert å dato ved hjelp av denne metoden (upubliserte data)12. Dette er i tråd med tidligere studier som beskriver bruken av kortvarig RNP for CRISPR/Cas9 eksperimenter26,27. Mangel på klonal linjer med bi-allel endringer kan også være bestemte locus eller på grunn av manglende evne til cellen tolerere to merket kopier av en viktig protein som foreslått fra tidligere publiserte eksperimenter hvor antatte bi-allel redigerte celler var observert i én locus (LMNB1), men ikke en annen (TUBA1B)12. Bi-allel fullt godkjente klonal cellelinjer har generert benytter denne metoden å kode ST6 beta-galactoside alfa-2, 6-sialyltransferase 1 (ST6GAL1), og RAB5A medlem RAS oncogene familie (RAB5A) med mEGFP19.

Utover bekrefter presisjon på Rediger i genomet, finnes det en rekke kvalitetskontroll analyser som kan brukes å karakterisere klonal linjen og identifisere kloner som oppfyller alle Stamcelle, genomisk, og cellen biologiske vilkår for bruk i fremtidige studier . Cellen biologiske og funksjonelle analyser kan brukes til å bekrefte riktig uttrykk, lokalisering og funksjon av fusion protein12. Sammenligningen til uredigerte Sperrefunksjon vil bidra til å evaluere redigeringsprosessen lokalisering, dynamikk og funksjon. Andre analyser avgjøre som vekst analyse og tester genomisk stabilitet kan også hjelpe om merket protein er perturbing til cellen. Når du bruker hiPSC i denne protokollen, kan evaluering av pluripotency markører og differensiering potensial være svært viktig for en klone som er verdifull for nedstrøms studier12. Fordi utvidet kultur hiPSC har vist seg å føre til genetisk ustabilitet, overvåking veksten og karyotype av klonal cellelinjer er også viktig12,37. Imidlertid ment finalen redigerte cellene til slutt avgjør nivå og bredden av kvalitetskontroll analyse og vil variere avhengig av programmet.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Daphne Dambournet for mange innsiktsfulle diskusjoner og råd på genet redigering, Thao gjøre illustrasjon, Angelique Nelson for kritisk lesing av manuskriptet, og Andrew Tucker for å generere mEGFP-merket ved B1 cellen linjen. Vi ønsker å erkjenne stamceller og Gene Editing og analysen utviklingsgrupper ved Allen Institute for cellen Science for deres bidrag til genet redigering og kvalitetskontroll prosessen. WTC linjen som vi laget vår gen-redigerte cellen linje ble levert av Bruce R. Conklin Laboratory på Gladstone institutter og UCSF. Vi takker Allen Institutt for cellen Science grunnlegger, Paul G. Allen, for hans visjon, oppmuntring og støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Geneious R9 Biomatters, or similar bioinformatics software for in silico donor plasmid design
TE Buffer pH 8.0 IDT, or similar 11-01-02-05
HERAcell VIOS 160i CO2 incubator, or similar ThermoFisher Scientific, or similar 51030408
Pipettes (1000 µL, 200 µL, 20 µL, 10 µL, 2 µL) Rainin, or similar
Pipette tips (1000 µL, 200 µL, 20 µL) Rainin, or similar
Multi-channel Pipette (200 µL) Rainin, or similar
Serological pipetes (25 mL, 10 mL, 5 mL) Costar, or similar
BRAND 8-Channel Manifold for Quiksip, Autoclavable Millipore Sigma, or similar BR704526-1EA use with non-filtered pipet tips, such as Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10, below
Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10 Thermo Fisher, or similar 3501-05
XP2 Pipette Controller Drummond, or similar 4-000-501
Disposable Pasteur Pipets VWR, or similar 53300-567
Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet CELLGARD, or similar NU-481
Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced Corning 354230 lot tested before use with hiPSC
DMEM/F12 (-phenol red) Gibco 11039-021 cold, for diluting Matrigel 1:30
mTeSR1 Complete Media StemCell Technologies 85850 recommended growth media for WTC hiPSC line
Penicillin-streptomycin Gibco 15070-063
WTC hiPSC line Coriell GM25256 the hiPSC line used in this protocol is available through Coriell
Tissue culture dish 100 mm Falcon 353003
6-well Cell Culture Plate CELLSTAR 657160
StemPro Accutase Gibco A11105-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) no calcium, no magnesium Gibco 14190144
15 mL polystyrene conical Sarstedt 62.554.100
Y-27632 (ROCK Inhibitor) StemCell Technologies 72308
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic crRNA, unmodified (custom sequence) Dharmacon Custom0247
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA Dharmacon U-002005-05
Recombinant wild-type Streptococcus pyogenes Cas9-NLS purified protein, 40 µM University of California-Berkeley QB3 Macrolab
Custom donor plasmid (PriorityGENE) Genewiz donor insert design was synthesized and cloned into pUC57 backbone by Genewiz
DNA LoBind Tube 1.5 mL Eppendorf 22431021
NucleoBond Xtra Maxi EF Clontech 740424.50
Neon Transfection System ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System, 100 µL kit ThermoFisher Scientific MPK10096
5 mL Polystyrene Round-bottom Tube with Cell Strainer Cap Falcon 352235
15 mL High Clarity Polyproylene Conical Tube Falcon 352196
FACSAriaIII Fusion BD Biosciences 656700
FACSDiva software BD Biosciences
FlowJo version 10.2 TreeStar
NERL Blood Bank Saline ThermoFisher Scientific 8504 used as preservative-free FACS Buffer
Olympus SZX7 Stereo Microscope, or similar Olympus, or similar
Tissue culture plate, 96-well Falcon 353072
96 well Cell Culture Plate, V-Bottom CELLSTAR 351180
CryoStor CS10 Sigma C2874-100ML used as cryopreservation buffer for cells in 96-well plate format
Parafilm Bemis PM-996
24 well Cell Culture Plate CELLSTAR 662160

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wood, A. J., et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 333, (6040), 307 (2011).
  2. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, (6096), 816-821 (2012).
  3. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, (6121), 819-823 (2013).
  4. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, (6121), 823-826 (2013).
  5. Dambournet, D., Hong, S. H., Grassart, A., Drubin, D. G. Tagging endogenous loci for live-cell fluorescence imaging and molecule counting using ZFNs, TALENs, and Cas9. Methods in Enzymology. 139-160 (2014).
  6. Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Sci Rep. 5, 9592 (2015).
  7. Hendriks, W. T., Warren, C. R., Cowan, C. A. Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells: Approaches, Pitfalls, and Solutions. Cell Stem Cell. 18, (1), 53-65 (2016).
  8. Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Cell Stem Cell. 18, (5), 573-586 (2016).
  9. Doyon, J. B., et al. Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells. Nature Cell Biology. 13, (3), 331-337 (2011).
  10. Cho, W. K., et al. Super-resolution imaging of fluorescently labeled, endogenous RNA Polymerase II in living cells with CRISPR/Cas9-mediated gene editing. Sci Rep. 6, 35949 (2016).
  11. White, C. W., Vanyai, H. K., See, H. B., Johnstone, E. K. M., Pfleger, K. D. G. Using nanoBRET and CRISPR/Cas9 to monitor proximity to a genome-edited protein in real-time. Sci Rep. 7, (1), 3187 (2017).
  12. Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Mol Biol Cell. 28, (21), 2854-2874 (2017).
  13. Soldner, F., et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations. Cell. 146, (2), 318-331 (2011).
  14. Young, J. E., Goldstein, L. S. Alzheimer's disease in a dish: promises and challenges of human stem cell models. Human Molecular Genetics. 21, (R1), R82-R89 (2012).
  15. Soares, F. A., Sheldon, M., Rao, M., Mummery, C., Vallier, L. International coordination of large-scale human induced pluripotent stem cell initiatives: Wellcome Trust and ISSCR workshops white paper. Stem Cell Reports. 3, (6), 931-939 (2014).
  16. Gene, NCBI- National Center for Biotechnology Information. U.S. National Library of Medicine. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene (2017).
  17. Gene, NCBI- National Center for Biotechnology Information. UCSC Genome Browser. https://genome.ucsc.edu/ (2017).
  18. Allen Cell Methods: Single cell passaging human iPS cells. https://www.youtube.com/watch?v=wao2UcMFPMc (2018).
  19. Allen Cell Explorer. http://www.allencell.org/ (2017).
  20. Lingeman, E., Jeans, C., Corn, J. E. Production of Purified CasRNPs for Efficacious Genome Editing. Curr Protoc Mol Biol. 120, 31-31 (2017).
  21. Michael Davidson Fluorescent Protein Collection. https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/davidson/ (2017).
  22. Cox, D. B., Platt, R. J., Zhang, F. Therapeutic genome editing: prospects and challenges. Nature Medicine. 21, (2), 121-131 (2015).
  23. Haas, S. A., Dettmer, V., Cathomen, T. Therapeutic genome editing with engineered nucleases. Hamostaseologie. 37, (1), 45-52 (2017).
  24. Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K., Carroll, D. Donor DNA Utilization During Gene Targeting with Zinc-Finger Nucleases. G3 (Bethesda). 3, (4), 657-664 (2013).
  25. Orlando, S. J., et al. Zinc-finger nuclease-driven targeted integration into mammalian genomes using donors with limited chromosomal homology. Nucleic Acids Research. 38, (15), e152 (2010).
  26. DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein. Methods. 121-122, 9-15 (2017).
  27. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24, (6), 1012-1019 (2014).
  28. Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
  29. Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44, (W1), W272-W276 (2016).
  30. Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42, (Web Server issue), W401-W407 (2014).
  31. Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30, (10), 1473-1475 (2014).
  32. CRISPOR V4.3. http://crispor.tefor.net/ (2017).
  33. Zhang, Y., et al. Comparison of non-canonical PAMs for CRISPR/Cas9-mediated DNA cleavage in human cells. Sci Rep. 4, 5405 (2014).
  34. Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Adv Drug Deliv Rev. 65, (10), 1357-1369 (2013).
  35. Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (25), E3501-E3508 (2016).
  36. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
  37. Baker, D., et al. Detecting Genetic Mosaicism in Cultures of Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 7, (5), 998-1012 (2016).
Endogene Protein merking i menneskelig indusert Pluripotent stilk celler med CRISPR/Cas9
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (138), e58130, doi:10.3791/58130 (2018).More

Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (138), e58130, doi:10.3791/58130 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter